CN1602199B

CN1602199B - 用于治疗包含免疫失调的疾病的革兰氏阳性菌制剂

Info

Publication number: CN1602199B
Application number: CN028247337A
Authority: CN
Inventors: 玛丽-安妮·拿获里; 米舍利娜·拉格朗迪; 吉勒·马沙尔; 贝尔纳多·鲍里斯·瓦尔加夫季格; 让·勒福尔; 费利克斯·罗曼; 乔治·海基梅因; 菲利普·佩尔特
Original assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2002-12-11
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2022-12-11
Also published as: AU2002356387C1; EP2316466A3; SI1461054T1; KR20110028558A; EP1461054A2; US20100272756A1; US20060062807A1; CN1602199A; EP2316466B1; CA2469334A1; US20070190076A1; JP4737586B2; US7871627B2; EP1461054B1; NZ533422A; US8404250B2; DE60236318D1; DK2316466T3; BR0214902A; AU2002356387B2

Abstract

本发明涉及包含自革兰氏阳性菌、如革兰氏阳性兼性胞内菌例如分枝杆菌制备的成分的组合物，所述组合物包括深度冻干灭活的革兰氏阳性菌，涉及其制备方法以及其在预防和/或治疗人类和动物的包含免疫失调的疾病如癌症、自身免疫病、过敏症和结核病中的用途。

Description

用于治疗包含免疫失调的疾病的革兰氏阳性菌制剂

技术领域

本发明涉及包含由革兰氏阳性菌(如革兰氏阳性兼性胞内菌，例如分枝杆菌)制备的成分的组合物，所述的组合物用于治疗人和动物的包含免疫失调的疾病。本发明还涉及所述成分和组合物的制剂。

背景技术

包含免疫失调(如Th1-Th2失衡)的疾病包括各种癌症、自身免疫病(如多发性硬化、类风湿性关节炎、克隆氏病(Crohn disease)和糖尿病)、和过敏性疾病(如哮喘、过敏性鼻炎、结膜炎和特应性皮炎)。

例如：

过敏性哮喘是一种常见疾病，其涉及过敏原诱导的气道炎症；T淋巴细胞到达呼吸道并与吸入的过敏原反应而激活，其结果是炎症性白细胞、嗜酸细胞以及有时中性粒细胞被募集至气道中。通过产生Th2型细胞因子，CD4+T淋巴细胞在过敏性气道炎症的起始过程中发挥重要作用，Th2型细胞因子促使嗜酸细胞在气道中募集并可能随后使之激活。有人认为Th2和Th1效应细胞之间的不平衡导致了哮喘的发生。

因此，有人建议刺激肺部的Th1免疫应答，例如通过IFN-γ雾化吸入或通过施用分枝杆菌疫苗；在小鼠中，这种刺激似乎可抑制继发性免疫过程的进展。

更具体地，外源性哮喘或特应性哮喘(例如职业性及药物诱发性)与Th2型免疫应答的增强相关，伴随产生特异性免疫球蛋白E(IgE)、常见的空气过敏原(aeroallergen)皮肤试验呈阳性、和/或特应性症状。外源性哮喘中的气道阻塞涉及由气道炎症引起的非特异性支气管高反应性(bronchial hyperresponsiveness，BHR)。这种炎症是由包括肥大细胞、嗜酸细胞和淋巴细胞在内的多种炎症细胞所释放的化学物质所介导的。这些介质的作用引起血管通透、粘膜分泌以及支气管平滑肌收缩。在特应性哮喘中，引起气道炎症的免疫应答由分泌IL-4和IL-5的Th2型T细胞引起。内源性或隐原性哮喘发生于上呼吸道感染后，但可新发于中年或老年人群，这些病人的哮喘较外源性哮喘更难治疗。

因此，过敏性疾病由分泌T辅助2(Th2)细胞因子、IL-4、IL-5和IL-13的T淋巴细胞介导，其产生高水平的血清IgE以及嗜酸细胞募集。不过，Th1细胞也参与了这些病理过程；例如，Th1细胞见于慢性特应性皮肤病。这种Th1-Th2失衡也见于其他疾病如一些癌症特别是膀胱癌，或见于自身免疫病。

流行病学研究，例如Shirakawa等(科学，1997，275，3)的研究，发现在结核菌素应答与特应性疾病之间存在负相关。这些结果提示既往针对某些活的革兰氏阳性菌如革兰氏阳性兼性胞内菌，例如分枝杆菌如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)或BCG进行的免疫接种可以产生对特应性疾病的保护作用。

一种治疗方案是通过诱导针对有关的免疫原或抗原的T辅助1(Th1)应答而下调Th2成分，这是因为Th1和Th2细胞因子被认为是相互拮抗的。

不同来源的实验结果均显示，以包括分枝杆菌和利斯特氏菌在内的已知能够诱导强Th1免疫应答的胞内菌对成年小鼠进行免疫接种，可以抗衡(counterbalance)免疫原或抗原诱导的Th2应答；例如在过敏反应中，其可诱导嗜酸细胞增多症及相关的BHR。

这就是有人认为某些分枝杆菌可用于治疗过敏性疾病且特别是哮喘的原因。

就这方面而言，已经测试了各种不同的包括分枝杆菌的组合物：

-活BCG疫苗被认为在实验性哮喘等中具有潜在的作用，特别是在经鼻给药的情况下(KJ.Erb等，实验医学杂志，1998，187，561-569；MA.Nahori等，疫苗，2001，19，1484-1495)。不过，尽管活BCG疫苗可用于预防结核病(JB Milstein等，WHO Bull.OMS，1990，68，93-108)，但其存在一些缺点：首先，由于其残存的毒力，其不能用于免疫抑制的对象(immunodeficient subject)；其次，皮内接种BCG疫苗引起局部的反应与所用的细菌总量成正比，且可引起局部溃疡，或在意外注射到皮下的情况下可引起更严重的反应(脓肿)。因此，特别是采用鼻内施用或气雾剂途径时，这种疫苗可能不适合在相当长的一段时间内反复施用以用于对呼吸道过敏性疾病或其他涉及Th1-Th2失衡的疾病进行免疫治疗。鼻内施用或通过气雾剂施用可能会产生活BCG疫苗在肺部引起的无法接受的不良反应；

-分枝杆菌热灭活制剂：

.BCG或结核分枝杆菌的热灭活制剂在用作疫苗时不具有全身性保护作用(R.Janssen等，免疫学，2001，102，4，441-449；MA Skinner等，免疫学，2001，102，2，225-233；GA Rook等，Novartis Found Symposium，1998，217，73-87和87-98)。此外，该制剂诱导的针对BCG纯化蛋白衍生物(PPD)的迟发型过敏反应可干扰对结核病的真的。不过，必须注意到，一些研究者认为，在新生儿时期单独以热灭活的牛分枝杆菌进行预接种或在母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)基础上以热灭活的牛分枝杆菌进行预接种，有可能有助于下调IgE应答(F.Tukenmez等，Pediatr.Allergy Immunol.，1999，10，2，107-111；F.Tukenmez等，J.哮喘，2000，37，4，329-334；Nahori等，见前)；

.母牛分枝杆菌的热灭活制剂(CC Wang等，免疫学，1998，93，3，307-313；WO 00/74715)已经用于临床对过敏症的免疫治疗。一些研究结果证实了热灭活的分枝杆菌作为Th1佐剂的效力，且显示重组分枝杆菌在抗原特异性免疫调制中的潜在用途(R.Janssen等，免疫学，2001，102，4，441-449；MA Skinner等，免疫学，2001，102，2，225-233；CC Wang等，免疫学，1998，93，3，307-313；WO 00/74715)。尽管所述的制剂在免疫治疗中具有活性，它们出现了与BCG或结核分枝杆菌的热灭活制剂相同的一些缺点，这也妨碍了其在免疫治疗这的应用。

实际上，所有的分枝杆菌热灭活制剂：

-通过肺泡巨噬细胞诱导产生TNF-α，其作为一种毒性和坏死物质，妨碍了此类热灭活制剂在免疫治疗中的应用，并且

-诱导局部不良反应(PM Shirtcliffe等，Am.J.Respir.Crit.CareMed.，2001，163，1410-1414)，例如临床试验中所见的发痒水疱、硬结和坏死伴持久疤痕。

因此，目前仍缺乏有效的来自革兰氏阳性菌如革兰氏阳性兼性胞内菌、例如分枝杆菌的组合物，以用于治疗包含免疫失调(如Th1-Th2失衡)的疾病，例如过敏性疾病，所述的组合物具有良好的耐受性且不具有上述的缺点。

此外，对于该组合物，必须能够鉴定出其制剂中的活性成分。而对通过在120℃加热处理10至30分钟的热灭活制剂而言，是不可能鉴定其热不稳定成分的。

发明内容

因此本发明的一个目的是提供一种新的灭活的革兰氏阳性菌制剂，如灭活的革兰氏阳性兼性胞内菌制剂，例如一种灭活的分枝杆菌制剂，以及含有所述制剂的组合物，其可用于治疗包含免疫失调(如Th1-Th2失衡)的疾病，例如癌症、自身免疫病和过敏性疾病，而无严重的不良反应。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述的灭活的革兰氏阳性菌制剂的方法，所述的制剂除了能够治疗包括免疫失调的疾病以外，还保持了来自所述细菌的分子的结构，以便能够鉴别来自这些细菌细胞的活性分子。

令人惊讶的是，本发明人发现，革兰氏阳性菌如革兰氏阳性兼性胞内菌，例如分枝杆菌，经不引起来自这些细菌细胞的分子发生变性的“温和方法”灭活后，在将其施用于患有哮喘或其他免疫失调的对象后，能够在体内刺激白细胞调节细胞(CD4+CD25+T细胞和/或B细胞和/或树突状细胞)。对这些调节细胞的刺激改变了患有哮喘的对象的免疫反应性，使其具有长时期的(数周)局部的和全身的作用；由此，经此类灭活的革兰氏阳性胞内菌制剂治疗的过敏对象可在长时期内不发作哮喘。

本发明人还发现，这些保持来自所述细菌细胞的分子结构的灭活的细菌制剂不会引起例如炎症、贫血、血小板减少和诱导产生TNF-α等不良反应。

本发明涉及一种细菌制剂，其特征在于：

-其含有通过不引起来自这些细菌细胞的分子的结构发生变性的方法而得到的灭活的革兰氏阳性菌，和

-其能够在体内诱导调制(modulation)针对一种抗原的免疫应答(免疫调制制剂(immunomodulatory preparation))。

免疫调制制剂是指在诱导针对任何抗原(自身抗原或外来抗原)的免疫应答之前或之后，能够改变免疫调节细胞和免疫辅助细胞之间的比例的制剂。免疫调节细胞包括白细胞调节细胞如CD4+CD25+T细胞和/或B细胞和/或树突状细胞。例如，对CD4+CD25+T细胞的描述见于Schevach等，Nat.Rev.Immunol.，2002，2，389-400。

根据所述的细菌制剂的一个优选的实施方式，其含有灭活的革兰氏阳性兼性胞内菌。

革兰氏阳性兼性胞内菌是指能够在体外生长于合成培养基中、同时也能在体内感染来自哺乳动物或非哺乳动物宿主的真核细胞且能够在这些细胞(例如巨噬细胞)中增殖的革兰氏阳性菌。

根据所述的细菌制剂的一个优选的实施方式，其含有选自利斯特氏菌(Listeria sp.)，棒杆菌(Corynobacterium sp.)，或包含分枝杆菌、诺卡氏菌(Nocardia sp.)和红球菌(Rhodococcus sp.)的放线菌类(Actinomycetes)的灭活的革兰氏阳性兼性胞内菌。

优选地，所述细菌制剂含有牛分枝杆菌，更优选地含有牛分枝杆菌BCG。

不引起来自所述细菌细胞的分子结构发生变性的方法是指不会引起所述分子的空间构型发生广泛变性的方法；优选地，该方法可保持来自所述细菌细胞的大分子(例如蛋白质、多糖和脂质)的三维结构。

这些称为“温和方法”的方法包括但不限于用物理方法破坏细菌的细胞膜而保持其大分子成分的结构。这些方法包括但不限于：深度冻干(extended freeze-drying)、在存在二氧化硅或锆珠的条件下研磨、使用所谓的“细胞均质机(French press)”、超声波裂解和γ-射线照射。其他可用来获得如上所述的灭活的细菌制剂的方法是本领域人员熟知的。

-例如，深度冻干灭活的细菌制剂是指所述制剂中的水分基本上被完全除去；因此，所述深度冻干灭活的细菌制剂含有少于1.5％的残留水分，优选地少于1％，且更优选地少于0.5％。不过，在非最佳的冻干条件下，当冻干的细菌制剂含有较多的残留水分(大约10％)，即尚未灭活所有的增加时，可转而通过将所述制剂与空气(大气压)接触而灭活残留的活细菌；此类制剂具有与上述深度冻干灭活的细菌制剂相同的特性和活性。深度冻干灭活的细菌制剂中残留的水分可通过Karl Fisher的库仑方法(coulometric method)进行即时的测定。

可通过任何本领域熟知的方法来验证来自本发明的灭活的革兰氏阳性菌制剂的分子未发生变性。例如，可根据Laemmli，自然，1970，277，680，通过对灭活的革兰氏阳性菌制剂提取物在变性和非变性条件下进行凝胶电泳，并对比来自活细菌的蛋白提取物，从而验证蛋白的结构；通过以适当的染料对凝胶进行染色可直接对蛋白进行观察，或者，可将蛋白转移至膜上，并以针对该革兰氏阳性菌蛋白的适当抗体进行染色而观察。也可用其他方法如凝胶过滤或质谱分析来验证来自本发明的灭活的革兰氏阳性菌制剂的纯化分子的结构。

根据所述细菌制剂的另一个优选的实施方式，其含有通过深度冻干方法得到的深度冻干的、灭活细菌。

优选地，所述深度冻干的、灭活的细菌制剂由如下步骤制备：

(i)收集活细菌细胞的培养物，

(ii)在水中或盐的水溶液如硼酸盐的水溶液中洗涤所述的细菌细胞，

(iii)在水中或盐的水溶液如硼酸盐的水溶液中冷冻所述的细菌细胞，

(iv)通过在冷冻干燥器中对所述的冷冻的细菌细胞进行干燥处理而将其灭活，处理的时间足以除去至少98.5％，优选地至少99％，且更优选地至少99.5％的水分，且

(v)收集所述的深度冻干灭活细菌细胞。

或者，所述深度冻干灭活的细菌制剂是通过如上所述的方法而制备的，只是省略了(ii)中洗涤所述细菌细胞的步骤。

优选地，步骤(iv)在干燥室压力为大约0.02mBar至0.2mBar条件下进行；更优选地为0.06mBar至0.1mBar，持续至少10至12小时，更优选地为持续数天，过程中采用低热量输入(low heat input)和低冷蒸气收集温度(low cold vapor trap temperature)以保持干燥过程中干燥的灭活的细菌制剂为低温(细菌细胞分子不发生变性)。

在冻干过程中，在冷冻干燥仪内无空气泄漏的条件下，当制冷装置和真空泵与真空室切断数秒后，如果真空室的压力不发生变化，即说明达到了深度冻干状态；这说明不再有水分自冻干的细菌中被除去(＝稳定的水蒸气压力)。例如，当冷凝管为-52℃，干燥室内的压力可在0.06-0.120mBar的范围内，通常为大约0.09mBar，以得到被有效深度冻干灭活细菌。

本发明还涉及本发明的灭活的细菌制剂的各种成分，其选自如下一组：

-成分A，由所述灭活的细菌制剂的有机溶剂提取物组成，以去除磷脂，

-成分B，由所述灭活的细菌制剂经糖苷酶处理的提取物组成，以去除糖衍生成分如肽聚糖，

-成分C，由所述灭活的细菌制剂经DNase和/或RNase消化的提取物组成，以去除核酸，

-成分D，由所述灭活的细菌制剂经蛋白酶处理的提取物组成，以去除蛋白质，

-成分E，由所述灭活的细菌制剂经有机溶剂、糖苷酶、DNase和/或RNase相继处理、且最后经蛋白酶处理得到的提取物组成。

优选地：

-所述成分A通过以甲醇/氯仿混合物提取而得到。

-所述成分B通过以溶菌酶消化而得到。

-所述成分C通过以DNase I和/或RNase A消化而得到。

-所述成分D通过以枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)消化而得到。

根据所述成分的一个优选的实施方式，其分离自一种如上所述的深度冻干的细菌制剂。

根据所述成分的一个优选的实施方式，其由分枝杆菌成分组成，优选地为牛分枝杆菌成分，更优选地为牛分枝杆菌BCG成分。

本发明还涉及一种用于预防或治疗包含免疫失调(如Th1-Th2失衡)的疾病的药物组合物，其包含有效量的如上所述的灭活的细菌制剂和/或至少其一种成分、药物学可接受的载体和/或添加剂、和/或佐剂、和/或免疫刺激剂(immunostimulant)和/或不同于本发明请求保护的细菌制剂的免疫调制剂(immunomodulator)。

佐剂是指一种天然的或合成的产物，当其与抗原联合施用时，其可强化针对所述抗原的特异性免疫应答(抗体产生、激活B和T细胞)。

免疫刺激剂是指一种天然的或合成的产物，当其与抗原联合施用时，其诱导非特异性的免疫应答(例如增强对该抗原的吞噬作用)。

根据本发明，所述组合物可优选地用于治疗癌症，自身免疫病如多发性硬化、类风湿性关节炎、克隆氏病和糖尿病，以及过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎。

根据所述组合物的一个优选的实施方式，其由分枝杆菌组成，优选地为牛分枝杆菌，更优选地为牛分枝杆菌BCG。

根据所述组合物的另一个优选的实施方式，其由通过如上所述的深度冻干方法得到的深度冻干灭活的细菌组成；优选地，所述深度冻干灭活的细菌是通过如上所述的冻干方法得到的。

根据所述组合物的另一个优选的实施方式，其形式适合于通过鼻内途径而施用。

根据所述组合物的另一个优选的实施方式，其形式适合于通过口服或舌下途径而施用。

一般而言，该组合物可通过胃肠外注射(例如经皮、肌肉、静脉或皮下)、鼻内(如通过吸入或雾化)、口服、舌下或局部、经皮肤或经直肠而施用。

按照说明，在一个实施方式中，本发明的组合物的形式适合输送至支气管肺粘膜表面。例如，该组合物可悬浮于液体配方中，通过类似于当前用于治疗哮喘的气雾装置(nebuliser device)，以气雾剂的形式输送至患者。

按照说明，在另一个实施方式中，本发明的组合物的形式适合口服施用。例如，该组合物的形式可以是用于口服施用的片剂、普通胶囊、凝胶胶囊或糖浆。这些凝胶胶囊、普通胶囊和片剂形式可含有药物配制中常规使用的赋形剂，例如佐剂或粘合剂如淀粉，胶质(gum)和凝胶，佐剂如磷酸钙，解离剂(disintegrating agent)如玉米淀粉或褐藻酸，润滑剂如硬脂酸镁、甜味剂或调味剂。可加入药物学相容性溶剂，在水性或非水性介质中配制溶液或悬液。这些溶剂包括甘油、聚乙二醇、丙二醇、聚乙二醇酯、DMSO和乙醇。

该组合物还额外含有药物学可接受的载体和/或添加剂和/或免疫刺激剂和/或佐剂，如含有本发明的细菌细胞或其成分的脂质体；用于制备药物组合物的所述一或多种添加剂可选自抗聚集剂(antiaggregatingagent)、抗氧化剂、染料、增味剂、或调匀剂、聚集剂或分离剂，且一般而言选自制药业中常规使用的任何赋形剂。

尽管本领域普通技术人员熟知的任何合适的载体均可用于本发明的药物组合物，但载体的类型依施用方式的不同而变化。对于胃肠外施用，如皮下注射，载体优选地包含水、盐溶液、乳糖、谷氨酸盐、一种油或一种蜡。对于口服施用，可采用任何上述载体或一种固相载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodium saccharine)、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸镁。生物可降解的微球(Biodegradablemicrosphere)(如polylactic galactide)也可用作本发明的药物组合物的载体。合适的生物可降解的微球在例如美国专利4,897,268和5,075,109中有揭示。

所述的多种佐剂中的任何一种均可用于本发明的组合物以增强免疫应答。大多数佐剂含有用来保护抗原不被快速代谢或用来实现可控炎症反应的物质例如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答的非特异性刺激物例如脂质A、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)毒素。合适的佐剂是商品化的，例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂，但其不能用来注射给人。其他可用于人类的合适的佐剂包括氢氧化铝、生物可降解的微球、单磷酰脂A(monophosphoryl A)和Quil A。

优选的施用频率和有效剂量随物种的不同以及对象的不同而变化。例如，深度冻干灭活的分枝杆菌制剂及其成分的剂量范围相当于在小鼠中为大约1μg至10000μg物质(大约10⁶至10¹⁰CFU)；优选地为大约10μg至1000μg；更优选地为大约10μg至100μg。剂量可更高或更低，这取决于物种或对象的体表面积，还取决于施用的频率。例如，在哮喘的治疗中，每2个月施用1或2剂可能更加有效。

本发明还涉及作为一种同时、单独或序贯用于预防和/或治疗包含免疫失调的疾病的联合制剂的制品，其含有本发明的细菌制剂或其成分以及一种选自抗癌药物、抗糖尿病药物或免疫调制药物的产品。

优选地，所述制品选自抗组胺药物或抗炎药物。

本发明还涉及本发明的细菌制剂或其成分在制备用于通过口服、胃肠外、舌下或鼻内途径施用以治疗哮喘的药物中的用途，其中所述药物的施用剂量范围相当于在小鼠中为1μg至10000μg，优选地为10μg至1000μg，最优选地为10μg至100μg，该药物至少自通常接触免疫原之前2周开始施用，每间隔2个月一次。

本发明还涉及本发明的细菌制剂或其成分在制备用于通过口服、胃肠外、舌下或鼻内途径施用以预防人类婴儿的哮喘的药物中的用途，其中所述药物的施用剂量范围相当于在小鼠中为1μg至10000μg，优选地为10μg至1000μg，最优选地为10μg至100μg。

本发明还涉及制备所述深度冻干灭活的细菌制剂的方法，其特征在于其至少包含以下步骤：

(i)收集活细菌细胞的培养物，

(v)收集所述的深度冻干灭活细菌细胞。

一种制备所述深度冻干灭活的细菌制剂的替代方法，包含步骤(i)、(iii)、(iv)和(v)；省略了步骤(ii)的洗涤细菌细胞的步骤。

优选地，在干燥室压力为大约0.02mBar至0.2mBar的条件下，更优选地为大约0.06mBar至0.1mBar的条件下进行步骤(iv)至少10至12小时，以便除去至少98.5％的水分同时防止所述冷冻的细菌发生融化并将所述干燥的灭活的细菌维持在使细菌细胞分子发生变性的温度以下。

根据所述方法的一个优选的实施方式，其由制备深度冻干灭活的分枝杆菌组成。

本发明还涉及所述灭活的细菌细胞制剂或其成分在制备一种用于预防和/或治疗包含免疫失调的疾病的药物中的用途，所述包含免疫失调的疾病例如为Th1-Th2失衡，例如为癌症，自身免疫病如多发性硬化，糖尿病和克隆氏病，过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎或特应性皮炎。

根据所述的用途，所述灭活的细菌制剂或其成分联合了药物学可接受的载体、和/或免疫刺激剂、和/或佐剂和/或如上所述的任何常规的添加剂。

根据本发明的一个优选的实施方式，分枝杆菌优选地使用了牛分枝杆菌，更优选地使用了牛分枝杆菌BCG。

根据本发明的另一个优选的实施方式，使用了通过一种深度冻干方法获得的深度冻干灭活的细菌。

本发明的灭活的细菌制剂具有以下优点：

-它们保护对象不发生包含免疫失调(如Th1-Th2失衡)的疾病，例如哮喘。

-它们不具有感染性且可以施用于免疫抑制的对象。

-它们不引起炎症性不良反应，这可能特别是由于它们不诱导产生TNF-α，TNF-α可引起毒性和坏死活性。此外，它们不产生包括贫血和血小板减少在内的其他副作用。

-使用它们不会诱导针对BCG纯化蛋白衍生物(PPD)的迟发型过敏反应，因此不会干扰对结核病的诊断。

-并且它们的制备方法可保护来自细菌细胞的分子结构(分子不发生广泛的变性)，因此能够鉴定来自所述灭活的细菌制剂的免疫调制分子。

本发明还涉及用于治疗包含免疫失调的疾病的试剂盒，其特征在于其包含至少一种本发明的药物组合物、用来施用所述药物组合物的手段和/或用来保证对所建议的治疗具有依从性的手段。

下面通过随后的描述和附图对本发明做进一步说明，随后的描述和附图引用实施例说明深度冻干灭活BCG在小鼠中对哮喘的保护性作用、分析了深度冻干灭活BCG、热灭活BCG和活BCG所诱导的免疫应答、或分析了深度冻干灭活BCG及其成分的产生。不过，应该理解，这些实施例仅仅用于对本发明进行说明，且不以任何方式对本发明构成限制。

附图说明

-图1显示了制备冻干的活BCG疫苗的标准方法(A)，并与本发明的制备深度冻干灭活BCG的方法进行对照(B)：图中所示为压力(mBar)(-△-)和样品(-○-)或托盘(-●-)的温度(摄氏度)随时间的变化(小时)。

-图2显示了深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)对特别严格的(高Th2)BP2小鼠哮喘模型的支气管肺高反应性的保护作用，通过通气量的下降进行评测。BP2小鼠对Th2/哮喘轴具有高度的反应性。这些小鼠还以OVA和明矾(已知其是一种Th2刺激剂)进行致敏。通过比较，在这种严格的小鼠模型中，活BCG处理组或热灭活BCG处理组均未观察到显著的作用。图中给出了曲线下面积(cm²)：个体(-○-)，各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。

-图3显示了深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)对以OVA为免疫原的BP2小鼠哮喘模型的支气管肺高反应性的保护作用，通过支气管肺阻力进行评测。通过比较，活BCG处理组或热灭活BCG处理组均未观察到显著的作用。图中给出了1分钟内测量得到的增强暂停(Enhancedpause(Penh))：个体数据(-○-)，各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。^***在深度冻干灭活BCG处理组中观察到对支气管肺高反应性的显著的保护作用(p＜0.001)。

-图4显示了深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)对BP2小鼠哮喘模型的肺中嗜酸细胞增多的保护作用，通过支气管肺泡灌洗液(BAL)细胞计数进行评测。通过比较，活BCG处理组或热灭活BCG处理组均未观察到显著的作用。图中给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。

-图5显示了深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)对BP2小鼠哮喘模型的肺中中性粒细胞增多的保护作用，通过支气管肺泡灌洗液(BAL)细胞计数进行评测。通过比较，活BCG处理组或热灭活BCG处理组均未观察到显著的作用。图中给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。^**在深度冻干灭活BCG处理组中观察到中性粒细胞的数量显著减少(p＜0.01)。

-图6显示了在深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)处理的BP2小鼠哮喘模型中，优选的无肺部炎症或组织损伤，通过支气管肺泡灌洗液中的纤连蛋白的水平进行评测。通过比较，活BCG处理组或热灭活BCG处理组的BAL中的纤连蛋白的水平均明显较高。图中数据以IU/ml表示；给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。^***深度冻干灭活BCG处理组的纤连蛋白水平显著降低(p＜0.001)。

-图7显示了以活BCG、热灭活BCG或深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)处理的或未处理的各组小鼠的支气管肺泡灌洗液中的IL-5的水平。图中数据以pg/ml表示；给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。

-图8显示了以活BCG、热灭活BCG或深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)处理的或未处理的各组小鼠的血清中的IL-5的水平。图中数据以pg/ml表示；给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。

-图9显示了以活BCG、热灭活BCG或深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)处理的或未处理的各组小鼠的肺培养物中的IFN-γ的水平(pg/ml)；该培养物已经在体外以纯化的BCG分泌蛋白(A)或抗CD3抗体(B)进行刺激。图中给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。

-图10显示了以活BCG、热灭活BCG或深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)治疗方案处理的或未处理的各组小鼠的血清中的OVA特异性IgE的水平。图中给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。

-图11A和12A显示了分别来自以OVA免疫接种的BP2和BALB/c小鼠的、经热灭活BCG(加热的)(-◆-)或深度冻干灭活BCG(冻干的)(....■....)体外刺激的肺泡巨噬细胞产生的IL-12(p70和p40)。数据表示为pg/ml每100000细胞。

-图11B(BP2)和12B(BALB/c)显示来自以深度冻干灭活BCG(冻干的)刺激的小鼠的巨噬细胞中无TNF-α产生，相比之下，来自以热灭活BCG(加热的)刺激的小鼠的巨噬细胞产生的TNF-α水平很明显。数据表示为ng/ml每100000细胞。

-图13显示以深度冻干灭活BCG(Lyoph灭活BCG)处理的小鼠中未观察到针对BCG纯化蛋白衍生物(PPD)的迟发型过敏反应(DTH)。相比之下，以活BCG或热灭活BCG处理的小鼠中观察到DTH。图中给出了个体数据(-○-)和各组小鼠的平均值±SEM(-●-)。^***在深度冻干灭活BCG处理组中无明显爪垫肿胀(p＜0.001)。

-图14显示在豚鼠哮喘模型中，深度冻干灭活BCG(EFD-BCG)对组胺引起的支气管肺高反应性的保护作用。以10μg(图14B)或100μg(图14C)的深度冻干灭活BCG对接种了OVA的动物进行处理或不处理(图14A)。图中给出在施用气雾剂形式的OVA之前(黑色符号)和之后(白色符号)，在各动物中能够产生支气管收缩的组胺的浓。^***10μg(p＜0.01)或100μg(p＜0.001)深度冻干灭活BCG处理组产生了明显的保护作用(Kruskal-Wallis非变量检验)。

-图15A显示了深度冻干灭活BCG(EFD1)在BP2小鼠哮喘模型中对肺中嗜酸细胞升高的保护作用，通过支气管肺泡灌洗液细胞计数进行评测。相比之下，在活BCG或热灭活BCG处理组未观察到明显的作用。各组小鼠的数据表示为平均值±SEM；各组n＝7。^*深度冻干灭活BCG处理组中的嗜酸细胞数明显减少(p＜0.05)。

-图15B显示了来自以活BCG、热灭活BCG、深度冻干灭活BCG(EFD1)处理或未处理的各组小鼠的支气管肺泡灌洗液中IL-5的水平。各组小鼠的数据表示为平均值±SEM；各组n＝7。

-图16显示了深度冻干灭活BCG制剂中蛋白结构的保留，通过SDS-PAGE并(A)在转移至PVDF膜后以抗分枝杆菌抗体染色或(B)以Aurodye染色进行评测。蛋白质表现为不连续的条带，没有降解带。

-图17显示了在以一种水溶性ray-grass花粉提取物作为免疫原的BP2小鼠哮喘模型中，深度冻干灭活BCG(EFD1)对支气管肺高反应性的保护作用，通过支气管肺高反应性进行评测。图中给出了在施用乙酰甲胆碱(methacholine)后，在3至8分钟之间测定的增强暂停(Penh)：各组小鼠的数据表示为平均值±SEM；各组n＝8。^**深度冻干灭活BCG处理组对支气管肺高反应性具有明显的保护作用(p＜0.01)。

-图18A和B显示了在BP2小鼠哮喘模型中，深度冻干灭活BCG(EFD1)对肺中多形核白细胞和嗜酸细胞增多的保护作用，通过支气管肺泡灌洗液细胞计数进行评测。各组小鼠的数据表示为平均值±SEM。在1mg和10mg的深度冻干灭活BCG处理组中多形核白细胞数明显减少(^**p＜0.01)；100μg、1mg和10mg的深度冻干灭活BCG处理组中嗜酸细胞分别明显减少：^**p＜0.01、^*p＜0.05和^*p＜0.05。

-图18C显示了深度冻干的BCG(EFD1)处理组(10μg，100μg，1mg和10mg)中肺部多形核白细胞和嗜酸细胞数减少与IL-4产生减少的相关性，通过支气管肺泡灌洗液细胞和细胞因子分析进行评测。各组小鼠的数据表示为平均值±SEM。10μg，100μg，1mg和10mg的深度冻干灭活BCG处理组中IL-4水平显著降低(^**p＜0.01)。

-图19显示了在BP2小鼠哮喘模型中，深度冻干灭活BCG (EFD1)处理组中阻止了白细胞对肺的浸润，通过肺细胞浸润计数评测。各组小鼠的数据表示为平均值±SEM；各组n＝5。10μg深度冻干灭活BCG处理组中细胞数明显减少(^**p＜0.001)。

-图20显示了在BP2小鼠哮喘模型中，深度冻干灭活BCG(EFD)处理组阻止了白细胞对肺的浸润，通过流式细胞仪分析巨噬细胞(CD11b+)、多形核白细胞(Gr1+)和树突状细胞(CD11c+)进行评测。各组小鼠的数据表示为平均值±SEM；各组n＝5。所有深度冻干灭活BCG(10μg、100μg、1mg和10mg)处理组中巨噬细胞和树突状细胞均明显减少(i)，而多形核白细胞仅在100μg、1mg和10mg深度冻干灭活BCG处理组中明显减少(ii)。

-图21显示了在活BCG、热灭活BCG、深度冻干灭活BCG(EFD1)处理或未处理、且有或没有OVA攻击的各组小鼠的肺培养物中IFN-γ和IL-10(pg/肺)的水平；培养物经纯化BCG分泌蛋白体外刺激。各组小鼠的数据表示为平均值±SEM；各组n＝4。仅在深度冻干灭活BCG处理组中出现IL-10产生的明显增加(^***p＜0.001)。

-图22显示了静脉施用深度冻干灭活BCG(EFD-BCG)后未出现贫血(A)和血小板减少(B)，而同样途径施用活BCG或热灭活BCG则与此不同。

-图23显示了皮下注射深度冻干灭活BCG(EFD1)后皮下注射部位的炎症反应最小，而活BCG和热灭活BCG与此不同，通过注射后连续10周每周测量爪垫增大的情况进行评测。箭头指示注射日；EFD和热灭活BCG为D0和D36，活BCG仅在D0。

-图24显示了静脉注射深度冻干灭活BCG(EFD1)后18天，LPS刺激肺外植体后，TNF-α产生减少，而同样途径注射活BCG或热灭活BCG则与此不同。深度冻干灭活BCG组与未处理组相比未见明显TNF-α产生(^***p＜0.001)。与此不同，在活BCG和热灭活BCG处理组观察到TNF-α产生明显。

-图25显示，BALB/c小鼠先在90天前以卵清蛋白免疫接种，然后在45天和65天用或不用深度冻干灭活BCG(EFD1)处理，并用或不用卵清蛋白进行攻击实验，来自上述BALB/c小鼠的脾脏内的CD11c⁺Gr1⁺B220⁺浆细胞样树突状细胞的数量增加。^***处理组中CD11c⁺Gr1⁺B220⁺细胞数明显增加(p＜0.001)，处理组中CD11c⁺CD8α⁺细胞数无增加。

-图26显示，BALB/c小鼠先在90天前以卵清蛋白免疫接种，然后在45天和65天用或不用深度冻干灭活BCG(EFD1)处理，并用或不用卵清蛋白进行攻击实验，来自上述BALB/c小鼠的脾脏内的CD4⁺CD25⁺IL-10⁺细胞的数量增加；在分析白细胞群之前，以OVA或BCG培养物上清液在体外对脾脏细胞进行刺激或不进行刺激。^***处理组中CD4⁺CD25⁺IL-10⁺细胞数明显增加(p＜0.001)。

-图27显示了口服途径给予深度冻干灭活BCG(EFD1)在小鼠哮喘模型中的保护作用，通过肺部细胞浸润计数评测。^***处理组肺部细胞数明显减少(p＜0.001)。

-图28显示了皮下注射单剂深度冻干灭活BCG(EFD)的保护作用，通过预防BALB/c哮喘模型的支气管肺高反应性进行评测。

-图29显示了皮下注射深度冻干灭活BCG(EFD)的延迟作用，通过预防BP2哮喘模型的支气管肺高反应性进行评测。仅在施用深度冻干灭活BCG和攻击实验之间存在2-3周的延迟时才出现对支气管肺高反应性的预防作用。

-图30显示了皮下注射深度冻干灭活BCG(EFD1)的作用过程，通过预防BP2哮喘模型的支气管肺高反应性进行评测；深度冻干灭活BCG的保护作用持续至少2个月。

具体实施方式

实施例1：制备深度冻干灭活的分枝杆菌

1)材料与方法

牛分枝杆菌BCG细胞(BCG巴斯德疫苗株1173P2，于1978年4月24日保藏于法国微生物保藏中心(CNCM)，25 rue du Docteur Roux，75724巴黎Cedex 15(法国)，保藏号n°I-059(M.Gheorghiu等，1983，Bull.Inst.Pasteur，81，281-288)生长于无菌Sauton培养基中(HOOCCH(NH₂O)CH₂CONH₂H₂O(天冬酰胺)，4g/l；C₆H₈O₇；H₂O(柠檬酸)，2g/l；K₂HPO₄(磷酸氢二钾)，0.5g/l；MgSO₄-H₂O(硫酸镁)，0.50g/l；柠檬酸铁III，0.05g/l；甘油，60ml；硫酸锌溶液(0.155g硫酸锌溶于10ml无致热原的水中)，240μl/l，pH 7)。更具体地，1173P2株生长于含130ml无菌Sauton培养基的250ml球形培养瓶中，37℃培养14天，相当于培养物达到对数生长期的尽头。

将培养物2000g离心10分钟，4℃，以沉淀BCG细胞。弃细胞培养物上清液，以蒸馏水充分洗涤沉淀(3次)；每次洗涤包括将所述沉淀重悬于蒸馏水(每体积细胞沉淀加20体积的水)并离心细胞2000g达10分钟，4℃。

末次洗涤后，将沉淀重悬于与沉淀等体积或2倍体积的蒸馏水中。使50ml水中的20g细菌分层并在瓶壁上冻结，以形成大约1cm厚的一层。将混合物冷冻于-60℃。

然后将冻结于水中的细胞悬液在图1B所述的深度冻干方案的条件下进行深度冻干，以除去基本上所有的水分(残留水分＜1.5％)。简言之，将压力快速降至0.150mBar，冰制冷装置(ice condenser)的温度大约为-50℃至-54℃，并开始冻干过程。样品保持冻结，不必精确监测温度。然后将压力维持在0.1mBar达34小时，以除去基本上所有的水分(残留水分＜1.5％)。逐渐升至室温(大约20℃)。干燥过程结束时，压力缓慢恢复为大气压，室温(大约20℃)，并收集深度冻干灭活BCG细胞(大约2g)，大气压下室温存放。

可使用Karl Fisher的库仑方法和756KF Coulometer(METHROM)，根据制造商的说明书来确定深度冻干灭活BCG制剂中的残留水分。

深度冻干灭活制剂存在的活细胞可通过以下方法验证：

-确定每毫升中的集落形成单位(CFU)；将0.2ml的深度冻干灭活制剂悬液(1mg，例如为大约10⁹个深度冻干灭活BCG细胞悬于水中)接种在Middlebrook 7H10琼脂培养基(DIFCO)，将培养盘在37℃孵育1个月，和/或

-以荧光染料CFDA-SE(羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺基酯(Carboxyfluorescein diacetate-Succimidyl Ester)；MOLECULAR PROBES目录号C-1157)进行染色，该染料只染色活细胞；将1ml深度冻干灭活制剂悬液(大约10⁸深度冻干灭活BCG细胞悬于水)与100μl的1/100稀释于PBS的CFDA试剂(储存液：1mg/ml溶于DMSO)混合。将混合物避光室温孵育60min。将标记的细菌3000rpm离心15分钟，PBS洗涤2次，并重悬于PBS。然后通过荧光显微镜检测活细胞的存在。

2)结果

根据材料与方法所述并概括于图1B中的深度冻干方案将BCG细胞深度冻干灭活。相比之下，按照制备活BCG疫苗的标准方法对BCG细胞进行冻干：将BCG细胞(1173P2株)培养在Sauton培养基中，37℃，并于对数生长期结束时离心收集细胞，BCG细胞沉淀重悬于谷氨酸钠中(1.5g/100ml H₂O)，BCG浓度为4mg/ml。将BCG悬液分装于小管中(0.25ml/管)，根据图1A所示方案进行冻干每管含有1.5±0.5％的H₂O，室温真空储存(0.06mBar)。

如材料与方法中所述分析不同制剂中的BCG细胞的活力。

通过Karl Fisher的库仑方法、培养物分析以及CFDA-SE染色得到如下结果：

-200mg的深度冻干灭活BCG制剂含有1.073mg水(一次代表性的测定值)，相对于残留水分少于0.5％，

-根据本发明的方法制备的深度冻干灭活BCG样品中未检测到活细菌，

-按照标准的BCG疫苗制备方法制备的冻干的灭活BCG制剂中存在50％至60％的活细菌。

实施例2：制备深度冻干灭活的分枝杆菌成分

1)去脂质成分(Delipidated fraction)(成分A)

将10mg/ml的大约10¹⁰深度冻干灭活BCG细胞悬浮于硼酸缓冲液(Na₂B₄O₇ 10H₂O 0.363％；H₃BO₃ 0.525％；NaCl 0.619％和Tween 200.0005％，溶于蒸馏水，pH8)，12000g离心10分钟，弃上清液。将沉淀重悬于1ml的氯仿/甲醇(9/1)中，室温作用24h以提取脂质。12000g离心10min以除去氯仿/甲醇。将来自氯仿/甲醇提取物的去脂质沉淀真空干燥。

2)去糖基化成分(Deglycosylated fraction)(成分B)

将10mg/ml的大约10¹⁰深度冻干灭活BCG细胞悬浮于硼酸缓冲液(Na₂B₄O₇ 10H₂O 0.363％；H₃BO₃ 0.525％；NaCl 0.619％和Tween 200.0005％溶于蒸馏水，pH8)，12000g离心10分钟，弃上清液。将沉淀重悬于含有1mg溶菌酶的1ml的0.1M乙酸钠中，37℃作用24h，以除去肽聚糖。将消化产物在96℃加热2min，12000g离心1h收集沉淀。

3)DNase和RNase处理的成分(成分C)

将10mg/ml的大约10¹⁰深度冻干灭活BCG细胞悬浮于硼酸缓冲液，12000g离心10分钟，弃上清液。将沉淀重悬于含有1mg DNase和1mgRNase以及5mM MgCl₂的1ml的40mM Tris-HCl缓冲液中，37℃作用24h，以除去核酸。将消化产物在96℃加热2min，12000g离心1h收集沉淀。

4)蛋白酶处理的成分(成分D)

将10mg/ml的大约10¹⁰深度冻干灭活BCG细胞悬浮于硼酸缓冲液，12000g离心10分钟，弃上清液。将沉淀重悬于含有0.1mg枯草杆菌蛋白的1ml的0.1M醋酸铵缓冲液中，37℃作用23h。为完全除去蛋白质，随后将0.1mg枯草杆菌蛋白酶加到反应混合物中，37℃孵育7h。将消化产物在96℃加热2min，12000g离心1h收集沉淀。

5)相继处理(Successive treatments)(成分E)

将10mg/ml的大约10¹⁰深度冻干灭活BCG细胞12000g离心10分钟，弃上清液。将沉淀重悬于硼酸缓冲液中并相继以上述氯仿/甲醇(9/1)、溶菌酶、DNase-RNase混合物和枯草杆菌蛋白酶进行处理。将消化产物在96℃加热2min，12000g离心1h收集沉淀。

6)检测深度冻干灭活BCG制剂的蛋白质和多糖含量。

a)材料与方法

将深度冻干灭活BCG制剂(10mg)悬浮于1ml的4％丁醇水溶液中，并分装至2个eppendorf管(每管500μl)中，管中有1g氧化锆/二氧化硅珠(0.1mm)(BIOSPEC PRODUCTS，INC.)。将管放置于Mixer Mills(MM301，RESCH)中，在5，15，30，60，120，180，240，300或470分钟内放入25次。然后将管以10000rpm离心30min；回收上清液，过滤(0.22μm滤膜，MILLIPORE)，如下所述测定蛋白质、氨基酸和多糖的浓度：

-以Micro BCA Protein试剂盒(PIERCE)测定总蛋白浓度，

-通过质谱法分析测定氨基酸浓度，

-使用S.Melvin，Anal.Biochem.1953，25，1656-所述的蒽酮方法测定总多糖浓度。

在5、60或300min收集细菌提取物，将细菌提取物的样品(5μg蛋白质)以SDS-PAGE分离，将蛋白质转移至PVDF膜，并以Aurodye

(Pharmacia)或抗分枝杆菌蛋白质的多克隆抗体染色。

b)结果

提取后5、60或300min收集的细菌提取物分别含有280、500和1258μg蛋白质；190、420和880μg氨基酸和697、1267和1765μg的多糖。

图16显示的结果说明，如蛋白质为不连续的条带且没有降解带所示，深度冻干方法可保留灭活BCG制剂中的蛋白质的结构；深度冻干灭活BCG制剂提取物的蛋白质分布图与活BCG制剂的蛋白质分布图相似。

实施例3：深度冻干灭活的分枝杆菌在小鼠模型中对哮喘的保护作用

1)材料与方法

a)动物

雄性成熟(6至7周龄)BP2(H-2^q)小鼠来自Centre d′élevage R.Janvier(Le Genest，Saint Isle，法国)并在无特异性病原体的条件下的动物饲养设施中饲养。

b)哮喘样免疫原特异性疾病的小鼠模型

在第0天(D₀)和第7天(D₇)，以1μg卵清蛋白(OVA；ICNLaboratories)和1.6mg氢氧化铝佐剂(溶于盐水，终体积0.4ml)对雄性成熟BP2小鼠经皮下途径(颈部背侧)进行免疫接种。通过在第96-98天以溶于50μl盐水的10μg OVA进行鼻内攻击实验以诱发过敏反应。或者，将一种水溶性ray-grass花粉提取物用作免疫原，免疫接种的添加与OVA相同，但提取物的量为10μg。

c)制备分枝杆菌免疫调制组合物

将如实施例1所述制备的深度冻干灭活BCG作为BP2小鼠的哮喘疫苗进行测试，并与以下BCG制剂相比较：

-活BCG

牛分枝杆菌BCG巴斯德疫苗株1173P2分散生长于Beck-Proskauer培养基(Gheorghiu等，1988，J.Biol.Standard.，16，15-26)中，培养基补充了0.05％Triton WR 1339(SIGMA)和6％葡萄糖。在对数生长期收集细菌(5至7天)并在-70℃存放于Beck-Proskauer培养基中，培养基中补充了0.05％Triton和6％甘油。将以PBS适当稀释的细菌悬液接种在Middlebrook 7H10琼脂培养基(DIFCO)中以测定每毫升的集落形成单位(CFU)数量。临注射前将悬液按照10⁸、10⁹或10¹⁰CFU/ml的浓度以PBS稀释以注射(100μl)。

热灭活BCG

将如上制备的活BCG以3000rpm离心15分钟，弃上清液。将沉淀重悬于盐水中，例如含有硼酸的缓冲液(Na₂B₄O₇ 10H₂O 0.363％；H₃BO₃0.525％；NaCl 0.619％和Tween-200.0005％，溶于蒸馏水，pH8)中，将悬液在115℃高压灭菌15分钟。

d)对小鼠哮喘模型施用深度冻干灭活的分枝杆菌的治疗方案

如上所述，以OVA对雄性成熟BP2小鼠进行免疫接种。给每组25只小鼠注射100μl的如上所述制备的BCG组合物。

-活BCG疫苗株1173P2(10⁷CFU)，

-热灭活BCG(10⁸菌体，相当于10⁷CFU)，

-深度冻干灭活BCG(10μg至10mg；10μg相当于10⁷CFU)，和

-PBS，

在首次接种OVA后的D_42-45和D_65-70，通过皮下途径(尾根部)注射。

通过在第96-98天以溶于50μl盐水的100μgOVA进行鼻内攻击实验以诱发过敏反应；鼻内施用PBS作为对照。

e)支气管肺(BHR)分析

使用了一种可对非麻醉动物进行BHR研究的气压体积描记装置(barometric plethysmographic equipment(BUXCO))。以OVA免疫接种的动物经不同的BCG制剂处理或不处理，以OVA或水溶性ray-grass花粉提取物进行攻击实验，24h后对动物进行测试。将动物置于体积描记室中。记录其基础通气参数，然后在20秒或1分钟内使用标准的气雾装置使小鼠吸入100mM乙酰甲胆碱(ALDRICH)的水溶液，在施用乙酰甲胆碱气雾剂后的10分钟内记录小鼠的通气参数。报告该段时间内通气的下降(曲线下面积)并将支气管肺阻力表示为增强暂停(Penh)，按照制造商的说明如下计算：(呼气时间(tE)/40％的松弛时间(trel)-1)x呼气峰流速(PEF)/吸气峰流速(PIF)×0.67。每分钟记录Penh的平均值。作图时表示出相应于每分钟的每个值。

f)支气管肺泡灌洗液(BAL)

通过腹腔注射致死量的氨基甲酸乙酯(urethane)(1.5g/kg；SIGMA)将小鼠麻醉。自腹主动脉放血，将连接于注射器的导管放置于气管内，以0.7ml PBS洗涤肺3次，将灌洗液收集到试管中并置于冰上。

以COULTER的自动计数装置(ZBI)测定BAL中的细胞数。为测定各种细胞类型(嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞)的百分数，将BAL中的细胞离心至玻片上，以DIFF QUICK(BAXTER)进行染色。

g)纤连蛋白分析

将BAL以1000rpm离心10min，4℃，按照标准方案(Rennard等，Anal.Biochem.，1980，205-214)，通过竞争性酶免疫测量分析(EnzymeImmunometric Assay(EIA))测定上清液中的纤连蛋白。

h)肺外植体的制备和分析

将肺每隔3mm切成大约1mm的小片，来自每个肺的4或5条组织被放置在组织培养盘的孔中，其中含有1ml的AIM V培养基(LifeTechnologies)。将肺外植体单独培养在培养基中以进行基础水平测定；或者将BCG培养物滤出液(10μg/ml)加入到培养物中，以显示分枝杆菌特异性细胞；或者将抗CD3单克隆抗体加入到培养物中，以显示T淋巴细胞的反应性。24h后，通过ELISA法测定各种淋巴因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10...)的存在，使用的是商品化试剂盒，按照制造商的说明检测。

将整个肺(无支气管)在含胶原酶和DNase的培养基中进行解离，然后用不同荧光标记的各种单克隆抗体，通过流式细胞仪测定浸润细胞。

i)肺的组织病理学分析

将整个肺固定于甲醛缓冲液中并处理以便进行组织病理学分析。Schiff染色用于染色粘液和含有粘液的细胞，苏木精-曙红(hematoxy-eosin)染色用作本底染色。由同一个观察者进行玻片的检测和细胞浸润和粘液含量的评价，该观察者对玻片进行积分时并不知道培样品的来源(盲法分析)。

j)细胞因子分析

细胞因子存在于来自免疫接种小鼠组的血清和BAL样品中，或者由来自这些小鼠的肺外植体培养物分泌，如下测定细胞因子：IFN-γ、IL-10和IL-12由ELISA检测；TNF-α和IL-5通过EIA(Enzyme ImmunometricAssay)检测。

k)OVA特异性IgE分析

按照标准方案(Hansen等，J.Immunol.，2000，223-230)，通过ELISA分析血清中OVA特异性IgE的水平。

1)统计学分析

每组动物的数量(n)为4＜n＜8。对独立事件进行student’s t检验。

2)结果

a)支气管肺(BHR)分析

动物以OVA或一种水溶性ray-grass花粉提取物进行免疫接种，并以不同的BCG制剂处理或者不处理，以OVA或ray-grass花粉进行攻击实验后24h，对动物进行测试。

这些研究中采用的模型为具有Th2背景的BP2小鼠，以卵清蛋白联合氢氧化铝对小鼠进行免疫接种，氢氧化铝是一种较弗氏不完全佐剂效力更高的一种过敏反应的佐剂，因此这些动物模型较CC W等采用弗氏不完全佐剂内的卵清蛋白进行免疫接种的BALB/c小鼠模型更加严格，见前。

图2和3的数据说明，在这种严格的哮喘模型中，深度冻干灭活BCG(10μg)具有显著的支气管肺保护作用(p＜0.001)，如与对照相比，其使得对乙酰甲胆碱的反应性降低。与此不同，在这种样的哮喘模型中，以活BCG(10⁷CFU)或热灭活BCG(10⁸菌体)处理的动物中未观察到明显的保护作用。当使用一种水溶性ray-grass花粉提取物作为免疫原时，深度冻干灭活BCG(EFD)制剂显示出相似的对哮喘的保护作用(p＜0.01)(图17)。

b)支气管肺泡灌洗液(BAL)

在10μg、100μg、1mg或10mg深度冻干灭活BCG处理组的小鼠观察到嗜酸细胞数(p＜0.05)和中性粒细胞数下降(p＜0.05)(图4，5，15A，18A和18B)。

气道渗出液中纤连蛋白的水平代表炎症反应，深度冻干灭活BCG处理组(10μg，图6)的纤连蛋白水平显示出非常明显的下降。

IL-5是一种淋巴因子，其在过敏反应中涉及嗜酸细胞数的增高，在深度冻干灭活BCG处理组，BAL和血中的IL-5均下降(图7，8和15)。

IL-4是一种Th2细胞因子，在10μg，100μg，1mg或10mg深度冻干灭活BCG处理组的小鼠中，BAL中的IL-4明显下降，具有统计学意义(图18C)。

相比之下，在以活BCG(10⁷CFU)或热灭活BCG(10⁸菌体)处理的小鼠中未发现明显的作用。

这些结果说明，深度冻干灭活BCG可诱导能够治疗哮喘症状的免疫应答，如肺部炎症反应降低所示(嗜酸细胞和中性粒细胞的产生，纤连蛋白渗出物)。在这种具有Th2背景的严格的哮喘模型(BP2小鼠)中，活BCG或热灭活BCG处理组均未出现保护作用。

c)组织病理学和肺部浸润细胞分析

肺部组织病理学分析显示，深度冻干灭活BCG(EFD)处理可防止肺部白细胞浸润和支气管上皮的粘膜转化。

通过流式细胞仪分析肺组织内的细胞，证实了上述结果，流式细胞仪分析显示，深度冻干灭活BCG处理可显著降低肺部白细胞浸润(p＜0.001)(图19)；对各种白细胞群体的分析(图20)显示，深度冻干灭活BCG处理组的肺部的巨噬细胞(CD11b⁺)、多形核白细胞(Gr1⁺)和树突状细胞(CD11c⁺)的数量均降低。

d)细胞因子分析

将以不同BCG制剂处理的各组小鼠的肺组织在有或没有BCG分泌的非纯化蛋白或抗CD3mAb的条件下培养，分析上清液中产生的IFN-γ和IL-10。

图9和21显示的结果说明，IFN-γ的产生需要BCG免疫接种(图9A)。观察到深度冻干灭活BCG组中IFN-γ水平较低(图9A)，但与其他BCG免疫接种组没有显著性差别。以抗CD3抗体非特异性刺激T淋巴细胞显示各组(用或不用BCG处理)的IFN-γ水平相似，提示BCG免疫接种没有改变肺部T淋巴细胞数量(图9B)。

图21所示的结果显示，与活BCG和热灭活BCG处理组相比，深度冻干灭活BCG处理组中的IL-10明显较高(p＜0.001)。

深度冻干灭活BCG处理组与其他BCG制剂处理组之间在肺部细胞因子表达分布图上存在差异，这提示深度冻干灭活BCG的活性与施用免疫原后肺组织内的白细胞群体的变化相关。肺外植体释放的高水平的IL-10和低水平的IFN-γ表明，施用免疫原后，深度冻干灭活BCG处理组的肺组织中存在调控细胞。

e)抗OVA特异性IgE的水平

先以OVA进行免疫接种，随后以不同BCG制剂(治疗方案)处理，抗OVA IgE水平在各组中相同(图10)，提示深度冻干灭活BCG的保护作用不直接影响IgE浓度。

实施例4：分析由热灭活或深度冻干灭活BCG刺激引起的肺泡巨噬细胞产生的细胞因子

1)材料与方法

如实施例3所述得到并饲养BP2和BALB/c(H-2^d)小鼠，如实施例3b所述以OVA进行免疫接种。末次注射OVA后1周，通过腹腔途径用致死量的氨基甲酸乙酯(1.5g/kg；SIGMA)将小鼠麻醉。自腹主动脉放血，将连接于注射器的导管放置于气管内，以0.5ml含有2％胎牛血清的HBSS培养基(Life Technologies)洗涤肺2次，随后以1ml同样培养基洗涤5次，将灌洗液收集到试管中并置于冰上。通过COULTER的自动计数装置(ZBI)测定BAL中存在的巨噬细胞数量。将巨噬细胞在室温1000rpm离心20min收集，将其浓度调整为340.10³细胞/ml，培养基为RPMI 1640培养基，含有3％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100UI/ml青霉素和10μg/ml链霉素。然后将巨噬细胞分配至96孔板进行组织培养(100000细胞/孔)，并在37℃，5％CO₂条件下孵育至少2小时。而后以RPMI培养基洗涤数次以便去除非贴壁细胞，将巨噬细胞在存在热灭活BCG或深度冻干灭活BCG的条件下培养(相当于5CFU/巨噬细胞，例如两种BCG制剂均为1.610⁶CFU/ml)；以E.coli脂多糖(LPS；1μl/ml)和OVA(10μg/ml)作为对照。在加入各种制剂后2，4，6，8，12，24，48，72和96小时收集细胞培养物上清液，并立即冷冻于-20℃。

2)结果

图11和12所示结果说明：

1)IL-12参与Th1细胞的成熟和抗过敏细胞因子(IFN-γ)的产生，经深度冻干灭活BCG制剂和热灭活BCG制剂刺激，BALB/c和BP2小鼠肺泡巨噬细胞产生IL-12，

2)TNF-α是一种与严重的炎症性副作用(坏死、溃疡...)相关的细胞因子，其仅由热灭活BCG制剂刺激的BALB/c和BP2小鼠肺泡巨噬细胞产生；在本实验所使用的浓度下，深度冻干灭活BCG制剂刺激的肺泡巨噬细胞未产生TNF-α。

这些结果支持注射深度冻干的BCG后产生极少的不良反应，这不同于注射热灭活BCG和活BCG引起的不良反应。

实施例5：施用深度冻干灭活BCG不诱导针对BCG纯化蛋白衍生物(PPD)的迟发型过敏反应(DTH)

1)材料与方法

如实施例3d所述，以OVA对小鼠进行免疫接种，以不同的BCG制剂处理，或不处理。在首次皮下注射各种BCG制剂后100天，在各组小鼠进行针对BCG纯化蛋白衍生物(PPD)的迟发型过敏反应(DTH)，BCG纯化蛋白衍生物(PPD)在人类用于诊断结核病。更确切地，将50μl溶于盐水的PPD(4μg)注射于小鼠爪垫，24h后测量该爪垫的肿胀。

2)结果

图13所示结果表明，以深度冻干灭活BCG(相当于10⁷CFU或10μg)免疫接种的小鼠不出现针对BCG纯化蛋白衍生物的迟发型过敏反应，如阴性的皮试结果所示。仅在注射大剂量深度冻干灭活BCG(1mg和10mg)时，小鼠才出现针对PPD的轻度过敏。相比之下，即使以低剂量活BCG或热灭活BCG(10⁷CFU的活BCG或相当于10⁸菌体的热灭活BCG)免疫接种的小鼠也出现了针对BCG纯化蛋白衍生物的迟发型过敏反应，如阳性皮试结果所示。这些结果与前面的结果(图9和21)一致，前面的结果(图9和21)显示，在深度冻干灭活BCG处理组，特异性刺激仅产生少量的IFN-γ，与此不同，其他BCG制剂处理组经特异性刺激产生较高水平的IFN-γ。相似地，深度冻干灭活BCG处理的豚鼠对PPD产生临界的反应。

这些结果说明，以深度冻干灭活BCG免疫接种后，选择出了一种特定亚型的特异性T淋巴细胞，或者，特异性T细胞被局限在一些特定的组织中。结果是，与用活BCG或热灭活BCG免疫接种不同，以深度冻干灭活BCG免疫接种不会影响通过DTH皮试对结核病进行诊断。

实施例6：深度冻干的(EFD)灭活的分枝杆菌在豚鼠模型中对哮喘的保护作用

1)材料与方法

以10μg卵清蛋白(OVA；ICN Laboratories)和1mg溶于盐水的明矾(0.4ml终体积)通过皮下途径接种雄性成熟豚鼠(350g)。

3周后，给所述豚鼠(3组，10只动物/组)经皮注射深度冻干灭活BCG(10⁷或10⁸CFU相当于，即10μg或100μg)或PBS(对照)。

分析豚鼠的支气管肺反应性采用与小鼠不同的方法；在进行免疫原攻击实验前24h，逐渐增加组胺气雾剂的剂量(20，50，100或400μg)以评价每只动物的敏感性，使Penh值升高的组胺的最高浓度被视为组胺敏感性的基础水平。

在免疫原攻击实验后24h进行相似的检测；以OVA免疫接种的豚鼠对组胺的敏感性较高，因此达到相同Penh值所需要的组胺少于攻击实验前。

更具体地：

注射BCG或对照产品7至10周(例如卵清蛋白免疫接种后10至13周)进行组胺测试，以评价每组6只豚鼠的支气管肺反应性。

对于每只豚鼠，均使用气压体积描记法测定诱发明显支气管收缩的组胺的剂量。

每只豚鼠均以其自身作为对照，基础反应性在测试的第1天测定。

24小时后，施用一种卵清蛋白气雾剂。第3天再次测定组胺反应性。

施用卵清蛋白增加了对组胺的支气管肺高反应性。

2)结果

图14所示的结果说明，经10μg(与10⁷CFU相当)(图14B)或100μg(与10⁸CFU相当)(图14C)本发明的深度冻干灭活BCG处理后，分别有5/6和6/6豚鼠产生了针对支气管肺高反应性的保护作用(组胺敏感性没有增加)，而对照组(图14A)(无BCG处理组)对组胺的支气管肺高反应性明显升高(x4)。

实施例7：深度冻干灭活BCG的副作用轻微

a)无贫血且无血小板减少

如实施例3d所述给小鼠静脉注射深度冻干灭活BCG(10μg)或不同的BCG制剂，或不进行处理。注射后18天，测定血样中的红细胞和血小板数量。

图22所示的结果说明，与活BCG和热灭活BCG处理组不同，在深度冻干的BCG处理组没有观察到贫血和血小板减少。

b)注射部位的炎症反应轻微

在第0天，如实施例3d所述，给各组小鼠皮下注射各种BCG制剂(在爪垫部位)。活BCG仅至少一次，而热灭活BCG和深度冻干灭活BCG至少两次(第0天和第36天)。每周测量爪垫增大的情况，连续10周。

图23所示的结果说明，深度冻干灭活BCG引起最小的炎症副作用。

c)降低LPS刺激引起的TNF-α产生

肺外植体来自如上所述经不同BCG制剂预先处理18天的小鼠，将肺外植体体外培养于有或没有LPS的条件下，然后使用商品化的ELISA试剂盒按照制造商的说明测定TNF-α的产生情况。图24所示的结果说明，不同于活BCG和热灭活BCG处理，深度冻干灭活BCG处理不诱导产生和/或激活巨噬细胞。

实施例8：分析皮下注射深度冻干灭活BCG后引流淋巴结内和脾脏内的细胞

1)材料与方法

以实施例3d所述的不同BCG制剂皮下注射处理小鼠，48小时后取小鼠的引流淋巴结，用标记了各种荧光的针对不同白细胞群体的细胞表面标记物的单克隆抗体，通过流式细胞仪分析引流淋巴结内的细胞。

取经皮下注射深度冻干灭活BCG处理的小鼠的脾脏的细胞，经或不经OVA或BCG培养物上清液体外刺激后，按照如上所述检测。

2)结果

a)引流淋巴结

对引流淋巴结内的细胞进行分析显示，与活BCG和热灭活BCG处理组相比，皮下注射深度冻干灭活BCG后48h，淋巴结内的细胞数量高处3至5倍。注射深度冻干灭活BCG后，对各种白细胞群体进行4天的动态分析，结果显示树突状细胞(CD11c⁺)数量在48小时时出现一过性升高，且发现B220+和CD4+淋巴细胞的数量自6至96小时出现升高。

b)脾脏

对脾脏内的细胞进行分析发现：

-CD11c⁺Gr1⁺B220⁺浆细胞样树突状细胞的数量在深度冻干灭活处理组明显升高，该组中未观察到CD8α⁺细胞升高(图25)。

-无论是以OVA或BCG培养物上清液进行体外刺激，还是不进行刺激，深度冻干灭活处理组中CD4⁺CD25⁺IL-10⁺细胞数量均明显增多(图26)。

这些结果说明，在小鼠哮喘模型中，深度冻干灭活BCG能够在预先以免疫原(OVA或水溶性ray-grass花粉)致敏的小鼠中诱导一些细胞数量明显升高，所述的细胞能诱导免疫调制细胞(CD11c⁺Gr1⁺B220⁺浆细胞样树突状细胞)或其本身即为免疫调制细胞(CD4⁺CD25⁺IL-10⁺细胞)，由此导致产生抗哮喘症状的保护作用。

实施例9：口服途径的深度冻干灭活BCG具有活性

如实施例3d所述，预先以OVA免疫小鼠，然后在第42，44，46和62，64和66天口服1mg深度冻干的制剂，或者不处理，然后在第96天以OVA进行攻击实验。如实施例3所述，通过计数肺部细胞浸润而评测深度冻干灭活BCG的保护作用。

结果显示，与未处理组(图27)相比，深度冻干灭活BCG处理组的肺部细胞总数明显降低(p＜0.001)。白细胞群体分析显示，处理组的肺内巨噬细胞、多形核白细胞和树突状细胞数量明显下降。

实施例10：确定深度冻干灭活BCG的作用剂量、施用周期(rhythm)、作用持续时间和作用的延迟

给预先免疫的小鼠皮下途径注射深度冻干灭活BCG，然后以OVA进行攻击实验，然后如实施例3所述测定深度冻干灭活BCG的活性。

a)作用剂量和施用次数

在第0天和第7天以OVA将成熟小鼠致敏，在第45天皮下注射深度冻干灭活BCG一次，或者在第45天和第65天两次皮下注射深度冻干灭活BCG，然后在第96天以卵清蛋白进行攻击实验。如实施例3所述，通过对BP2哮喘模型的支气管肺高反应性的预防作用检测深度冻干灭活BCG的活性。

最小的剂量(10μg)仍有活性，但剂量超过100μg并未进一步增加活性。

仅单剂(10μg)深度冻干灭活BCG显示出具有保护作用(图28)。

b)深度冻干灭活BCG的作用的延迟

为了确定获得深度冻干灭活BCG的功效的施用时序，在第0天和第7天以OVA将成熟小鼠(每组6只)致敏，在第14天皮下注射100μg深度冻干灭活BCG，然后在第21、28或35天以OVA进行攻击。如实施例3所述，通过对BP2哮喘模型的支气管肺高反应性的预防作用检测深度冻干灭活BCG的活性。

仅在施用深度冻干灭活BCG和攻击实验之间存在2-3周的延迟时才出现对支气管肺高反应性的预防作用(图29)；此结果提示深度冻干灭活BCG的作用的产生需要一个特定细胞群体的募集和扩增的过程。此结果也证实单剂的深度冻干灭活BCG足以在小鼠产生抗哮喘的保护作用。

c)深度冻干灭活BCG的作用持续时间

为了确定深度冻干灭活BCG的作用持续时间，在第0天和第7天以OVA将成熟小鼠(每组6只)致敏，在第45天和第65天皮下注射100μg深度冻干灭活BCG，然后在第96或42天以OVA进行攻击。如实施例3所述，通过对BP2哮喘模型的支气管肺高反应性的预防作用以及计数肺部细胞浸润情况来评测深度冻干灭活BCG的活性。

结果显示深度冻干灭活BCG的保护作用可持续至少2个月(图30)。

d)施用深度冻干的BCG的预防与治疗方案

上述结果证明了深度冻干灭活BCG在“治疗方案”(在以免疫原接种后施用)中的功效。因此，为了评价深度冻干灭活BCG在预防方案中的功效，将小鼠进行如下处理：

-在进行OVA免疫接种前14、21或28天(第-14、-21和-28天)，给成熟小鼠(6-7周龄；每组6只小鼠)皮下注射深度冻干灭活BCG(100μg)，在第0和7天以OVA进行免疫接种，然后在第14天以OVA进行攻击实验。

-在进行OVA免疫接种前56天(第-56天)，给新生小鼠(7-8日龄，每组6-8只小鼠)皮下注射或鼻内施用深度冻干灭活BCG(100μg)，在第0天和第7天以OVA进行免疫接种，然后在第14天以OVA进行攻击实验。

如实施例3所述，通过对BP2哮喘模型的支气管肺高反应性的预防作用来评测深度冻干灭活BCG在预防方案中的作用。

成熟小鼠中的结果显示，仅在进行致敏之前的某几天(2周和3周)注射深度冻干的BCG制剂时，该制剂才在预防方案产生保护作用。

新生小鼠中的结果显示，仅在皮下施用时，深度冻干的BCG才在预防方案中产生保护作用；在所述条件下，鼻内施用作用不佳。

Claims

1.含有非变性的灭活的牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovisBCG)细胞的组合物在制备一种用于预防和/或治疗选自癌症、自身免疫病或过敏症的疾病的药物中的用途所述药物能够诱导调制针对自身抗原或免疫原的免疫应答，其中所述组合物不包含任何活的牛分枝杆菌BCG和任何干燥剂，并且所述组合物是通过一种深度冻干方法而制备的，所述方法至少包含如下步骤：

-收集活的牛分枝杆菌BCG细胞的培养物，

-在水中或盐的水溶液中冷冻所述牛分枝杆菌BCG细胞，

-通过在冷冻干燥器中对所述冷冻的牛分枝杆菌BCG细胞进行干燥处理而将其灭活，处理的时间足以除去至少98.5％的水分，且

-收集所述的深度冻干灭活的牛分枝杆菌BCG细胞。

2.权利要求1的用途，其中所述的自身免疫病选自多发性硬化、类风湿性关节炎、克隆氏病或糖尿病。

3.权利要求1的用途，其中所述的过敏症选自哮喘、过敏性鼻炎、结膜炎或特应性皮炎。

4.权利要求1的用途其中所述组合物含有的残留水分低于1％。

5.权利要求1的用途，其中所述组合物含有的残留水分低于0.5％。

6.权利要求1的用途其中在干燥室压力为0.02mBar至0.2mBar的条件下对冷冻的牛分枝杆菌BCG细胞进行灭活。

7.权利要求1的用途，其中所述深度冻干方法包含在冷冻所述牛分枝杆菌BCG细胞之前在水中或盐的水溶液中洗涤所收集的牛分枝杆菌BCG细胞的额外步骤。

8.权利要求1的用途，其中所述冷冻牛分枝杆菌BCG细胞在硼酸盐的水溶液中进行。

9.权利要求7的用途，其中所述洗涤牛分枝杆菌BCG细胞在硼酸盐的水溶液中进行。

10.权利要求1至9中任一项的用途，其中所述的药物用于经口服、舌下、鼻内、或胃肠外而施用。

11.权利要求10的用途，其中所述胃肠外施用是经皮下施用。

12.权利要求3至9中任一项的用途，其中制备用于通过口服、胃肠外、舌下或鼻内途径，至少自通常接触免疫原之前2周开始，每间隔2个月施用以治疗哮喘的药物，其中所述药物的施用剂量范围相当于在小鼠中为1μg至10000μg。

13.权利要求3至9中任一项的用途，其中制备用于通过口服、胃肠外、舌下或鼻内途径施用以预防人类婴儿的哮喘的药物，其中所述药物的施用剂量范围相当于在小鼠中为1μg至10000μg。

14.含有深度冻干灭活的非变性的牛分枝杆菌BCG细胞的细菌制剂，其中所述细菌制剂不包含任何活的牛分枝杆菌BCG和任何干燥剂，并且通过至少含有如下步骤的方法而制备：

-收集活的牛分枝杆菌BCG细胞的培养物，

-在水中或盐的水溶液中冷冻所述牛分枝杆菌BCG细胞，

-收集所述的深度冻干灭活的牛分枝杆菌BCG细胞。

15.权利要求14的细菌制剂，其中在干燥室压力为0.02mBar至0.2mBar的条件下对冷冻的牛分枝杆菌BCG细胞进行灭活。

16.权利要求14的细菌制剂，其中所述深度冻干方法包含在冷冻所述牛分枝杆菌BCG细胞之前在水中或盐的水溶液中洗涤所收集的牛分枝杆菌BCG细胞的额外步骤。

17.权利要求14的细菌制剂，其中所述冷冻牛分枝杆菌BCG细胞在硼酸盐的水溶液中进行。

18.权利要求16的细菌制剂，其中所述洗涤牛分枝杆菌BCG细胞在硼酸盐的水溶液中进行。

19.一种药物组合物，其包含(1)有效量的如权利要求14至18中任一项所定义的细菌制剂，和(2)一或多种药物学可接受的载体、添加剂、免疫刺激剂、佐剂和不同于权利要求14至18中任一项所定义的细菌制剂的免疫调制剂，其中所述药物组合物不包含任何活的细菌。

20.作为一种同时、单独或序贯使用用于预防和/或治疗选自癌症、自身免疫病和过敏症的疾病的联合制剂的制品，其由以下组成：(1)含有如权利要求1以及4至9中任一项所定义的非变性的灭活的牛分枝杆菌BCG细胞的第一制品，其中所述第一制品不包含任何活的牛分枝杆菌BCG，以及(2)一种选自抗癌药物、抗糖尿病药物或免疫调制药物的第二制品。

21.权利要求20的制品，其特征在于所述药物是一种抗组胺药物或一种抗炎药物。