JP2009523721A - ポリイノシン酸−ポリシチジル酸に基づくアジュバントを含む、免疫原性物質 - Google Patents

ポリイノシン酸−ポリシチジル酸に基づくアジュバントを含む、免疫原性物質 Download PDF

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Abstract

本発明は、ポリヌクレオチドアジュバント(PICKCa)組成物、および、免疫応答、特に粘膜免疫応答を引き起こす際の使用方法を提供する。ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種の陽イオンを含んでいる。本発明はまた、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原および/またはがん抗原から選択される抗原(例えば、ワクチンに見られるようなもの)などの他の免疫原性組成物と共にポリヌクレオチドアジュバント組成物が含まれている免疫原性組成物を提供する。本発明はさらに、このようなアジュバント組成物の使用方法、特に免疫応答、とりわけ抗原性化合物に対する粘膜免疫応答を引き起こす際の使用方法を意図している。

Description

発明の詳細な説明
〔発明の分野〕
本発明は、概して、免疫原性組成物およびこれを用いた方法に関する。より詳細には、本発明は、宿主において疾患に特異的な免疫応答を引き起こすのに使用される、一つ以上の抗原性物質を組み合わせたポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫原性組成物に関する。
〔発明の背景〕
免疫システムは、特異免疫および非特異免疫のいずれも示す。非特異免疫は、いろいろある中で、例えば、マクロファージまたは顆粒球によるファゴサイトーシス(外来微粒子または抗原の取り込み)、およびナチュラルキラー(NK)細胞活性など、様々な細胞およびメカニズムを含んでいる。非特異免疫は、進化があまり進んでいないメカニズムに依存しており、特異免疫応答の典型的な特徴である、特異性および記憶の獲得性質を示さない。特異免疫と非特異免疫との主要な違いは、B細胞およびT細胞特異性に基づくものである。これらの細胞は、主に、特定の抗原による活性化の後にそれらの応答性を獲得し、この抗体にさらにさらされることがあったときに、記憶を提示するメカニズムを有している。その結果、ワクチン接種(特異性および記憶を含む)は、有害な病原体に対する防御のための有効なプロトコールとなる。
通常、Bリンパ球およびTリンパ球は、特定の抗原に特異的なレセプターを細胞表面に提示しており、特異免疫を生み出している。特異免疫システムは、2つの手段により、異なる抗原に応答できる:1)B細胞刺激およびB細胞による抗体もしくは免疫グロブリンの産生、抗原ならびにヘルパーT細胞(主に、Th2)を含む、液性免疫、および2)細胞傷害性Tリンパ球(CTLs)を包含するT細胞を通常含み、CTL応答の産生に関与する他の細胞(例えば、抗原提示細胞およびTh1細胞)もまた含む、細胞性免疫。
より安全で、より有効なワクチンを求めた継続的な研究において、組み換え、精製および合成方法を含む新しい技術が、質および用いられる抗原に対する特異性を向上させるために用いられている。精製した抗原、サブユニット化された抗原および合成抗原は、安全性の向上を示したが、有効なアジュバントを同定するための一つの要因(driver)である免疫原性が減少していた。したがって、有効なアジュバントは、ますます、最近のワクチンの必須成分となっている。アジュバントは、概して、抗原と共に(抗原の投与と同時に、もしくは抗原の投与よりも所定の時間で先に)投与したときに、その特定の抗原に対する免疫応答を亢進させ、および/または修正する組成物である。
免疫応答を亢進させるために用いられている典型的なアジュバントとしては、アルミニウム組成物(全て、一般的に“ミョウバン”と称されている)、水中油型(oil-in-water)エマルジョン(フロイント完全アジュバント(CFA)は、乾燥し熱殺菌した結核菌(Mycobacterium tuberculosis)生物を含む水中油型エマルジョンである)、サポニン(キラヤ・サポナリア(Quillaja Saponoria)の樹皮から単離したものであり、Quile Aとして知られているアジュバント活性成分である)、CpG ODN(非メチル化CpGジヌクレオチドを含む、合成オリゴデオキシヌクレオチド)、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)Re595のリポ多糖類由来のモノホスホリル脂質A(MPL)、リポソーム(通常、リン脂質などの生分解性物質により作り出されている)、および生分解性ポリマーミクロスフィア(ポリホスファゼンおよびポリ無水物などの様々なポリマーにより作られている)がある。これら化合物のアジュバントの特性は、それぞれのアジュバントが長所および短所を示すものとして評価されてきている。
ポリヌクレオチド複合体は、アジュバントとしての作用を含め様々な応用について調べられてきている。二本鎖RNA(dsRNAs)は、ナノモルの濃度で細胞に対して深い影響を及ぼすことができる、非常に強力な生物学的修飾因子である。dsRNAによる調節効果は、分子レベルおよび細胞レベルにおいて、広範な範囲の作用に及ぶ。
分子レベルにおいて、dsRNAsは、インターフェロン合成、プロテインキナーゼの誘導、組織適合抗原の亢進および代謝阻害などの生物学的効果を引き起こすことができる。また、細胞レベルにおいて、dsRNAは、発熱性(pyrogenicity)、有糸分裂生起(mitogenicity)、マクロファージの活性化、液性免疫の活性化、細胞性免疫の活性化および抗ウイルス状態の誘導などの生物学的効果を引き起こすことができる。dsRNAsの免疫調節効果はすでに開示されている。米国特許第4,124,702号には、生きている動物の細胞において二本鎖ポリヌクレオチドがインターフェロン誘導を引き起こすことが、開示されている。米国特許第3,906,092号には、アジュバント型ワクチンに対する抗体応答がポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド複合体のワクチンと結合することにより増大することが、開示されている。Houstonらは、新たなアジュバントを追加することなく一次抗体反応を増加させることにより、強力なアジュバントとしてPICLC(ポリイノシン酸ポリシチジル酸ポリ−L−リジンカルボキシ−メチルセルロース複合体)を構築した。
ポリイノシン酸−ポリシチジル酸(PIC)は、最もよく研究されているポリヌクレオチド複合体の一つであるが、サルおよびヒトに用いた場合には、投与後、体内において不安定であるため、効果的ではなかった。そのため、一つまたは他の欠陥を克服するために、様々な手法によるPICの修飾がなされてきている。例えば、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸とポリ−L−リジン臭化水素酸塩との複合体は、もとのPICと比較して、膵臓リボヌクレアーゼによる加水分解に対して、およそ5から15倍の耐性がある。
Linらは、ポリイノシンポリシチジル酸、カナマイシンおよびカルシウムを含む抗ウイルス薬はアジュバントとして用い得ることを報告している(Lin, et al., A new immunostimulatory complex(PICKCa) in experimental rabies: antiviral and adjuvant effects, Arch Virol, 131:307-19, 1993;および中国特許第93105862.7号)。中国特許第93105862.7号では、ヒトおよび哺乳動物への利用のためのワクチンにおけるアジュバントとして、ポリI:C、カナマイシンおよびカルシウム(PICKCa)の一般組成物の利用を提供している。しかしながら、当初同定されたPICKCaの形態は、アジュバントの利用として最適な効率/安全性に関する特徴点をもたらさず、また、特定の状況下においては、許容できない意に沿わない副作用をも含んでいることをLinは見出していた。
本発明は、安全性および効率の特徴点が向上している新規な免疫原性組成物;およびこの組成物の利用方法を提供する。主たる免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバントおよび抗原を含んでいる。
[文献]
以下の参考文献が着目される。
・日本国特開平01−93540号
・米国特許第4,124,702号
・米国特許第3,692,899号
・米国特許第3,906,092号
・米国特許第4,389,395号
・米国特許第4,349,538号
・米国特許第4,024,241号
・米国特許第3,952,097号
・Houston et al., Infection and Immunity, 14:318-9, 1976C
・Wright and Adler-Moore, Biochemical and Biophysical Research Communications, 131:949-45, 1985
・Lin, et al., A new immunostimulatory complex(PICKCa) in experimental rabies; antiviral and adjuvant effects, Arch Virol, 131:307-19, 1993
・中国特許第93105862.7号
・Gupta R.K. et al., Adjuvants - a balance between toxicity and adjuvanticity, Vaccine, 11:293-306, 1993
・Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines 1:83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1987
・Sela, M., Science 166:1365-1374 (1969)
・米国特許第6,008,200号
・Ellouz et al., Biochem. & Biophy. Res. Comm., 59:1317, 1974
・米国特許第4,094,971号
・米国特許第4,101,536号
・米国特許第4,153,684号
・米国特許第4,235,771号
・米国特許第4,323,559号
・米国特許第4,327,085号
・米国特許第4,185,089号
・米国特許第4,082,736号
・米国特許第4,369,178号
・米国特許第4,314,998号
・米国特許第4,082,735号
・米国特許第4,186,194号
・米国特許第6,468,558号
・New Trends and Development in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Md., USA, 1978
・Klein, J., et al., Immunology(2nd), Blackwell Science Inc., Boston (1997)
・Gupa R.K. and Siber G.R., Adjuvants for human vaccines - current status, problems and future prospects, Vaccine, 13 (14):1263-1276, 1995
・Richard T Kenney et al. Meeting Report - 2nd meeting on novel adjuvants currently in/close to human clinical testing, Vaccine 20 2155-2163, 2002
・Laboratory Techniques in Rabies Edited by F X Meslin, M M Kaplan, H Koprowski 4th, 1996, Edition ISBN 92 4 1544 1
〔発明の概要〕
概して、本発明は、免疫原性または抗原性物質と共にポリヌクレオチドアジュバントを含む新規な免疫原性組成物、および免疫応答を引き起こす利用方法に関する。
したがって、(a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、(b)少なくとも1種類の抗原とを含む免疫原性組成物であって、持続放出投与するように剤形化されていることを特徴とする免疫原性組成物が提供される。
本発明に係る免疫原性組成物は、分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも66,000ダルトンである。
〔図面の簡単な説明〕
図1−PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図2−PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図3−PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後のマウス脾細胞により生産されたIL−4のELISPOT検出。
図4−PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(400×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出。
図5−PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−ガンマ(γ)を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図6−PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図7−PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図8−PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(900×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出。
図9−PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図10−PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図11−PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図12−PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+細胞の割合。
図13−PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図14−PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図15−PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図16−PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+細胞の割合。
図17−PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(400×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出。
図18−PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化16週間後のマウス血清に由来する特定のIgGの力価のELISA検出。
図19−PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図20−PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図21−PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図22−PIKAおよび/またはHSV 2gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+細胞の割合。
図23−PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(2,700×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出。
図24−PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図25−PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図26−PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図27−PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+ve細胞の割合。
図28−PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(900×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出。
図29−PIKAおよび/または不活化SARS抗原の全体を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(16,000希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出。
図30−PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定の抗体H5の力価のELISA検出。
図31−PIKAおよび/または不活化H9N2抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定のH9抗体の力価のELISA検出。
図32−野生の狂犬病ウイルスにさらされた後に狂犬病ワクチンを処方されたマウスの生存率。
図33−PIKAおよび/またはHBs抗原adwを含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のELISA検出。
図34−PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のELISA検出。
図35−PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のIgG1の力価のELISA検出。
図36−PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のIgG2の力価のELISA検出。
図37−PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出。
図38−PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞(2ug/mlのIPQペプチドを用いて6日間再刺激した後)のELISPOT検出。
表1は、抗原源としての役割を果たし得る典型的なウイルス病原体およびこれらの有機体に関連する疾患の表である。
表2は、抗原源としての役割を果たし得る典型的な細菌性病原体およびこれらの生物に関連する疾患の表である。
表3は、抗原源としての役割を果たし得る典型的な真菌性病原体およびこれらの生物に関連する疾患の表である。
表4は、抗原源としての役割を果たし得る典型的な寄生生物およびこれらの生物に関連する疾患の表である。
表5は、抗原源としての役割を果たし得る典型的ながん(例えば、組織別によるもの)の表である。
〔本発明を例示する実施形態の詳細な説明〕
本発明は、以下の本発明の特定の実施形態の詳細な説明および本明細書に記載の実施例を参照することにより、より容易に理解されるだろう。
本出願は参考文献を載せており、これらの文献の開示内容は、本発明の属する分野の技術水準をより十分に説明するために、そのまま、本出願に参考として援用される。
本発明についてさらに説明する前に、本発明が、説明に用いられる特定の実施形態に限定されるものではなく、当然、変化したものであってもよいことは、理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
別の定義をしていない限り、本明細書における技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の通常の当業者のひとりによって一般的に理解される意味と同じ意味で用いられる。本明細書において記載されているものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施および評価にも用いることができるものの、好ましい方法および材料がここに記載されている。本明細書において記載されている全ての文献は、方法および/または材料を開示し、説明するために、当該文献に挙げられている方法および/または材料と併せて、本明細書に参考として援用される。
本明細書および特許請求の範囲に用いているように、単数形である「一」、「および」および「その」は、前後関係から別のことであることが明確に指示されていない限り、複数形の対象を含むものである点、留意しなければならない。したがって、例えば、「一免疫原性組成物」というときは、このような組成物の複数を含み、また、「その抗原」というときは、一つ以上の抗原をいうこと、および当業者において公知の、その他それらと同等のものを含む。特許請求の範囲は任意の構成要素を考慮しないで作成してもよいことは、さらに留意すべきである。そのようなものとして、この明細書は、請求項の構成要素の列挙と共に、「一つだけ」および「のみ」など排他的な用語を使用するための、または「消極的」な限定を使用するための根拠としての役割を果たすことが意図されている。
<用語の定義>
本発明の詳細について記載する前に、本明細書に用いられるいくつかの用語の定義を記載することは、本発明を理解するために有用であろう。
本明細書において用いる場合、用語「アジュバント」は、抗原性化合物に対する宿主の免疫応答を増大または多様化させる任意の物質または物質の混合物をいう。
特に:
1.用語「PICKCa」は、特定の物理的特性および免疫原性特性に関わりなく、概して、ポリI:C、カナマイシンおよびカルシウムを含む組成物を指す。
2.「Av−PICKCa」は、抗ウイルス剤として商業的に用いられているPICKCaの形態を指す。
3.「PIKA」は、ポリI:C、抗生物質(例えば、カナマイシン)、陽イオン(例えば、カルシウム)を含む本発明の組成物を指し、PIKAは投与におけるような物質特性(例えば、分子量、サイズなど)により特徴付けられ、PIKAは、例えばPICKCaよりも意に沿わない副作用が低減しており(例えば、毒性の低下)、また例えばAv−PICKCaよりも有効性が優れている(例えば、亢進した免疫応答を刺激する)というアジュバントの特徴を示す。
用語「ポリI:C」または「PIC」は、ポリリボイノシン核酸およびポリリボシチジル核酸(これらは、それぞれ、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸ともいう)を含む組成物を指す。
「PIC含有分子」または「PIC含有化合物」は、特に制限なく、PICを指し、PIC含有分子を含む組成物中に存在する抗生物質(例えば、カナマイシン)および陽イオン(例えば、カルシウム)の少なくとも一つまたは両方と、状況に応じて複合し、または別の方法で組み合わされている。一実施形態において、PIC含有分子は、複合体中に、ポリ−L−リジンまたはその誘導体を含んでいない。
本明細書において、本発明のアジュバント組成物との関連で用いられる場合、「不均一」は、例えばPIC含有分子などの組成物の構成物質が、分子量、サイズまたはその両方の物理的特性に関して均一ではないことを指す。組成物が所定の物理的特性において不均一であるとして記載されている場合、またさらに組成物がその物理的特性において一定の値の範囲であるとして記載されている場合、列挙された範囲にわたる、および範囲を超えた物理的特性を有する分子により特徴付けられる分子から実質的に構成されていると考えられている。組成物は、列挙された範囲の上限と下限との間の全ての物理的特性値に対応する分子は含んでいないものの、組成物は、概して、上限値および下限値の物理的特性を有する分子を少なくとも一つは含んでいるだろう。特定の実施形態における組成物は、組成物を説明するために用いられる物理的特性の規定の範囲からはずれた分子を含んでいてもよい。組成物中にある、規定した範囲からはずれた分子は、組成物の基本特性および新規特性に実質的に影響を与えない。
用語「個体」は、本明細書において、「宿主」、「被験体」および「動物」と交換可能に用いられ、ヒト、ならびに家畜およびペットなど全ての家畜化された哺乳動物および野生の哺乳動物、ならびに家禽が含まれ、畜牛、ウマ、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、シカ、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウおよびゲームヘンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含んでおり、同様に、Fab、F(ab’)2、FdおよびFv断片を含むような抗体の抗原性物質結合断片、ならびにそれらの一本鎖誘導体を含んでいる。さらに、用語「抗体」は、自然に生じる抗体および自然には生じない抗体を含み、例えば、キメラ抗体、二官能性抗体およびヒト化抗体ならびに関連した合成アイソフォームが含まれる。用語「抗体」は、「免疫グロブリン」と交換可能に用いられる。
本明細書で用いられる場合、「抗原性化合物」は、適当な条件下において免疫システムに認識され得る(例えば、抗体が結合する、または細胞内免疫応答を引き起こすために加工される)任意の物質を指す。
本明細書で用いられる場合、「抗原」は、細胞、細胞抽出物、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、核タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖複合体、ペプチドによる多糖模倣物、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルス、ウイルス抽出物、細菌、細菌抽出物、真菌、真菌抽出物、寄生生物などの多細胞生物、およびアレルゲンを含むが、これらに限定されるものではない。抗原は、外来性(例えば、抗原が投与される個体以外に由来するもの、例えば、異なる種に由来するもの)、または内因性(例えば、宿主内に由来するもの、例えば、身体の罹患成分、がん抗原、および抗原を生産するウイルス感染細胞など)のものであってよい。抗原は、天然のもの(例えば、自然に生じるもの)、合成したもの、または組み換えたものであってよい。抗原は、粗抽出物、全細胞、および精製抗原を含む。ここで「精製」とは、抗原が通常生じる環境および/または例えば抗原の培養状態などの粗抽出物と比較して濃縮されている状態の抗原を指す。
本明細書で用いられる場合、「免疫原性組成物」は、宿主に投与したときに免疫応答を共に引き起こす2以上の物質(例えば、抗原およびアジュバント)を組み合わせたものを指す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸の任意の長さの重合形態を指し、コードしているアミノ酸およびコードしていないアミノ酸、化学修飾もしくは生化学修飾アミノ酸または誘導アミノ酸、ならびに修飾されたペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含み得る。
「抗原性化合物の有効量」は、任意的にアジュバントを組み合わせたときに、抗原性化合物に対する特異免疫応答を対象に引き起こさせるであろう抗原性化合物の量を指す。
用語「免疫応答」は、脊椎動物被験体の免疫システムによる、抗原性または免疫原性化合物に対する任意の応答を指す。典型的な免疫応答は、CD8 細胞傷害性Tリンパ球(CTLs)の抗原特異的誘導を含むCTL応答、T細胞の増殖反応およびサイトカイン放出を含むヘルパーT細胞応答ならびに抗体反応を含むB細胞応答などの、局所および全身性細胞性免疫および液性免疫であるが、これらに限定されるものではない。
用語「免疫応答を引き起こすこと」は、主に、免疫応答の誘導および/または増強作用を包含するために本明細書において用いられる。
用語「免疫応答を誘導すること」は、刺激された、引き起こされた、または誘導された免疫応答を指す。
用語「免疫応答を増強すること」は、向上した、促進された、補われた、増幅された、亢進した、増大した、または引き延ばされた既存の免疫応答を指す。
「亢進した免疫応答」という表現または類似の表現は、事前の免疫応答の状態、例えば本発明の免疫原性組成物の投与の前の状態と比較して、宿主に対する免疫応答の利点が高まり、向上し、亢進していることを意味する。
用語「液性免疫」および「液性免疫応答」は、抗原刺激に応答して抗体分子が産生される免疫の形態を指す。
用語「細胞性免疫」および「細胞性免疫応答」は、例えば、T細胞リンパ球が被害細胞に近接したときにT細胞リンパ球によりもたらされる免疫防御など、リンパ球によりもたらされる免疫防御を指すことを意味する。細胞性免疫応答は、通常、リンパ球の増殖を含む。「リンパ球増殖」が測定されるとき、特定の抗原に応答したリンパ球の増殖能力が測定される。リンパ球増殖は、B細胞、Tヘルパー細胞、または細胞傷害性Tリンパ球(CTL)細胞増殖を指すことを意味する。
用語「免疫原性量」は、主たる免疫原性組成物を投与したときに、ポリヌクレオチドアジュバントの非存在下で抗原により引き起こされる免疫応答と比較して、免疫応答を刺激するのに十分な抗原性化合物の量を指す。
用語「免疫増強量」は、本発明の組成物における抗原性化合物を投与したときに、ポリヌクレオチドアジュバントの非存在下で観察される抗体および/または細胞性免疫レベルの増加と比較して、抗体力価および/または細胞性免疫の増加をもたらすのに必要なアジュバントの量を指す。
用語「処理」、「処理すること」および「処理する」などは、概して、所望の薬理効果および/または生理学的効果を獲得することを指すために本明細書において用いられる。この効果は、疾患または疾患の症状を完全にまたは部分的に抑えるという観点から予防の効果であってよく、および/または、疾患および/または疾患に起因する副作用を部分的にまたは完全に安定化する、または治癒するという観点から治療の効果であってよい。本明細書において用いる場合、「処理」は、被験体の、特に哺乳動物被験体の、より特にはヒトの疾患に対する任意の処理に及び、以下のものを含む:(a)疾患または症状にかかりやすいが未だかかっているとは診断されていない被験体において、疾患または症状が生じるのを抑えること、(b)疾患の症状を防ぐこと、例えば、その発達を阻むこと、または疾患の症状を軽減させること、すなわち、疾患または症状の退行を引き起こすこと、(c)疾患を引き起こす病原体により産出される産物(例えば、毒素および抗原など)の水準の低減、および(d)疾患を引き起こす病原体に対する、好ましくない生理反応(例えば、発熱および組織浮腫など)を減少させること。
本明細書において用いる場合、用語「混合すること」は、組成物の構成成分を混ぜ合わせる任意の方法を含むものである。このような方法としては、組成物の構成成分の混和、分配、溶解、乳化、凝固もしくは懸濁、または組成物の構成成分を物理的に混ぜ合わせる別の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
化合物の「薬剤として許容される塩」は、薬剤として許容され、もととなる化合物の所望の薬理活性を保持している塩を意味する。このような塩としては以下のものが含まれる:(1)酸を添加した塩であり、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸およびリン酸などの無機酸により形成されているもの、または、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、琥珀酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3−(4−ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2−エタンジスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−クロロベンゼンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、4−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、4,4’−メチレンビス−(3−ヒドロキシ−2−エン−1−カルボン酸)、3−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、tert−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸およびムコン酸などの有機酸により形成されているもの、または(2)もととなる化合物にある酸性プロトンを、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオンなどの金属イオンにより置換するか、または、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミンおよびN−メチルグルカミンなどの有機塩基を用いて調整するかの何れかにより形成された塩。
本明細書において用いられる場合、用語「単位剤形」は、ヒトおよび動物被験体に対する単一の投薬量として適している物理的に分離した一構成単位を指し、各構成単位は、薬事的/生理学的に許容し得る希釈剤、キャリヤまたは賦形剤と共に、所望の効果を産み出すのに十分な量に計算された本発明の化合物の規定量を含んでいる。
<本発明の例示となる実施形態>
本発明は、免疫原性組成物、ならびに免疫応答の誘導および/または亢進に有用な方法に向けられており、この免疫応答は、ヒト、非ヒト動物もしくは細胞培養における液性および/または細胞性免疫応答であってよい。概して、主たる免疫原性組成物は、抗原(「抗原性組成物」)およびアジュバントを含んでいる。アジュバントが存在することにより、抗原に対する免疫応答が亢進され、修飾される。アジュバントは、産生される免疫グロブリン、ケモカインおよび/またはサイトカインのサブクラス(アイソタイプ)に影響を与えることにより、免疫応答の質を変化させてもよい。結果として、先天性免疫、液性および/または細胞性免疫応答は、アジュバントの存在により、より有効となる。
際立った利点は、特定の液性免疫応答を誘導し、それにより防御免疫を亢進させる際の、抗原性物質と組み合わせたPIKAアジュバントの効果である。
さらなる重要な利点は、抗原と組み合わせたPIKAアジュバントが、ウイルス、細菌および寄生生物の細胞内感染を制限し、治療するための治療ワクチンに必須である特異的な細胞性免疫応答、およびがんまたは自己免疫疾患の治療などの疾患の治療に必須である特異的な細胞性免疫応答を誘導できることである。
したがって、本発明には、動物および/またはヒトに投与するためのワクチンとしての利用に最も適したものとする独特の産物特性を有し、有益な免疫応答を引き起こす、安全なアジュバントの必要性に対応する組成物が含まれる。
したがって、本発明は、ヒトおよび動物において安全に利用し得るアジュバントおよび免疫原性組成物を提供する。
したがって、(a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、(b)少なくとも1種類の抗原とを含む免疫原性組成物であって、持続放出投与するように剤形化されていることを特徴とする免疫原性組成物が提供される。
本発明に係る免疫原性組成物は、分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでいることができ、この分子量は少なくとも66,000ダルトンである。66,000ダルトンという値は、約6.4スベドベリの大きさに対応する。したがって、66,000から1,200,000ダルトンの範囲の分子量は、約6.4から24.0スベドベリの大きさに対応する。
いくつかの実施形態において、PIKAアジュバント組成物は、ポリヌクレオチド、抗生物質および陽イオンを含み、ここで、ポリヌクレオチドはポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)であってよく、抗生物質はカナマイシンであってよく、イオンはカルシウムであってよい。
特に着目される一態様において、本発明は、抗原特異的細胞性免疫応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドアジュバント組成物を含む、抗原性化合物の抗原性を亢進させるための免疫原性組成物を提供する。
特に着目される一態様において、本発明は、抗原特異的液性免疫応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドアジュバント組成物を含む、抗原性化合物の抗原性を亢進させるための免疫原性組成物を提供する。
特に着目される一態様において、本発明は、特定の細胞性免疫応答と液性免疫応答とが結合した応答を引き起こすことができるポリヌクレオチドアジュバント組成物を含む、抗原性化合物の抗原性を亢進させるための免疫原性組成物を提供する。
特に着目される一態様において、本発明は、凍結乾燥されているアジュバント組成物またはアジュバント組成物を含む凍結乾燥されている免疫原性組成物を提供する。
特に着目される一態様において、本発明は、宿主における免疫応答を亢進させるための薬剤を調製するための、ポリヌクレオチドアジュバント組成物の利用を提供する。
<ポリヌクレオチドアジュバント>
対象免疫原性組成物は、PIC含有ポリヌクレオチドアジュバントを含む。例えば、PIKA組成物は、概して、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、抗生物質(例えば、カナマイシン)、および2価の陽イオン(例えば、カルシウム)を含んで構成されている。そのようなPIC含有アジュバントの中でも典型的な例として、本明細書において、PIKAを参照する。
着目されるPIC含有アジュバントは、技術的に利用可能な方法を用いて製造することができる。PIC含有アジュバント組成物は、任意の適当な工程で製造することができる。例えば、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、ポリイノシン酸、ポシシチジル酸、抗生物質、およびpH6〜8の塩化ナトリウム/リン酸緩衝液中の陽イオン源を混合することにより製造することができる。ポリイノシン酸およびポリシチジル酸は、一般に0.1〜10mg/ml、通常は0.5〜5mg/ml、より通常には0.5〜2.5mg/mlの濃度で提供される。濃色効果値(hyperchromicity value)は10%より大きい値、15%より大きい値、20%より大きい値、または50%より大きい値であるべきである。PICの調製、および抗生物質(例えば、カナマイシン)と陽イオン(例えば、カルシウム)との組み合わせは、一般に、国際適正製造基準(Good Manufacturing Process)と一致する品質基準のもとで実施される。
本発明のある実施形態では、アジュバントの抗生物質成分はカナマイシンである。抗生物質がカナマイシンであるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバント組成物中のカナマイシンは、1つ以上の抗生物質と共に用いる、または、1つ以上の抗生物質で代用される。1つ以上の抗生物質は、トブラマイシン)、アントラサイクリン、ブチロシンサルフェート(butirosin sulfate)、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、アミカシン、ジベカシン、ネブラマイシン、メタズアミド(metrzamide)、ネオマイシン、ピューロマイシン、ストレプトマイシンおよびストレプトゾシンを含む群から選択される。本発明のポリヌクレオチドアジュバント組成物中の抗生物質(例えば、カナマイシンまたは同種のもの)は、一般に、約10〜100,000units/ml、約100〜10,000units/ml、または約500〜5,000units/mlの濃度で提供される。
本発明のある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、さらに、陽イオン(カチオン)、通常は2価の陽イオン、普通はアルカリ金属の陽イオンを含む。陽イオンは、一般に、塩または複合体のような陽イオン源として本発明の組成物中に供給される。塩または複合体の例としては、有機塩もしくは無機塩または有機複合体もしくは無機複合体であり、通常は、無機塩または無機複合体である。典型的な陽イオンは、カルシウム、カドミウム、リチウム、マグネシウム、セリウム、セシウム、クロム、コバルト、重水素、ガリウム、ヨウ素、鉄、または亜鉛を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
陽イオンは、任意の適切な塩または有機複合体の形で供給することができる。任意の適切な塩もしくは有機複合体は、塩化物、フッ化塩、水酸化物塩、リン酸塩、または硫酸塩を含むが、必ずしもこれらに限定されない。例えば、陽イオンがカルシウムである場合、イオンは、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム、または硫酸カルシウムの形で供給することができる。
陽イオン(例えば、カルシウム)は、約10umol/ml〜10mmol/ml、通常は約50umol/ml〜5mmol/ml、より通常には約100umol/ml〜1mmol/mlの範囲の濃度で、本発明の組成物中に供給することができる。用語「umol」は、マイクロモルを表すために文中で用いられる。
本発明のアジュバント組成物中の陽イオンがカルシウムである場合、カルシウムイオンは、その他の陽イオンと組み合わせること、またはその他の陽イオンで代用することができる。その他の陽イオンとは、カドミウム、リチウム、マグネシウム、セリウム、セシウム、クロム、コバルト、重水素、ガリウム、ヨウ素、鉄および亜鉛を含み、これらのイオンは、無機塩または有機複合体の形で存在することができる。
上記の結果生じる組成物は、抗生物質および陽イオンをさらに含むPIC含有アジュバントである。抗生物質はカナマイシンであり、イオンはカルシウムである、ある実施形態では、産物は、PICKCaとして記載してもよい。関連の実施形態では、異なる物理的性質の制限なしに、PICKCa組成物は分子を含むことができる。
<PIKAアジュバント組成物>
特定の典型的な実施形態では、PIC含有アジュバントは、PIKAである。PIKAは、特に着目すべきPICKCaから生産されると同時に、様々な方法で生産されてもよい。PIKAは、分子の大きさおよび/または分子量が明確な分子の単離および/または濃縮を含む付加的な製造工程を通して、PICKCaから生産することができる。特定の性質のポリヌクレオチド分子の分離および濃縮は、ろ過、クロマトグラフィー、熱処理、遠心分離、電気泳動、および当業者に公知の標準的な工程の同様の方法を用いて行われる。
着目される特定の実施形態では、本発明は、一般にPIKAとして引用されるアジュバントを特徴とする。PIKAは、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、抗生物質(例えば、カナマイシン)、および正電気を帯びたイオン(例えば、カルシウムイオン)を含んでおり、組成物は、約66,000〜1,200,000ダルトンの不均一な分子量のアジュバント分子を含む。すなわち、アジュバント組成物は、約66,000〜1,200,000ダルトンの範囲の重量分布を有する分子を含む。
関連の実施形態では、組成物中のPIKAポリヌクレオチドアジュバント組成物分子は、不均一である。すなわち、アジュバント分子の重量は、約300,000〜1,200,000ダルトン、または約66,000〜660,000ダルトン、または約300,000〜660,000ダルトン、または約300,000〜2,000,000ダルトン、または約66,000〜100,000ダルトン、または100,000〜200,000ダルトン、約300,000〜4,000,000ダルトン、または約500,000〜1,000,000ダルトン、または約1,000,000〜1,500,000ダルトン、または約1,500,000〜2,000,000ダルトン、または約2,000,000〜2,500,000ダルトン、または約2,500,000〜3,000,000ダルトン、または約3,000,000〜3,500,000ダルトン、または約3,500,000〜4,000,000ダルトン、または約4,000,000〜4,500,000ダルトン、または約4,500,000〜5,000,000ダルトンの範囲に分布する。
関連の実施形態では、組成物中のPIKAポリヌクレオチドアジュバント組成物分子は、66,000ダルトンと等しいもしくは等しいもしくはそれより大きい平均分子量、150,000ダルトンより大きい平均分子量、または250,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または350,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または500,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または650,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または750,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または1,000,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または1,200,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または1,500,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量、または2,000,000ダルトンと等しいもしくはそれより大きい平均分子量を有する。
特に着目される実施形態では、本発明は、一般にPIKAとして引用されるアジュバントを特徴とする。PIKAは、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、抗生物質(例えば、カナマイシン)、および正電気を帯びたイオン(例えば、カルシウムイオン)を含んでおり、組成物は、不均一なアジュバント分子を含む。すなわち、アジュバント分子の大きさは、約6.43S〜24.03Sの沈降係数スベドベリ(Svedbergs)(S)を有する分子の大きさの範囲に分布する。
関連の実施形態では、組成物中のPIKAポリヌクレオチドアジュバント組成物分子は不均一である。すなわち、アジュバント分子の大きさは、約12.8S〜24.03S、または約3S〜12S、または約6.43S〜18.31S、または約12.8S〜18.31S、または約12.8S〜30.31S、または約12.8S〜41.54S、または約13.5S〜18.31S、または約13.5S〜24.03S、または約16.14S〜22.12S、または約22.12S〜26.6S、または約26.6S〜30.31S、または約30.31S〜33.55S、または約33.55S〜36.45S、または約36.45S〜39.1S、または約39.1S〜41.54S、または約41.54S〜43.83S、または約43.83S〜45.95Sの範囲内に分布する。
さらに関連の実施形態では、PIKAポリヌクレオチドアジュバント組成物は、9より大きい平均沈降係数(スベドベリ)、または12より大きい平均沈降係数、または13.5より大きい平均沈降係数、または15より大きい平均沈降係数、または16より大きい平均沈降係数、または17より大きい平均沈降係数、または18より大きい平均沈降係数、または19より大きい平均沈降係数、または20より大きい平均沈降係数、または21より大きい平均沈降係数、または22より大きい平均沈降係数、または25より大きい平均沈降係数、または30より大きい平均沈降係数を有している。
<免疫原性特性>
PIKAと抗原とを含む免疫原性組成物は、一般に、少なくとも2つの方法で抗原特異的免疫応答を誘導する事ができる。つまり、i)液性免疫、および、ii)細胞性免疫である。液性免疫は、B細胞刺激、および抗体もしくは免疫グロブリンの産生を含む(その他の細胞も抗体応答の発生に関与する。例えば、マクロファージおよびヘルパーT細胞(Th1およびTh2)を含む抗原提示細胞)。細胞性免疫は、一般に、細胞傷害性Tリンパ球を含むT細胞が関与する。しかし、その他の細胞も細胞傷害性Tリンパ球応答の発生に関与する(例えば、Th1および/またはTh2細胞、ならびに抗原提示細胞)
さらに、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、免疫グロブリンの親和性と同様に、産生される免疫グロブリンのサブクラス(アイソタイプ)に影響を与える事で、免疫応答の質を変えることができる。
それ故に、対象免疫原性組成物により誘導される免疫グロブリン応答の程度および性質は、免疫系の細胞によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および抗体を含む分子の存在を測定することにより評価することができる。
インターロイキン−4は、主として、活性化Th2細胞によって産生される。上記インターロイキン−4(IL−4)の産生は、B細胞の活性化を誘導し、その結果、IgG1およびIgE免疫グロブリン(抗体)の産生を誘導する。免疫グロブリンは、血清のサンプル中で測定することができる。IL−4は、Th2免疫応答の指標(indictor)および典型的なサイトカインと考えられる。Th2細胞は、抗体応答を促進する傾向がある。
インターロイキン−2(IL−2)は、NK細胞およびリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞と同様に、主として、活性化Th1細胞によって産生される。IL−2は、効果的な細胞性適応的免疫応答において必須段階であるT細胞の増殖および成熟に関与する。
インターフェロン−γ(INF−γ)は、CD4T細胞およびCD8 T細胞と同様、ナチュラルキラー細胞を含む様々な細胞によって産生され、マクロファージを活性化し高殺菌性にすることを含む適応的免疫応答において必須の部分を担う。さらに、INF−γは、特にTh1 T細胞の発生を方向付け、その結果、細胞性適応的免疫応答を上昇制御(up-regulating)するよう作用する因子である。
本発明は、例えば、抗原特異的液性応答および/または特異的細胞性応答(例えば、T細胞)を被験体中で誘発するために、本発明のポリヌクレオチドアジュバントと抗原との使用方法を意図している。誘発される免疫応答は、未免疫被験体では、抗原への応答であってもよいし、または、現在の免疫応答を亢進させる役割を果たしてもよい(例えば、追加免疫により)。本発明に記載のPIKAを含む免疫原性組成物は、本明細書において記述するように、特に有利な特性を有している。
様々な異なる抗原は、PIKAの有無により、免疫応答を誘導する能力をin vivoで試された。試験抗原は、B型肝炎表面抗原adw型の組み換えタンパク質、不活化分割インフルエンザワクチン(サノフィパスツール製VAXIGRIP)、合成HIVペプチド抗原、単純ヘルペスウイルス2型gD抗原の組み換えタンパク質、組み換え防御炭疽菌タンパク質抗原、トリインフルエンザ抗原H5N1株の不活化全ウイルス、および、抗原不活化重症急性呼吸器症候群(SARS)の不活化全ウイルスを含む。
それぞれの場合で、抗原のみまたはPIKAのみの場合と比較して、抗原と共にPIKAアジュバントが存在することによりサイトカインの発現が亢進した。特に、サイトカインINF−γ、IL−2、およびIL−4の発現亢進(実施例1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、および1.6を参照)は、PIKAアジュバントの存在により、特異的適応的免疫の刺激がより亢進したことを示唆している。より具体的には、サイトカインINF−γおよびIL−2の発現亢進は、PIKAアジュバントの存在により、主要Th1細胞免疫が有意に改善されたことを示唆している。細胞性免疫応答の活性は、細胞内のウイルス、細菌、および寄生生物感染症を治療するために必須の主要な特徴であり、特に、治療用ワクチンの開発にとって重要な因子である。
さらに、PIKAを含む組成物は、CD4T細胞によるINF−γ産生を刺激した(実施例1.3、1.4、1.5、および1.6)。この特徴は、PIKAが宿主の適応的免疫応答を亢進させることを立証する。
観察された血清中の抗体の増加は、PIKAアジュバントが効果的な液性応答を誘導することを示している。PIKAを免疫原性組成物に加えることにより、特異的抗体であるIgG力価の上昇が観察された(実施例1.1、1.2、1.4、1.5、1.6、2、3、5、および6を参照)。
PIKAアジュバントは、不活化抗原(実施例1.2、1.6、2、3、4、および6)、ペプチド抗原(実施例1.3)、および組み換え抗原(実施例1.1、1.4、1.5、5、および7)と組み合わせたときに、宿主における免疫応答を亢進させる。
PIKAアジュバントの特定の特徴は、宿主における感染を抑えるおよび/または感染を根絶するための適切な防御をもたらすこと、および/または、病原体による感染の結果生じる疾病の症状の危険性を減らすことである。実施例1.2および6で抗原として用いられたVAXIGRIP(サノフィパスツール社製)は、それ自身がヒトインフルエンザワクチンであり、急性インフルエンザ感染に対する防御を提供するのに十分であると考えられる程度の免疫活性を誘発する。免疫系により発現する有益なサイトカイン(IL−2、INF−γ、および、IL−4)および特異的IgGの程度によって実証されるように、PIKAをVAXIGRIPに添加すると免疫応答がさらに亢進した。
PIKAの防御特性のさらなる実証では、24羽の10日齢のニワトリに、PIKAと、H5N1株およびH9N2株を含む不活化トリインフルエンザ抗原とを含む組成物を接種した(実施例3)。続いて、これらのニワトリに、H5N1生ウイルスを病原体接種し、2週間の期間観察した。この計画の終わりの時点において、PIKA/抗原組成物を事前に接種せず、生ウイルスを病原体接種した対照群24羽のニワトリの生存率がたった17%であったのに比べ、PIKA/抗原組成物を接種したニワトリの生存率は83%であった。
PIKAアジュバントの治療亢進特性を実証する為の関連の実験では、Balb/cマウスに、狂犬病ウイルスの野性株を病原体接種した(実施例4)。感染後、3つの異なる動物群は、異なる狂犬病ワクチンでの治療レジュメ(regime)を接種された。ハムスター腎臓細胞から精製された不活化狂犬病抗原とPIKAとの組み合わせを接種された上記マウス群の生存率は、80%に達した。ハムスター腎臓細胞から精製された狂犬病抗原とミョウバンアジュバントとを接種された第二群のマウスの生存率は、15%であった。さらに、サノフィ‐アベンティス製の「ベロラブ(Verorab)」を投与された第三群のマウスは、20%の生存率を有していた。ベロラブとはベロ細胞由来の不活化狂犬病ワクチンである。
PIKAアジュバントの特性のさらなる実証では、実施例7で、HBsAg adw型と同時にPIKAが存在することによりマウス血清中の特異的IgGの産生が亢進すること(表26図35)、およびIgG2aの力価がより有意に亢進すること(表27図36)が実証されている。この観察からの結論は、PIKAが治療免疫応答、特に、Th1に偏った免疫応答を亢進させることである。
関連の実験(実施例7)では、HBsAG adw型を含むワクチン製剤中にPIKAが存在することにより、CD8 T細胞ペプチドエピトープで刺激された脾細胞によるインターフェロン−γの産生が亢進することが示された。この結果は、PIKAがCD8T細胞免疫応答を誘導することを実証する(表28図37)。
さらに、(実施例7)HBsAgを含むワクチン製剤中にPIKAが存在することにより、2ug/mlのCD8 T細胞ペプチドエピトープと共に6日間生体外で培養した脾細胞によるインターフェロン−γの産生が亢進することが示された。この結果は、PIKAは中枢メモリーT細胞応答を誘導することを実証する。
<追加の特徴>
さらなる実施形態では、対象免疫原性組成物は、PIKAアジュバントおよび抗原または複数抗原の相対的存在によってさらに特徴付けられる。この場合、上記存在は量、濃度、容量、分子数、またはその他の認定された測定基準の中の1つ以上の特徴に関して測定される。
関連の実施形態では、対象免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバント組成物および1つの抗原または複数抗原を含み、分子量もしくは分子数に関するアジュバントと抗原との存在は、1:1000より低い比、1:900より低い比、1:800より低い比、1:700より低い比、1:500より低い比、1:400より低い比、1:300より低い比、1:200より低い比、1:100より低い比、1:50より低い比、1:10より低い比、1:5より低い比、1:2より低い比、約1:1、2:1より高い比、5:1より高い比、10:1より高い比、50:1より高い比、100:1より高い比、200:1より高い比、300:1より高い比、400:1より高い比、500:1より高い比、600:1より高い比、700:1より高い比、800:1より高い比、900:1より高い比、1000:1より高い比である。
さらに関連する実施形態では、対象免疫原性組成物は投与量の点で特徴付けられる。投与量とは、つまり、適切で有益な免疫応答を誘導するために投与されるワクチンの量、または、免疫応答を誘発するための必要最低投与量から意に沿わない副作用を誘導する可能性との関連で追加の有益な応答が医学的に立証されない最大投与量までの、投与できる投与量の範囲である。
特に着目される実施形態では、免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバント組成物と抗原とを含み、単位投与量中の抗原の存在は、以下の量で供給される。つまり、0.1ugより多い量、0.5ugより多い量、0.001mgより多い量、0.005mgより多い量、0.01mgより多い量、0.025mgより多い量、0.05mgより多い量、0.075mgより多い量、0.1mg、0.25mgより多い量、0.5mgより多い量、1.2mgより多い量、1.4mgより多い量、1.6mgより多い量、1.8mgより多い量、2.0mgより多い量、2.5mgより多い量、3mgより多い量、3.5mgより多い量、4mgより多い量、5mgより多い量、6mgより多い量、7mgより多い量、8mgより多い量、9mgより多い量、10mgより多い量、15mgより多い量、20mgより多い量、25mgより多い量、または50mgより多い量である。
適切な抗原量およびPIKAアジュバントに対する抗原の適切な比率は、宿主における抗体の力価とその他の免疫原性応答との観察を含む標準的な研究により究明することができる。
<抗原>
特に着目される実施形態では、本発明は、抗原またはワクチンと共にポリヌクレオチドアジュバント組成物を提供する。この場合、抗原の元は、ヒト抗原、動物抗原、植物抗原、あらゆるウイルス、マイコバクテリアを含む細菌、真菌、もしくは、寄生生物由来の感染性物質からの1つ以上の物質、がん抗原、アレルギー性物質、および自己免疫疾患を発症するようなその他の抗原である。
ある実施形態において、抗原は粗製または精製した自然源に由来してもよいし、抗原の元の生存型、または殺傷後抗原、または不活型抗原、または短縮型抗原、または弱毒型抗原、または非可逆型への形質転換型抗原、または解毒型抗原、または無毒型への変異型抗原、またはフィルター処理した抗原、または精製した抗原を用いてもよい。
いくつかの実施形態では、抗原は、例えば、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、アレルギー性抗原、がん抗原、または自己免疫抗原のような単離された微小有機体抗原である。その他の実施形態では、抗原は、不活化完全抗原である。完全抗原を不活化する方法は、周知技術である。つまり、いくつかの既知の方法は、抗原を不活化するために用いることができ、抗原の種類に応じて適切に選択することができる。そのような抗原不活化法は、例えば、光反応性化合物;酸化剤;照射(例えば、紫外線、γ線照射のような放射照射);リボフラビンと紫外線照射との組み合わせ;溶剤−界面活性剤処理(例えば、有機溶媒であるトリ−N−ブチル−ホスフェートとTween 80のような界面活性剤との処理);ポリエチレングリコール処理;低温殺菌(熱処理);および低pH処理;ペプシンまたはトリプシンでの緩やかな酵素処理;メチレンブルー(MB)光処理;ジメチルメチレンブルー(DMMB)と可視光との処理;ソラレン誘導体S‐59と紫外線A照射との処理;および同類のものの使用を含む。
着目される関連の実施形態では、抗原は、固相合成法により合成されてもよいし、または、遺伝子組み換え法により得てもよいし、または、病原体の免疫原性の特徴を模倣するように別の方法で人工的に製造してもよい。
ポリペプチド抗原は、公知技術である標準的なタンパク質精製法を用いて自然源から単離してもよい。タンパク質精製法は、液体クロマトグラフィー(例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィー等)、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動(一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含む)、親和性クロマトグラフィー、または、その他の精製技術を含むが、これらに限定されない。固相ペプチド合成技術を採用してもよく、そのような技術は当業者において公知である。ジョーンズ、「The Chemical Synthesis of Petides」(Clarendon Press, Oxford)(1994)を参照のこと。一般に、そのような方法では、ペプチドは、活性型モノマー単位を固相結合伸長ペプチド鎖に逐次的に付加することで産生される。十分に確立された組み換えDNA技術をポリペプチドの産生のために採用してもよい。そのような組み換えDNA技術は、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトを適切な宿主細胞(例えば、単細胞性の存在としてin vitro細胞培養中で成長する真核生物宿主細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等)、または、原核細胞(例えば、in vitro細胞培養中で成長する)に導入し、遺伝子操作により改変された宿主細胞を作り出す方法を含むが、これらに限定されない。つまり、適切な培養条件下で、タンパク質は、遺伝子操作により改変された宿主細胞により産生される。
いくつかの実施例では、抗原は、例えば、約25%〜50%純度、約50%〜約75%純度、約75%〜約85%純度、約85%〜約90%純度、約90%〜約95%純度、約95%〜約98%純度、約98%〜約99%純度、99%純度より高純度の精製抗原である。
抗原は、無細胞性、カプセル状、感染性クローン、レプリコン、ベクター化、マイクロカプセル化、1価、2価、または多価であってもよい。
本発明のポリヌクレオチドアジュバント組成物は、DNAワクチンにより産生される抗原、および/または、DNA発現タンパク質に対する免疫応答を亢進させるために用いることもできる。これらのワクチン中の抗原をコードするDNA配列は、そのままでもよいし、または、リポソームのような運搬システム中に収容することができる。
特に着目される一態様では、対象免疫原性組成物は、PIKAアジュバントとの組み合わせで用いられる抗原または複数抗原の選択により特徴付けることができる。
より具体的には、上記本発明は、免疫原性組成物、および使用方法を提供する。この場合、免疫原性組成物はウイルス性抗原と共にPIKAアジュバントを含む。典型的な抗原は、表1に記載の一つ以上のウイルスの抗原を含むが、これらに限定されない。
Figure 2009523721
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より具体的には、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物は細菌性抗原と共にPIKAアジュバントを含む。典型的な抗原は、表2に記載の一つ以上の細菌の抗原を含むが、これらに限定されない。
Figure 2009523721
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より具体的には、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物は真菌性抗原と共にPIKAアジュバントを含む。典型的な抗原は、表3に記載の一つ以上の真菌の抗原を含むが、これらに限定されない。
Figure 2009523721
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より具体的には、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物は、寄生生物性抗原と共にPIKAアジュバントを含む。典型的な抗原は、表4に記載の一つ以上の寄生生物の抗原を含むが、これらに限定されない。
Figure 2009523721
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関連の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物、および使用法を提供する。この場合、免疫原性組成物はアレルギー性抗原(いわゆるアレルゲン)またはワクチンと共にPIKAアジュバントを含み、抗原もしくはワクチンの元は、ヒトもしくは動物のアレルギー源に由来する、または、これらのアレルギー源からの病原体を模倣して生産される。動物のアレルギー源は、植物、動物、真菌、昆虫、穀物、薬物、埃、およびダニ等を含む。
アレルゲンは、周囲の空気アレルゲン;ブタクサ/花粉症のような植物の花粉;雑草花粉アレルゲン;牧草花粉アレルゲン;ジョンソン草;樹木花粉アレルゲン;ライグラス;イエダニアレルゲンのようなクモ形類動物アレルゲン(例えば、Der p I、Der f I等);倉庫ダニアレルゲン;杉花粉/花粉症;カビ胞子アレルゲン;動物アレルゲン(例えば、イヌ、テンジクネズミ、ハムスター、アレチネズミ、ラット、ハツカネズミ等のアレルゲン);食物アレルゲン(例えば、甲殻類のアレルゲン;ピーナッツのような木の実のアレルゲン;柑橘類の果物のアレルゲン);昆虫アレルゲン;毒物:(膜翅目、スズメバチ、ミツバチ、カリバチ、スズメバチ、カミアリ);ゴキブリ、ノミ、蚊等からのその他の周囲の昆虫アレルゲン;連鎖球菌(streptococcal)抗原のような細菌アレルゲン;回虫(Ascaris)抗原のような寄生生物アレルゲン;ウイルス抗原;真菌胞子;薬物アレルゲン;抗生物質;ペニシリンおよび関連化合物;その他の抗生物質;ホルモン(インスリン)、酵素(ストレプトキナーゼ)のような完全タンパク質;不完全抗原もしくはハプテンのように働くことができるすべての薬物およびそれらの代謝産物;ハプテンのように働きアレルゲンとして機能することができる産業用化学物質および代謝産物(例えば、酸無水物(無水トリメリット酸など)およびイソシアネート(トルエンジイソシアネートなど));小麦粉(例えば、パン屋喘息の原因となるアレルゲン)、トウゴマの実、コーヒー豆、および、上記に記載の産業用化学物質のような職業性アレルゲン;ノミアレルゲン;および、非ヒト動物におけるヒトタンパク質を含むが、これらに限定されない。
アレルゲンは、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖類複合体、多糖類およびその他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、低分子、脂質、糖脂質、および、炭水化物を含むが、これらに限定されない。
天然アレルゲン、動物アレルゲン、および植物アレルゲンの例としては、以下の属に特異的なタンパク質、つまり:イヌ属(Canine)(イヌ(Canis familiaris));ヒョウダニ属(Dermatophagoides)(例えば、コナヒョウダニ(Dermatophagoides farinae));ネコ属(Felis)(イエネコ(Felis domesticus));ブタタサ属(Ambrosia)(ブタクサ(Ambrosia artemiisfolia));ドクムギ属(Lolium)(例えば、ホソムギ(Lolium perenne)またはネズミムギ(Lolium multiflorum));スギ属(Cryptomeria)(スギ(Cryptomeria japonica));アルテルナリア属(Alternaria)(アルテルナリア・アルテルナタ(Alternaria alternata));ハンノキ属(Alder);ハンノキ属(Alnus)(アルヌス・グルティノサ(Alnus gultinosa));カバノキ属(Betula)(カバ(Betula verrucosa));コナラ属(Quercus)(クウェルクス・アルバ(Quercus alba));オリーブ属(Olea)(オリーブ(Olea europa));ヨモギ属(Artemisia)(ヨモギ(Artemisia vulgaris));オオバコ属(Plantago)(例えば、ヘラオオバコ(Plantago lanceolata));ヒカゲミズ属(Parietaria)(例えばパリエタリア・オフィチナリス(Parietaria officinalis)またはタチヒカゲミズ(Parietaria judaica));チャバネゴキブリ属(Blattella)(例えば、チャバネゴキブリ(Blattella germanica));ミツバチ属(Apis)(例えば、アピス・ムルティフロルム(Apis multiflorum));イトスギ属(Cupressus)(例えば、クプレスス・セムペルビレンス(Cupressus sempervirens)、クプレスス・アリゾニカ(Cupressus arizonica)、および、クプレスス・マクロカルパ(Cupressus macrocarpa));ビャクシン属(Juniperus)(例えば、ユニペルス・サビオノイデス(Juniperus sabinoides)、ユニペルス・ビルギニアナ(Juniperus virginiana)、ユニペルス・コムニス(Juniperus communis)、および、ユニペルス・アシェイ(Juniperus ashei));クロベ属(Thuya)(例えば、ツヤ・オリエンタリス(Thuya orientalis));ヒノキ属(Chamaecyparis)(例えば、ヒノキ(Chamaecyparis obtusa));ゴキブリ属(Periplaneta)(例えば、ワモンゴキブリ(Periplaneta americana));カモジグサ属(Agropyron)(例えば、アグロピロン・レペンス(Agropyron repens));ライムギ属(Secale)(例えば、ライムギ(Secale cereale));コムギ属(Triticum)(例えば、コムギ(Triticum aestivum));カモガヤ属(Dactylis)(例えば、カモガヤ(Dactylis glomerata));ウシノケグサ属(Festuca)(例えば、ヒロハノウシノケグサ(Festuca elatior));イチゴツナギ属(Poa)(例えば、ナガハグサ(Poapratensis)またはポア・コンプレサ(Poa compressa));カラスムギ属(Avena)(例えば、マカラスムギ(Avena sativa));シラゲガヤ属(Holcus)(例えば、シラゲガヤ(Holcus lanatus));ハルガヤ属(Anthoxanthum)(例えば、ハルガヤ(Anthoxanthum odoratum));オオカニツリ属(Arrhenatherum)(例えば、オオカニツリ(Arrhenatherum elatius));ヌカボ属(Agrostis)(例えば、コヌカグサ(Agrostis alba));アワガエリ属(Phleum)(例えば、オオアワガエリ(Phleum pratense));クサヨシ属(Phalaris)(例えば、クサヨシ(Phalaris arundinacea));スズメノヒエ属(Paspalum)(例えば、パスパルム・ノタツム(Paspalum notatum));モロコシ属(Sorghum)(例えば、ソルグム・ハレペンシス(Sorghum halepensis));および、スズメノチャヒキ属(Bromus)(例えば、コスズメノチャヒキ(Bromus inermis))を含むが、これらに限定されない。
関連の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドアジュバント組成物、および免疫原性組成物が自己免疫抗原もしくはワクチンと共にPIKAアジュバントを含む場合の使用方法を提供する。
関連の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物、および、使用方法を提供する。この場合、上記免疫原性組成物は、PIKAアジュバントのみを含む、または、がん抗原を併せて含む。典型的な抗原は、表5に記載の一つ以上のがんの抗原を含むが、これらに限定されない。
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関連の実施形態では、がん抗原の起源は以下のようであってもよい。つまり、1)ウイルス性タンパク質、例えば、B型肝炎ウイルス(HBV)、エプスタイン‐バーウイルス(EBV)、および、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)は、それぞれが、肝細胞がん、リンパ腫、および、子宮頸がんの発症に重要である。;2).全がん細胞(不活化されてもよい)、および/または、これらの細胞の未精製および/または半精製抽出物;3).腫瘍特異的発がんタンパク質、糖鎖付加タンパク質、ガングリオシド、糖脂質、ムチン、ペプチド、炭水化物および抗イディオタイプモノクローナル抗体のような腫瘍関連抗原(TAAs)。
関連の実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫源組成物は、現存するがんのさらなる成長の防止、処置したがんの再発防止、または先の治療により殺されなかったがん細胞の除去を通じてがん腫瘍を治療するために使用されてもよい。この治療は、個体に提供されるその他の治療に先立って、その他の治療と併せて、またはその他の治療の後に行ってもよい。それゆえに、がんを治療するための総合的な併用治療の一環をなしてもよい。
関連の実施形態では、がんワクチンは、初期腫瘍および転移腫瘍の両方に対する腫瘍特異的免疫応答を誘導することができる治療を提供する。加えて、強力な免疫の誘導により、免疫記憶の確立をもたらすことができる。その結果、腫瘍の再発を減らすまたは阻止することができる。がんワクチンは、腫瘍関連表面抗原に対する特異的抗体を誘導してもよいし、なるべくTh1免疫応答に偏った細胞性免疫応答を誘導することがより好ましい。
様々な既知の腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原(TAA)のいずれのものも、対象免疫原性組成物中に含むことができる。全部のTAAは、必ずしも必要ではないが用いてもよい。代わりに、TAAの一部分、例えばエピトープを用いてもよい。腫瘍関連抗原(または、腫瘍関連抗原の中のエピトープを含む断片)は、YFVに用いてもよく、腫瘍関連抗原は、MAGE−2、MAGE−3、MUC−1、MUC−2、HER−2、高分子量メラノーマ関連抗原MAA、GD2、がん胎児性抗原(CEA)、TAG‐72、卵巣関連抗原OV‐TL3およびMOV18、TUAN、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、OFP、CA−125、CA−50、CA−19−9、腎腫瘍関連抗原G250、EGP‐40(EpCAMとしても知られる)、S100(悪性黒色腫関連抗原)、p53、およびp21rasを含むが、これらに限定されない。前述の任意のTAAを含む任意のTAA(または、それらのエピトープ)の合成類似体を用いてもよい。さらに、一つ以上のTAA(または、それらのエピトープ)の組み合わせを組成物中に含んでもよい。
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドアジュバントと少なくとも2つの異なる抗原とを含む。例えば、いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、2つの抗原、3つの抗原、4つの抗原、5つの抗原、または5つより多い抗原を含む。
<付加的な物質>
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、PIKAアジュバントおよび抗原に加えて、一つ以上の付加的な物質、例えば、免疫賦活剤、担体等を含む。
特に着目される実施形態では、本発明は、免疫原性組成物およびその使用方法を提供する。この場合、免疫原性組成物は、アジュバントを含むその他の免疫賦活物質と共に、PIKAアジュバント、抗原またはワクチンを含んでおり、適切な免疫賦活物質は、水酸化アルミニウムのようなアルミニウム組成物;水中油型乳剤(oil-in-water emulsion)組成物、または、フロイント完全アジュバントを含む免疫原性物質を含む乳剤;乾燥、熱殺傷ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)有機体を含む水中油型乳剤;フロイント不完全アジュバント;マイコバクテリアの細胞壁を含む乳剤組成物;スクアレン(MF−59)を含む乳剤;モノホスホリル脂質A微生物(MPL)を含む無毒化エンドトキシンである脂質A誘導体;ハプテン;ニトロセルロース−吸収タンパク質;キラヤ・サポナリアの皮から単離された粒子状免疫賦活剤、例えばQS21を含むサポニン;内因性ヒト免疫賦活剤;非メチル化CpGジヌクレオチドを含む微生物由来アジュバント;非メチル化CpGジヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチド(例えば、合成オリゴヌクレオチド);リポソーム(例えば、リン脂質のような生体分解性物質から作ったリポソーム);生体分解性重合体ミクロスフィア(例えば、ポリ乳酸−コ−グリコール酸(polylactic-co-glycolic acid)(PLGA)、ポリホスファゼン、および、ポリ無水物のような様々なポリマーから作られるミクロスフィア);インターロイキン−2;カルメット・ゲラン桿菌(Bacille Calmette Guerin);顆粒球単球−コロニー刺激因子;モンタナイド(Montanide) ISA−51;キーホールリンペットヘモシアニン;DNA;タンパク質;カプセル型抗原;免疫刺激複合体(ISCOM’s);コレラ毒素、コレラ毒素誘導体;閉鎖帯毒素;大腸菌昜熱性エンテロトキシン;不安定毒素、不安定毒素誘導体;百日咳毒素、百日咳毒素誘導体;ムラミールジペプチド誘導体;セピック社シリーズのモノタニドアジュバント(seppic series of monotanide adjubant);ポリ−ジ(カルボキシラトフェノキシ)ホスファゼン(poly-di(carboxylatophenoky)phosphazene)、および、リーシュマニア伸長因子を含むが、これらに限定されない。
対象免疫原性組成物がその他のアジュバントと併せて投与されるとき、ポリヌクレオチドアジュバントは、その他のアジュバントの投与前に、および/または、その他のアジュバントの投与後に、および/または、その他のアジュバントの投与と同時に投与することができる。例えば、ポリヌクレオチドアジュバントは、抗原の初回投与に併せて投与し、続いてアジュバントの一方または両方を含む追加免疫ワクチンを投与してもよい。代わりに、初回ワクチンは、ポリヌクレオチドアジュバントを除いてもよいが、ポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫原性物質は、その後患者に投与される。
ある実施形態では、対象免疫原性組成物は、サイトカインまたはその他の共刺激分子、例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15、と共に投与されてもよい。
関連の実施形態では、本発明は、PIKAアジュバント、1つの抗原性物質もしくは複数の抗原性物質に加えて、適切な担体を含む免疫原性物質を提供する。担体は、例えば、水中油型乳剤、懸濁液、脂質小胞、アルミニウム塩、コクリエート(cochleate)、ISCOMs、リポソーム、生細菌ベクター(live bacterial vector)、生ウイルスベクター(live viral vector)、ミクロスフィア、核酸ワクチン、ポリマー、ポリマー環、フッ化ナトリウム、遺伝子組み換え植物、ビロソーム(virosome)、ウイルス様微粒子、および公知技術であるその他の運搬小胞でよい。
ポリヌクレオチドアジュバントは、被験体に直接投与してもよいし、または、運搬複合体と組み合わせて投与してもよい。この場合、運搬複合体は、標的手段に関連する物質、例えば、樹上細胞表面のような標的細胞への高親和性結合をもたらす分子、および/または標的細胞による細胞内取り込みを増加するような分子である。典型的な運搬複合体は、ステロール(例えば、コレステロール)、脂質(例えば、陽イオン性脂質、ビロソーム、または、リポソーム)、または標的細胞特異的結合剤(例えば、標的細胞特異的受容体により認識されるリガンド)に関連する核酸運搬酸を含むが、これらに限定されない。好ましい複合体は、生体内で十分に安定であるため、標的細胞によって取り込まれるより前の著しい脱共役を防ぐことができる。しかし、複合体は、細胞内の適切な条件下では開裂可能であってもよい。
着目される一実施形態では、PIKAアジュバントを含む組成物は、ポリ−L−リジンまたはそれらの誘導体を含まない。
<キット>
ある実施形態では、本発明は、対象免疫原性組成物を含むキットを提供する。ある実施形態では、本発明は、別々の製剤中にPIKAアジュバントおよび抗原を含むキットを提供する。
関連の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドアジュバントおよび免疫原性化合物を含むキットを提供する。この場合、免疫原性物質は抗原である。
いくつかの実施形態では、対象キットは、無菌液製剤(例えば、水性製剤)中に対象免疫原性組成物を含む。この場合、上記製剤は無菌であり、無菌容器、無菌バイアル、または無菌注射器に入れて提供される。
いくつかの実施形態において、対象キットは、注射用に製剤された対象免疫原性組成物を含んでいる。いくつかの実施形態では、対象キットは、無菌注射器内に入れられた無菌液製剤中の対象免疫原性組成物;および、注射針を含む。いくつかの実施例では、対象キットは、無菌注射器内に入れられた単位投薬量(例えば、一回の投与量)の無菌液製剤中の対象免疫原性組成物;および注射針を含んでいる。
いくつかの実施形態では、対象キットは、無菌容器中の凍結乾燥された対象免疫原性組成物;および凍結乾燥された組成物を再構成するための無菌液を含む容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、さらに、上記凍結乾燥された組成物を再構成するための使用説明書を含む。
いくつかの実施形態では、対象キットは、直腸投与、経膣投与、経鼻投与、経口投与(吸入を含む)、オプサマリカリーな(opthamalically)投与、局所投与、肺投与、眼球投与、または皮膚投与のために製剤された免疫原性組成物、および、適切な運搬デバイス、例えば、吸引器、坐薬、塗布器またはそれと同等のものを含む。
いくつかの実施形態における対象キットは、例えば、投与量および投与頻度を含む使用のための使用説明書をさらに含むだろう。いくつかの実施形態では、使用説明書は、キットに直接印刷されている。その他の実施形態では、使用説明書は能書として提供される印刷物である。使用説明書は、その他の媒体、例えば、音声カセット、音声テープ、コンパクトディスク、デジタル多用途ディスク等に、例えば、デジタル形式またはアナログ形式で電子的に提供することもできる。
<製剤>
対象免疫原性組成物は、様々な製剤のいずれかで提供される。例えば、対象免疫原性組成物は、注射物質、乾燥粉末、溶液(例えば、水溶液または生理食塩水)として、または、懸濁液、クリーム、乳剤、錠剤、被覆錠剤、マイクロカプセル、坐薬、点滴剤、丸薬、顆粒、糖衣錠、カプセル、ゲル、シロップ、または、スラリーとして調製してもよい。所望の免疫原性組成物製剤の調製は、概して、Vaccine 4th Edition(Stanley A Plotkin et al., W.B. Saunders Company;4th edition 2003)に記載されている。適切な製剤は、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」((2000) A.Gennaro, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins);Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems((1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins);および、Handbook of Pharmaceutical Excipients((2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.);Methods in Molecular Medicine, Vol.87: Vaccine Protocols, 2nd edition((2003), Humana Press);Mucosal Vaccines((1996), Kiyono et al., eds., Academic Press);および、Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols((2000) D.T. O’Hagan, Humana Press)にも記載されている。
対象免疫原性組成物は、マイクロカプセル内に入れられてもよいし、コクリエートに入れられてもよいし、極小の金粒子上に被覆されてもよいし、リポソーム内に入れられてもよいし、噴霧エアロゾルでもよいし、皮下に埋め込む丸薬でもよいし、または、皮膚に傷をつけるための鋭利なもの(例えば、注射針)の上で乾燥させてもよい。
さらなる実施形態では、対象免疫原性物質は、単独で運搬されてもよいし、分散系と組み合わせて運搬されてもよい。いくつかの実施形態では、分散系は、例えば、高分子複合体に基づく系、ナノカプセルに基づく系、ミクロスフィアに基づく系、ビーズに基づく系および脂質に基づく系からなる群より選択される。脂質に基づく系は、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、または、リポソームを任意に含む。
ある実施形態では、PIKAアジュバントを含む対象免疫原性組成物は、薬事上許容される溶液の形であり、通常、薬事上許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体、アジュバント、および任意にその他の治療用成分を含んでいてもよい。組成物は、添加剤、例えば、錠剤分解物質、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、香味料、甘味料、または可溶化剤等を含んでいてもよい。
ある実施形態では、PIKAアジュバントを含む対象免疫原性組成物は、薬事上許容されるそのままの形で、または、薬事上許容される塩の形で投与される。
本発明の免疫原性組成物は、カプセル、溶液、液滴、乳液、懸濁液、エリキシル剤、クリーム、坐薬、ゲル、ソフトカプセル、スプレー、吸入抗原、エアロゾル、粉末、錠剤、被覆錠剤、トローチ剤、ミクロカプセル、坐薬、糖衣錠、シロップ、スラリー、顆粒、浣腸剤、または丸薬として、無菌的および非無菌的両方の形態で用いてもよい。いずれの不活性な担体を用いてもよい。例えば、ゼラチンカプセルもしくはミクロカプセルで覆われた生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水、防腐剤、高圧ガス、または投与を助ける媒体、または任意の担体中で本発明の方法で用いられる化合物が本発明の方法での使用に適した溶解特性を有するような担体を用いることができる。
ある実施形態では、PIKAアジュバント組成物、および、PIKAアジュバントと抗原性化合物とを含む免疫原性組成物は、長期間の安定性のために凍結乾燥され、固形で貯蔵される。凍結乾燥法は、当業者に公知である。
着目される一態様では、本発明は、アジュバント組成物または免疫原性組成物を提供し、免疫原性組成物または免疫原性組成物に含まれるアジュバント組成物は、固体もしくは液体であり、または、溶液中もしくは懸濁液中もしくは乳剤中に存在する。
対象免疫原性組成物は、吸入投与法(経口投与、気管内投与、経鼻投与)のための薬剤運搬系法により個体に投与される。そのため、対象免疫原性組成物は、吸引による投与に適切な形に製剤してもよい。薬剤運搬系は、気管支の粘膜内層へ対象細菌性組成物を局所投与することによる呼吸器系の治療に適した運搬系である。この発明は、容器から細菌を発射するために圧縮ガスの粉に依存した系を利用することができる。エアロゾルまたは加圧型容器を、この目的に用いることができる。
本明細書において用いられる場合、用語「エアロゾル」は、加圧下の高圧ガスにより治療適用場所へ運ぶ、非常に微細な液体粒子もしくは固体粒子を表す従来の意味で用いられる。エアロゾル式医薬品が、本発明で用いられる場合、エアロゾルは、免疫原性組成物を含んでおり、この免疫原性組成物は、流動性担体および高圧ガスの混合物中に溶解、懸濁、または、乳化することができる。エアロゾルは、溶液、懸濁液、乳剤、粉末、または半固体の形に調製できる。本発明で用いられるエアロゾルは、被験体の気道経由で微細な固体粒子または液体蒸気としての投与を対象としている。当業者に公知の様々な種類の高圧ガスを利用することができる。適切な高圧ガスの例として、炭化水素もしくはその他の適切なガスを含むが、これらに限定されない。加圧型エアロゾルの場合、定量を運搬するための値を規定することにより、投薬量単位を決定することができる。
いくつかの異なる種類の吸入方法があり、本発明と組み合わせて用いることができる。対象免疫原性組成物は、基本的に3つの異なる種類の吸入用製剤中に製剤することができる。まず、対象免疫原性組成物は、低沸点高圧ガスと共に製剤することができる。そのような製剤は、一般に、従来の定量吸入器(MDI’s)により投与される。しかし、米国特許第5,404,871号および第5,542,410号において論じられているように、従来のMDI’sは、被験体の吸入量および流速を測定する技術を用いることにより、再現性のある投薬を達成する能力を高めるように改良できる。
あるいは、対象免疫原性組成物は、水溶液またはエタノール溶液中に製剤し、従来の噴霧器により運搬することができる。いくつかの実施形態では、そのような溶液製剤は、米国特許第5,497,763号;第5,544,646号;第5,718,222号;および、第5,660,166号に開示されているような装置および系を用いてエアロゾル化される。
さらに、対象免疫原性組成物は、乾燥粉末製剤に製剤される。そのような製剤は、粉末のエアロゾル蒸気を作り出した後、乾燥粉末製剤を単純吸引することにより投与することができる。上記を実施するための技術は、米国特許第5,775,320号および米国特許第5,740,749号に記載されている。鼻内投与に適した製剤は、鼻腔用スプレー、鼻腔用点滴剤およびエアロゾル製剤等を含む。
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、持続放出(例えば、制御された放出製剤)するように製剤される。例えば、いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、丸薬またはシリンダー内に製剤され、貯蓄注射もしくはインプラントとして、筋肉内もしくは皮下に埋め込まれる。そのようなインプラントは、一般に、生体分解性ポリマーのような既知の不活性材料が用いられる。注射用デポー剤形は、対象免疫原性組成物のマイクロカプセル化マトリクスをポリラクチド−ポリグリコリドのような生体分解性ポリマー中に形成することにより作られる。その他の適した生体分解性ポリマーの例として、ポリオルトエステルおよびポリ無水物が含まれる。貯蓄注射製剤は、組成物を生体組織に適合するリポソームもしくはマイクロエマルジョン中に封入することによっても調製される。運搬放出系は、下記の例、つまり、ポリマーに基づく系、マイクロカプセル、脂質、ヒドロゲル放出系、シラスティック系(sylastic system)、ペプチド系、ペプチドに基づく系、ワックス加工、圧縮錠、部分融合インプラント、当業者に公知のその他の持続放出の形も含む。
<方法>
特に着目される一態様では、本発明は、抗原性化合物への免疫応答を誘発するおよび/または亢進させる方法を提供する。この方法は、宿主への対象免疫原性組成物の投与を含む。いくつかの実施形態では、宿主はヒトである。その他の実施形態では、宿主は非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類、鳥類等である。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバント組成物は、ワクチンとの関連で用いることができる。任意に、ワクチン組成物は付加的なアジュバントを含む。含まれるワクチンの種類は、抗感染症、抗がん、抗アレルギー、および抗自己免疫疾患である。
さらに、本発明は、宿主に対象免疫原性組成物を投与することにより、抗原性化合物への免疫応答を亢進させる方法を提供する。宿主をヒトまたは非ヒト動物とすることができる。
ある実施形態では、アジュバントは抗原と共に投与される。さらなる実施形態では、アジュバントは、抗原の投与前、または、投与後に投与される。
対象免疫原性組成物は、いくつかの実施形態では、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈注射、または皮内注射のような注射により非経口で運搬される。その他の実施形態では、免疫原性組成物は、注射以外の方法、例えば、機械的な手法により上皮バリアーを傷つけない方法により経皮投与される。その他の実施形態では、免疫原性組成物は、直腸から、膣から、鼻から、口から(吸入を含む)、オプサマリカリーに、眼球から、局所的に、肺から、または皮膚から運搬される。
被験体は、環境接触により抗原に曝され、その結果、例えば、アレルギー反応、感染症、自己免疫疾患、またはがんを発症する危険性があってもよい。その他の実施形態では、被験体は、環境接触を通して抗原に前もって曝された結果、例えば、感染症、自己免疫疾患、がん、またはアレルギーになる。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバントを含む免疫原性組成物の投与方法ががん腫瘍の治療のためである場合、運搬は、腫瘍に直接注射する方法、または腫瘍の近くに注射する方法である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、生体内分布を向上させて治療効果を高めるために、均一に腫瘍の全体または至る所に運搬される。
水溶液での非経口投与のために、例えば、この溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な生理食塩水もしくはグルコースで等張にされるべきである。これらの特殊な水溶液は、特に、静脈投与および腹腔内投与に適している。このことに関しては、本発明の開示内容に照らせば、用いることができる無菌的水性溶剤は、当業者にわかるだろう。本発明で用いられる典型的な注射溶剤は、分散剤および/または防腐剤、および、食用油、ミネラルオイル、タラの肝油、スクアレン、モノグリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、およびそれらの混合物を添加したまたは添加していない緩衝剤を含む。
対象免疫原性組成物は、「効果的な量」で投与される。効果的な量とは、選択された投与経路で免疫応答を誘発し、誘導し、または亢進させるのに効果的な対象免疫原性組成物量である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、病原微生物により産生される抗原に対して誘発される。いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物の量は、病原有機体による感染を制限すること、および/または感染を根絶すること、および/または感染に関連する症状を減らすことに効果がある。
例えば、いくつかの実施形態では、個体への対象免疫原性組成物の投与は、感染症の治療に効果がある。この場合、感染症の治療とは、個体における病原体の数を減らすこと(例えば、ウイルス量を減らすこと、細菌量を減らすこと、原虫量を減らすこと、蠕虫量を減らすこと)、および/または感染症関連のパラメーターを減らすことの内、一つ以上を含む。感染症関連のパラメーターとは、病原体により産生される産物(例えば、毒素、抗原等)の量の減少、および病原体への望まない生理応答(例えば、発熱、組織浮腫等)の減少を含むが、これらに限定されない。
必要とされるそのような組成物の正確な量は、被験体間で異なり、被験体の種、年齢、体重および全身状態、治療もしくは予防する疾病、感染または病気の重症度、用いる詳細な化合物、ならびにその投与方法等による。本明細書において指示される所定の実験のみを用いて、技術的にありふれた技術の一つにより適切な量を決定することができる。初回投与に続いて、被験体は、十分に期間をあけて、1回または数回の追加免疫を受けてもよい。
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は連続投与される。これらの実施形態では、ワクチン投与の結果を受けて、第一回目の投与量の対象免疫原性組成物を投与してもよい。第一回目の投与量に曝され、個体が免疫学的に準備が整った後、第二回目の投与量の対象免疫原性組成物が上記個体に投与される。追加抗原投与量は、患者の反応および状態により、初回投与量のから数日後、数週間後、または数ヶ月後に投与されてもよい。例えば、追加免疫投与量は、初回から、約2日後から約12ヶ月後、例えば、約2日後から約7日後、約1週間後から約2週間後、約2週間後から約4週間後、約4週間後から約8週間後、約8週間後から約6ヶ月後、約6ヶ月後から約12ヶ月後に投与される。本発明は、例えば、第三回目、第四回目、第五回目、第六回目、またはそれに続く投与量を用いての、第三回目、第四回目、第五回目、第六回目、またはそれに続く追加免疫の使用を、さらに意図している。
ある実施形態では、投与方法は、代わりの経路の組み合わせを含んでもよい。例えば、全身的な投与(例えば、腹膜投与、筋肉内投与、皮下投与、または皮内投与)の後には、粘膜的運搬投与(例えば、経鼻投与、吸入)が続いてもよい。または、逆の場合も同じである。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドアジュバントは、投与される抗原の初回用量もしくは後続の投与用量のいずれかと一緒に投与してもよいし、または患者へ投与されるすべての用量と共に投与してもよい。全体の手順の一環として投与される用量の内、少なくとも一つは、PIKAアジュバントを含むだろう。
ある実施形態では、投与された免疫原性組成物の組成物は、初回投与と追加免疫との間、および/または追加免疫の投与量間で異なっていてもよい。一例として、最初の投与用量は、DNAワクチンを含んでいるが、追加免疫投与量は組み換えタンパク質ワクチンの形であってもよい。全体の手順の一環として投与される用量の内、少なくとも一つは、PIKAアジュバントを含むだろう。
抗原に対する抗体応答が個体内で誘導される、または、亢進されるかどうかは、標準的試験を用いて容易に実証される。例えば、酵素免疫測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫沈降試験、およびタンパク質ブロット試験(“ウエスタン”ブロット)のような免疫学的試験;および、中和試験(例えば、in vitroまたはin vivoでのウイルスの感染力の中和);であり、これらの試験は、体液もしくはその他の生体試料、例えば、個体の血清、分泌物、またはその他の液体中の細菌抗原に特異的な抗体の存在を検出するために用いることができる。
抗原に対するCD4免疫応答が個体中に誘導されたかどうかは、標準的な試験を用いて容易に実証される。例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)(例えば、Waldrop et al. (1997) J. Clin. Invest. 99:1739-1750参照);抗原刺激後のサイトカインの産生を検出する細胞内サイトカイン試験(例えば、Suni et al. (1998) J. Immunol. Methods 212:89-98;Nomura et al. (2000) Cytometry 40:60-68;Ghanekar et al. (2001) Clin. Diagnostics Lab Immunol. 8:628-631を参照);MHC−ペプチドマルチマー染色試験、例えば、検出可能な標識(例えば、蛍光標識)を付けた可溶性MHC Class II/ペプチドマルチマーの使用(例えば、Bill and Kotzin (2002) Arthritis Res. 4:261-265;Altman et al. (1996) Science 274:94-96;および、Murali-Krishna et al. (1998) Immunity 8:177-187を参照);エリスポット(enzyme-linked immunospot)(ELISPOT)試験(例えば、Hutchings et al. (1989) J. Immunol. Methods 120:1-8;および、Czerkinsky et al. (1983) J.Immunol. Methods 65:109-121を参照)等である。細胞内サイトカイン試験の一つの限定されない例として、全血液は抗原、および、共刺激抗体(例えば、抗CD28、抗CD49d)で2時間以上刺激され;ブレフェルジンAはサイトカインの分泌を阻害するために加えられ;そして、細胞は、CD4対する蛍光標識抗体と、TNF−a、INF−γおよびIL−2のようなサイトカインに対する蛍光標識抗体とを用いてFACS解析される。
抗原特異的CD8(例えば、細胞傷害性T細胞;いわゆる、CTL)応答が抗原(例えば、病原体)に対して誘導されるかどうかは、公知技術である多くの試験のうちいずれかを用いて実証することができる。試験は、細胞表面に抗原を発現する標的細胞におけるCTLによる特異的溶解の測定を含むが、これに限定されない。標的細胞は、溶解により標的細胞から放出される検出可能な標識を取り込んでおり、例えば、51Cr−放出試験;ランタニド蛍光に基づくサイトカイン試験等を用いて測定することができる。
<治療に適した被験体>
細菌性病原体への免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療するまたは防ぐ方法を用いた治療に適した被験体は、病原微生物に感染した個体;病原微生物により感染しやすいが、まだ感染していない個体;および、病原微生物に感染する危険性があるが、まだ感染していない個体を含む。適した被験体は、乳児、子供、若者、および成人を含む。
細菌性病原体に対する免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療または制限する方法を用いた治療に適した被験体は、小児科が対象とする集団を含む。例えば、約1歳から約17歳の間の個体で、乳児(例えば、約1ヶ月齢から約1歳);子供(例えば、約1歳から約12歳);および、若者(例えば、約13歳から約17歳)である。
細菌性病原体に対する免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療または制限する方法を用いた治療に適した被験体は、新生児を含む。例えば、1日齢から約14日齢の個体(例えば、ヒトの新生児)で、例えば、約1日齢から約2日齢、約2日齢から約10日齢、約10日齢から約14日齢の個体である。
特定の実施形態では、被験体は、約10歳またはそれより若い、例えば、約5歳またはそれより若いヒトの子供である。そして、免疫原性組成物は、以下の時期の内いずれか1つまたはそれ以上で投与される。具体的には、生後2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、15ヶ月、18ヶ月もしくは21ヶ月、または2歳時、3歳時、4歳時、5歳時、6歳時、7歳時、8歳時、9歳時もしくは10歳時である。いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は約6ヶ月齢から約6歳の範囲の個体に投与される。この場合、個体は、約6ヶ月齢で初回投与量を受け、続く追加免疫投与量、例えば、2回から3回の続く追加免疫投与量を、例えば、2歳、4歳および6歳で受ける。
特定の実施形態では、被験体は、約17歳から49歳のヒトの成人である。いくつかの実施形態では、被験体は、50歳から65歳、65歳から75歳、75歳から85歳、85歳以上のヒトの高齢者である。
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、実際の細菌性病原体源または細菌性病原体源の可能性があるものに接触して間もなく(例えば、接触が認められた、または接触が疑われてから間もなく)の個体、例えば、細菌性病原体に感染した、または感染したことが疑われるとわかった個体に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、細菌性病原体に感染したまたは感染したことが疑われるとわかった個体との接触後約1時間以内、約2時間以内、約5時間以内、約8時間以内、約12時間以内、約18時間以内、約24時間以内、約2日以内、約4日以内、約7日以内、約2週間以内または約1ヶ月以内に個体に投与される。
いくつかの実施形態では、対象免疫原性組成物は、個体が感染の症状を示しているいないを問わず、保菌者もしくは細菌性病原体であることがわかっている、または疑うことのできる個体に投与される。
細菌性病原体に対する免疫応答を誘導する対象方法、および細菌性病原体の感染を治療するもしくは制限する方法を用いた治療に適した被験体は、CD4T細胞を欠損する個体(“CD4−欠損”個体)、例えば、機能性CD4+ Tリンパ球の数が正常より低い個体を含む。本明細書において用いられる場合、用語「正常個体」は、集団内で正常範囲内のCD4Tリンパ球の水準と機能を有する個体を表す。ヒトでは、通常は、1mmの血液あたり600〜1500個のCD4 Tリンパ球が範囲内である。CD4−欠損個体は、後天的免疫不全、または一次免疫不全の個体を含む。後天的一次免疫不全は、放射線療法または化学療法による一時的なCD4欠損でもよい。
健康で、免疫系が損なわれていないが、CD4欠損になる危険性がある個体(“危険な状態にある”個体)も本発明の方法を用いた治療に最適である。危険な状態にある個体とは、CD4欠損になる可能性が、一般的な集団よりも高い個体を含むが、これらに限定されない。CD4欠損になる危険な状態にある個体とは、HIVに感染した個体との性行為が原因でHIVに感染する危険性がある個体;静脈注射用薬物使用者;HIVに感染した血液、血液製剤またはその他のHIVに汚染された体液に曝された可能性のある個体;HIV感染個体の産道を通った新生児;HIV感染している母親より授乳されている新生児等を含むが、これらに限定されない。
がん治療のために対象方法を用いる治療に適した被験体は、発がん物質に感染した個体、がんになりやすいが、まだがんと診断されていない個体;およびがんになる危険性があるが、まだがんと診断されていない個体を含む。適した被験体は、乳児、子供、若者、および成人を含む。
がん治療のために対象方法を用いる治療に適した被験体は、がんと診断された個体;例えば化学療法もしくは放射線療法により、以前、がんの治療をした個体、および、以前治療したがんの再発を観察されている個体;および、骨髄移植またはその他の臓器移植を経験した個体を含む。
アレルギー治療のために本発明の製剤および方法を用いる治療に適した被験体は、アレルギーを有すると診断されたあらゆる個体をも含む。本明細書に記載された方法および薬剤を用いた治療の影響を受けやすい被験体は、一つ以上のアレルゲンに対しアレルギー性過敏症を有することがわかっている個体を含む。治療の影響を受けやすい被験体は、上述したアレルギー性疾患のいずれかを有する個体を含む。一つ以上のアレルゲンに対しアレルギー反応を有する危険性のある被験体も治療の影響を受けやすい。一つ以上のアレルギー性疾患治療のための標準的な療法を用いた治療が失敗した個体も最適である。
治療に適した被験体は、先進工業国に住んでいる個体;発展途上国に住んでいる個体;農村部に住んでいる個体;比較的隔離された地域に住んでいる個体等を含む。
対象免疫原性組成物の標的集団は、細菌性病原体によって変わるだろう。
上記の開示は、主に、本発明について記載している。以下の実施例は、本発明の理解に役立つだろう。これらの実施例は、説明の目的のためだけに記載され、本発明の範囲を限定するものではない。周囲の環境により方法が示唆または提供されている場合には、形態の変更および均等物への置換が予期される。本明細書においては、特殊な用語が用いられているが、そのような用語は、説明的な意味で表されたのであって、限定目的ではない。
〔実施例〕
[実施例1:PIKAは種々の抗原とともに特定の免疫応答を誘導する]
本実施例は、生体内において種々の抗原とともに特定の免疫応答を誘発するPIKAの使用に関する。本研究は、毎回異なる抗原を使用しているが、共通のプロトコルによる一連の独立の実験において実施された。検証された抗原は、以下のものを含む:B型肝炎表面抗原adw型の組換えタンパク質、不活化され分割されたインフルエンザワクチン(サノフィパスツール社が提供するVAXIGRIP)、合成HIVペプチド抗原、単純ヘルペスウイルス2型のgD抗原の組換えタンパク質、組み換え型の炭疽菌タンパク質防御抗原、不活化されたトリインフルエンザウイルス全体の抗原H5N1株、および不活化された重症急性呼吸器症候群(SARS)ウイルス全体の不活化抗原。
個々の実験におけるプロトコルでは、抗原のみを含む組成物、抗原およびPIKAアジュバント(主に約66kDa〜1,200kDaの重量分布範囲内であるPIKA分子の不均一な組成物)を含む組成物、PIKAのみを含む組成物、またはリン酸緩衝液(PBS)を含むコントロールを、Balb/cマウスのグループ(グループにつき3匹のマウス)へ接種することを伴う。
実際の投与量は、使用される抗原ごとに規定される。マウスは、最初の注射の10〜14日後に、また同一の追加免疫ワクチンを与えられた。追加免疫注射の10〜14日後に血液試料を採取し、その後マウスを屠殺して、脾臓から組織試料を採取した。示された結果は、各グループ内における個々のマウスの試験結果の平均である。
脾臓細胞の懸濁液を調製した後、各マウスからの細胞懸濁液試料を、ELISPOTプレートの6−12ウェルの中に入れ、培養した。ELISPOTプレートの各ウェルは、200ulの脾細胞懸濁液(約2×10〜1×10cells/well)を含んでいた(詳細は下記の表を参照)。培養する各マウスの脾細胞試料について、脾細胞を含むウェルのうちの半分のウェルは、培養液とともに培養し、残りの半分のウェルには、評価中の特定の抗原についての2つの異なる濃度のうち1つを用いて刺激を与えた。最後の調製および標準的なELISPOTプレート読取り装置を用いた読取りの前に、環境的に制御される条件において、プレートを37℃で20時間インキュベートする。
サイトカインIL−4、IL−2、およびINF−γを生産する細胞の数を検出するために、当業者に知られる標準的なELISPOT試験を用いた。
CD4+T細胞により生産されるINF−γを検出するために、フローサイトメトリー解析を用いた。蛍光発色セルソーター(FACS)の使用方法は、当業者において周知である。簡単にいえば、2.5×10cells/mlの濃度の脾細胞懸濁液を調製し、試料につき2mlを個々のチューブに分配した。次に抗原により刺激された試料を調製した後、環境的に制御された条件において37℃で5時間培養した。その後、標準的なFACS読取り装置における読取りの前に、試料を洗浄および染色した。
屠殺前の動物から採取された血清における特定の抗体の力価を検出するために、当業者に公知の標準的なELISA試験を用いた。
[実施例1.1:組換えB型肝炎表面抗原(HBsAg)adw]
下記の表6における結果は、HBs抗原adw型の組換えタンパク質を用いてINF−γ、IL−2およびIL−4を生産した細胞の存在数を検出したELISPOT試験の結果である。表6におけるデータ(図1、2および3もまた参照)は、ELISPOTの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
スポットを形成した細胞の数がPIKAアジュバントの添加により明らかに増加したこと(抗原のみと比べて)は、培養脾臓細胞によるサイトカインINF−γ、IL−2およびIL−4の発現がPIKAアジュバントを組換えB型肝炎表面抗原に添加することにより亢進したことを示している。サイトカインの発現が観察されたことは、PIKAアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
Figure 2009523721
屠殺前に採取された血液試料におけるELISA試験の結果(下記の表7、および図4)は、PIKAの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
Figure 2009523721
導き出される結論は、PIKAアジュバントの添加により、HBs抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確にはTh1に顕著に偏った免疫応答が亢進し、細胞性免疫応答が促進されることである。
[実施例1.2:H1N1、H3N2様菌株およびb/Shanghai5/361/2002菌株を含む、不活化および精製されたインフルエンザ抗原、VAXIGRIP(サノフィパスツール社)]
下記の表8における結果は、サノフィパスツール社により製造された、不活化され分割されたヒトインフルエンザワクチンである、VAXIGRIPワクチンを用いて、INF−γ、IL−2およびIL−4を生産した細胞の存在数を検出したELISPOT試験の結果である。表8におけるデータ(図5、6および7もまた参照)は、ELISPOTの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
スポットを形成した細胞の数がPIKAアジュバントの添加により明らかに増加したこと(抗原のみと比べて)は、培養脾臓細胞によるサイトカインINF−γ、IL−2およびIL−4の発現がPIKAアジュバントをインフルエンザ抗原に添加することにより亢進したことを示している。サイトカインの発現が観察されたことは、PIKAアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
Figure 2009523721
屠殺前に採取された血液試料におけるELISA試験の結果(下記の表9、および図8)は、PIKAの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
Figure 2009523721
導き出される結論は、PIKAアジュバントの添加により、インフルエンザ抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
VAXIGRIPは、インフルエンザに感染する危険性を著しく減少させることが認められている、認可されたインフルエンザワクチンである。PIKAの添加によりサイトカインの生産量が亢進することは、VAXIGRIPおよびPIKAを含むワクチンが、インフルエンザに感染する危険性を著しく減少させる免疫応答をさらに誘発することを示す。
[実施例1.3:合成HIVペプチド抗原]
下記の表10における結果は、HIVペプチド抗原を用いてINF−γ、IL−2およびIL−4を生産した細胞の存在数を検出したELISPOT試験の結果である。表10におけるデータ(図9、10および11もまた参照)は、ELISPOTの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
スポットを形成した細胞の数がPIKAアジュバントの添加により明らかに増加したこと(抗原のみと比べて)は、培養脾臓細胞によるサイトカインINF−γ、IL−2およびIL−4の発現が、PIKAアジュバントをHIV抗原に添加することにより亢進したことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、PIKAアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
Figure 2009523721
FACS解析の結果を、下記の表11に示す(図12もまた参照)。INF−γを発現するCD4+T細胞がPIKAおよびHIV抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびPIKAがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
Figure 2009523721
導き出される結論は、HIV抗原へのPIKAアジュバントの添加により、免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
[実施例1.4:バチルス・アントラシスからの、組み換え型炭疽菌の防御抗原(rPA)]
下記の表12における結果は、組み換え型炭疽菌を用いてINF−γ、IL−2およびIL−4の存在を検出したELISPOT試験の結果である。表12におけるデータ(図13、14および15もまた参照)は、ELISPOTの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
スポットを形成した細胞の数がPIKAアジュバントの添加により明らかに増加したこと(抗原のみと比べて)は、培養される脾臓細胞によるサイトカインINF−γ、IL−2およびIL−4の発現が、PIKAアジュバントを炭疽菌抗原へ添加することにより亢進されたことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、PIKAアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
Figure 2009523721
FACS解析の結果を、下記の表13に表す(図16もまた参照)。INF−γを発現するCD4+T細胞がPIKAおよびrPA抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびPIKAがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
Figure 2009523721
屠殺前に採取された血液試料におけるELISA試験の結果(下記の表14、ならびに図16および17)は、PIKAの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
標準的なELISA試験を用いて、当初のグループAおよびBのマウスからの血液試料における特定の抗体の存在量について調べたところ、最初のワクチン注射の16週間後において一貫性のある結果が観察された。炭疽菌抗原とともにPIKAが存在することにより、血清中の特定の抗体の力価により示されるような、著しくより高い免疫応答が再び誘導された。
Figure 2009523721
導き出される結論は、PIKAアジュバントの添加により、rPAへの免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
[実施例1.5:組換え型単純ヘルペスウイルス2型のgD抗原]
下記の表15における結果は、組み換え型単純ヘルペスウイルス抗原を用いてINF−γ、IL−2およびIL−4の存在を検出したELISPOT試験の結果である。表15におけるデータ(図19、20および21もまた参照)は、ELISPOTの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表している。
スポットを形成した細胞の数がPIKAアジュバントの添加により明らかに増加したこと(抗原のみと比べて)は、培養される脾臓細胞によるサイトカインINF−γ、IL−2およびIL−4の発現が、PIKAアジュバントを単純ヘルペスウイルス抗原へ添加することにより亢進したことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、PIKAアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
Figure 2009523721
FACS解析の結果を、下記の表16に表す(図22もまた参照)。INF−γを発現するCD4+T細胞がPIKAおよびHSV抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびPIKAがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
Figure 2009523721
屠殺前に採取された血液試料におけるELISA試験の結果(下記の表17、および図23)は、PIKAの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
Figure 2009523721
導き出される結論は、PIKAアジュバントの添加により、HSV抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
[実施例1.6:不活化H5N1のウイルス(トリインフルエンザ)全体の抗原]
下記の表18における結果は、不活化された未精製のH5N1抗原を用いてINF−γ、IL−2およびIL−4の存在を検出したELISPOT試験の結果である。表18におけるデータ(図24、25および26もまた参照)は、ELISPOTの読取り、つまりスポットを形成した細胞の数を表しており、すなわちサイトカインを生産した細胞の数の直接的な測定を表す。
スポットを形成した細胞の数がPIKAアジュバントの添加により明らかに増加したこと(抗原のみと比べて)は、培養される脾臓細胞によるサイトカインINF−γ、IL−2およびIL−4の発現が、PIKAアジュバントをH5N1抗原へ添加することにより亢進したことを明らかにする。サイトカインの発現が観察されたことは、PIKAアジュバントの存在により、液性および細胞性免疫の両方におけるより一層の適応的免疫反応が誘導されたことを示す。
Figure 2009523721
FACS解析の結果を、下記の表19に表す(図27もまた参照)。INF−γを発現するCD4+T細胞がPIKAおよびH5N1抗原の両方を含む処方においてのみ存在したことは、適応的免疫反応が成熟段階に達していたこと、およびPIKAがこの過程に有益であることについての所見を確かにする。
Figure 2009523721
屠殺前に採取された血液試料におけるELISA試験の結果(下記の表20、および図28)は、PIKAの存在が著しく免疫応答を亢進させ、かつ血清中に検出された特定の抗体の力価により示されたことを明らかにする。
Figure 2009523721
導き出される結論は、PIKAアジュバントの添加により、H5N1抗原への免疫応答全般、特には特定の免疫応答、より特には適応的免疫、またより明確には細胞性免疫応答が亢進することである。
[実施例2:不活化されたウイルス全体のSARS抗原]
本実験の目的は、SARS抗原にPIKAを添加することが免疫応答を亢進させ、かつSARS特異的な防御抗体を生産するために宿主の免疫システムを刺激することを明らかにすることである。
本調査計画においては、それぞれ4匹のBalb/cマウスを含む6つのグループに対して、SARS抗原、抗体にPIKA(主に66kDa〜1,200kDaの重量分布範囲内であるPIKA分子による不均一な組成物)を加えたもの、PIKAのみ、またはコントロールの組み合わせについて接種(腹膜注射)した(下記の表21、および図29もまた参照)。
各グループに対して、0日目、14日目および28日目に同一の投与量を投与した。6週間目に血液試料を抽出し、そしてその血清における、病気特異的な抗体の存在の指標であるIgGの存在量について検査した。血清を16,000倍の係数により希釈し、その後当業者によく知られている方法でELISA読取り装置を用いてIgGの存在量を測定した。出力は吸光度(O.D.)であり、値が大きいほどIgGの存在量が多いことを示す。
表21に示される、各グループの平均の結果は、PIKAアジュバントの存在とIgG発現の増加との関係を明らかにする。
Figure 2009523721
結論は、SARS抗原とともにPIKAが存在することにより、投与量依存的にIgG発現が増加し、それにより宿主の免疫応答が亢進することである。
[実施例3:PIKAワクチンはH5N1およびH9N2感染に対して免疫防御を与える]
本実験の目的は、PIKAアジュバントを含むトリインフルエンザワクチンが、生きているトリインフルエンザウイルスの感染からニワトリを保護し得ることを明らかにすることである。
調査は、2つのグループにおける24羽の特定病原体除去(SPF)のニワトリそれぞれに対して行われた。PIKA(主に66kDa〜660kDaの重量分布範囲内であるPIKA分子の不均一な組成物)と、トリインフルエンザ(H5N1およびH9N2)の2つの株とを含むワクチンの投与量700ulを、10日目のニワトリの頚部の皮下に接種した。組成物は、抗原とPIKAアジュバントとを、約2:1(抗原対PIKAアジュバント)の割合で含んでいた。
7、14および21日目に、羽の下から血液試料を採取した。それぞれのニワトリからの血清に対して、特定のH5およびH9抗体の存在について検査した。
21日目に、ニワトリに、H5N1の生きているウイルスを病原体接種し、その後さらに14日間観察した。生きているH5N1にさらされてから14日後のニワトリの生存率を記録した。
各グループの平均の結果(表22、図30および31もまた参照)から、PIKAの存在により特定の抗原の抗体の生産が誘導されることが明らかである。
Figure 2009523721
生きているH5N1ウイルスにさらされてから14日後に生存していたのは、抗原/PIKA組成物をワクチン接種された24羽のニワトリのうち21羽(83%)であった。全くワクチンを受けずに、しかし生きているH5N1ウイルスにさらされたコントロールグループにおける24羽のニワトリのうち、14日後に生存していたのはたった4羽(17%)であった。
導き出される結論は、PIKAワクチンが、H5N1ウイルスに対する有効なレベルの免疫防御を与えることである。
[実施例4:PIKAワクチンは狂犬病感染に対して免疫防御を与える]
本調査の目的は、PIKAアジュバントを含む狂犬病ワクチンが、狂犬病感染に対する防御を与え得ることを明らかにすることである。
各グループの平均の結果(表22、図30および31もまた参照)から、PIKAの存在が特定の抗原の抗体の生産を誘導したことが明らかである。
Figure 2009523721
生きているH5N1ウイルスにさらされてから14日後に生存していたのは、抗原/PIKA組成物をワクチン接種された24羽のニワトリのうち21羽(83%)であった。全くワクチンを受けずに、しかし生きているH5N1ウイルスにさらされたコントロールグループにおける24羽のニワトリのうち、14日後に生存していたのはたった4羽(17%)であった。
導き出される結論は、PIKAワクチンが、H5N1ウイルスに対する有効なレベルの免疫防御を与えることである。
[実施例4:PIKAワクチンは狂犬病感染に対して免疫防御を与える]
本調査の目的は、PIKAアジュバントを含む狂犬病ワクチンが、狂犬病感染に対する防御を与え得ることを明らかにすることである。
20匹のBalb/cのSPFクンミンマウスを含む4つのグループ(i、ii、iiiおよびivと表される)に対して、野生の狂犬病ウイルスCQ92株を含む100ulをそれぞれ病原体接種した。各グループは、異なるタイプのワクチンを接種される;i)PIKA(主に66kDa〜660kDaの重量分布範囲内であるPIKA分子の不均一な組成物)と、不活化され精製されたハムスターの腎臓細胞による狂犬病抗原とを1:4の体積比で含む組成物、ii)ベロ細胞による不活化された狂犬病ワクチンである、サノフィ・アベンティス社のVeroab、iii)ミョウバンアジュバントを含む、不活化され精製されたハムスター腎臓細胞による狂犬病ワクチン、およびiv)コントロールのリン酸緩衝液。大腿への皮下注射による感染の30〜40分後、3日後、6日後および9日後に、投与量60ulのワクチンが投与された。
各グループの生存率を、表23に示す(図32もまた参照)。
Figure 2009523721
導き出される結論は、PIKAの存在により、不活化され精製されたハムスター腎臓細胞による狂犬病抗原により与えられる免疫防御が著しく亢進することである。
[実施例5:PIKA B型肝炎ワクチンは血清において特定の抗体の生産を誘導する]
本実験のプロトコルでは、Balb/cマウスの3つのグループ(グループあたり3匹のマウス)について、グループAには4ugのHBs抗原adwのみを含む組成物、グループBには75ugのPIKAアジュバント(主に66kDa〜1,200kDaの重量分布範囲内であるPIKA分子の不均一な組成物)を含む4ugの当該抗原を含む組成物、およびグループCには100ugのPIKAのみを含む組成物を皮下注射することによりワクチン接種した。
最初の注射の10〜14日後に、マウスに、同一の追加免疫ワクチンを皮下注射により与えた。追加免疫注射の10〜14日後に血液試料を採取し、特定の抗体の力価について、当業者に公知の標準的なELISA試験により検査した。
下記の表24(および図33)に示される各グループの平均の結果は、血清試料において観察される特定の抗体の力価により示されるように、B型肝炎抗原への免疫応答がPIKAの存在により亢進することを明らかにする。
Figure 2009523721
上記の例から導き出される結論は、血清中の特定の抗体の力価により示されるように、PIKAおよびB型肝炎抗原を含む免疫原性の物質が、著しい免疫応答の産生を誘導することである。
[実施例6:PIKA インフルエンザワクチンは血清中における特定の抗体の生産を誘導する]
本実験のプロトコルでは、Balb/cマウスの2つのグループ(グループあたり3匹のマウス)に、グループAには4ugのサノフィ社のVAXIGRIPインフルエンザワクチンのみを含む組成物、およびグループBには100ugのPIKAアジュバント(主に66kDa〜1,200kDaの重量分布範囲内であるPIKA分子の不均一な組成物)を含む4ugの抗原を含む組成物を皮下注射することによりワクチン接種した。
最初の注射の20日後に、マウスに、同一の追加免疫ワクチンを皮下注射により与えた。最初のワクチン接種の35日後に血液試料を採取し、特定の抗体の力価について、当業者に公知の標準的なELISA試験により検査した。
下記の表25(および図34)に示される各グループの平均の結果は、血清試料において観察される特定の抗体の力価により示されるように、PIKAの存在によりインフルエンザワクチン抗原への免疫応答が亢進することを明らかにする。
Figure 2009523721
上記の例から導き出される結論は、血清中の特定の抗体の力価により示されるように、PIKAおよびインフルエンザ抗原を含む免疫原性の物質が、著しい免疫応答の産生を誘導することである。
[実施例7:PIKA B型抗原(表面抗原adw型)ワクチンは治療的な免疫応答を誘導する]
本実験のプロトコルでは、6〜10週間の4匹のBalb/cマウスのグループに、PIKAアジュバント(主に66kDa〜1,200kDaの重量分布範囲内であるPIKA分子の不均一な組成物)を含む市販のHBs抗原adw型を含む組成物、PIKAアジュバントを含まない抗原を含む組成物、PIKAのみを含む組成物、またはリン酸緩衝液を含むコントロールを接種することを必要とする。
マウスに対して、背中の両側のそれぞれに100ulずつの第一の皮下注射を施した。実際の投与量は、下記の結果の表において与えられる。最初の注射の21日後に、マウスに、同一の追加免疫ワクチンを与えた。42日目に血液試料を採取し、その後マウスを屠殺して、検査のために脾臓から組織試料を採取した。
抗原特異的なインターフェロン−γを分泌するT細胞の数を計測するために、ELISPOT解析を実施した。HBs抗原由来のペプチドエピトープ(IPQSLDSWWTSL)特異的なCD8+細胞の存在を測定するために、各マウスからの脾細胞試料を、5ug/mlの濃度の、どちらか一方のCD8 T細胞のペプチドエピトープ(IPQSLDSWWTSL)を用いて、生体外において刺激した。
第二の脾細胞試料に対して、生体外において6日間、2ug/mlのHBs抗原ペプチドIPQSLDSWWTSLを用いて再度刺激した。インターフェロン−γを検出するために、5ug/mlのHBs抗原ペプチドIPQSLDSWWTSLを生体外の刺激物として用いたELISPOT解析を実施した。この解析は、免疫化に続く中枢の記憶細胞応答を評価し、同定するために実施された。
血清中のHBV抗原特異的な抗体、特にIgG1およびIgG2a抗体の存在を測定するために、ELISA解析を用いた。Nunc Immunoplate Maxisorpプレートを、HBs抗原(PBS/0.01%Tween20において6ug/ml)により摂氏4度において一晩コーティングした。プレートを、PBS/Tweenで洗浄し、5%FCSを含むPBSにより2時間ブロッキングした。洗浄後、血清のPBS/Tweenによる希釈液を2時間加えた。洗浄後、ビオチンが結合したラットの抗マウスIgG1モノクローナル抗体の1/3000希釈液、またはビオチンが結合したラットの抗マウスIgG2aモノクローナル抗体の1/1500希釈液のいずれかを加えた。洗浄後、ストレプトアビジンHRP(PBS/Tweenによる1/10,000希釈液)を1時間加えた。洗浄後、ABTS基質を過酸化水素(1000:1)とともに20分間加えた。その後405nmにおける吸光度(OD)を測定し、示された結果は各グループにおける平均である。
PIKAアジュバントを用いて処方されたHBs抗原によって免疫化されたマウスにおけるIgG1応答は、HBs抗原のみによって免疫化されたマウスにおける応答より約5倍高かった。IgG1の力価は、投与量依存的に増加した(表26、図35)。
Figure 2009523721
PIKAアジュバントを用いて処方されたHBs抗原によって免疫化されたマウスにおけるIgG2a応答は、HBs抗原のみによって免疫化されたマウスにおける応答よりも著しく増加した。IgG2aの力価は投与量依存的に増加し、Th1に偏った免疫応答が増加したことを示す(表27、図36)。
Figure 2009523721
CD8ペプチドエピトープ特異的な生体外の刺激におけるELISPOT解析は、HBs抗原のみにより免疫化されたマウスによる応答が検出できなかったことを示した。それに比べて、PIKAを用いて処方されたHBs抗原による免疫化後には、投与量依存的にインターフェロン−γを発現する細胞が容易に検出されたことは、PIKAにより治療的な免疫応答が亢進することを示している(表28、図37)。
Figure 2009523721
脾細胞を6日間培養した後さらに実施したELISPOT解析によって、HBs抗原およびPIKAアジュバントを含む製剤により免疫化されたマウスにおけるインターフェロン−γを生産する脾細胞の数が、HBs抗原のみを投与されたマウスにおける脾細胞の数の2倍であったことが明らかになった。上記の結果は、PIKAの存在により中枢の記憶細胞の活性化が亢進することを確かにする(表28、図38)。
PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後のマウス脾細胞により生産されたIL−4のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原adw型を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(400×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−ガンマ(γ)を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(900×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHIV gp120抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+細胞の割合を示す。 PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+細胞の割合を示す。 PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(400×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/または炭疽菌rPA抗原を含むワクチンによる免疫化16週間後のマウス血清に由来する特定のIgGの力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHSV 2gD抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+細胞の割合を示す。 PIKAおよび/またはHSV2−gD抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(2,700×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−2を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、IL−4を生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後の、マウスの脾細胞におけるFACS解析の図であり、インターフェロン−γを発現しているCD4+ve細胞の割合を示す。 PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(900×希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/または不活化SARS抗原の全体を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清(16,000希釈)に由来する特定のIgGの力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/または不活化H5N1抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定の抗体H5の力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/または不活化H9N2抗原を含むワクチンによる免疫化後のニワトリ血清に由来する特定のH9抗体の力価のELISA検出の図である。 野生の狂犬病ウイルスにさらされた後に狂犬病ワクチンを処方されたマウスの生存率の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原adwを含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/または不活化され分割されたインフルエンザ抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定の抗体の力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のIgG1の力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後のマウス血清に由来する特定のIgG2の力価のELISA検出の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞のELISPOT検出の図である。 PIKAおよび/またはHBs抗原を含むワクチンによる免疫化後の、インターフェロン−γを生産したマウス脾細胞(2ug/mlのIPQペプチドを用いて6日間再刺激した後)のELISPOT検出の図である。

Claims (23)

  1. (a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
    (b)少なくとも1種類の抗原とを含む免疫原性組成物であって、
    持続放出するように剤形化されていることを特徴とする免疫原性組成物。
  2. (a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
    (b)少なくとも1種類のウイルス抗原とを含む免疫原性組成物であって、
    上記抗原が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、フラビウイルス科、デルタ肝炎ウイルス科、ヘペウイルス科、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科またはトガウイルス科の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
  3. (a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
    (b)少なくとも1種類の細菌性抗原とを含み、
    上記抗原が、放線菌門、クラミジア門、グラム陽性細菌門、プロテオバクテリア門またはスピロケータ門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
  4. (a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
    (b)少なくとも1種類の真菌抗原とを含み、
    上記抗原が、子嚢菌門または担子菌門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
  5. (a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
    (b)少なくとも1種類の寄生生物抗原とを含み、
    上記抗原が、肉質鞭毛虫門、アピコンプレクサ門、有毛虫門、扁形動物門、線形動物門または節足動物門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
  6. (a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
    (b)少なくとも1種類のがん抗原とを含み、
    上記抗原が、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、消化管/胃腸がん、内分泌腺がん、眼がん、泌尿生殖器がん、生殖細胞腫瘍、婦人科がん、頭頚部がん、液/血液腫、肺がん、筋骨格腫瘍、神経がん、呼吸器/胸部がんまたは皮膚がんのがん抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
  7. (a)ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸(PIC)、少なくとも1種類の抗生物質および少なくとも1種類の陽イオンを含むポリヌクレオチドアジュバントと、
    (b)2種類以上の抗原を組み合わせたものとを含み含み、
    上記抗原が、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、フラビウイルス科、デルタ肝炎ウイルス科、ヘペウイルス科、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、トガウイルス科、放線菌門、クラミジア門、グラム陽性細菌門、プロテオバクテリア門またはスピロケータ門、子嚢菌門または担子菌門、肉質鞭毛虫門、アピコンプレクサ門、有毛虫門、扁形動物門、線形動物門および/または節足動物門の抗原であることを特徴とする免疫原性組成物。
  8. 分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも66,000ダルトンであることを特徴とする請求項1から7の何れか1項に記載の免疫原性組成物。
  9. 分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は約66,000から1,200,000ダルトンであることを特徴とする請求項1から8の何れか1項に記載の免疫原性組成物。
  10. 分子量が不均一なポリヌクレオチドアジュバント組成物分子を含んでおり、該分子量は少なくとも150,000ダルトンであることを特徴とする請求項1から9の何れか1項に記載の免疫原性組成物。
  11. 少なくとも1種類の免疫賦活剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項1から10の何れか1項に記載の免疫原性組成物。
  12. 上記抗原は、不活化微生物、弱毒化微生物、組み換えポリペプチドおよび/または合成ポリペプチドであることを特徴とする請求項1から11の何れか1項に記載の免疫原性組成物。
  13. 請求項1から12の何れか1項に記載の免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物または該免疫原性組成物に含まれるPIKAアジュバントが、液体、溶液、液滴、固形物、カプセル、乳液、懸濁物、エリキシル剤、クリーム、坐薬、ゲル、ソフトカプセル、スプレー、吸入抗原、エアロゾル、錠剤、被覆錠剤、マイクロカプセル、坐薬、糖衣錠、シロップ剤、スラリー、浣腸剤、顆粒、粉末、錠剤またはトローチ剤の形態であることを特徴とする免疫原性組成物。
  14. 請求項1から12の何れか1項に記載の免疫原性組成物であって、上記アジュバント組成物の少なくとも1種または該免疫原性組成物が凍結乾燥されていることを特徴とする免疫原性組成物。
  15. 請求項1から14の何れか1項に記載の免疫原性組成物を備えているキット。
  16. 抗原に対する宿主の免疫応答を亢進させる方法であって、
    請求項1から14の何れか1項に記載の免疫原性組成物を宿主に投与することを特徴とする方法。
  17. 上記宿主は感染症に罹患しており、上記抗原性化合物の投与により、該感染症の原因となっている病原体に対する免疫応答を引き起こすことを特徴とする請求項16に記載の方法。
  18. 上記投与が、非経口注射、筋肉注射、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射、局所送達、経皮送達または皮内送達によるものであることを特徴とする請求項16または17に記載の方法。
  19. 上記抗原に対する宿主における免疫応答を亢進させるための薬剤を調製するための、請求項1から14の何れか1項に記載の免疫原性組成物の利用。
  20. 上記宿主は感染症に罹患しており、上記宿主に対する上記抗原の投与により、該感染症の原因となっている病原体に対する免疫応答を引き起こすことを特徴とする請求項19に記載の利用。
  21. 上記投与が、非経口注射、筋肉注射、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射、局所送達、経皮送達または皮内送達によるものであることを特徴とする請求項20に記載の利用。
  22. 上記宿主がヒトであることを特徴とする請求項16から18の何れか1項に記載の方法および請求項19から21の何れか1項に記載の利用。
  23. 上記宿主が非ヒト動物であることを特徴とする請求項16から18の何れか1項に記載の方法および請求項19から21の何れか1項に記載の利用。
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