JP2010502766A - アジュバントとしてのキチン微粒子 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、キチン(天然のNアセチル−D−グルコサミンの多量体)微粒子の調製と、免疫アジュバントとしてのキチン微粒子の特徴付けと、キチン微粒子の使用とに関し、該キチン微粒子の使用は、感染しやすいモデル動物において食中毒及び胎児の流産の原因となるリステリア モノサイトゲネスのような病原体に対する防御免疫を増強する。
キチン微粒子を含む組成物。キチン(天然のNアセチル−D−グルコサミンの多量体)微粒子の調製と、免疫アジュバントとしてのキチン微粒子の特徴付けと、病原体に対する防御免疫を増大するためのキチン微粒子の使用との方法。
本明細書で用いられるところの「被験体」又は「患者」とは、本発明に従って実施される治療の受容者をいう。前記被験体はいずれかの脊椎動物であるが、哺乳類であることが好ましい。哺乳類の前記被験体はヒトであることが好ましいが、家畜、実験動物又はペット動物となる場合がある。
キチン微粒子が宿主(実験動物)に供与されたとき、該宿主防御機構は図1で示されたように促進される。感染性細菌をファゴサイトーシスするマクロファージに類似する機構でマクロファージ(MΦ)は、キチン微粒子をファゴサイトーシス(取り込み)する。3時間ないし24時間以内にIL−12及び腫瘍壊死因子−α(TNFα)を誘導するTh1サイトカインをマクロファージは産生する。前記Th1サイトカインはナチュラルキラー(NK)細胞を活性化し、該細胞は12時間ないし24時間以内にインターフェロン−ガンマ(IFNγ)を産生するであろう。キチン微粒子投与後1日ないし3日以内にIFNγはマクロファージを活性化し、該マクロファージは活性酸素及び窒素中間体(ROI及びRNI)を生じるさせ、該ROI及びRNIはスーパーオキサイドアニオン及び一酸化窒素を含む。
前記好ましい実施態様では、前記キチン微粒子はTh1応答に対するアジュバント及び免疫転換剤として用いられ、抗原の異なるタイプは前記組成物に含まれる。免疫応答が生じるとき、該免疫応答はワクチン接種された個体に対する複数のレベルの治療効果を提供するために前記抗原は選択され、該治療効果は、例えば、病原体に対する複数のレベルの有効な保護である。前記実施態様では、Th1の特性の前記免疫応答を増大するために改変されたDNAワクチンに由来する前記免疫応答を示し、ワクチンにおいて前記DNAによってエンコードされる前記抗原は所望のこの効果とともに選択されるであろう。
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ノケグサ及び
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ギのアレルゲンを含み、一般的なアレルゲンは、アルテルナリア属、フザリウム属、ホルモデンドラム属、アスペルギルス属、ミクロポリスポラ属、ケカビ属及び好熱性放線菌類のような糸状菌又は真菌から得られ、ペニシリン及びテトラサイクリンは一般的な抗生物質性アレルゲンであり、上皮性のアレルゲンは、ウマ又は有機的なホコリ(真菌に由来するのが典型的である。)か、家ダニのような昆虫(ヤケヒョウヒダニ)か、あるいは羽毛と、ネコ及びイヌのフケとのような動物性資源から得られ、一般的な食物アレルゲンは、ミルク及びチーズ(習慣)、卵、小麦、木の実(例えば、ピーナッツ)、海産物(例えば、甲殻類)、エンドウ豆、豆及びグルテンのアレルゲンを含み、一般的な薬物アレルゲンは局所麻酔薬及びサリチル酸塩のアレルゲンを含み、抗生物質性アレルゲンはペニシリン及びスルホンアミドのアレルゲンを含み、一般的な昆虫のアレルゲンは、ミツバチ、スズメバチ及び蟻の毒素と、ゴキブリの杯とのアレルゲンを含む。特によく特徴付けられたアレルゲンは、Der p Iアレルゲンの主要及び潜在性エピトープ(Hoyneら、Immunology、83190−195(1995))と、ミツバチの毒素のホスホリパーゼA2(PLA)(Akdisら、J. Clin. Invest. 98:1676−1683(1996))と、カバの花粉アレルゲンBet v 1(Bauerら、Clin. Exp. Immunol. 107:536−541(1997))と、組み換えイネ科植物の多数エピトープのアレルゲンrKBG8.3(Caoら、Immunology 90:46−51(1997))とを含むが、これらに限られない。前記又は他の適切なアレルゲンは商業的に入手可能及び/又は以下の周知技術で容易に調製される。
方法の好ましい実施態様では、肝臓、骨髄、のような特異的組織に直接的にか、あるいは癌治療の場合における腫瘍にキチン微粒子組成物は全身性又は粘膜性経路を介して投与される。全身性経路の例は、皮内注、筋注、皮下注及び静注を含むが、これらに限られない。粘膜性経路の例は、経鼻、経膣、腎臓内、気管内及び眼内投与を含むが、これらに限られない。粘膜経路、特に経鼻、気管内及び眼内投与は環境中の病原体か、あるいはアレルゲンへの自然曝露に対する保護のために実施され、該病原体は、RSV、インフルエンザウイルス及び感冒ウイルスのようなものであり、該アレルゲンは、イネ科植物及びブタクサの花粉と、家屋内のチリ・ダニとのようなものである。キチン微粒子による自然免疫の局所的活性化は、抗原、アレルゲン、病原体のような物質に遭遇後に対する保護効果を増大させるであろう。
キチン微粒子の精製
発明者はキチン微粒子を調製するための方法を確立し、該微粒子はマクロファージの活性化を誘導し、殺菌効果及びTh1アジュバント効果を仲介する。
1.未精製のキチン調製物(C9213)はSigma社から購入された。2.エンドトキシン不含生理食塩水で洗浄した。3.酸可溶性キチンは、30分間冷たい12N 塩酸(HCl)でキチン混合物から抽出された。4.酸可溶性キチンは、4°Cで1,500xg、15分間の遠心分離によって単離された。5.酸可溶性キチンは、冷たい10N 水酸化ナトリウム(NaOH)でpH7に中和された。6.キチンは不溶性となり、沈殿した。7.不可溶性キチンは、4°Cで1,500xg、各15分間の遠心分離によって生理食塩水で5回洗浄された。8.pH7.0に調製した後に、不溶性キチンは遠心分離によって収集された。9.ペレットは凍結乾燥され、乾燥機に保管された。
10.凍結乾燥されたキチン粉末は、約50mg/mLで生理食塩水に懸濁された。11.前記懸濁は氷上で音波破壊された。12.1−10μmのキチン粒子は10μmの孔を有するナイロンメッシュを通じて濾過された。粒子の は4−5μmであった。1−4μmのキチン粒子は、4μmの孔を有するナイロンメッシュを通じてさらに濾過された。13.濾過された粒子は、4°Cで1,500xg、各15分間の遠心分離によって生理食塩水で4回収集され、洗浄された。14.前記遠心分離収集物は、使用前に10mg/mL又は16mg/mLに調製された。
生物活性分子はマクロファージ培養で測定され、以上で調製された生物活性分子のキチン微粒子の測定するために、マウスマクロファージRAW264.7細胞は20又は100μg/mLのキチン粒子で3、6及び24時間刺激された。上清中のTh1サイトカインである腫瘍壊死因子−α(TNFα)のレベルは、商業的に入手可能なELISAキット(PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)によって測定された。陽性対照として、5μg/mLの細菌のDNA(CpG−ODN)及び0.1μg/mLの細菌のエンドトキシン(LPS)は比較検討のために用いられた。陰性対照として、培養液単独(無刺激対照)、100μg/mLのキトサン微粒子(脱アセチル化キチン粒子)及び5μg/mLのGpC−ODNは用いられた。図3に示されたように、発明者の新たに調製されたキチン粒子は、細菌のCpG及びLPSによるレベルに匹敵するレベルで活性分子を産生するTNFαを誘導した。
正常なBalb/c及びC57BL/6は、感染に対して感受性かつ耐性のおのおのとなることが知られており、IL−10ノックアウトC57BL/6(IL−10−/−)マウスはC57BL/6(野生型、WT)マウスより耐性であり、アテローム性動脈硬化のモデルとして用いられる高コレステロール血症系統のアポリポプロテインEノックアウトC57BL/6(apoE−/−)マウスは、C57BL/6(野生型)マウスよりもL.モノサイトゲネスの感染に対してより感受性であった。
CpG−ODNで刺激されたとき、無処理のRAW264.7マクロファージは1,106 pg/mLのIL−10を産生した(表2)。CpG−ODNで刺激されたマクロファージは、CpG−ODN刺激の前後の選択された時点においてキチン粒子で処理された。キチン微粒子は、CpG−ODN刺激の9時間後までにIL−10産生を著しく阻害したことをその結果(表2)は示した。
本発明はこれらの詳細の説明を説明すると理解されるであろうが、前述の説明は例示することを意図し、本発明の射程を限定することを意図するものではない。他の局面、利益及び改変は以下の特許請求の範囲で定められる範囲内である。
Claims (24)
- 直径約0.01μmないし20μmのキチン微粒子を少なくとも1個含むことを特徴とする、アジュバント組成物。
- 前記キチン微粒子は直径約1μmないし10μmであることを特徴とする、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 前記キチン微粒子は直径約1μmないし4μmであることを特徴とする、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 前記キチン微粒子は、2型ヘルパーT細胞の活性を低下させ、1型ヘルパーT細胞の活性を増大させるのに有効な量で医薬品組成物に懸濁されることを特徴とする、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 前記キチン微粒子は、1ミリグラムあたり粒子約1×103個から5×109個までの濃度で存在することを特徴とする、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 前記キチン微粒子は、1ミリグラムあたり粒子約1×108個から約6×108個までの濃度で存在することを特徴とする、請求項5に記載のアジュバント組成物。
- 前記キチン微粒子の直径が約1μmないし約10μmのとき、該キチン微粒子は1ミリグラムあたり粒子約1×108個から約3×108個までの濃度で存在することを特徴とする、請求項5に記載のアジュバント組成物。
- 前記キチン微粒子の直径が約1μmないし約4μmのとき、該キチン微粒子は1ミリグラムあたり粒子約3×108個から約6×108個までの濃度で存在することを特徴とする、請求項5に記載のアジュバント組成物。
- 前記組成物は、マイコバクテリウム属細菌の抗原と、MDP−59と、ブタクサのアレルゲンと、ピーナッツのアレルゲンと、木の実のアレルゲンと、花粉のアレルゲンと、家屋内のチリ・ダニのアレルゲンと、ゴキブリのアレルゲンと、卵白アルブミンと、マイコバクテリウム属細菌のヒート・ショックタンパク質65と、抗原と、これらの精製タンパク質誘導体(PPD)及び誘導体とをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 前記抗原は、ワクチン、腫瘍抗原、ウイルス性抗原、細菌性抗原又はペプチドを含むことを特徴とする、請求項9に記載のアジュバント組成物。
- エンドトキシン不含生理食塩水でキチンの原料を洗浄するステップと、
洗浄されたキチンを酸と混合するステップと、
酸可溶性のキチンの抽出及び単離するステップと、
可溶性のキチンを中和及び沈殿するステップと、
水に不溶性のキチンを洗浄するステップと、
水に不溶性のキチンを凍結乾燥するステップと、
水に不溶性のキチンをエンドトキシン不含生理食塩水に再懸濁するステップと、
キチンの粒子を微細孔を通して濾過するステップと、
1−10μmのキチン微粒子を調製するステップとを含むことを特徴とする、キチン微粒子を調製する方法。 - 前記キチン微粒子のサイズは約1μmないし4μmであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 生理食塩水中の前記キチン微粒子は少なくとも1年間4°Cで安定であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 約1μmないし4μmの前記キチン微粒子の治療上の有効量を患者に投与するステップを含むことを特徴とする、炎症性疾患を治療及び/又は予防する方法。
- 前記キチン微粒子は、患者の体重1キログラムあたり約0.1−500mgを含む量で投与されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記キチン微粒子は、患者の体重1キログラムあたり約0.1−10mgを含む量で腹腔内又は皮下に投与されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記キチン微粒子は、経口投与されるとき、患者の体重1キログラムあたり約0.1−1gを含む量で投与されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記キチン微粒子は、2型ヘルパーT細胞の活性を低下させ、1型ヘルパーT細胞の活性を増大させるのに有効な量で医薬品組成物に懸濁されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 投与経路は、経口投与、腹腔投与、静注及び/又は皮下投与であることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記キチン微粒子の投与はTh2が介在する疾患を下向き調節するのに治療上有効であり、前記疾患は、アレルギー性喘息、食物アレルギー及びアレルギー性皮膚炎を含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記キチン微粒子の投与は、細胞内感染に対するTh1宿主防御を上向き調節するのに治療上有効であることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 直径約1μmないし4μmの前記キチン微粒子の有効量を動物に投与するステップを含むことを特徴とする、免疫応答を変調する方法。
- 前記キチン微粒子は、2型ヘルパーT細胞の活性を低下させ、1型ヘルパーT細胞の活性を増大させるのに有効な量で医薬品組成物に懸濁されることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
- 投与経路は、経口投与、腹腔投与、静注及び/又は皮下投与であることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
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