CN107802659A - 一种增强免疫功能的静脉注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增强免疫功能的静脉注射剂，属于生物医药领域。这种药物的主要成分是灭活乳酸菌，通过将活的乳酸菌灭活制备得到。灭活乳酸菌静脉给药可以增强机体免疫功能，可用于人或动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、真菌性疾病、寄生虫病、癌症以及各种原因引起的机体免疫功能低下等多种疾病的预防、治疗或辅助治疗，具有广阔的应用前景。

Description

一种增强免疫功能的静脉注射剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种增强免疫功能的静脉注射剂。

背景技术

机体的免疫系统由免疫器官(如脾脏、胸腺、淋巴结等)、免疫细胞(如单核巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等)以及免疫活性物质(如抗体、补体、白细胞介素等)组成。免疫系统是机体重要的防御体系，与机体的抗病力直接相关。机体可通过免疫系统清除病毒、细菌、真菌、寄生虫和癌细胞等，以避免引起疾病。免疫系统能够清除病原体主要是通过非特异性免疫功能和特异性免疫功能起作用的。非特异性免疫功能是指无特殊针对性的对病原体的天然抵抗力，它借助于皮肤、黏膜的屏障作用、淋巴组织的滤过作用、单核-巨噬细胞系统的吞噬作用以及溶菌酶等的杀灭作用清除病原体。特异性免疫功能是指淋巴细胞针对某一种特异性抗原，产生与之相对应的抗体或进行局部性细胞反应，以杀灭特异性病原体，如T细胞受到病原体刺激后，转化为致敏淋巴细胞，可以直接攻击具有特异抗原性的病原体，发挥细胞免疫作用；B淋巴细胞受到病原体刺激后，可转变成浆细胞分泌抗体，抗体可与病原体发生中和、沉淀、凝集或溶解的免疫反应以消除病原体，发挥体液免疫作用。

当机体免疫功能低下时，机体的防御机能就会降低，容易引起病原微生物或寄生虫的侵染以及癌症发生等。能够引起机体免疫功能低下的因素很多，当机体发生应激反应、长期劳累、工作压力大或遭受放射性物质辐射等会出现免疫功能低下；一些药物能够抑制机体免疫功能，如地塞米松、环磷酰胺、环孢素、氯霉素、磺胺药等；一些毒素也能抑制免疫功能，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等。另外，许多疾病本身就会造成机体免疫抑制，如在人的临床上，艾滋病、恶性肿瘤、结节性麻风、三期梅毒、晚期结核病、粪类圆线虫病等；在兽医临床上，也有很多免疫抑制病，如马传染性贫血病、牛白血病、羊小反刍兽疫、猪蓝耳病、猪圆环病、禽网状内皮增生症病、鸡马立克氏病、犬瘟热、犬细小病毒病等。

目前用于提高机体免疫功能的药物主要有：多糖类，如黄芪多糖、香菇多糖、云芝多糖、人参多糖、银耳多糖、猪苓多糖等；细胞因子类，如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、重组白细胞介素-2、胸腺肽、转移因子、集落细胞刺激因子、脾多肽等；抗体类，如卵黄抗体、血清抗体、单克隆抗体、丙种免疫球蛋白等；中药类，如玉屏风散、冬虫夏草、蜂胶等；维生素类，如维生素C、叶酸、维生素B₁₂、维生素A等；微量元素类，如葡萄糖酸锌、亚硒酸钠、右旋糖酐铁等；化学药物类，如左旋咪唑、异丙肌苷、匹多莫德等。

除了上述的免疫调节药物外，将微生物及其有效成分或代谢产物作为免疫调节剂的药物越来越多，但多为有害菌或非益生菌，将其致弱或灭活或其菌体成分或其代谢产物制成的制剂。如卡介苗，是结核活菌苗，具有免疫增强作用，可通过口服、皮下、腹腔或瘤内注射用于预防结核病和肿瘤的辅助治疗。短小棒状杆菌制剂，为短小棒状杆菌的死菌悬液，可提高机体非特异性免疫功能，经皮下、肌肉、瘤内或静脉滴注等用于一些肿瘤的辅助治疗。A群链球菌制剂，为溶血性链球菌A组Ⅲ型低毒变异株Su株冷冻干燥的菌体制剂，其中尚含有青霉素G钾盐等，具有直接杀伤肿瘤细胞和激活宿主免疫功能的作用，可通过皮下、肌内、瘤内注射或静脉注射等用于癌症的辅助治疗。铜绿假单胞菌制剂，本品为铜绿假单胞菌菌毛株经灭活后制成，可以调节机体免疫功能，经皮下或肿瘤局部注射进行辅助治疗。草分枝杆菌制剂，其主要成分为灭活的草分枝杆菌，经深部肌内注射，用于免疫功能低下性疾病，如慢性支气管炎、肿瘤、肝炎、糖尿病、肺和肺外结核病等治疗。另外，还有人将红球菌属、戈登氏菌属、诺卡氏菌属、迪茨氏菌属、冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞作为免疫调节剂(专利公开号：CN1735431A)。通过对一些有害菌加工处理得到的成分用于免疫调节的药物有：注射用红色诺卡氏菌细胞壁骨架，是由红色诺卡氏菌经发酵、破碎、提取获得细胞壁骨架(N-CWS)，加入适量乳化剂后冻干制成，主要含该菌细胞壁的组分霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽等，可用于癌症的辅助治疗。卡介菌多糖核酸制剂，是从卡介菌中提取的多糖、核酸制成，经肌内注射可预防和治疗慢性支气管炎、感冒及哮喘等。甘露聚糖肽，是从A型链球菌培养液中提得的α-甘露聚糖作为免疫增强剂，用于肿瘤放疗、化疗过程中的辅助治疗。细菌溶解物制剂，是将流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、草绿色链球菌、卡他奈瑟菌这8种细菌经碱性蛋白酶水解后提取的细菌溶解产物，是一种免疫刺激剂，经口服给药可预防呼吸道的反复感染及慢性支气管炎急性发作。伤寒杆菌脂多糖制剂，由伤寒杆菌培养物经酶消化、提取而制得，用于慢性气管炎患者，对控制感冒发生和减轻病情均有一定疗效。金黄色葡萄球菌滤液制剂，是用从慢性骨髓炎患者脓液中分离得到的金黄色葡萄球菌菌株，经发酵培养后，除去菌体细胞得到的淡黄色澄明液体，是金葡菌胞外蛋白产物，其有效成分之一是肠毒素C，具有免疫调节作用，经肌内或腹腔注射可用于恶性肿瘤的辅助治疗。此外，还有人用灭活的禽结核杆菌作为免疫抗原，采用兔耳缘静脉注射法进行免疫，可以制备高效价血清(专利公开号：CN105504054A)。

以上均为有害菌或非益生菌及其成分或代谢产物制备的免疫调节剂，而关于将有益菌(即益生菌)作为免疫调节剂的研究越来越受到关注。益生菌是一类对宿主健康发挥有益作用的活性微生物的总称。其中益生菌当中的乳酸菌研究更加备受重视。乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌对于维护人和动物机体健康起着重要作用。目前大量研究证实口服活的乳酸菌可以提高机体免疫功能。还有人发现一些灭活的乳酸菌仍具有生物功能，如灭活乳酸菌的细胞对体外培养的人结肠腺癌细胞Caco-2细胞仍具有粘附性能和拌料饲喂促进动物生长等生理活性(专利公开号：CN104906143A)。此外，构成乳酸菌的菌体成分也具有一定的生理功能或药理作用，如经过高温高压得到的粪肠球菌细胞壁裂解物给小鼠腹腔注射可以增强巨噬细胞吞噬能力(专利公开号：CN101953855A)，还有人发现乳酸菌的基因组DNA(脱氧核糖核酸)可以通过改变Th1/Th2平衡抗人体过敏(专利公开号：US2014/0288159A1)，还有人报道，乳酸菌的细胞壁成分肽聚糖或完整肽聚糖口服、皮下注射或腹腔注射具有免疫调节、抗过敏或抗肿瘤的作用(参考文献[1]苏广伟，孙进，施用晖，乐国伟.乳酸杆菌肽聚糖对小鼠机体免疫功能的调节作用.中国生物工程杂志，2006，26(8)：98-102.参考文献[2]：谷超，王志锐，魏骏飞，宋立学，陈锦英.双歧杆菌细胞壁组分免疫调节作用的研究.天津医科大学学报，2004,10(2)：179-181.参考文献[3]：陈玉梅，程茜.双歧杆菌完整肽聚糖对食物过敏小鼠调节性T细胞影响的研究.中国微生态学杂志，2012，24(10)：865-867.参考文献[4]：宋娜娜，宋静慧.乳杆菌胞外多糖及肽聚糖抗肿瘤作用研究进展.内蒙古医学院学报，2012,34(6)：996-999.)。还有人用将能够表达细胞毒性蛋白的外源基因导入沙门氏菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌等，然后静脉注射依赖群体效应进行靶向肿瘤治疗(专利公开号：US2015/0225692A1)。

相对于有害菌作为免疫调节剂使用，有益菌更加安全。有害菌或其组成成分或其代谢产物一般具有对机体有害的毒性成分，或本身就是利用其毒性成分防治疾病，因此对机体具有潜在的安全风险，特别是通过静脉注射给药，不良反应会更加明显。而乳酸菌所含的毒性物质少或无，将灭活乳酸菌静脉给药对机体则安全得多。目前尚无将灭活乳酸菌静脉给药用于提高免疫功能的报道，我们大胆尝试进行了灭活乳酸菌静脉给药的药效研究，发现对机体具有强大的免疫增强作用，未来具有广阔的应用前景。

发明内容

一种增强免疫功能的注射剂，该注射剂的主要成分为灭活乳酸菌，对注射剂中的灭活乳酸菌进行革兰氏染色，在油镜下观察，灭活乳酸菌保持完整菌体形态。此处所述的保持完整菌体形态是指与灭活前活菌菌体的轮廓和形态基本一致。所说的基本一致实质上是指乳酸菌灭活过程中菌体细胞壁可能会出现轻微变化，比如部分表面成分的流失，但这种变化微乎其微或很少发生。

所述的注射剂每ml注射剂包含灭活乳酸菌完整菌体数量为10⁵—10¹²个。

进一步，乳酸菌的灭活方法选自高温灭活、高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种。

再进一步，所述的注射剂还包含药学上可接受的佐剂，佐剂中含有足够的盐或单糖以保证注射剂悬浮液与血液渗透压相同或相近。

用于本发明的制备灭活乳酸菌注射剂剂型包括：粉针剂、混悬注射剂等。所述的粉针剂通过喷雾干燥或冷冻干燥制成，应用时制成混悬液。

所述注射剂为静脉注射剂。

优选的，所述灭活乳酸菌为单一菌，对灭活乳酸菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察，灭活乳酸菌保持完整菌体形态，与其灭活前活菌菌体轮廓和形态一致，药物的给药方式为静脉注射给药。

进一步，所述灭活乳酸菌为两种以上灭活乳酸菌混合物，对灭活乳酸菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察，主要为保持完整菌体形态的灭活乳酸菌，药物的给药方式为静脉注射给药。利用高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种灭活方法得到所述灭活乳酸菌。

从所述灭活乳酸菌中提取DNA，通过基因测序或进行16S rDNA等目的片段的PCR扩增测序可鉴定出乳酸菌的种类。

进一步，所述的灭活乳酸菌从以下乳酸菌中选取经过灭活处理得到的：(1)乳杆菌属：德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳杆菌(L.helviticus)、嗜酸乳杆菌(L.acido phlus)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、发酵乳杆菌(L.fementi)等；(2)明串球菌属：肠膜明串球菌(L.mesenteroides)及其乳脂亚种(L.cremoris)和葡聚糖亚种(Leuc.dextranicun)、乳酸明串球菌(L.lactis)、酒明串球菌(L.oenos)等；(3)肠球菌属：屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)等；(4)乳球菌属：乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(L.lactissubsp.hordniae)等；(5)链球菌属：乳酸链球菌(S.lactis)、丁二酮乳酸链球菌(S.diacetilactis)、乳酪链球菌(S.creamoris)、嗜热乳链球菌(S.thermophilus)等；(6)双歧杆菌属：两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)等；(7)其他种属的乳酸菌。

优选的，乳酸菌选自乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactissubsp.Lactis，保藏编号：CICC 6246)、植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillusplantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)、长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC 6196)、短乳杆菌(拉丁名称：Lactobacillusbrevis，保藏编号：CICC 6239)、屎肠球菌(拉丁名称：Enterococcus faecium，保藏编号：CICC 6049)。

分别对以上5种乳酸菌进行常规方法灭活，然后对小鼠静脉给药，发现以上5种灭活乳酸菌静脉给药均可增强小鼠机体免疫功能。此后，选择了分离得到的屎肠球菌又进行了详细研究，发现灭活的屎肠球菌仍然可以进行革兰氏染色，油镜下观察灭活的屎肠球菌与活的屎肠球菌保持一致的菌体轮廓和形态。然后对灭活屎肠球菌生理盐水混悬液进行离心，弃上清留沉淀，提取DNA，采用PCR技术仍可以扩增出16S rDNA基因片段，通过测序还可以进行乳酸菌种类鉴别。

所述的静脉注射剂还可以包括佐剂，可以选自辛苯氧基聚乙氧乙醇、四丁酚醛、山梨醇酐聚乙二醇单油酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯衍生物、吐温-80、聚烷基苯磺酸钠、月桂基硫酸酯钠、多糖硫酸酯碱金属盐、葡聚糖硫酸酯钠、磺基琥珀酸双辛酯、金合欢胶、阿拉伯乳胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅酸乙酯、乙醇、甘油、山梨醇、蜂蜜、琼脂、淀粉、右旋糖、果糖、麦芽浸膏、可可粉、酒石酸、枸橼酸、枸橼酸钠、角叉酸、海藻酸、海藻酸钠、鞣酸、环己烷氨基磺酸、矿物油、优卡林、糖精钠、印度树胶、刺梧桐树胶、西黄蓍胶、果胶、鹿角菜胶、明胶、羧甲基纤维素、硫酸纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、醋酸硫酸纤维素钠、羟乙基纤维素钠、甲基聚硅、山梨酸钾、高岭土、硅藻土、膨润土、硅酸铝、氢氧化铝、胶体氢氧化铝、硅酸镁铝、蒙脱土镁、三聚硅酸镁、硅酸铝镁钠、碳酸氢钠、碳酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、乙基香草醛、柠檬油、橙皮油、香草醛、干酪素等。

进一步研究发现，将灭活屎肠球菌静脉给药，可以有效地提高正常小鼠和免疫功能低下小鼠模型的非特异性免疫功能和特异性免疫功能，还能够增加机体免疫器官的重量。

本发明所述的灭活乳酸菌静脉注射剂可用于人或动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、真菌性疾病、寄生虫病、癌症以及各种原因引起的机体免疫功能低下等多种疾病的预防、治疗或辅助治疗。

此前没有人尝试用灭活乳酸菌静脉给药用于提高机体免疫功能方面的研究，主要考虑灭活乳酸菌静脉给药存在安全性问题，与日常使用的水溶性静脉注射剂相比较，灭活乳酸菌静脉注射剂呈颗粒性混悬液，将这样的颗粒性物质进行静脉给药，风险较高。有研究认为将有害菌的菌体及其成分静脉给药能够“以毒攻毒”治疗疾病，而有益菌则难有这方面作用，而本发明经过长期的研究发现，灭活乳酸菌静脉给药对机体具有强大的免疫增强作用，可以发挥“增免攻毒”的作用。

以往一些研究报道，乳酸菌的表面成分，如脂磷壁酸(LTA)、细胞壁肽聚糖(PG)、细胞表面蛋白(S-protein)以及一些未知的表面提取物，可以作为配体被Toll样受体识别后激活免疫信号通路，从而增强机体免疫功能(参考文献[5]：章文明，汪海峰，刘建新.乳酸杆菌益生作用机制的研究进展.动物营养学报，2012，24(3)：389-396.)。特别是乳酸菌的表面物质肽聚糖是乳酸菌细胞壁的必需成分，也是赋予乳酸菌作用于Toll样受体激活免疫系统是重要物质(参考文献[6]：刘朝，乔建军，朱宏吉.乳酸菌肽聚糖的研究进展.微生物学通报，2016，43(1)：188-197.)。本发明没有从乳酸菌上提取以上所述的表面成分，而是直接将乳酸菌按常规方法灭活后，进行静脉给药就可以提高机体免疫功能，而且发现灭活后的乳酸菌与灭活前活的乳酸菌保持一致的菌体轮廓和形态，还证实了不同乳酸菌属的具有代表性的菌株(如乳酸乳球菌乳酸亚种、植物乳杆菌植物亚种、长双歧杆菌、短乳杆菌、屎肠球菌)灭活后静脉注射都可以提高机体免疫功能，这说明灭活乳酸菌静脉给药激活免疫系统具有普遍性。

据分析，乳酸菌虽然被灭活，但其完整菌体轮廓上的表面成分仍然可以被免疫细胞上Toll样受体识别，从而激活免疫系统。这样，灭活乳酸菌静脉给药作为免疫增强剂的优势在于：不需要提取乳酸菌表面成分来调节免疫功能，而是直接灭活即可，所以方法简单；而且灭活乳酸菌可以随着血液流动进入胸腺、脾脏和淋巴结等免疫器官，直接作用于免疫细胞上Toll样受体，所以其免疫激活作用更加强大、快速。

附图说明

图1活的屎肠球菌革兰氏染色油镜观察照片

图2灭活屎肠球菌革兰氏染色油镜观察照片

图3 PCR扩增屎肠球菌16S rDNA电泳照片，其中，M为Marker；1、2和3为三次重复PCR扩增灭活屎肠球菌16S rDNA的条带。

具体实施方式

实施例1

将屎肠球菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,拉丁名称：Enterococcusfaecium，保藏编号：CICC 6049)接种于MRS培养基，于37℃温箱培养24小时，然后3000转离心5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心5分钟，重复清洗3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成混悬液。取一定量的屎肠球菌生理盐水混悬液，于分光光度计690nm处测量其OD值，当用无菌生理盐水稀释的最终浓度的OD值为0.38时，将这样稀释浓度的屎肠球菌生理盐混悬液作为1倍(1×)浓度，经过THOMA细菌计数板进行细菌计数可得到该浓度条件下，每ml混悬液含有约10⁸个屎肠球菌完整菌体。取少量的1×浓度的屎肠球菌生理盐水混悬液，进行革兰氏染色，在油镜下观察活菌的形态(参见附图1)。将配制好的1×浓度的屎肠球菌生理盐水混悬液于121℃、压力0.12MPa，灭活15min，得到灭活屎肠球菌注射剂，取少量灭活屎肠球菌注射剂进行革兰氏染色，在油镜下观察灭活菌体的形态(参见附图2)。对比发现，灭活菌与活菌保持一致的菌体轮廓和形态,细菌计数发现灭活前后菌体数量未发生明显变化。对灭活屎肠球菌生理盐水混悬液进行离心，弃上清留沉淀，提取DNA，采用PCR扩增16S rDNA，进行琼脂糖凝胶电泳(参见附图3)，通过测序还可以进行乳酸菌种类鉴别。

实施例2

将屎肠球菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心,拉丁名称：Enterococcusfaecium，保藏编号：CICC 6049)接种于MRS培养基，于37℃温箱培养24小时，然后3000转离心5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入0.9％无菌生理盐清洗沉淀，离心5分钟，重复清洗3次后，加入适量0.9％无菌生理盐水，与沉淀混匀。取一定量的乳酸菌混悬液，于分光光度计690nm处测量其OD值，当用灭菌生理盐水稀释的最终浓度的OD值为0.38时，将这样稀释浓度的乳酸菌混悬液作为1倍(1×)浓度。以此为依据，对含有乳酸菌生理盐水进行不同倍数的生理盐水稀释，便可以得到5×、1×和0.2×浓度的乳酸菌混悬液。此后分别将配制好的5×、1×和0.2×浓度的屎肠球菌混悬液于121℃、压力0.12MPa，灭活15min，得到5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液药品。采用碳粒廓清试验方法检测灭活屎肠球菌静脉注射剂对正常小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、胸腺五肽组(阳性药物对照组)和高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组。每组10只小鼠，雌雄各半。正常对照组小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，胸腺五肽组静脉注射剂量为0.2mg/kg的胸腺五肽，高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组分别静脉注射5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液。以上各组给药体积均为0.1mL/10g，连续尾静脉注射5天，每天1次。第5天给药2小时后，小鼠尾静脉注射印度墨汁0.05mL/10g，于1min和10min分别从眼眶静脉丛采血40μL，加到4mL 0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀，用分光光度计在680nm波长下比色，测定光密度(以下分别用OD₁和OD₁₀来表示1min和10min所取血样的光密度)，按下式计算碳廓清指数K值。碳廓清指数K＝(lgOD₁-lgOD₁₀)/(t₁₀-t₁)。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表1。由表1可知，与正常对照组相比较，高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组均极显著提高了碳廓清指数K值；而且与阳性药物胸腺五肽组相比较，高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组仍极显著地提高了碳廓清指数K值。以上说明，灭活屎肠球菌静脉给药可以提高正常小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能，即提高了小鼠的非特异性免疫功能。

表1灭活屎肠球菌静脉给药对正常小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照组比较差异显著P＜0.05；△△表示与胸腺五肽组比较差异极显著P＜0.01，△表示与胸腺五肽组比较差异显著P＜0.05。

实施例3

使用实施例2制备的5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，采用碳粒廓清试验方法检测灭活屎肠球菌混悬液静脉注射对免疫抑制小鼠模型单核-巨噬细胞吞噬功能的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、免疫抑制模型组、胸腺五肽组和高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组。每组10只小鼠，雌雄各半。采用剂量为40mg/kg的地塞米松对小鼠进行腹腔注射给药，每天1次，连续5天，制备小鼠免疫抑制模型。小鼠免疫抑制模型制备完成当天，正常对照组和免疫抑制模型组小鼠尾静脉注射生理盐水，胸腺五肽组尾静脉注射剂量为0.2mg/kg的胸腺五肽，高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组分别尾静脉注射5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液。以上各组给药体积均为0.1mL/10g。各组小鼠连续给药5天，每天1次。最后一次给药后间隔2小时，小鼠尾静脉注射印度墨汁0.05mL/10g，于1min和10min分别从眼眶静脉丛采血40μL，加到4mL 0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀，用分光光度计在680nm波长下比色，测定光密度(以下分别用OD₁和OD₁₀来表示1min和10min所取血样的光密度)，按下式计算碳廓清指数K值。碳廓清指数K＝(lgOD₁-lgOD₁₀)/(t₁₀-t₁)。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表2。由表2可知，免疫抑制模型组与正常对照组比较，碳廓清指数K值极显著降低，说明免疫抑制小鼠模型制备成功；高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组与免疫抑制模型组比较，均极显著或显著地提高了碳廓清指数K值；高剂量灭活屎肠球菌组与胸腺五肽组比较，仍显著地提高了碳廓清指数K值。以上说明，灭活屎肠球菌混悬液静脉给药可以提高免疫抑制小鼠模型的单核-巨噬细胞吞噬功能，即提高了免疫抑制小鼠模型的非特异性免疫功能。

表2灭活屎肠球菌静脉给药对免疫抑制小鼠模型单核-巨噬细胞吞噬功能的影响结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照组比较差异显著P＜0.05；△△表示与免疫抑制模型组比较差异极显著P＜0.01，△表示与免疫抑制模型组比较差异显著P＜0.05；﹟表示与胸腺五肽组比较差异显著P＜0.05。

实施例4

使用实施例2制备的1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，测定灭活屎肠球菌混悬液静脉注射对正常小鼠特异性免疫功能的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为对照组(即正常小鼠新城疫攻毒组)和灭活屎肠球菌给药组，每组10只小鼠，雌雄各半。对照组小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，灭活屎肠球菌给药组小鼠尾静脉注射1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，各组小鼠给药体积均为0.1mL/10g。给药1次后，间隔24小时，将新城疫病毒给小鼠尾静脉注射，此后间隔3天小鼠眼球静脉丛采血，通过血凝和血凝抑制试验检测新城疫抗体水平。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表3。由表可知，灭活屎肠球菌给药组与对照组比较，显著地提高了新城疫抗体水平，说明灭活屎肠球菌静脉给药能提高正常小鼠新城疫抗体水平，即提高正常小鼠特异性免疫功能。

表3灭活屎肠球菌静脉给药对正常小鼠新城疫病毒抗体水平影响结果

注：**表示与对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与对照组比较差异显著P＜0.05。

实施例5

使用实施例2制备的1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，测定灭活屎肠球菌混悬液静脉注射对免疫抑制小鼠模型特异性免疫功能的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为对照组(即正常小鼠新城疫攻毒组)、免疫抑制模型组，灭活屎肠球菌给药组，每组16只小鼠，雌雄各半。采用剂量为80mg/kg的地塞米松对小鼠进行腹腔注射给药，每天1次，连续3天，制备小鼠免疫抑制模型。小鼠免疫抑制模型制备完成当天，灭活屎肠球菌给药组的模型小鼠尾静脉注射1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液；对照组和免疫抑制模型组小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，给药体积均为0.1mL/10g。在给药后间隔24小时各组小鼠尾静脉均注射等量的新城疫病毒，此后间隔3天小鼠眼球静脉丛采血，通过血凝和血凝抑制试验检测新城疫抗体水平。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表4。由表4可知，免疫抑制模型组与对照组比较，新城疫抗体效价显著降低；灭活屎肠球菌给药组与免疫抑制模型组比较，显著地提高了新城疫抗体水平，而且灭活屎肠球菌给药组与对照组比较无显著性差异，以上说明灭活屎肠球菌给药组的小鼠新城疫抗体恢复到了正常水平，即灭活屎肠球菌静脉给药可以提高免疫功能低下小鼠机体的特异性免疫功能。

表4灭活屎肠球菌静脉给药对免疫抑制小鼠模型新城疫病毒抗体水平影响结果

注：**表示与对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与对照组比较差异显著P＜0.05；△△表示与免疫抑制模型组比较差异极显著P＜0.01，△表示与免疫抑制模型组比较差异显著P＜0.05。

实施例6

使用实施例2制备的5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，检测灭活屎肠球菌混悬液静脉注射对正常小鼠免疫器官指数的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、胸腺五肽组(阳性药物对照组)和高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组。每组10只小鼠，雌雄各半。正常对照组小鼠尾静脉注射生理盐水，胸腺五肽组尾静脉注射剂量为0.2mg/kg的胸腺五肽，高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组分别尾静脉注射5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，以上各组给药体积均为0.1mL/10g。各组小鼠连续尾静脉注射给药5天，每天1次，最后一次给药2小时后测定小鼠脾指数。脾指数＝脾脏重量/小鼠体重。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表5。由表5可知，高剂量的灭活屎肠球菌组与正常对照组相比较，极显著的增加了脾指数；中、低剂量的屎肠球菌组与正常对照组相比较，脾指数无显著差异。高剂量的灭活屎肠球菌组与胸腺五肽组相比较，也极显著的增加了脾指数。以上说明，灭活屎肠球菌静脉给药能够促进正常小鼠免疫器官指数增加。脾指数是衡量药物对免疫功能影响的一个重要指标，脾指数增加说明脾脏相对于机体的重量增大，是药物作用免疫器官的结果，是免疫功能增强的表现。

表5灭活屎肠球菌静脉给药对正常小鼠脾指数影响结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照组比较差异显著P＜0.05；△△表示与胸腺五肽组比较差异极显著P＜0.01，△表示与胸腺五肽组比较差异显著P＜0.05。

实施例7

使用实施例2制备的5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，检测灭活屎肠球菌混悬液静脉注射对免疫抑制小鼠模型免疫器官指数的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、免疫抑制模型组、胸腺五肽组和高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌组。每组10只小鼠，雌雄各半。采用剂量为40mg/kg的地塞米松对小鼠进行腹腔注射给药，每天1次，连续5天，制备小鼠免疫抑制模型。小鼠免疫抑制模型制备完成当天，正常对照组和免疫抑制模型组的小鼠尾静脉注射生理盐水，胸腺五肽组尾静脉注射0.2mg/kg的胸腺五肽，高、中、低三个剂量的屎肠球菌给药组分别注射5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液。此后各组连续静脉注射给药5天，每天1次。最后一次给药后测定小鼠脾指数。脾指数＝脾脏重量/小鼠体重。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表6。由表6可知，与正常对照组相比较，模型组脾指数极显著降低；高剂量给药组与模型组相比较，极显著地增加了脾指数，而且高剂量给药组与正常对照组相比较无显著性差异。说明高剂量的灭活屎肠球菌可以提高免疫抑制模型小鼠的脾指数，而且能够恢复到正常水平。

表6灭活屎肠球菌静脉给药对免疫抑制小鼠模型脾指数影响结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照组比较差异显著P＜0.05；△△表示与免疫抑制模型组比较差异极显著P＜0.01，△表示与免疫抑制模型组比较差异显著P＜0.05；﹟﹟表示与胸腺五肽组比较差异极显著P＜0.01。

实施例8

本发明从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买了5种乳酸菌，分别是：乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactis subsp.Lactis，保藏编号：CICC6246)、植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)、长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC6196)、短乳杆菌(拉丁名称：Lactobacillus brevis，保藏编号：CICC 6239)、屎肠球菌(拉丁名称：Enterococcus faecium，保藏编号：CICC 6049)。根据实施例2的方法分别制备上述5种乳酸菌的5×浓度的灭活乳酸菌静脉注射剂，采用碳粒廓清试验方法检测5种灭活乳酸菌及混合物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、灭活乳酸乳球菌乳酸亚种组、灭活植物乳杆菌植物亚种组、灭活长双歧杆菌组、灭活屎肠球菌组、灭活短乳杆菌组和2种灭活乳酸菌混合组(即灭活屎肠球菌和灭活短乳杆菌等比例混合组)。每组10只小鼠，雌雄各半。正常对照组小鼠尾静脉注射生理盐水，5种不同的灭活乳酸菌组及2种灭活乳酸菌混合组分别尾静脉注射相应药物。以上各组给药体积均为0.1mL/10g，连续尾静脉注射5天，每天1次。第5天给药2小时后，小鼠尾静脉注射印度墨汁0.05mL/10g，于1min和10min分别从眼眶静脉采血40μL，加到4mL 0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀，用分光光度计在680nm波长下比色，测定光密度(以下分别用OD₁和OD₁₀来表示1min和10min所取血样的光密度)，按下式计算碳廓清指数K值。碳廓清指数K＝(lgOD₁-lgOD₁₀)/(t₁₀-t₁)。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表7。由表7可知，5种不同的灭活乳酸菌组和2种灭活乳酸菌混合组与正常对照组比较，均显著或极显著地提高了小鼠单核-巨噬细胞的吞噬功能。这说明不同灭活乳酸菌及混合物静脉给药均可以提高小鼠的非特异性免疫功能。

表7五种灭活乳酸菌及混合物静脉给药对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照组比较差异显著P＜0.05。

实施例9

根据免疫学理论，免疫功能增强有利于机体清除病原体避免感染。使用实施例2制备的1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液作为静脉注射剂，检测灭活屎肠球菌静脉注射剂对沙门氏菌感染小鼠的防治作用。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为3组，即正常对照组、沙门氏菌组和灭活屎肠球菌组，每组30只小鼠，雌雄各半。正常对照组和沙门氏菌组的小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，灭活屎肠球菌组尾静脉注射1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，给药体积均为0.1mL/10g。给药后间隔24小时，沙门氏菌组和灭活屎肠球菌组的小鼠分别尾静脉注射肠炎沙门氏菌(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，拉丁名称:Salmonella enteritidis,编号CVCC 3377)。连续观察7天，记录小鼠每天的死亡数。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行卡方检验，结果见表8。由表8可知，与沙门氏菌对照组比较，灭活屎肠球菌组极显著地降低了小鼠的死亡数。说明灭活屎肠球菌静脉给药对沙门氏菌感染小鼠具有防治作用。

表8灭活屎肠球菌静脉给药防治沙门氏菌对小鼠致死作用的结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照常组比较差异显著P＜0.05；△△表示与沙门氏菌组比较差异极显著P＜0.01，△表示与沙门氏菌组比较差异显著P＜0.05。

实施例10

使用实施例2制备的5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，检测灭活屎肠球菌静脉注射剂对流感病毒PR8株感染小鼠死亡数的影响。实验选用18-22g清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、PR8株模型组(即流感病毒PR8株感染小鼠模型组)和高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌给药组。每组30只小鼠，雌雄各半。高、中、低三个剂量的灭活乳酸菌组分别尾静脉注射5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液；正常对照组和PR8株模型组尾静脉注射无菌生理盐水，各组给药体积均为0.1mL/10g。各组小鼠于给药1次后间隔24小时，除正常对照组外，其他各组小鼠在乙醚轻度麻醉下于鼻腔内接种含流感病毒PR8株的鸡胚尿囊液，每只0.05mL，使流感病毒PR8株感染小鼠。此后观察记录10天内各组小鼠死亡数。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行卡方检验，结果见表9。由表9可知，高、中剂量的灭活屎肠球菌给药组与PR8株模型组比较，均可以极显著降低了小鼠死亡数，而低剂量给药组与PR8株模型组比较，可以显著降低小鼠死亡数。以上说明灭活屎肠球菌静脉给药可以用于病毒性疾病防治。

表9灭活屎肠球菌静脉给药对流感病毒PR8株感染小鼠的影响结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照常组比较差异显著P＜0.05；△△表示与PR8株模型组比较差异极显著P＜0.01，△表示与PR8株模型组比较差异显著P＜0.05。

实施例11

使用实施例2制备的5×、1×和0.2×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，检测灭活屎肠球菌混悬液静脉给药对腹水瘤小鼠体重及脾指数的影响。将重为18-22g的ICR小鼠分为5组，即腹水瘤模型组、胸腺五肽组和高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌给药组，每组10只腹水瘤模型小鼠。腹水瘤模型组小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，胸腺五肽组尾静脉注射0.2mg/kg剂量的胸腺五肽，高、中、低三个剂量的灭活屎肠球菌给药组分别尾静脉注射5×、1×和0.2×的灭活屎肠球菌静脉注射剂，给药体积均为0.1mL/10g。制备EAC艾氏腹水瘤小鼠模型前一天给药1次，即给药后间隔24小时，小鼠腹腔接种艾氏腹水瘤细胞悬液，制备EAC艾氏腹水瘤小鼠模型。此后再连续给药7天，测定腹水瘤小鼠的体增重及脾指数，脾指数＝脾脏重量/小鼠体重。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行显著性检验，结果见表10。由表10可知，与腹水瘤模型组相比较，高剂量灭活屎肠球菌给药组显著地降低了腹水瘤小鼠的体增重。EAC艾氏腹水瘤小鼠模型由于腹水的形成，荷瘤小鼠的体重增长迅速，而本研究发现高剂量的灭活屎肠球菌尾静脉给药可减缓荷瘤小鼠体重的增长速度，与抑制腹水生成有关。此外，高剂量和中剂量两个灭活屎肠球菌给药组的腹水瘤小鼠的脾指数比腹水瘤模型组分别极显著和显著地增加。由此说明，灭活屎肠球菌静脉给药还可以增强腹水瘤小鼠的免疫功能。

表10灭活屎肠球菌静脉给药对腹水瘤小鼠体增重及脾指数的影响结果

注：**表示与腹水瘤模型组比较差异极显著P＜0.01，*表示与腹水瘤模型组比较差异显著P＜0.05；△△表示与胸腺五肽组比较差异极显著P＜0.01，△表示与胸腺五肽组比较差异显著P＜0.05。

Claims (10)

1.一种增强免疫功能的注射剂，该注射剂的主要成分为灭活乳酸菌，对所述的灭活乳酸菌进行革兰氏染色，在油镜下观察，灭活乳酸菌保持完整菌体形态。

2.如权利要求1所述的注射剂，其特征在于，每ml注射剂包含灭活乳酸菌完整菌体数量为10⁵—10¹²个。

3.如权利要求1所述的注射剂，其特征在于，所述的乳酸菌选自乳杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、明串球菌属、链球菌属。

4.如权利要求1或2所述的注射剂，其特征在于，所述乳酸菌选自乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactis subsp.Lactis，保藏编号：CICC 6246)、植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)、长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC 6196)、短乳杆菌(拉丁名称：Lactobacillus brevis，保藏编号：CICC 6239)、屎肠球菌(拉丁名称：Enterococcusfaecium，保藏编号：CICC 6049)的一种或两种以上。

5.根据权利要求1或2所述的注射剂，其特征在于，灭活方法选自高温灭活、高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种。

6.根据权利要求1或2所述的注射剂，其特征在于，所述的注射剂还包含药学上可接受的佐剂，佐剂中含有足够的盐或单糖以保证注射剂悬浮液与血液渗透压相同或相近。

7.根据权利要求1或2所述的注射剂，其特征在于，所述的注射剂通过喷雾干燥或冷冻干燥制作成粉针剂，应用时配制成混悬液。

8.根据权利要求1-7任一项所述的注射剂，其特征在于，所述注射剂为静脉注射剂。

9.根据权利要求1-8任一项所述的注射剂，其特征在于，按照以下方法制备得到所述注射剂：将乳酸菌进行常规液体培养基培养12-36小时后，3000-5000转离心保留沉淀，再将沉淀充分清洗后，配制成所需浓度混悬液，于120-122℃、压力0.1-0.2MPa，灭活15-30min得到灭活乳酸菌注射剂。

10.如权利要求1-9所述的注射剂在制备增强免疫功能的药物中的用途。