CN101166559B

CN101166559B - 包含基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的佐剂的免疫原物质

Info

Publication number: CN101166559B
Application number: CN2006800007767A
Authority: CN
Inventors: 林海祥; 李烈涛
Original assignee: Newbiomed PIKA Pte Ltd
Current assignee: Newbiomed PIKA Pte Ltd
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2006-06-27
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2026-06-27
Also published as: RU2462264C2; US20110212123A1; KR20080091106A; ZA200806339B; CN101166559A; WO2007081287A9; BRPI0621181A8; US20130115244A1; NZ570379A; US20090175902A1; RU2008133217A; US20070166800A1; AU2006335367B2; AU2006335367A1; US8303966B2; IL192746A0; HK1112863A1; EP1971402A1; CU23810A3; WO2007081287A1

Abstract

本发明提供聚核苷酸佐剂组合物以及引发免疫反应的使用方法。本发明亦提供一种免疫原组合物，包含该聚核苷酸佐剂组合物和抗原等其它免疫原组合物(例如此二种成份位于一疫苗内)。本发明更思及这些佐剂组合物的使用方法，特别是诱导对于抗原化合物的免疫反应。

Description

包含基于聚肌苷酸-聚胞苷酸的佐剂的免疫原物质

技术领域

本发明大致涉及免疫原组合物和其使用方法。更特定地，本发明涉及一种免疫原组合物，包含聚核苷酸佐剂以及一种或多种抗原物质，用以促进宿主体内的疾病特异性免疫反应。

背景技术

免疫系统具有产生特异性和非特异性免疫力。非特异性免疫包含多种细胞及作用机制，例如巨噬细胞(macrophages)或颗粒细胞(granulocytes)的吞噬作用(phagocytosis)以吞噬外来颗粒或抗原，以及天然杀伤细胞(NK细胞)活性等。非特异性免疫力依赖是原来的免疫机制，且不会展现出特异性和记忆性的获得性特性，该获得性特性是特异性免疫反应的典型特点。特异性和非特异性免疫之间的关键性差异是以B和T细胞的特异性反应为基础。这些细胞主要是在被特定抗原所活化后获得他们的反应性，而且在未来暴露于该特定抗原时展现出免疫记忆性。因此接种疫苗(涉及免疫特异性和记忆性)是一种保护机体以对抗有害病原体的有效机制。

一般而言，B和T淋巴细胞在他们的细胞表面上有针对特定抗原的特定受体，产生特异性免疫力。该特异性免疫系统会对各抗原以二种方式特异免疫反应：1)体液免疫反应，涉及刺激B细胞并产生抗体或免疫球蛋白、抗原及辅助T细胞(主要为Th2)功能，以及2)细胞免疫反应，一般涉及T细胞、包括细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和其它涉及CTL反应的产生的细胞例如，抗原递呈细胞以及Th1细胞。

为持续寻求更安全且更有效的疫苗，重组、纯化及合成等新技术已被用以改善抗原的品质和特异性。纯化、亚单位或合成抗原显现出安全性增加但免疫原性降低，而此已成为检定出有效佐剂的一个驱动力。因此有效佐剂日渐成为现代疫苗的一种必要成份。佐剂通常是化合物，当它和抗原共同给予时(与该抗原相结合，或在给予该抗原之前或后给予)会促进和/或改变对于该特定抗原的免疫反应。

常见促进免疫反应的典型佐剂包括：铝化合物(该佐剂常被通称为铝佐剂″Alum″)、水包油乳剂(完全弗氏佐剂CFA是一种水包油乳剂，含有经干燥和热杀灭的结核杆菌)、皂甙(从皂质树Quillaja Saponoria皮分离而来，该佐剂活性成份被称为QuileA)、CpG ODN(合成寡聚脱氧核苷酸，含有去甲基化的CpG二核苷酸)、从明尼苏达Re595沙氏杆菌(Salmonella minnesota Re595)的脂多糖衍生而来的单磷酰脂A(MPL)、脂质体(通常由如磷脂等可生物降解性材料制成)以及可生物降解性聚合微球体(由如聚膦腈(polyphosphazene)和聚酐等多种聚合物制成)。这些化合物的佐剂性质已经过评估各有优缺点。

聚核苷酸复合物已在试验用作佐剂等多种用途上。双链RNAs(dsRNAs)是非常有效的生物修饰因子，可在纳摩尔浓度下对细胞引起明显作用。dsRNA的调控效应包括在分子和细胞水平上广泛的作用。

在分子水平上，dsRNAs可诱导如干扰素(interferon)的合成、蛋白质激酶的产生、增进组织兼容性抗原以及抑制代谢作用等生物效应。在细胞水平上，dsRNA可激发如热原性(pyrogenicity)、细胞分裂(mitogenicity)、巨噬细胞活化、活化体液免疫、活化细胞免疫以及引发抗病毒等生物效应。dsRNAs的免疫调控效应已被揭露于美国专利第4,124,702号，其提出dsRNAs在活的动物细胞中诱导干扰素产生。美国专利第3,906,092号提出含有聚核苷酸或聚核苷酸复合物的疫苗增强佐剂型疫苗抗体反应。Houston等人建立PICLC(聚肌苷酸聚胞苷酸poly-L-离胺酸羧基-甲基纤维素复合物)作一种有效的佐剂，藉此增加初级抗体反应而无需其它佐剂的辅助。

作为被研究最多的聚核苷酸复合物中的一种，聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)在用于猴和人体时并不有效，这是因为PIC在进入体内后不稳定。因此许多方式用来改进PIC的不足，例如，由PIC与poly-L-赖氨酸氢溴酸盐复合物对于胰核糖核酸酶水解的抵抗性较原PIC高约5至15倍。

Lin等人叙述，一种包含聚肌苷酸-聚胞苷酸、卡那霉素和钙离子的抗病毒药物可用作一种佐剂(参见Lin，et al.，A new immunostimulatory complex(PICKCa)inexperimental rabies：antiviral and adjuvant effects，Arch Virol，131：307-19，1993；以及中国专利93105862.7号)。中国专利第93105862.7号提供由PIC、卡那霉素和钙离子所构成的复合物(简称PICKCa)在人和哺乳动物作为疫苗佐剂用途。但是，Lin发现该种原先发现的PICKCa型作为佐剂时不能提供最佳的有效性/安全性状态，且在某些情况下会引起令人无法接受的不良副作用。

本发明提供具有改善有效性和安全性状态的新颖免疫原组合物，以及使用该等组合物的方法。本发明免疫原组合物包含聚核苷酸佐剂和抗原。

文献

相关参考资料列示于下：

JP 1093540A2；

美国专利第4,124,702号

美国专利第3,692,899号

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发明内容

总的来说，本发明涉及新颖的免疫原组合物，其包含聚核苷酸佐剂和免疫原性或抗原性物质，以及用以促进免疫反应的方法。

因此，本发明提供一种免疫原组合物。该组合物包含：(a)聚核苷酸佐剂，该佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一种抗生素以及至少一个正价离子；以及(b)至少一种抗原；其中该组合物可以被配制成供持续释放给予形式。

依据本发明的免疫原组合物可包含聚核苷酸佐剂组合物，该聚核苷酸佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为至少66,000道尔顿。

附图说明

图1-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

图2-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-2的小鼠脾细胞；

图3-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测被小鼠脾细胞所产生的IL-4；

图4-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清(稀释400倍)的特异性IgG效价；

图5-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原(inactivated split influenzaantigen)的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

图6-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-2的小鼠脾细胞；

图7-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-4的小鼠脾细胞；

图8-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清(稀释900倍)的特异性IgG效价；

图9-以含有PIKA和/或HIVgp120抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

图10-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-2的小鼠脾细胞；

图11-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-4的小鼠脾细胞；

图12-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗进行免疫后，利用FACS法来分析小鼠脾细胞，图中显示表达干扰素-γ的CD4+细胞百分率；

图13-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

图14-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-2的小鼠脾细胞；

图15-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-4的小鼠脾细胞；

图16-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫后，利用FACS法来分析小鼠脾细胞，图中显示表达干扰素-γ的CD4+细胞百分率；

图17-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清(稀释400倍)的特异性IgG效价；

图18-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫16周之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG效价；

图19-以含有PIKA和/或HSV2gD抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

图20-以含有PIKA和/或HSV2gD抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-2的小鼠脾细胞；

图21-以含有PIKA和/或HSV2gD抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-4的小鼠脾细胞；

图22-以含有PIKA和/或HSV2gD抗原的疫苗进行免疫后，利用FACS法来分析小鼠脾细胞，图中显示表达干扰素-γ的CD4+细胞百分率；

图23-以含有PIKA和/或HSV2gD抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清(稀释2,700倍)的特异性IgG效价；

图24-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

图25-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-2的小鼠脾细胞；

图26-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISPOT法来检测产生IL-4的小鼠脾细胞；

图27-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫后，利用FACS法来分析小鼠脾细胞，图中显示表达干扰素-γ的CD4+细胞百分率；

图28-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清(稀释900倍)的特异性IgG效价；

图29-以含有PIKA和/或全部灭活SARS抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清(稀释16,000倍)的特异性IgG效价；

图30-以含有PIKA和/或灭活禽流感抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于鸡血清的特异性抗体H5的效价；

图31-以含有PIKA和/或灭活禽流感抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于鸡血清的特异性抗体H9的效价；

图32-暴露于野生型狂犬病毒后再接受狂犬病疫苗治疗的小鼠的存活率；

图33-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性抗体效价；

图34-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原的疫苗进行免疫后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性抗体效价；

图35-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG1效价；

图36-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG2a效价；

图37-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

图38-以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗进行免疫之后，以2ug/ml的IPQ肽再刺激6天，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞；

表1提供一个可作为抗原来源的典型病毒病原体以及与这些机体相关的疾病的列表。

表2提供一个可作为抗原来源的典型细菌病原体以及与这些机体相关的疾病的列表。

表3提供一个可作为抗原来源的典型真菌病原体以及与这些机体相关的疾病的列表。

表4提供一个可作为抗原来源的典型寄生虫以及与这些机体相关的疾病的列表。

表5提供一个可作为抗原来源的典型癌肿(例如以组织种类来分类)的列表。

本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

本申请在整篇内容中参照公开文献，这些公开文献的内容被并入本申请中作为参考，以充分地叙述本发明所属技术领域的水准。

在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为木发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

除非另行界定，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域中的技术人员所普遍明了的意义相同。现在就实施本发明的优选方法和材料加以叙述，但是和本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。

应注意，如本申请说明书和权利要求中所使用的用语，除非前后文意指明另有其它意义，否则单数形用语“a”、“and”和“the”包括复数形用语。因此，例如提及“免疫原组合物”即包括该组合物的的复数形式，提及“该抗原”即包括提及一或多个抗原以及熟习于本领域技术人士所知悉的等效体等等。此外应注意，权利要求可被撰写成排除任何可选择性成分。因此，此一说明是要作为使用例如“仅有(solely)”、“只有(only)”等排除性用语于权利要求构成要件的相关载述内容时或是使用“负向”限制(“negative”limitation)时的前述基础(antecedent basis)。

名词定义

在陈述木发明的详细内容之前，应当了解被使用于木说明书中的数个用语。

使用于此处的“佐剂”此用语是指增加或改变宿主对于抗原化合物的免疫反应的任何物质或物质混合物。特定地说：

1.“PICKCa”此用语是一般性地指称由PIC卡那霉素和钙所构成的组合物，而和组合物的特定物理和免疫原性无关。

2.“Av-PICKCa”是指PICKCa在商业上被使用作为抗病毒药剂的形式。

3.“PIKA”是指本发明组合物，包含PIC、抗生素(例如卡那霉素)以及阳离子(例如钙)，其中所述PIKA的特征在于物理特性(例如本说明书中所叙述的分子量、尺寸等)，以使得PIKA在给予后可展现出一个佐剂的特性，且具有相较于以PICKCa为例更低的副作用(例如毒性降低)以及相较于以Av-PICKCa为例更高的效力强度(例如促进增强的免疫反应)。

“聚I：C”或“PIC”等用语是指含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的组合物，亦分别称作为聚肌苷酸-聚胞苷酸。

“含PIC分子”或“含PIC化合物”是非限制性地指称PIC，它可选择性地通过复合或组合所述含PIC分子的组合物中的抗生素(例如卡那霉素)以及阳离子(例如钙)中的至少一者或二者。在一实施方案中，在复合物中该含PIC分子不包含聚-L-赖氨酸或其衍生物。

在本发明佐剂组合物的前后文中所使用的“异质”此用语是指该组合物的成份(例如含PIC分子)在分子量、尺寸或此二者的物理特性上不是均一的。当组合物被描述成对于给定物理特性呈异质，且进一步通过该物理特性的数值范围来描述时，即是将该组合物叙述成实质上包含以具有分布在所述范围内的物理特性为特征的分子。虽然该组合物可能不会含有代表所述范围的下及上限内的每一物理特性数值的分子，但该组合物通常会包含至少一个具有该上限数值或下限数值物理特性的分子。在某些实施方案中，该组合物可包含位于用以描述该组合物的所述物理特性范围以外的分子。这些在组合物中位于所定范围以外的分子不会实质影响该组合物的基本的和新颖的特性。

“个体”此用语在此和“宿主”、“主体”和“动物”互换使用，包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv片段，以及这些抗体和片段的单链衍生物。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

如本说明书中所使用，“抗原化合物”此用语是指可在适当情形下被免疫系统所辨识(例如结合至抗体或被加工，以诱导细胞免疫反应)的任何物质。

如本说明书中所使用，“抗原”包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、核蛋白、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖的肽仿真体、脂肪、糖脂质、糖类、病毒、病毒提取物、细菌、细菌提取物、真菌、真菌提取物、多细胞生物例如寄生虫、以及过敏原。抗原可为外源性(例如来自于被给予该抗原的个体以外的其它来源，例如来自于一个不同的物种)或是内源性(例如源自于宿主体内，例如身体的疾病因子、癌抗原、病毒感染细胞所产生的抗原等等)。抗原可以是天然型(例如天然产生的)、合成型或重组型。抗原包含细胞提取物、完整细胞和纯化抗原，其中“纯化”此用语是指该抗原呈现相较于抗原通常存在的环境和/或相较于粗提物(例如抗原的培养形式)更为丰富的形式。

本说明书中所使用的“免疫原组合物”此用语是指由二或更多种物质(例如抗原和佐剂)所构成的组合，当将这些物质给予宿主时会共同激发免疫反应。

“多肽”、“肽”“寡肽”和“蛋白”等用语在本说明书中可互换使用，它们的意思是任何长度氨基酸聚合物形式，该聚合物形式可包括编码和非编码性氨基酸、经化学或生化修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰肽主链的多肽。

“抗原化合物有效量”是指抗原化合物的用量将会致使个体产生针对该抗原化合物的特异性免疫反应，该抗原化合物可选择性地和佐剂组合。

“免疫反应”此用语是指脊椎动物个体的免疫系统对于抗原性或免疫原性化合物的任何反应。典型的免疫反应包括但不限于局部及系统性细胞及体液免疫反应，例如包括CD8+CTLs的抗原特异性诱导作用在内的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、包括T-细胞增殖反应和细胞因子释出作用在内的辅助T-细胞反应，以及包括抗体反应在内的B-细胞免疫反应。

本说明书所使用的“诱导免疫反应”此用语是一般性地包含免疫反应的诱导和/或增强(induction and/or potentiation)。

“诱导免疫反应”此用语是指刺激、起始或诱导一个免疫反应。

“增强(potentiating)免疫反应”是指一个既存的免疫反应被改善、助长、补充、扩增、促进、增加或延长。

“增强免疫反应”此表达方式或类似表达方式的意思是，相较于先前的免疫反应状态，免疫反应被提高、改善或上升，而对宿主有利，所述先前的免疫反应状态例如给予本发明的免疫原组合物之前的免疫反应状态。

“体液免疫力(humoral immunity)”和“体液免疫反应(humoral immuneresponse)”等用语是指因应抗原刺激而产生抗体分子的免疫形式。

“细胞免疫(cell-mediated immunity)”和“细胞免疫反应(cell-mediated immune response)”等用语是指淋巴细胞所提供的免疫防御力，例如T淋巴细胞在靠近受害细胞时所提供的防御力。细胞免疫反应通常包括淋巴细胞的增殖。当测量“淋巴细胞的增殖”时，会测量淋巴细胞因应特定抗原的增殖能力。淋巴细胞增殖是指B细胞、T-辅助细胞或细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)的细胞增殖。

“免疫原量”此用语是指，相较于没有聚核苷酸佐剂时抗原所诱导的免疫反应，当与本发明的免疫原组合物共同给予时足以刺激免疫反应的抗原用量。

“免疫增效量(immunopotentiating amount)”此用语是指，相较于没有聚核苷酸佐剂时所观察到的抗体效价和/或细胞免疫反应水平，当佐剂和在本发明组合物中的抗原化合物共同给予时，致使抗体效价和/或细胞免疫反应增加所需的佐剂量。

本说明书中所使用的“治疗”此用语是一般性地指称获得所需药理和/或生理效应。该效应从完全地和/或部分地防止疾病或其症状的角度来看可以是属于预防性质的，和/或该效应从完全地和/或部分地稳定或治愈疾病和/或疾病所导致的负面效果来看可以是属于医疗性质的。本说明书中所使用的“治疗”此用语涵盖对于个体(特别是哺乳动物个体，更特别是人类)体内的疾病的任何处理，且包括：(a)预防可能有罹病倾向但尚未诊断出罹病的个体发生疾病或症状；(b)遏制疾病症状，例如阻止该疾病症状的发展；或是舒缓疾病症状，例如致使该疾病或症状消退；(c)降低疾病传染物质所产生的产物水平(例如毒素、抗原等)；(d)降低对于疾病传染物质的不利生理反应(例如发烧、组织水肿等)。

如本说明书中所使用，“混合”此用语包括用以组合组合物的成份的任何方法；这些方法包括但不限于掺合、分配、溶解、乳化、凝集、悬浮或将组合物的组成份合理地加以组合的其它方法。

“药学上可接受的盐”的化学物意指该盐是药用上可接受的，且拥有母化合物的所需药理活性。这些盐包括：(1)合成盐的酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸共同形成盐；或是和例如乙酸、丙酸、已酸、环戊丙酸、羟乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、三级丁基乳酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等有机酸等共同形成盐；或是(2)当母化合物中所存在的酸性质子被如碱金族金属离子、碱土族金属离子或铝离子等金属离子所置换，或是配位有如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇(tromethamine)、甲基葡萄糖胺(N-methylglucamine)等有机碱时，所形成的盐。

本说明书中所使用的”单位剂型”此用语是指数个在实体上呈分离的单位，适合作为使用于人类和动物个体的单位剂量，各个单位含有一预定量的本发明化合物，该预定量经计算后呈现一个足以和药学/药理上可接受的稀释剂、载剂或载体共同产生所需效应的用量。

本发明的例示性实施方案

本发明涉及用在人类、非人类动物或细胞培养物中引起和/或促进免疫反应的免疫原组合物和方法，该免疫反应可为体液和/或细胞免疫反应。一般而言，本发明免疫原组合物包含抗原(“抗原组合物”)和佐剂。该佐剂的存在会促进或改变对于该抗原的免疫反应。该佐剂可通过影响免疫球蛋白、趋化因子和/或细胞因素的亚型(异构型)的产生而改变免疫反应的品质。结果先天性免疫力、体液和/或细胞免疫反应因该佐剂的存在而更加有效。

一个特别的优点在于PIKA佐剂和抗原物质相组合可有效地引起特异体液免疫反应，从而增进保护性免疫力。

另一个重要优点在于PIKA佐剂和抗原物质相组合可引起特异细胞免疫反应，而该特异细胞免疫反应是治疗用疫苗在限制和治疗细胞内病毒、细菌和病原感染时以及临床疾病治疗(例如治疗癌症或自体免疫疾病)时所需要的。

因此，本发明包括组合物，这些组合物具有特殊的产物特性，使这些组合物特别适合使用作为疫苗，以给予动物和/或人类，以因应对于诱导有益免疫反应之安全佐剂的需求。

因此，本发明提供可安全地使用于人类和动物的佐剂和免疫原组合物。

因此，本发明提供一种免疫原组合物，包含：(a)聚核苷酸佐剂，该佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、至少一种抗生素以及至少一个正价离子；以及(b)至少一个抗原；其中该组合物被配制成供持续释放给予之用。

依据本发明的免疫原组合物可包含聚核苷酸佐剂组合物，该组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为至少66,000道尔顿。66,000道尔顿的数值相当于约6.4S沉降系数单位(Svedbergs)的分子尺寸。因此，66,000至1,200,000道尔顿的分子量范围相当于约6.4至24.0沉降系数单位的分子尺寸。

在一些实施方案中，PIKA佐剂组合物包含聚核苷酸、一种抗生素以及一个正价离子，其中该聚核苷酸可为聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)；该抗生素可为卡那霉素，以及该离子可以是钙。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以增进抗原化合物的抗原性的免疫原组合物，包含可诱导抗原特异性细胞免疫反应的聚核苷酸佐剂组合物。

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以增进抗原化合物的抗原性的免疫原组合物，包含可诱导抗原特异性体液免疫反应的聚核苷酸佐剂组合物。

在一个特别相关方面，本发明提供用以增进抗原化合物之抗原性的免疫原组合物，包含可诱导特定细胞和体液合并免疫反应的聚核苷酸佐剂组合物。

在一个特别相关方面，本发明提供佐剂组合物或含有佐剂组合物的免疫原组合物，其中该佐剂组合物或该免疫原组合物被冷冻干燥。

在一个特别相关方面，本发明提供聚核苷酸佐剂组合物在制备一用以诱导宿主免疫原反应的药剂上的用途。

聚核苷酸佐剂

本发明免疫原组合物具有含PIC聚核苷酸佐剂(例如PIKA组合物)通常包含聚肌苷酸、聚胞苷酸、一种抗生素(例如卡那霉素)，以及二价离子(例如钙)。请明了，本说明书以PIKA作为这种含PIC佐剂的范例。

相关含PIC佐剂可利用在本领域中可得的方法来制造。含PIC佐剂组合物可通过任何适当方法所制造。例如，聚核苷酸佐剂组合物可通过在具有pH6至pH8的pH值的氯化钠/磷酸盐缓冲液内，将聚肌苷酸、聚胞苷酸、种抗生素和正价离子来源加以混合而制成。聚肌苷酸和聚胞苷酸的浓度通常为0.1至10mg/ml，通常为0.5至5mg/ml且更常为0.5to2.5mg/ml。增色值(hyperchromicity value)应高于10％、高于15％、高于20％或高于50％。PIC的制备以及和抗生素(如卡那霉素)和正价离子(如钙)的组合通常是在符合于国际优良制程规范(GoodManufacturing Process)的品质标准下进行。

在本发明的某些实施方案中，该佐剂的抗生素组份是卡那霉素。当该抗生素是卡那霉素时，在一些实施方案中，聚核苷酸佐剂组合物内的卡那霉素可和一或多种抗生素共同使用或被一或多种抗生素所取代，这些抗生素选自于包括泰百霉素、蒽环霉素、丁苷菌素硫酸盐、庆大霉素、潮霉素、艾米康丝菌素、双去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、新霉素、嘌呤霉素、链霉素和链脲霉素所构成的群组中。本发明聚核苷酸佐剂组合物内的抗生素(例如卡那霉素等)的浓度通常为约10单位/ml至100,000单位/ml，约100单位/ml至10,000单位/ml，或约500单位/ml至5,000单位/ml。

在本发明的某些实施方案中，该聚核苷酸佐剂组合物更包含正价离子(阳离子)，通常是二价正价离子，且通常是碱金族金属的阳离子。在本发明的组合物内，该正价离子一般被用作为正价离子的来源，例如盐或复合物，例如一种有机或无机盐或复合物，且通常是无机盐或有机复合物。典型的正价离子包括但不必然限于钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌。

该正价离子可以呈任何适当的盐或有机复合物的形式，包括但不必然限于氯化物、氟化物、氢氧化物、磷酸盐或硫酸盐。例如，当该正价离子是钙时，则该离子可呈碳酸钙、氯化钙、氟化钙、氢氧化钙、磷酸钙或硫酸钙的形式。

本发明的组合物内可配有正价离子(例如钙)，该正价离子的浓度位在约10umol至10mmol/ml的范围内，通常为约50umol至5mmol/ml，且更常为约100umol至1mmol/ml。本说明书中所使用的”umol”此用语意指微摩尔。

当本发明佐剂组合物中的正价离子是钙时，则它可和其它正价离子相组合或被其它正价离子所取代，这些正价离子包括镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁或锌，其中这些离子可呈无机盐或有机复合物的形式。

所得的组合物是含PIC佐剂组合物，其另含有抗生素和正价离子。在一特定实施方案中，当该抗生素是卡那霉素及该正价离子是钙时，该产品可称为PICKCa。在相关实施方案中，PICKCa组合物可无限制地含有不同物理特性的分子。

PIKA佐剂组合物

在特定的例示性实施方案中，该含PIC佐剂是PIKA。PIKA可通过多种方式来制得，以从PICKCa来制得特别有利。PIKA可通过涉及分离和/或浓缩具有所界定分子尺寸和/或分子量之分子的额外制程，而从PICKCa制得。利用过滤、层析、热处理、离心分离、电泳和类似方法来分离和浓缩具有特定特性的聚核苷酸分子均为标准制备方法，且为熟习于本领域技术人士所知悉。

在特别相关的实施方案中，本发明的特点是被通称为PIKA的佐剂，其包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素(例如卡那霉素)以及正价离子(例如钙离子)，其中该组合物含有在分子量上为异质的佐剂分子，该分子的分子量为约66,000至1,200,000道尔顿。也就是说，该佐剂组合物包含重量分布于约66,000至1,200,000道尔顿的范围内的分子。

在相关实施方案中，该组合物中的PIKA聚核苷酸佐剂组合物分子是异质的，也就是说这些佐剂分子的重量分布在分子量范围内，其中该分子量为约300,000至1,200,000道尔顿，或是约66,000至660,000道尔顿，或是约300,000至660,000道尔顿，或是约300,000至2,000,000道尔顿，或是约66,000至约100,000道尔顿，100,000至200,000道尔顿，或是约300,000至约4,000,000道尔顿，或是约500,000至1,000,000道尔顿，或是约1,000,000至1,500,000道尔顿，或是约1,500,000至2,000,000道尔顿，或是约2,000,000至2,500,000道尔顿，或是约2,500,000至3,000,000道尔顿，或是约3,000,000至3,500,000道尔顿，或是约3,500,000至4,000,000道尔顿，或是约4,000,000至4,500,000道尔顿，或是约4,500,000至5,000,000道尔顿。

在相关实施方案中，该组合物中的PIKA聚核苷酸佐剂组合物分子具有平均分子量，该平均分子量等于或高于66,000道尔顿，或是等于或高于150,000道尔顿，或是等于或高于250,000道尔顿，或是等于或高于350,000道尔顿，或是等于或高于500,000道尔顿，或是等于或高于650,000道尔顿，或是等于或高于750,000道尔顿，或是等于或高于1,000,000道尔顿，或是等于或高于1,200,000道尔顿，或是等于或高于1,500,000道尔顿，或是等于或高于2,000,000道尔顿。

在特别相关的实施方案中，本发明的特点是一种被通称为PIKA的聚核苷酸佐剂，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及正价离子，其中该组合物含有在分子尺寸上呈异质的佐剂分子，也就是说这些佐剂分子的尺寸分布在一个分子尺寸范围内，这些佐剂分子的沉降系数单位(Svedbergs)为约6.43S至24.03S。

在相关实施方案中，该组合物中的PIKA聚核苷酸佐剂组合物分子是异质的，也就是说这些佐剂分子的尺寸分布在一个分子尺寸范围内，其中该分子尺寸为约12.8S至24.03S，或是约3至12S，或是约6.43至18.31S，或是约12.8至18.31S，或是约12.8S至30.31S，或是约12.8S至41.54S，或是约13.5S至18.31S，或是约13.5S至24.03S，或是约16.14至22.12S，或是约22.12S至26.6S，或是约26.6S至30.31S，或是约30.31S至33.55S，或是约33.55S至36.45S，或是约36.45S至39.1S，或是约39.1S至41.54S，或是约41.54S至43.83S，或是约43.83S至45.95S。

在其它相关实施方案中，该PIKA聚核苷酸佐剂组合物具有一平均沉降系数单位(Svedbergs)，该平均沉降系数高于9，或是高于12，或是高于13.5，或是高于 15，或是高于16，或是高于17，或是高于18，或是高于19，或是高于20，或是高于21，或是高于22，或是高于25，或是高于30。

免疫原性质

一种包括有PIKA和抗原的免疫原组合物能够以至少二种方式来引起抗原特异性免疫反应：i)体液免疫反应，涉及刺激B细胞产生抗体或免疫球蛋白(其它细胞亦涉及产生抗体反应过程，例如抗原递呈细胞(APCs，包括巨噬细胞)及辅助T细胞(Th1和Th2)，以及ii)细胞免疫反应，一般涉及T细胞、包括细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和其它涉及CTL反应产生的细胞，例如Th1和/或Th2细胞以及抗原递呈细胞。

此外，该聚核苷酸佐剂组合物可通过影响所产生的免疫球蛋白亚型(异构型)以及它们的亲和力，来改变免疫反应的性质。

因此，本发明免疫原组合物所诱导的免疫原反应的程度和性质可通过测量由免疫系统的细胞所产生的细胞因子、趋化因子和抗体等分子的存在而进行评估。

白介素-4主要是由活化的Th2细胞所产生。白介素-4(IL-4)的产生会活化B细胞，从而产生IgG1和IgE免免疫球蛋白(抗体)，其可在血清样品中测量。IL-4被视为Th2免疫反应的一个指针和典型细胞因子。Th2细胞可促进抗体反应。

白介素-2(IL-2)主要是由活化的Th1细胞、NK细胞和淋巴因子活化型杀伤细胞(LAK)所产生。IL-2可帮助T细胞的增殖和成熟，此为有效的适应性细胞免疫反应中的一个必要阶段。

干扰素-γ(INF-γ)可由多种细胞产生，包括天然杀伤细胞和CD4⁺和CD8⁺T细胞，在适应性免疫反应中扮演一必要角色，包括将巨噬细胞活化成为具有高度微生物杀伤力的细胞。另外，干扰素-γ是影响诱使特定Th1T细胞发展的因子，从而向上调控适应性细胞免疫反应。

本发明思及将本发明聚核苷酸佐剂和抗原共同使用的方法，以例如诱导机体内的抗原特异性体液反应和/或特异性细胞，例如T细胞免疫反应。所诱导的免疫反应可为在之前没有免疫的个体中对于抗原的反应，或是可用以促进之前已有的免疫反应(例如加强剂)。已发现本发明的含PIKA免疫原组合物已被发现具有本说明书所叙述的优异性质。

许多不同种类的抗原已在活体内测试其于存在或不存在PIKA佐剂下诱导免疫反应的能力。受测抗原包括：乙型肝炎adw型表面抗原重组蛋白、灭活裂解型流感疫苗(得自于Sanofi Pasteur药厂的VAXIGRIP)、合成型HIV肽抗原、第2型单纯疱疹病毒gD抗原重组蛋白、重组型炭疽菌保护蛋白抗原、灭活型全病毒禽流感抗原品系H5N1和灭活型全病毒严重急性呼吸道综合症(SARS)灭活抗原。

在各例中，PIKA佐剂和抗原的共同存在相较于抗原或PIKA单独存在更能够增进细胞因子的表达。特别是，细胞因子干扰素-γ、IL-2和IL-4的增进表达(参见实施例1.1、1.2、1.3、1.4、1.5和1.6)显示PIKA佐剂的存在更能激发专一性适应免疫力，更特别是，细胞因子干扰素-γ、IL-2的增强表达显示主要的Th1细胞免疫力在PIKA佐剂的存在下被显著地增强。细胞免疫反应活性是治疗细胞内病毒、细菌和寄生虫感染所必须的关键特性，且对于发展治疗用疫苗特别重要。

此外，含PIKA组合物通过CD4+T细胞而刺激干扰素-γ的产生(实施例1.3、1.4、1.5和1.6)。此种特性确认PIKA可增强宿主的适应性免疫反应。

血清内被观测到的抗体增加显示PIKA佐剂诱导有利的体液免疫反应。随着将PIKA加入免疫原组合物，观察到特异性抗体IgG的效价增加(参见实施例1.1、1.2、1.4、1.5、1.6、2，3、5和6)。

当PIKA佐剂与灭活抗原(实施例1.2、1.6、2、3、4和6)、肽抗原(实施例1.3)和重组型抗原(实施例1.1、1.4、1.5、5和7)相组合时，可促进宿主体内的免疫反应。

PIKA佐剂的一个特性在于提供适当保护以限制和/或根除宿主体内的感染，和/或降低因病原感染所导致的疾病症状的危险性。实施例1.2和6中所使用的抗原VAXIGRIP(Sanofi Pasteur)本身就是一种人用流感疫苗，其可引起被认为足以提供保护的免疫力程度以防止实际流感病毒感染。免疫系统所表达的有益细胞因子(IL-2、干扰素-γ和IL-4)和特异性IgG的水平显示，添加PIKA至VAXIGRIP可进一步增进免疫反应。

为进一步展现PIKA的保护性质，24只10天龄鸡被接种以一种含有PIKA和灭活禽流感抗原的组合物，该禽流感抗原包括病毒株H5N1和H9N2(实施例3)。这些鸡只随后以活的H5N1病毒加以攻毒，并观察二周。观察期间结束时，被接种以PIKA/抗原组合物的鸡只存活率为83％，相较之下，对照组中24只未预先接种PIKA/抗原组合物的鸡只被暴露于活病毒，存活率只有17％。

在显示PIKA佐剂的治疗促进性质的相关实验中，数只Balb/c鼠被攻毒以野生型狂犬病病毒的一个病毒株(实施例4)。感染之后，三群动物在治疗时被接种以不同的狂犬病疫苗。被接种以仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原加上PIKA的组合的鼠群存活率达到80％。给予仓鼠肾细胞纯化型狂犬病抗原和铝佐剂的第二群鼠的存活率为15％。另外，给予Sanofi-Aventis的”Verorab”-Vero细胞灭活狂犬病疫苗的第三群鼠具有20％的存活率。

为进一步展现PIKA佐剂的性质，实施例7显示PIKA和adw型HBsAg的共同存在能促进在小鼠血清内特异性IgGl(表26图35)的产生，并更显著地促进IgG2a(表27图36)的效价。此观察结果的结论是PIKA可促进治疗性免疫反应，特别是Th1偏好型免疫反应。

在一个相关实验中(实施例7)，PIKA在含adw型HBsAg的疫苗配方中的存在显示可促进被CD8T细胞肽抗原表位所刺激的脾细胞产生干扰素-γ。这个结果显示PIKA诱导CD8+T细胞免疫反应(表28图37)。

另外，(实施例7)PIKA存在于含HbsAg的疫苗配方中显示可促使活体外和2ug/ml CD8T细胞肽抗原表位共同培养6天的脾细胞产生干扰素-γ。这个结果显示PIKA诱导中心记忆T细胞反应。

其它特征

在另一实施方案中，本发明的免疫原组合物进一步通过PIKA佐剂和抗原的相对存在量来界定，其中该存在量是通过数量、浓度、体积、分子数目或其它被认可的度量来测量。

在相关实施方案中，本发明的免疫原组合物包含聚核苷酸佐剂组合物和一或多种抗原，其中佐剂和抗原的存在量是通过分子的重量或数目来界定，而呈现下列比例：低于1比1,000、低于1比900、低于1比800、低于1比700、低于1比500、低于1比400、低于1比300、低于1比200、低于1比100、低于1比50、低于1比10、低于1比5、低于1比2、约1比1、高于2比1、高于5比1、高于10比1、高于50比1、高于100比1、高于200比1、高于300比1、高于400比1、高于500比1、高于600比1、高于700比1、高于800比1、高于900比1、高于1,000比1。

在另一个相关实施方案中，本发明的免疫原组合物是通过剂量来界定，该剂量是指欲给予以便诱导最佳免疫反应的疫苗用量，或是另指给予剂量范围，其涵盖用以引起免疫反应所需要的最低剂量，至过量即会潜在性地诱导不良副作用因而在医学上无法证明可增加有利反应的最高剂量。

在某些特别相关的实施方案中，该免疫原组合物包含聚核苷酸佐剂组合物和抗原，其中抗原的单位剂量是以数量来计算，该数量为高于0.1ug、高于0.5ug、高于0.001mg、高于0.005mg、高于0.01mg、高于0.025mg、高于0.05mg、高于0.075mg、高于0.1mg、高于0.25mg、高于0.5mg、高于1.2mg、高于1.4mg、高于1.6mg、高于1.8mg、高于2.0mg、高于2.5mg、高于3mg、高于3.5mg、高于4mg、高于5mg、高于6mg、高于7mg、高于8mg、高于9mg、高于10mg、高于15mg、高于20mg、高于25mg或是高于50mg。

抗原的最佳量和抗原相对于PIKA佐剂的最佳比例可通过观测宿主体内的抗体效价和其它免疫反应等标准研究方法来确认。

抗原

在特别相关的实施方案中，本发明提供聚核苷酸佐剂组合物以及抗原或疫苗，其中该抗原的来源为人类抗原、动物抗原、植物抗原、源自于病毒、细菌(包括分枝杆菌(Mycobacterium))、真菌或寄生虫中的任一种的感染物的一种或多种制剂、癌肿抗原、过敏性成分以及例如会导致自体免疫疾病的其它抗原。

在某些实施方案中，该抗原可从粗制或纯化的天然来源衍生而来，并以它的原始存活形式来使用，或是于被杀死、灭活、截短、减毒或转形成为不可回复形式或是去毒或突变成为无毒性形式或被过滤或纯化后使用。

在某些实施方案中，该抗原是被分离的微生物抗原，例如病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、过敏性成分抗原、癌肿抗原或自体免疫抗原。在其它实施方案中，抗原是完整的灭活抗原。使完整抗原灭活的方法为业界所熟知；任何常用方法均可使用以使抗原灭活，且可针对相关抗原种类而适当地选用。这些使抗原灭活的方法包括例如利用光反应性化合物；氧化剂；辐射线(例如UV射线；γ-射线)；核黄素和UV射线的组合；溶剂-去污剂处理(例如以有机溶剂三-N-丁基-磷酸酯和Tween80等去污剂来处理)；聚乙二醇处理；巴斯德灭菌法(热处理)；以及低pH处理；以胃蛋白酶或胰蛋白酶进行温和酶处理；亚甲蓝(MB)光处理；以二甲基亚甲蓝(DMMB)和可见光进行处理；以S-59(一种补骨脂内酯衍生物)和UVA照射进行处理；以及类似方法。

在特别相关的实施方案中，抗原可通过固相合成法来合成，或是可通过重组遗传技术而获得，或是可被人为制造以仿真病原体的免疫原性质。

多肽抗原可利用本技艺所熟知标准蛋白纯化方法从天然来源分离，这些标准方法包括但不限于液相层析法(例如高效液相层析法、快速蛋白液相层析法等)、尺寸排它性层析法、凝胶电泳(包括一维凝胶电泳、二维凝胶电泳)、亲和层析法或其它纯化技术。可使用固相肽合成技术，这些技术是熟习于本领域技术人士所知悉的。请参见Jones，The Chemical Synthesis of Peptides(Clarendon Press，Oxford)(1994)。一般而言，在这些方法中，肽是通过将活化单体单元顺序加入结合有增长肽链的固相来制造。建构完成的重组DNA技术可用以制造多肽，这些方法包括但不限于例如将表达构建体导入适当的宿主细胞中(例如在活体外细胞培养基中生长成为单细胞实体的真核宿主细胞，例如酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等，或原核细胞(例如在活体外细胞培养基中生长的)，该表达构建体含有编码一多肽的核苷酸序列，而产生遗传基因改变的宿主细胞；在适当的培养条件下，蛋白质可被该遗传基因改变的宿主细胞所制得。

在一些实施方案中，该抗原为纯化抗原，例如具有约25％至50％的纯度、约50％至约75％的纯度、约75％至约85％的纯度、约85％至约90％的纯度、约90％至约95％的纯度、约95％至约98％的纯度、约98％至约99％的纯度，或高于99％的纯度。

抗原可为非细胞型、囊封型、感染性克隆(infectious clone)、扩增片段(replicon)、具载体型(vectored)、微囊封型(microencapsulated)、单价、二价或多价的。

本发明的聚核苷酸佐剂组合物亦可用于促进免疫反应，该免疫反应是针对运用DNA疫苗和/或DNA表达蛋白所产生的抗原。这些疫苗中用以编码抗原的DNA序列可以是”裸露的”，或是被容纳在一个如脂质体的载体系统内。

在一个特别相关方面，本发明的免疫原组合物可通过选用一或多种抗原和PIKA佐剂相组合来界定。

具体上说，本发明提供免疫原组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物包含PIKA佐剂以及病毒抗原，其中典型的抗原包括但不限于表1所述一或多种病毒的抗原。

表1：病毒病原体和疾病

具体上说，本发明提供免疫原组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物包含PIKA佐剂以及细菌抗原，其中典型的抗原包括但不限于表2所述一或多种细菌的抗原。

表2：细菌病原体和疾病

具体上说，本发明提供一种免疫原组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物包含PIKA佐剂以及真菌抗原，其中典型的抗原包括但不限于表3所述一或多种真菌的抗原。

表3：真菌病体和疾病

具体上说，本发明提供一种免疫原组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物包含PIKA佐剂以及寄生虫抗原，其中典型的抗原包括但不限于表4所述一或多种寄生虫的抗原。

表4：寄生虫病原体和疾病

本发明提供一种免疫原组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物包含PIKA佐剂以及过敏成份抗原(“过敏原”)或疫苗，其中该抗原或疫苗的来源是从源自于人类或动物过敏成分来源的病原衍生而来或是仿真该病原来产生，该病原包括植物、动物、真菌、昆虫、食品、药物、灰尘和尘螨等。

过敏原包括但不限于环境空气过敏原；豕草/花粉热(ragweed/hayfever)等植物花粉；杂草花粉过敏原；牧草花粉过敏原；石茅高梁(Johnson grass)；树木花粉过敏原；黑麦草(ryegrass)；屋尘螨(例如Der pI，Der fI等)等蜘蛛类过敏原：储藏室粉螨过敏原；日本柳杉花粉热；霉菌孢子过敏原；动物过敏原(例如狗、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠、小鼠等过敏原)；食物过敏原(例如甲壳类水产品过敏原；例如花生等坚果类；柑橘类水果)；昆虫过敏原；毒液：(膜翅目昆虫(Hymenoptera)、胡蜂、蜜蜂、木胡蜂、黄蜂、火蚁)；来自于蟑螂、跳蚤、蚊子等其它环境昆虫的过敏原；链球菌抗原等细菌过敏原；蛔虫抗原等寄生虫过敏原；病毒抗原；真菌孢子；药物过敏原；抗生素；青霉素(penicillins)和相关化合物；其它抗生素；激素(胰岛素)、酶(链激酶(streptokinase))等完整蛋白；可作为不完全抗原或半抗原(haptens)的所有药物和它们的代谢物；可作为半抗原并作为过敏原的工业用化学品和它们的代谢物(例如酸酐(例如苯偏三甲酸酐)和异氰酸酯(例如甲苯二异氰酸酯))；面粉(例如导致面包师哮喘症(Baker′s asthma)的过敏原、蓖麻籽、咖啡豆和前述工业用化学品等职业过敏原；蚤过敏原；以及非人类动物中的人类蛋白。

过敏原包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖的肽或非肽仿真体以及其它分子、小分子、脂肪、糖脂质和糖类。

特定天然、动物和植物过敏原的范例包括但不限于下列属所特有的蛋白：犬属(家犬(Canis familiaris))；Dermatophagoides(例如粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae))；猫属(家猫(Felis domesticus))；豚草属(豚草(Ambrosia artemiisfolia))；黑麦草属(例如多年生黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Loliummultiflorum))；柳杉属(日本柳杉(Cryptomeria japonica))；链格孢属(炼格孢菌(Alternaria alternate))；红桦(Alder)；赤杨属(Alnus gultinoasa)；桦属(瘤皮桦(Betula verrucosa))；栎属(白橡(Quercus alba))；木犀属(油橄榄(Olea europa))；蒿属(野艾(Artemisia vulgaris))；车前草(例如长叶车前草(Plantago lanceolata))；墙草属(例如直墙草(Parietaria officinalis)或犹大墙草(Parietaria judaica))；小蠊属(例如德国小蠊(Blattella germanica))；蜜蜂(例如Apis multiflorum)；柏木属(例如丝柏(Cupressus sempervirens)、亚利桑那柏(Cupressus arizonica)和大果柏(Cupressus macrocarpa)；圆柏属(例如Juniperus sabinoides、铅笔柏(Juniperusvirginiana)、杜松(Juniperus communis)和Juniperus ashei)；侧柏属(例如东方侧柏(Thuya orientalis)；扁柏属(例如日本扁柏(Chamaecyparis obtuse))；大蠊属(例如美洲大蠊(Periplaneta Americana))；鹅观草属(例如偃麦草(Agropyronrepens))；黑麦属(例如黑麦(Secale cereale))；小麦属(例如小麦(Triticumaestivum))；鸭茅属(例如鸭茅(Dactylis glomerata))；狐茅属(例如草地狐茅(Festucaelatior))；早熟禾属(例如草地早熟禾(Poa pratensis)或加拿大早熟禾(Poacompressa))；燕麦属(例如燕麦(Avena sativa))；绒毛草属(例如绒毛草(Holcuslanatus))；黄花茅属(例如黄花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麦草属(例如燕麦草(Arrhenatherum elatius))；剪股颖属(例如小糠草(Agrostis alba))；梯牧草属(例如梯牧草(Phleum pretense))；鹬草属(例如鹬草(Phalaris arundinacea))；雀稗属(例如百喜草(Paspalum notatum))；高梁属(例如石茅高粱(Sorghumhalepensis))；和雀麦属(例如无芒雀麦(Bromus inermis))。

在一个相关实施方案中，本发明提供聚核苷酸佐剂组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物包含PIKA佐剂以及自体免疫抗原或疫苗。

具体上说，本发明提供免疫原组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物仅包含PIKA佐剂或PIKA与癌肿抗原的组合，其中典型的抗原包括但不限于表5所述一或多种癌肿的抗原。

表5：癌肿

在一个相关实施方案中，癌肿抗原的来源可为：1).病毒蛋白，例如乙型肝炎病毒(HBV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和人类乳头瘤病毒(HPV)，其分别在肝细胞癌、淋巴癌和子宫颈癌的发展上具有重要性；2).完整癌细胞，其可经过灭活和/或这些细胞的未纯化和/或半纯化提取物；3).肿瘤相关抗原(TAAs)例如肿瘤特异性致癌蛋白、糖基化蛋白、神经节糖苷、糖脂、粘质素(mucins)、肽、糖类和抗独特型(anti-idiotype)单株抗体。

在一个相关实施方案中，含聚核苷酸佐剂的免疫原组合物可通过防止既有癌肿继续生长、防止治愈的癌肿复发、或是去除未被先前疗程所灭杀的癌细胞，而用以治疗癌肿。此疗程可在其它疗程之前、同时或之后给予个体，因此可形成治疗癌症的完整组合式疗程的一部分。

在一个相关实施方案中，治疗用癌肿疫苗可以诱导肿瘤特异性免疫反应以对抗原发性肿瘤和转移性肿瘤。另外，诱导强免疫力可促使建立免疫记忆力，从而降低或遏制肿瘤的复发。癌肿疫苗可诱导特异性抗体来对抗肿瘤相关性表面抗原，优选为诱导细胞免疫反应，且更优选为具有诱导Th1免疫反应的偏好。

本发明的免疫原组合物可包含各种习知肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原(TAA)中的任何一种。可以使用但并非必须使用完整的TAA分子。取而代之地，可使用TAA的一部分，例如它的一个抗原表位。可被使用于YFV中的肿瘤相关抗原(或是它的含抗原表位片段)包括但不限于MAGE-2、MAGE-3、MUC-1、MUC-2、HER-2、高分子量黑色素瘤相关抗原MAA、GD2、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、卵巢相关抗原OV-TL3和MOV18、TUAN、甲型幼儿蛋白(AFP)、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、肾肿瘤相关抗原G250、EGP-40(也被称作为EpCAM)、S100(恶性黑色素瘤相关抗原)、p53以及p21ras。任何TAA(包括前述任何TAA和或它的抗原表位)的合成型类似物均可使用。另外，组合物内可以包含一或多种TAAs(或它的抗原表位)的组合。

在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物包含聚核苷酸佐剂以及至少二种不同的抗原，例如在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物包含二种抗原、三种抗原、四种抗原、五种抗原或是超过五种抗原。

其它成份

在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物除了PIKA佐剂和抗原以外，另包含一或多种成份例如免疫调节剂、载剂等。

在一特别相关的实施方案中，本发明提供一种免疫原组合物和其使用方法，其中该免疫原组合物包含PIKA佐剂、抗原或疫苗，以及另一种免疫调节物质(包含佐剂在内)，其中适合的免疫调节物质包括但不限于：铝组合物例如氢氧化铝；含有免疫原物质的水包油乳剂组合物或是乳剂，包括完全弗氏佐剂(CompleteFreund’s Adjuvant)；含有经干燥和热杀灭的结核杆菌的水包油乳剂；不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant)；含有分枝杆菌细胞壁成份的乳剂；含有角鲨烯(squalene)的乳剂(MF-59)；去毒化的内毒素；脂质A衍生物，包括微生物单磷脂酰脂质A(MPL)；半抗原；硝化纤维素吸收性蛋白；皂甙，包含从皂质树QuillajaSaponoria皮分离而来的免疫调节剂颗粒，例如QS21；人类内源性免疫调节剂；从细菌衍生而来的佐剂，包括去甲基化的CpG二聚核苷酸；寡聚脱氧核苷酸(例如合成寡核苷酸)，含有去甲基化的CpG二聚核苷酸；脂质体(例如由如磷脂等可生物降解性材料制成的脂质体)；可生物降解性聚合微球体(由如聚乳酸-共-甘醇酸(PLGA)、聚膦腈(polyphosphazene)和聚酐等多种聚合物制成的聚合微球体)；白介素-2；卡介苗；颗粒性白血球及单核球群落刺激因子；Montanide ISA-51；钥孔虫戚血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)；DNA；蛋白；囊封型抗原(encapsulatedantigens)；免疫刺激复合物(ISCOM’s)；霍乱毒素和霍乱毒素衍生物；小带闭合毒素(zonula occludens toxin)；大肠杆菌忌热性肠毒素(Escherichia coli heat-labileenterotoxin)；忌热性毒素和忌热性毒素衍生物；百日咳毒素和百日咳毒素衍生物；胞壁酰二肽(muramyl dipeptide)衍生物；赛比克药厂(Seppic)的montanide系列佐剂；聚-二(羧负离子基苯氧基)膦腈以及利甚曼原虫延长因子(leishmania elongationfactor)。

当本发明的免疫原组合物和另佐剂共同给予时，聚核苷酸佐剂可在给予该另佐剂之前和/或之后和/或同时给予。例如，聚核苷酸佐剂可在初次给予抗原时并合给予，随后追加给予一剂含有其中一种佐剂或所有二种佐剂的疫苗。选择性地，初次给予的疫苗可排除聚核苷酸佐剂，但后续给予病人含有该聚核苷酸佐剂的免疫原物质。

在某些实施方案中，本发明的免疫原组合物可以和细胞因子或是例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15等其它辅助刺激分子共同给予。

在一个相关实施方案中，本发明提供一种免疫原物质，包含PIKA佐剂、一或多种抗原物质，加上一适当载剂。该载剂可为例如油水乳剂、悬浮液、脂质载剂、铝盐、脂质体卷(cochleates)、ISCOMs、脂质体、活细菌载体、活病毒载体、微球体、核酸疫苗、聚合物、聚合物环、氟化钠、转基因植物、病毒原质体(virosomes)、类病毒颗粒，以及其它常用传输载体。

聚核苷酸佐剂可直接给予个体或是和传输复合物共同给予。该传输复合物是一种并合有致标手段的物质，例如对于诸如树突细胞(dendritic cell)等标的细胞表面具有更高亲和力和/或易被标的细胞所吸收的分子。传输复合物的范例包括但不限于并有下列物质的核酸传输复合物：固醇(例如胆固醇)、脂肪(例如正价离子脂肪、病毒原质体或脂质体)或是标的细胞特异性结合成份(例如能被一标的细胞特异性受体所辨识的配位体)。优选的复合物在活体内是足够稳定以防止在被标的细胞内化之前显著崩解。但是，该复合物在细胞内的适当条件下是可以裂解的。

在相关实施方案中，含有PIKA佐剂的组合物不包含聚-L-赖氨酸或其衍生物。

组合套装(Kits)

在某些实施方案中，本发明提供一种包含本发明免疫原组合物的组合套装。在某些实施方案中，本发明提供一种组合套装，包含分别位在不同配方内的PIKA佐剂和抗原。

在个相关实施方案中，木发明提供一种组合套装，包含聚核苷酸佐剂和免疫原化合物，其中该免疫原物质是抗原。

在一些实施方案中，本发明的组合套装包含配制于无菌液体(例如水性)配方内的本发明免疫原组合物，其中该配方是无菌的且盛装在无菌容器、无菌小管或无菌注射筒内。

在一些实施方案中，本发明的组合套装包含被配制成注射用的本发明免疫原组合物。在一些实施方案中，本发明的组合套装包含配制于无菌液体配方内的本发明免疫原组合物，盛装在无菌注射筒内；以及针头。本发明的组合套装包含配制于无菌液体配方内且呈一单位剂量(例如单次剂量)的本发明免疫原组合物，盛装在无菌注射筒内；以及针头。

在一些实施方案中，本发明的组合套装包含被冷冻干燥且被盛装在无菌容器内的本发明免疫原组合物，以及含有用以复原冷冻干燥组合物的无菌液体的容器。在一些实施方案中，该组合套装另包含复原冷冻干燥组合物的无菌液体的指南。

在一些实施方案中，本发明的组合套装包含一免疫原组合物，该免疫原组合物被配制成通过直肠、阴道、鼻、口(包括经呼吸道吸入)、眼、局部、肺脏、眼球或透皮来给予，以及适当传输装置，例如吸入器、栓剂施用器等。

在一些实施方案中，本发明的组合套装另包含例如有关给予剂量和给予频率的使用指南。在一些实施方案中，指南是被直接印刷在组合套装上。在其它的实施方案中，指南是被设置成为包装内容物的印刷品。指南亦可被设置在其它媒介物上，例如呈数字或模拟形式的电子媒体上，例如录音匣、录音带、光盘、多功能数字光盘等。

配方

本发明的免疫原组合物可被配置在任一种配方中。例如，本发明的免疫原组合物可被制备成为一种可注射型溶液、干燥粉末、液态溶液例如水性或生理食盐水溶液，或成为悬浮液、油膏、乳剂、片剂、包衣片剂、微胶囊、栓剂、液滴、药片、颗粒、糖衣锭、胶囊、凝胶、糖浆或浆液。所需免疫原组合物配方的制备被一般性地叙述在Vaccine4^thEdition by Stanley A Plotkin et al.，W.B.SaundersCompany；4th edition2003。适当的配方亦被叙述在例如A.Gennaro(2000)“Remington：The Science and Practice of Pharmacy，”20^thedition，Lippincott，Williams，&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.，eds.，7^thed.，Lippincott，Williams，&Wilkins；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.，eds.，3^rded.Amer.PharmaceuticalAssoc.；Methods in Molecular Medicine，Vol.87：Vaccine Protocols，2nd edition(2003)，Humana Press；Mucosal Vaccines(1996)，Kiyono et al.，eds.，Academic Press；以及Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(2000)D.T.O′Hagan，Humana Press。

本发明的免疫原组合物可被微囊封、并入脂质体卷(encochleated)、涂布在微型金质颗粒上、或是容纳于脂质体、气雾剂或丸片内以植入皮肤，或是被干燥于一尖锐对象(例如一针头)上以刮擦进入皮肤内。

在另一实施方案中，本发明的免疫原物质可单独传输或与悬浮液系统并合传输。在一些实施方案中，该悬浮液系统是选自于由例如巨分子复合物、奈米胶囊、微球体、微珠粒和脂体基质系统所构成的群组中。脂体基质系统可选择性地含有水包油乳剂、微胞(micelles)、混合微胞(mixed micelles)或脂质体(liposomes)。

在某些实施方案中，含有PIKA佐剂的本发明免疫原组合物是呈药学上可接受性溶液的形式，该溶液可例行性地含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、兼容性载剂、佐剂和其它任择性治疗用组份。该组合物可含有例如崩解剂、粘合剂、包覆剂、膨胀剂、润滑剂、香料、甘味剂或助溶剂等添加剂。

在某些实施方案中，含有PIKA佐剂的本发明免疫原组合物是以其原物形式或药学上可接受的盐形式来给予。

木发明的免疫原组合物可以无菌和非无菌形式来使用，例如胶囊、液态溶液、液滴、乳剂、悬浮液、酏剂(elixirs)、油膏、栓剂、凝胶、软胶囊、喷剂、吸入剂、气雾剂、粉末、片剂、包衣片、菱锭(lozenges)、微胶囊、栓剂、糖衣锭(dragees)、糖浆、浆液、颗粒、灌肠剂(enemas)或药片。可以运用任何惰性载剂，例如生理食盐水或磷酸盐缓冲化生理食盐水、稳定剂、驱动剂等任何惰性载剂，该惰性载剂被包封在用以帮助给药的明胶胶囊内或是在微胶囊或载体内，或是可以运用使得本发明方法所使用的化合物具有适用于本发明方法的溶解性质的任何载剂。

在某些实施方案中，PIKA佐剂组合物以及包含PIKA佐剂和抗原化合物的免疫原组合物可被冷涷干燥，以呈固体形式长时稳定保存。冷涷干燥法是熟习本领域技术人士所知悉的。

在一个特别相关方面，木发明提供佐剂组合物或免疫原组合物，其中该免疫原组合物，或是被包含在该免疫原组合物的佐剂组合物，呈现固体或液体形式或是位于溶液或悬浮液或乳剂内。

本发明的免疫原组合物可借着通过呼吸道吸入途径(经口腔、气管内、鼻内)的药用传输系统来给予个体。因此，本发明的免疫原组合物可被配制成适合吸入给予的形式。该药用传输系统适合于将本发明的细菌组合物局部给予至支气管的粘膜被覆层而进行吸入性治疗。本发明可运用依赖压缩气体驱动力的系统而将细菌喷出容器。为达成此一目的，可使用气雾剂或加压容器。

本说明书所使用的“气雾剂”此用语是依据它的惯用意义来使用，意指被加压推进气体携载至施行治疗地址的极细微液态或固态颗粒。当药用气雾剂被运用于本发明时，该气雾剂含有免疫原组合物，而该免疫原组合物可被溶解、悬浮或乳化在由流体载剂和抛射剂所构成的混合物中。气雾剂可呈溶液、悬浮液、乳剂、粉末或半固体制剂的形式。本发明所使用的气雾剂是意图以细微固态颗粒或液态气雾的形式通过个体的呼吸道来给予。被熟习木项技术人士所知悉的各种抛射剂均可被使用。适当抛射剂的范例包括但不限于烃类或其它适当气体。以加压气雾剂为例，其剂量可通过设置一阀件来设定，以传输经计算的用量。

数个不同种类的呼吸道吸入方法可被使用于本发明。本发明的免疫原组合物基本上可被配制成三种不同种类的吸入用配方。第一，本发明的免疫原组合物可与低沸点抛射剂共同配制。这种配方通常通过常用定量吸入器(MDI′s)来给予。但是，可运用美国专利第5,404,871号和第5,542,410号中所论及的技术来测量个体的呼吸体积和流速，而将常用MDI′s加以改装以增进重复给药的能力。

选择性地，本发明的免疫原组合物可被配制在水性或酒精溶液中，并通过常用雾化器来传输。在一些实施方案中，这种溶液配方是利用例如美国专利第5,497,763号、第5,544,646号、第5,718,222号和第5,660,166号中所揭露的装置和系统来雾化。

另外，本发明的免疫原组合物可被配制成干粉配方。这种配方的给予方式可透过产生该粉末的气雾之后再简单地吸入该干粉配方。这种给予方式的实施技术被叙述在美国专利第5,775,320号和美国专利第5,740,794号中。

适合鼻内给予的配方包括鼻用喷剂、鼻用滴剂、气雾剂配方等。

在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物被配制成持续释放剂(例如控制释放型配方)。例如，在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物被配制成丸片或柱体，并以贮释注射剂(depot injections)或植入物的形式植入肌肉内或皮下。这种植入物通常会应用如可生物降解性聚合物等习知惰性材料。可注射的贮释形式可通过在如聚乳酸聚甘醇酸(polylactide-polyglycolide)等可生物降解性聚合物中形成本发明免疫原组合物的微胶囊基质来制成。其它适用的可生物降解性聚合物的范例包括聚(原酸酯)(poly(orthoesters))和聚酐。可注射的贮释配方亦可通过将组合物埋覆在可与身体组织兼容的脂质体或微乳剂内来制成。传输释放系统亦包括下列范例：以聚合物为基础的系统、微胶囊、脂肪、水凝胶释放系统、硅橡胶系统(sylastic systems)、肽系统、以肽为基础的系统、蜡质覆膜、压片、部分融合型植入物。其它形式的持续释放剂是熟习于本领域技术人士所知悉的。

方法

在一个特别相关方面，本发明提供一种用以刺激和/或促进对于抗原化合物的免疫反应的方法，包含将本发明的免疫原组合物给予宿主。在一些实施方案中，该宿主是人类。在其它实施方案中，该宿主是非人类动物，例如非人类哺乳动物、禽鸟物种等。

在某些实施方案中，该聚核苷佐剂组合物可被使用在疫苗内。该疫苗组合物可选择性地含有其它佐剂。所涵盖的疫苗种类为抗传染病、抗癌症、抗过敏和抗自体免疫疾病。

另外，本发明提供一种用以促进对于抗原化合物的免疫反应的方法，包含将本发明的免疫原组合物给予宿主。该宿主是人类或非人类动物。

在某些实施方案中，该佐剂和该抗原共同被给予。在其它实施方案中，该佐剂是在给予该抗原之前或之后被给予。

本发明的免疫原组合物在一些实施方案中是通过肌肉内、腹腔内、静脉、皮下或皮内注射等胃肠道外注射来传输。在其它实施方案中，该免疫原组合物是以注射以外的方式(例如不以机械装置来破坏上皮细胞障壁的方式)经皮内传输。在其它实施方案中，该免疫原组合物是通过直肠、阴道、鼻、口(包括经呼吸道吸入)、眼、眼球、局部、肺脏或透皮来传输。

个体会透过环境接触而暴露于抗原中，因而会有发展出例如过敏反应、传染病、自体免疫疾病或癌症的危险。在其它实施方案中，个体因先前透过环境接触而暴露于抗原中，结果罹患传染病、自体免疫疾病、癌症或过敏症。

在某些实施方案中，当含有聚核苷酸佐剂的免疫原组合物的给予形式是用以治疗癌症时，传输方式是将该免疫原组合物直接注射进入肿瘤或肿瘤附近。在一些实施方案中，该免疫原组合物是平均地传输于肿瘤表面或内部以增进生物分布性，从而增进治疗效果。

例如，对于以水溶液进行胃肠道外给予而言，该溶液在必要时应该被适当地缓冲化，且先以足量的生理食盐水或葡萄糖来稀释以使其呈现等张。这些特定的水性溶液特别适用于静脉和腹腔内给予。关于这点，熟习本领域技术人士将可参照本申请揭示内容而知悉可供使用的无菌水性媒介物。可供本发明使用的典型注射媒介物包括含有或不含有分散剂和/或防腐剂的缓冲液，以及食用油、矿物油、鳕鱼肝油、角鲨烯(squalene)、一-、二-或三酸甘油酯，以及这些成份的混合物。

本发明的免疫原组合物是以有效量被给予，也就是说，本发明的免疫原组合物的用量在选定给予途径中可有效地刺激、诱导或增进免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应是被特定病原性微生物所产生的抗原所激发。在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物的用量可有效地遏制和/或根除病原性微生物的感染和/或降低感染所并发的症状。

例如，在一些实施方案中，将本发明的免疫原组合物给予个体可有效地治疗一传染病，其中传染病的治疗包含下列一或多者：降低病原体在个体内的数目(例如降低病毒负荷量、降低细菌负荷量(bacterial load)、降低原虫数目、降低蠕虫数目)和/或降低传染病相关参数，该参数包括但不限于传染物质所产生的产物水平的降低(例如毒素、抗原等)；以及降低对于该传染物质的非所需生理反应(例如发烧、组织水肿等)。

这些组成所需的精确用量是随着个体不同，依据个体的物种、年龄、体重及一般状态，被治疗或预防的疾病、感染或病况的严重性，所使用的特定化合物及它的给予形式等而有所变化。熟习本领域技术人士得知本说明书的公开的内容后，可仅仅利用例行实验而决定适当的用量。初次给予后，个体可再接受一或多次适当间隔的追加免疫。

在一些实施方案中，一系列剂量的本发明免疫原组合物被给予。在这些实施方案中，第一剂本发明免疫原组合物是为了给予疫苗。第二剂本发明免疫原组合物是在个体因暴露于该第一剂而已经被免疫致敏化之后再给予该个体。加强剂(booster)可在初次免疫数日、数周或数月之后给予，依据病人的反应和状况而定。例如，加强剂在给予第一剂约2日至约12个月后给予，例如在给予第一剂约2日至约7日、约1周至约2周、约2周至约4周、约4周至约8周、约8周至约6个月、或6个月至约12个月后给予。本发明亦思及利用第三、四、五、六剂或后续剂量来进行第三、四、五、六次或后续加强免疫的应用。

在某些实施方案中，给予手段可包含数个替代性途径的组合，例如：在系统性给予剂型(例如腹腔、肌肉内、皮下或皮内给予)之后接续以粘膜传输剂型(例如经鼻内吸入)，反之亦然。

在某些实施方案中，聚核苷佐剂可以和给予病人的第一剂抗原或是和给予病人的任何后续配剂或是和给予病人的所有配剂合并给予。所给予的至少一剂中将会包含PIKA佐剂以作为完整流程的一部分。

在某些实施方案中，所给予的免疫原组合物的组成可以在初始给予和加强剂之间和/或数个加强之间具有变化。举例来说，所给予的初次配剂可包含DNA疫苗，而加强剂是呈重组蛋白疫苗的形式。所给予的至少一剂中将会包含PIKA佐剂以作为完整流程的一部分。

运用标准分析方法可容易地测定对于抗原的抗体反应是否已经在个体内被诱导或促进。例如，酶连结免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、免疫沉降分析和蛋白墨点(“western blot”)分析等免疫分析以及中和分析(例如活体外或活体内的病毒感染性中和分析可用以测定体液或其它生物样品(例如个体的血清、分泌物或其它流体)内对于微生物抗原具有特异性的抗体的存在。

运用标准分析方法可容易地测定对于抗原的CD4免疫反应是否已经在个体内被诱导，例如萤光-活化细胞分类法(fluorescence-activated cell sorting(FACS))(请参见例如Waldrop et al.(1997)J.Clin.Invest.99：1739-1750)；细胞内细胞因子分析用以测定抗原刺激后细胞因子的产生(参见例如Suni et al.(1998)J.Immunol.Methods212：89-98；Nomura et al.(2000)Cytometry40：60-68；Ghanekar et al.(2001)Clin.Diagnostic Lab.Immunol.8：628-631)；MHC-肽多聚体染色分析，例如利用可被检测地标志(例如被萤光标志)的可溶性第II类MHC/肽多聚体(参见例如Billand Kotzin(2002)Arthritis Res.4：261-265；Altman et al.(1996)Science274：94-96；以及Murali-Krishna et al.(1998)Immunity8：177-187)；酶连结免疫点(ELISPOT)分析(参见例如Hutchings et al.(1989)J.Immunol.Methods120：1-8；以及Czerkinskyet al.(1983)J.Immunol.Methods65：109-121)等。作为细胞内细胞因子分析的一个非限制性实施例，全血被抗原和共刺激抗体(例如抗-CD28、抗-CD49d)刺激2小时以上；加入布雷菲德菌素A(BrefeldinA)以抑制细胞因子分泌；以及处理细胞以利用针对CD4以及针对TNF-α、IFN-γ和IL-2等细胞因子的萤光标志抗体进行FACS分析。

运用常用分析方法可以测定对于抗原(例如病原体)的抗原特异性CD8(例如细胞毒性T细胞；“CTL”)反应是否被诱导，这些分析方法包括但不限于通过测量CTL对于细胞表面上表达出抗原的标的细胞所造成的特异性分解作用，其中标的细胞已并有可检测标志，该标志在标的细胞分解后会释出且可利用例如⁵¹Cr-释放分析、以镧萤光为基础的细胞分解分析等方法来测量。

适合进行治疗的个体

适合利用木发明诱导对于微生物病原体的免疫反应的方法以及治疗或预防微生物病原体感染的方法来进行治疗的个体，包括已被病原性微生物感染的个体；易被病原性微生物感染但尚未被感染的个体；以及具有被病原性微生物感染的危险性但尚未被感染的个体。适合的个体包括婴儿、幼童、青少年和成人。

适合利用本发明诱导对于微生物病原体的免疫反应的方法以及治疗或限制微生物病原体感染的方法来进行治疗的个体包括小儿科目标族群，例如约1岁至约17岁之间的个体，包括婴儿(例如约1个月至约1岁)、幼童(例如约1岁至约12岁)和青少年(例如约13岁至约17岁)。

适合利用本发明诱导对于微生物病原体的免疫反应的方法以及治疗或限制微生物病原体感染的方法来进行治疗的个体包括新生儿，例如1天至约14天龄的个体(例如人类新生儿)，例如约1天至约2天龄、约2天至约10天龄、或是约10天至约14天龄。

在特定实施方案中，该个体是一位约10岁或更年少(例如约5岁或更年少)的人类儿童，且免疫原组合物在下列一或多个时间被给予：出生后2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、15个月、18个月或21个月，或是在2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁或10岁时。在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物被给予一位在约6个月至约6岁的年龄范围的个体，其中该个体在约6个月龄时接受第一剂，并在例如2岁、4岁和6岁时接受2-3剂的后续加强剂。

在特定实施方案中，该个体是一位约17岁至49岁的人类成人。在一些实施方案中，该个体是一位50至65岁、65岁至75岁、75至85岁或超过85岁的老年人类成人。

在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物是在一个体与微生物病原体的实际或潜在来源(例如已知被微生物病原体所感染或怀疑被感染的个体)接触之后(例如在确认或怀疑接触之后)立即给予该个体。例如，在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物是在个体已知被微生物病原体所感染或怀疑被感染的个体接触之后约1小时内、约2小时内、约5小时内、约8小时内、约12小时内、约18小时内、约24小时内、约2日内、约4日内、约7日内、约2周内或1个月内给予该个体。

在一些实施方案中，本发明的免疫原组合物被给予已知或怀疑是微生物病原体的携带者的个体，无论他们是否显现感染症状。

适合利用本发明诱导对于微生物病原体的免疫反应的方法以及治疗或限制微生物病原体感染的方法来进行治疗的个体包括缺乏CD4⁺T细胞的个体(「CD4⁺-缺乏性」个体)，例如具有低于正常数目的功能性CD4⁺T淋巴细胞的个体。本说明书所使用的「正常个体」此用语的意思是，所具有的CD4⁺T淋巴细胞水平和功能是位在族群正常范围内的个体，就人类而言，通常每毫升血液中具有600至1500个CD4⁺T淋巴细胞。CD4⁺-缺乏性个体包括罹患后天免疫不全症或原发性免疫不全症的个体。后天免疫不全症可能是因放射线治疗或化学治疗等所造成的暂时性CD4⁺缺乏。

具有健康完整的免疫系统但具有转变成CD4⁺缺乏的危险性的个体(「高危险」个体)亦适合以本发明的方法来治疗。高危险个体包括但不限于较一般族群具有更高可能性转变成CD4⁺缺乏的个体。具有转变成CD4⁺缺乏的危险性的个体包括但不限于因为和被HIV感染的个体进行性活动而具有受HIV感染的危险性的个体；静脉药物使用者；可能被暴露于受HIV感染的血液、血液制品或其它受HIV所污染的体液的个体；通过受HIV感染个体的产道的婴儿；被HIV感染母亲所哺育的婴儿等。

适合利用本发明治疗癌症的方法来进行治疗的个体包括已被致癌物质所感染的个体；易于罹患癌症但尚未被诊断出罹患癌症的个体；以及具有罹患癌症的危险但尚未被诊断出罹患癌症的个体。适合的个体包括婴儿、幼童、青少年和成人。

适合利用本发明治疗癌症的方法来进行治疗的个体包括已被诊断出罹患癌症的个体。先前已接受例如化学治疗或放射线治疗来治疗癌症而现在正监控该先前所治疗的癌症是否复发的个体；以及接受骨髓移植手术或其它器官移植手术的个体。

适合利用本发明用以治疗过敏的配方和方法来进行治疗的个体包括已被诊断出患有过敏的个体。可以接受本说明书所述方法和药剂来进行治疗的个体包括已知对于一或多种过敏原具有过敏反应(allergic hypersensitivity)的个体。可以接受治疗的个体包括罹患前述任何一种过敏性疾病的个体。具有对于一或多种过敏原产生过敏反应的危险性的个体也可以接受治疗。接受一或多个治疗过敏性疾病的标准疗程但治疗失败的个体也适合利用本发明。

适合接受治疗的个体包括居住在工业国家的个体；居住在发展中国家的个体；居住在乡村地区的个体；居住在较偏远隔离地区的个体等。

本发明的免疫原组合物的日标族群是依据微生物病原体的不同而有所变化的。

以上所述内容是一般性地叙述本发明。以下描述实施例将可协助了解本发明。这些实施例仅以例示说明为目的，而非意图对于本发明的范围加以限制。当情势所趋或为因时制宜时，当可思及本发明在形式上的变化和等效性取代。虽然本说明书使用特定的用语，但是这些用语是意图供说明之用，而不是以限制为目的。

实施例

实施例1：PIKA和各种抗原相组合以诱导特异性免疫反应

这个实施例涉及利用PIKA和各种抗原相组合以在活体内刺激特异性免疫反应。这个研究利用共通流程进行一系列独立实验，但每次利用一种不同的抗原。受测抗原包括：乙型肝炎adw型表面抗原重组蛋白、灭活裂解型流感疫苗(得自于Sanofi Pasteur的VAXIGRIP)、合成型HIV肽抗原、第2型单纯疱疹病毒gD抗原重组蛋白、重组型炭疽菌保护蛋白抗原、灭活型全病毒禽流感抗原品系H5N1和灭活型全病毒严重急性呼吸道综合症(SARS)灭活抗原。

个别实验的流程涉及将数组Balb/c小鼠(每组3只)接种以抗原组合物、抗原和PIKA佐剂(一种由主要位在约66kDa至1,200kDa的重量分布范围内的PIKA分子所构成的异质组合物)、PIKA、含有磷酸盐缓冲溶液(PBS)的对照组。

依据所使用的各种抗原给予实际剂量。在初次注射后第10至14天，给予小鼠相同的加强剂疫苗。在加强剂注射后第10至14天采取血液样品，随后处死小鼠并从脾脏取得组织样品。实验结果是以各组内个别小鼠的测验结果的平均值来呈现。

制备脾脏细胞的悬浮液，并将来自于各只小鼠的细胞悬浮液的样品置入ELISPOT培养板的6-12孔中并加以培养。该ELISPOT培养板的各孔容纳有200ul的脾细胞悬浮液，每孔约有2x10⁵至1x10⁶个细胞(详见下表)。对于各只小鼠的脾细胞培养样品来说，半数含有脾细胞的孔是以培养基来培育，另外半数的孔是利用特定抗原的两种不同浓度其中一种来刺激并进行评估。培养板是在环境受控制的条件下于37℃培育20小时之后，再进行最后准备并利用具标准型ELISPOT培养板读数机来读取数据。

运用本领域技术人员所知悉的标准ELISPOT测验法来检测产生细胞因子IL-4、IL-2和干扰素-γ的细胞数目。

运用流式细胞筛选分析法(Flow Cytometry analysis)来检测CD4+T细胞所产生的干扰素-γ。萤光-活化细胞分类仪(FACS)的应用是本领域技术人员所知悉的。简单来说，浓度为2.5x10⁶个细胞/ml的脾细胞溶液被制备并分置于个别小管，每个样品置入2ml。随后制备接受抗原刺激的样品，并在环境受控制的条件下于37℃培育5小时。接着将样品加以洗涤并染色，再置入具标准型FACS读数机中读取数据。

运用本领域技术人员所知悉的标准ELISA测验法来检测从处死动物所取得的血清中的特异性抗体效价。

实施例1.1：重组型乙型肝炎表面抗原(HBSAg)adw

下表6所显示的结果是利用乙型肝炎adw型表面抗原重组蛋白来检测产生干扰素-γ、IL-2和IL-4的细胞存在数目的ELISPOT测验结果。表6中的数据(也请一并参见图1、2和3)代表ELISPOT读数和斑点形成细胞(spot forming cells)的数目，也就是产生细胞因子的细胞数目的直接测量值。

斑点形成细胞数目随着PIKA佐剂的加入而显著增加(相较于仅加入抗原)显示将PIKA佐剂加入乙型肝炎表面抗原重组蛋白可以促进被培养的脾细胞表达细胞因子干扰素-γ、IL-2和IL-4。所观察到的细胞因子表达显示PIKA佐剂的存在促进了体液和细胞免疫系统的适应性免疫反应。

表6-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生细胞因子的小鼠脾细胞

以HBsAg2.0ug/ml进行刺激单位：斑点形成脾细胞

对于处死前所采血液样品所进行的ELISA测验结果(下表7和图4)显示PIKA的存在明显地促进了免疫反应，该免疫反应是通过血清中所测得的特异性抗体效价来计算。

表7-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特定IgG效价

得到的结论是PIKA佐剂的加入促进了对于HBsAg的整体免疫反应，特别是特异性免疫反应，更特别是适应性免疫反应，且主要是Th1偏好型免疫反应以及促进细胞免疫反应。

实施例1.2：VAXIGRIP(Sanofi Pasteur)，含有类H1N1、H3N2病毒株和b/Shanghai5/361/2002病毒株的灭活纯化流感抗原

下表8所显示的结果是利用VAXIGRIP疫苗(由Sanofi Pasteur药厂所生产的一种灭活裂解人类流感疫苗)来检测产生干扰素-γ、IL-2和IL-4的细胞存在数目的ELISPOT测验结果。表8中的数据(也请一并参见图5、6和7)代表ELISPOT读数和斑点形成细胞的数目，也就是细胞因子产生量的直接测量值。

斑点形成细胞数目随着PIKA佐剂的加入而显著增加(相较于仅加入抗原)显示将PIKA佐剂加入流感抗原可以促进被培养的脾细胞表达细胞因子干扰素-γ、IL-2和IL-4。所观察到的细胞因子表达显示PIKA佐剂的存在促进了体液和细胞免疫系统的适应性免疫反应。

表8-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原(inactivated split influenzaantigen)的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生细胞因子的小鼠脾细胞

单位：斑点形成脾细胞

对于处死前所采血液样品所进行的ELISA测验结果(下表9和图8)显示PIKA的存在明显地促进了免疫反应，该免疫反应是通过血清中所测得的特异性抗体效价来测量。

表9-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特定IgG效价

得到的结论是PIKA佐剂的加入促进了对于流感抗原的整体免疫反应，特别是特异性免疫反应，更特别是适应性免疫反应，又更特别是细胞免疫反应。

VAXIGRIP是一种经过认可的流感疫苗，它被认为可以显著地降低罹患流感的危险性。PIKA的加入促进了细胞因子的产生水平，因而显示含有VAXIGRIP和PIKA的疫苗亦可激发免疫反应而显著地降低罹患流感的危险性。

实施例1.3：合成型HIV肽抗原

下表10所显示的结果是利用HIV肽抗原来检测产生干扰素-γ、IL-2和IL-4的细胞存在数目的ELISPOT测验结果。表10中的数据(也请一并参见第9、10和11图)代表ELISPOT读数和斑点形成细胞的数目，也就是细胞因子产生量的直接测量值。

斑点形成细胞数目随着PIKA佐剂的加入而显著增加(相较于仅加入抗原)显示将PIKA佐剂加入HIV抗原可以促进被培养的脾细胞表达细胞因子干扰素-γ、IL-2和IL-4。所观察到的细胞因子表达显示PIKA佐剂的存在促进了体液和细胞免疫系统的适应性免疫反应。

表10-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生细胞因子的小鼠脾细胞

单位：斑点形成脾细胞

FACS分析的结果显示在下表11(也请一并参见第12图)。产生干扰素-γ的CD4+T细胞只存在于含有PIKA和HIV抗原的配方的事实确认了适应性免疫反应已到达成熟阶段且PIKA能帮助这个过程的完成。

表11-以含有PIKA和/或HIV gp120抗原的疫苗进行免疫之后，利用FACS法来分析小鼠脾细胞

得到的结论是PIKA佐剂的加入促进了对于HIV抗原的整体免疫反应，特别是特异性免疫反应，更特别是适应性免疫反应，又更特别是细胞免疫反应。

实施例1.4：来自于炭疽杆菌(Bacillus Anthracis)的重组型炭疽菌保护蛋白抗原 (rPA)

下表12所显示的结果是利用重组炭疽菌抗原来检测产生干扰素-γ、IL-2和IL-4的细胞存在数目的ELISPOT测验结果。表12中的数据(也请一并参见图13、14和15)代表ELISPOT读数和斑点形成细胞的数目，也就是细胞因子产生量的直接测量值。

斑点形成细胞数目随着PIKA佐剂的加入而显著增加(相较于仅加入抗原)显示将PIKA佐剂加入炭疽菌抗原可以促进被培养的脾细胞表达细胞因子干扰素-γ、IL-2和IL-4。所观察到的细胞因子表达显示PIKA佐剂的存在促进了体液和细胞免疫系统的适应性免疫反应。

表12-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生细胞因子的小鼠脾细胞

单位：斑点形成脾细胞

FACS分析的结果显示在下表13(也请一并参见图16)。产生干扰素-γ的CD4+T细胞只存在于含有PIKA和rPA抗原的配方的事实确认了适应性免疫反应已到达成熟阶段且PIKA能帮助这个过程的完成。

表13-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫之后，利用FACS 法来分析小鼠脾细胞

对于处死前所采血液样品所进行的ELISA测验结果(下表14以及图16和17)显示PIKA的存在明显地促进了免疫反应，该免疫反应是通过血清中所测得的特异性抗体效价来测量。

初次施打疫苗之后16周，利用标准ELISA测验法来评估来自于原始A和B组小鼠的血液样品中的特异性抗体存在量，可以观察到一致性的结果。再次，PIKA和炭疽菌抗原的共同存在可诱导显著较高的免疫反应，该免疫反应是通过血清中所测得的特异性抗体效价来测量。

表14-以含有PIKA和/或炭疽菌rPA抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG效价

得到的结论是PIKA佐剂的加入促进了对于rPA的整体免疫反应，特别是特异性免疫反应，更特别是适应性免疫反应，又更特别是细胞免疫反应。

实施例1.5：2型单纯疱疹病毒gD抗原重组蛋白

下表15所显示的结果是利用重组型单纯疱疹病毒抗原来检测干扰素-γ、IL-2和IL-4的存在量的ELISPOT测验结果。表15中的数据(也请一并参见图19、20和21)代表ELISPOT读数和斑点形成细胞的数目，也就是细胞因子产生量的直接测量值。

斑点形成细胞数目随着PIKA佐剂的加入而显著增加(相较于仅加入抗原)显示将PIKA佐剂加入单纯疱疹病毒抗原可以促进被培养的脾细胞表达细胞因子干扰素-γ、IL-2和IL-4。所观察到的细胞因子表达显示PIKA佐剂的存在促进了体液和细胞免疫系统的适应性免疫反应。

表15-以含有PIKA和/或HSV2gD抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生细胞因子的小鼠脾细胞

单位：斑点形成脾细胞

FACS分析的结果显示在下表16(也请一并参见图22)。产生干扰素-γ的CD4+T细胞只存在于含有PIKA和HSV抗原的配方的事实确认了适应性免疫反应已到达成熟阶段且PIKA能帮助这个过程的完成。

表16-以含有PIKA和/或HSV2gD抗原的疫苗进行免疫之后，利用FACS法来分析小鼠脾细胞

对于处死前所采血液样品所进行的ELISA测验结果(下表17以及图23)显示PIKA的存在明显地促进了免疫反应，该免疫反应是通过血清中所测得的特异性抗体效价来测量。

表17-以PIKA和/或HSV2gD疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG效价

Figure DEST_PATH_G18150862150138000D000052

得到的结论是PIKA佐剂的加入促进了对于HSV抗原的整体免疫反应，特别是特异性免疫反应，更特别是适应性免疫反应，又更特别是细胞免疫反应。

实施例1.6：灭活H5N1全病毒(禽流感)抗原

下表18所显示的结果是利用灭活未纯化型H5N1抗原来检测干扰素-γ、IL-2和IL-4的存在量的ELISPOT测验结果。表18中的数据(也请一并参见图24、25和26)代表ELISPOT读数和斑点形成细胞的数目，也就是细胞因子产生量的直接测量值。

斑点形成细胞数目随着PIKA佐剂的加入而显著增加(相较于仅加入抗原)显示将PIKA佐剂加入H5N1抗原可以促进被培养的脾细胞表达细胞因子干扰素-γ、IL-2和IL-4。所观察到的细胞因子表达显示PIKA佐剂的存在促进了体液和细胞免疫系统的适应性免疫反应。

表18-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT 法来检测产生细胞因子的小鼠脾细胞

FACS分析的结果显示在下表19(也请一并参见图27)。产生干扰素-γ的CD4+T细胞只存在于含有PIKA和H5N1抗原的配方的事实确认了适应性免疫反应已到达成熟阶段且PIKA能帮助这个过程的完成。

表19-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫之后，利用FACS法来分析小鼠脾细胞

单位：斑点形成脾细胞

对于处死前所采血液样品所进行的ELISA测验结果(下表20以及图28)显示PIKA的存在明显地促进了免疫反应，该免疫反应是通过血清中所测得的特异性抗体效价来测量。

表20-以含有PIKA和/或灭活H5N1抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG效价

Figure DEST_PATH_G18150862150138000D000061

得到的结论是PIKA佐剂的加入促进了对于H5N1抗原的整体免疫反应，特别是特异性免疫反应，更特别是适应性免疫反应，又更特别是细胞免疫反应。

实施例2：灭活型全病毒SARS抗原

这个实验的目标在于显示将PIKA加入SARS抗原能促进免疫反应并刺激宿主免疫系统以产生SARS特异性保护抗体。

在这个研究计划中，6个各含4只Balb/c小鼠的群组(经腹腔注射)被接种以SARS抗原组合、抗原加上PIKA(一种由主要位在约66kDa至1200kDa的重量分布范围内的PIKA分子所构成的异质组合物)、PIKA或对照组。参见下表21(请一并参见图29)。

在第0天、第14天和第28天时将相同剂量给予各群组。第6周时抽取一血液样品并测验血清中的IgG的存在量，以此为疾病特异性抗体的存在测量值。将血清稀释16,000倍，接着利用ELISA读数器来测量IgG的存在量，这个过程是本领域技术人员所知悉的。输出的数值为光学密度(O.D.)的读数，其中该数值愈高表示IgG的存在量愈高。

各群组实验结果的平均值呈现在表21，该数据显示PIKA佐剂的存在和IgG表达的增加之间具有相关性。

表21-以含有PIKA和/或完整灭活SARS抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG效价

Figure DEST_PATH_G18150862150138000D000062

得到的结论是PIKA和SARS抗原的共同存在能以剂量相依赖的方式来增加IgG的表达，从而促进宿主的免疫反应。

实施例3：PIKA疫苗提供对抗H5N1感染的免疫保护作用

这个实验的目标在于显示含有PIKA佐剂的禽流感疫苗能够保护鸡只免于禽流感活病毒的感染。

这个研究是在2个各具有24只SPF鸡的群组中进行。在10天龄鸡只的颈部通过皮下接种以一剂700ul的含PIKA(一种由主要位在66kDa至660kDa的重量范围内的PIKA分子所构成的异质组合物)和二株禽流感病毒(H5N1和H9N2)的疫苗。该组合物含有呈现约为2∶1的比例的抗原和PIKA佐剂。

在第7、14和21天时在鸡只的翼下部分采取数个血液样品。测验来自于各鸡只的血液样品中的特异性H5和H9抗体的存在量。

在第21天时，以活的H5N1病毒来攻毒鸡只，再观察14天。记录暴露在活的H5N1病毒后第14天的鸡只存活率。

各群组的平均结果(表22，请一并参见图30和31)显示PIKA的存在诱导特异性抗体的产生。

表22-以含有PIKA和/或灭活禽流感抗原(H5N1和H9N2)的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于鸡血清的特异性抗体效价

单位：ELISA分析所得到的光密度值

在施打抗原/PIKA组合物疫苗的24只鸡中，有21只(83％)在暴露于活的H5N1病毒后第14天仍存活。在没有接受疫苗但仍暴露于活的H5N1病毒的对照组24只鸡中，14天后仅有4只(17％)存活。

得到的结论是PIKA疫苗能够提供显著的免疫保护作用水平以对抗H5N1病毒。

实施例4：PIKA疫苗提供对抗狂犬病感染的免疫保护作用

这个研究的目标在于显示含有PIKA佐剂的狂犬病疫苗能够提供对抗狂犬病感染的免疫保护作用。

4个群组(分别编号I、ii、iii和iv)各包含20只Balb/c SPF Kunming小鼠，各只小鼠被攻毒以100ul的野生型狂犬病病毒株CQ92。各群组接受不同种类疫苗的接种：i)一由PIKA(一种由主要位在66kDa至660kDa的重量范围内的PIKA分子所构成的异质组合物)和仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原所构成的组合物，其中该PIKA和狂犬病抗原呈现1比4的体积比；ii)Sanofi-Aventis药厂的Veroabvero细胞灭活型狂犬病疫苗；iii)仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病疫苗和铝佐剂(alum adjuvant)；以及iv)磷酸盐缓冲溶液对照组。感染后第30至40分钟、第3天、第6天和第9天通过皮下注射动物大腿而给予60ul的疫苗。

各群组的存活率显示在表23。(请一并参见图32)。

表23-暴露于野生型狂犬病毒后再接受狂犬病疫苗治疗的小鼠的存活率

得到的结论是PIKA的存在显著地增进了仓鼠肾细胞灭活纯化型狂犬病抗原所提供的免疫保护作用。

实施例5：PIKA和乙型肝炎疫苗诱导血清中特异性抗体的产生

这个实验的过程涉及将3个群组的Balb/c小鼠(每组3只小鼠)通过皮下注射施打下列组合物疫苗：第A组，仅有4ug的乙型肝炎adw型表面抗原；第B组，4ug抗原和75ug的PIKA佐剂(一种由主要位在约66kDa至1,200kDa的重量分布范围内的PIKA分子所构成的异质组合物)；以及第C组，仅有100ug PIKA。

在初次注射后第10至14天，通过皮下注射给予小鼠相同的加强剂疫苗。在加强剂注射后第10至14天采取血液样品，并利用本领域技术人员所知悉的标准ELISA测验法来检验特异性抗体的效价。

各群组实验结果的平均值呈现在下表24(以及图33)，这些数据显示PIKA的存在促进了对于乙型肝炎抗原的免疫反应，该免疫反应是通过观测血清样品中的特异性抗体效价来测量。

表24-以含有PIKA和/或HBsAg adw的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性抗体效价

从这个实验得到的结论是含有PIKA和乙型肝炎抗原的免疫原物质诱导了显著免疫反应的产生，该免疫反应是通过血清样品中的特异性抗体效价来测量。

实施例6：PIKA和流感疫苗诱导血清中特异性抗体的产生

这个实验的过程涉及将2个群组的Balb/c小鼠(每组3只小鼠)通过皮下注射施打下列组合物疫苗：第A组，仅有4ug的Sanofi VAXIGRIP流感疫苗；以及第B组，4ug抗原和100ug的PIKA佐剂(一种由主要位在约66kDa至1,200kDa的重量分布范围内的PIKA分子所构成的异质组合物)。

在初次注射后第20天，通过皮下注射给予小鼠相同的加强剂疫苗。在初次施打疫苗后第35天采取血液样品，并利用本领域技术人员所知悉的标准ELISA测验法来检验特异性抗体的效价。

各群组实验结果的平均值呈现在下表25(以及第34图)，这些数据显示PIKA的存在促进了对于流感疫苗抗原的免疫反应，该免疫反应是通过观测血清样品中的特异性抗体效价来测量。

表25-以含有PIKA和/或灭活裂解型流感抗原的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性抗体效价

从这个实验得到的结论是含有PIKA和流感抗原的免疫原物质诱导了显著免疫反应的产生，该免疫反应是通过血清样品中的特异性抗体效价来测量。

实施例7：PIKA和乙型肝炎(adw型表面抗原)疫苗诱导治疗性免疫反应

这个实验的过程涉及将数个各含有4只6至10周龄的Balb/c小鼠的群组接种以商业上可购得的adw型HbsAg组合物，该组合物含有或不含有PIKA佐剂(一种由主要位在约66kDa至1,200kDa的重量分布范围内的PIKA分子所构成的异质组合物)；PIKA；或是含有磷酸盐缓冲溶液(PBS)的对照组。

在小鼠背部两侧给予初次皮下注射各100ul。实际剂量提供于下表所显示的实验结果中。接着在初次注射后第21天给予小鼠相同的加强剂疫苗。在第42天时采取二个血液样品，随后处死小鼠并从脾脏取得细胞以供测试之用。

进行ELISPOT分析法以筛选出分泌抗原特异性干扰素-γ的T细胞。令来自于HBsAg的CD8T细胞肽表位(IPQSLDSWWTSL)在5ug/ml的浓度下活体外刺激取自于各只小鼠的一个脾细胞样品，以测量IPQSLDSWWTSL-特异性CD8+细胞的存在量。

以2ug/ml的HBsAg肽IPQSLDSWWTSL在活体外再刺激第二个脾细胞样品历时6天。利用5ug/ml的HBsAg肽IPQSLDSWWTSL作为活体外刺激剂进行ELISPOT分析以检测干扰素-γ。进行这个分析是为了检测免疫之后的中心记忆细胞反应。

利用ELISA分析来测量HBV抗原特异性抗体(特别是IgG1和IgG2a抗体)在血清中的存在量。在摄氏4度下，将数个Nunc Immunoplate Maxisorp培养板涂布以HBsAg(6ug/ml，配在PBS/0.01％Tween20内)过夜。以PBS/Tween洗涤这些培养板，并以配在PBS内的5％FCS进行封闭处理2小时。加以洗涤后，加入配在PBS/Tween内的血清稀释液2小时。加以洗涤后，加入缀合有生物素(biotin)的大鼠抗小鼠IgG1单克隆抗体的1/3000稀释液，或是缀合有生物素的大鼠抗小鼠IgG2a单克隆抗体的1/1500稀释液。加以洗涤后，加入链霉亲和素HRP(streptavidinHRP)(1/10,000稀释于PBS/Tween)历时1小时。加以洗涤后，以ABTS和过氧化氢(1000:1)加入，历时20分钟。接着测量在405nm下的光密度(OD)，实验结果是以各群组的平均值来呈现。

以配有PIKA佐剂的HBsAg进行免疫的小鼠的IgG1反应相较于仅以HBsAg进行免疫的小鼠反应高出约5倍。IgG1的效价是以剂量相依赖形式增加(表26和图35)。

表26：以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG1效价

单位：光密度平均值

以配有PIKA佐剂的HBsAg进行免疫的小鼠的IgG2a反应相较于仅以HBsAg进行免疫的小鼠反应显著为高。IgG2a的效价是以剂量相依赖形式增加，提示以Th1为主的免疫反应增加(表27和第36图)。

表27：以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗进行免疫之后，利用ELISA法检测来自于小鼠血清的特异性IgG2a效价

单位：光密度平均值

CD8肽表位特异性活体外刺激的ELISPOT分析显示对于仅以HBsAg进行免疫的小鼠无法测得反应。相对地，在利用配有PIKA的HBsAg进行免疫之后，表达干扰素-γ的细胞可以容易地测得且呈现剂量相依赖形式，此指出PIKA促进了治疗性免疫反应(表28和图37)。

表28：以含有PIKA和/或HBsAg的疫苗进行免疫之后，利用ELISPOT法来检测产生干扰素-γ的小鼠脾细胞

单位：斑点形成脾细胞(每1×10⁶的脾细胞中产生IFN-γ的细胞数量)

培养脾细胞6天之后所进行的ELISPOT分析显示来自被含有HbsAg和PIKA佐剂的配方所免疫的小鼠中能够产生干扰素-γ的脾细胞数目是两倍于来自仅给予HBsAg的小鼠的脾细胞数目。这结果确认了PIKA的存在能够促进中心记忆细胞的活化(表28和图38)。

Claims

1.一种免疫原组合物，其包含：(a)PIKA佐剂组合物，其中PIKA佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一种抗生素以及一种正价离子，其中所述抗生素为卡那霉素，所述正价离子为钙离子；以及(b)至少一种抗原；其中该组合物被配制成供持续释放使用，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为66,000至1,200,000道尔顿。

2.一种免疫原组合物，其包含：(a)PIKA佐剂组合物，其中PIKA佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一种抗生素以及一种正价离子，其中所述抗生素为卡那霉素，所述正价离子为钙离子；以及(b)至少一种病毒抗原；其中该抗原是腺病毒(adeniviridae)、沙粒病毒(arenaviridae)、星状病毒(astroviridae)、本扬病毒(bunyaviridae)、杯状病毒(cliciviridae)、黄病毒(flaviviridae)、肝炎病毒(hepeviridae)、疱疹病毒(Herpesviridae)、单分子负链RNA病毒(mononegavirales)、巢病毒(nidovirales)、小RNA病毒(piconaviridae)、正黏液病毒(orthomyxoviridae)、乳头瘤病毒(papillomaviridae)、细小病毒(parvoviridae)、多瘤病毒(polyomaviridae)、痘病毒(poxviridae)、呼肠孤病毒(reoviridae)、反转录病毒(retroviridae)或披膜病毒(togaviridae)中的一个抗原，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为66,000至1,200,000道尔顿。

3.根据权利要求2的免疫原组合物，其中肝炎病毒(hepeviridae)是D型肝炎病毒(hepatitis delta virus)。

4.一种免疫原组合物，其包含：(a)PIKA佐剂组合物，其中PIKA佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一种抗生素以及一种正价离子，其中所述抗生素为卡那霉素，所述正价离子为钙离子；以及(b)至少一种细菌抗原；其中该抗原是放线菌(actinobacteria)、衣原体(chlamydiae)、硬壁菌(firmicutes)、变形菌(proteobacteria)或螺旋体(spirochaetes)中的一个抗原，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为66,000至1,200,000道尔顿。

5.一种免疫原组合物，包含：(a)PIKA佐剂组合物，其中PIKA佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一种抗生素以及一种正价离子，其中所述抗生素为卡那霉素，所述正价离子为钙离子；以及(b)至少一种真菌抗原；其中该抗原是子囊菌(ascomycota)或担子菌(basidiomycota)中的一个抗原，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为66,000至1,200,000道尔顿。

6.一种免疫原组合物，其包含：(a)PIKA佐剂组合物，其中PIKA佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一种抗生素以及一种正价离子，其中所述抗生素为卡那霉素，所述正价离子为钙离子；以及(b)至少一种寄生虫抗原；其中该抗原是肉足鞭毛门(phylum sarcomastigophora)、顶覆门(phylum apicomplexa)、纤毛门(phylum ciliophora)、扁形动物门(phylum platyhelminthes)、线虫门(phylumnematode)或节肢动物门(phylum arthropoda)中的一个抗原，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为66,000至1,200,000道尔顿。

7.一种免疫原组合物，其包含：(a)PIKA佐剂组合物，其中PIKA佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一种抗生素以及一种正价离子，其中所述抗生素为卡那霉素，所述正价离子为钙离子；以及(b)至少一种癌肿抗原；其中该抗原是骨胳、脑部、乳房、消化道、内分泌、眼部、泌尿生殖器、生殖细胞、妇科、头颈部、血液、骨胳肌、神经、呼吸系统或皮肤的癌中的一种癌肿抗原，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为66,000至1,200,000道尔顿。

8.一种免疫原组合物，其包含：(a)PIKA佐剂组合物，其中PIKA佐剂包含：聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一种抗生素以及一种正价离子，其中所述抗生素为卡那霉素，所述正价离子为钙离子；以及(b)由二或更多种抗原所构成的组合；其中这些抗原是腺病毒(adeniviridae)、沙粒病毒(arenaviridae)、星状病毒(astroviridae)、本扬病毒(bunyaviridae)、杯状病毒(cliciviridae)、黄病毒(flaviviridae)、肝炎病毒(hepeviridae)、单分子负链RNA病毒(mononegavirales)、巢病毒(nidovirales)、小RNA病毒(piconaviridae)、正黏液病毒(orthomyxoviridae)、乳头瘤病毒(papillomaviridae)、细小病毒(parvoviridae)、多瘤病毒(polyomaviridae)、痘病毒(poxviridae)、呼肠孤病毒(reoviridae)、反转录病毒(retroviridae)、披膜病毒(togaviridae)、放线菌(actinobacteria)、衣原体(chlamydiae)、硬壁菌(firmicutes)、变形菌(proteobacteria)、螺旋体(spirochaetes)、子囊菌(ascomycota)、担子菌(basidiomycota)、肉足鞭毛门(phylumsarcomastigophora)、顶覆门(phylum apicomplexa)、纤毛门(phylum ciliophora)、扁形动物门(phylum platyhelminthes)、线虫门(phylum nematode)和/或节肢动物门(phylum arthropoda)中的抗原，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为66,000至1,200,000道尔顿。

9.根据权利要求8的免疫原组合物，其中肝炎病毒(hepeviridae)是D型肝炎病毒(hepatitis delta virus)。

10.如权利要求第1至9项中任一项的免疫原组合物，其中该组合物包含PIK佐剂组合物，该PIKA佐剂组合物中的分子在分子量上是异质的，其中该分子量为150,000至1,200,000道尔顿。

11.如权利要求第1至9项中任一项的免疫原组合物，其另外包含至少一个免疫调节物。

12.如权利要求第1至9项中任一项的免疫原组合物，其中该抗原为灭活微生物、减毒微生物、重组型多肽和/或合成型多肽。

13.如权利要求第1至9项中任一项的免疫原组合物，其中该免疫原组合物是呈现溶液、胶囊、乳剂、悬浮液、酏剂、油膏、凝胶、喷剂、吸入剂、气雾剂、微胶囊、栓剂、糖衣丸(dragees)、糖浆、灌肠剂、颗粒、粉末、片剂或锭剂(lozenges)的形式。

14.如权利要求13的免疫原组合物，其中所述溶液为滴液。

15.如权利要求第1至9项中任一项的免疫原组合物，其中该免疫原组合物中的至少一者被冷冻干燥。

16.一种组合套装，包含如权利要求第1至9项中任一项的免疫原组合物。

17.一种如权利要求第1至9项中任一项的免疫原组合物在制造药物上的用途，该药物是用以促进宿主对于该抗原的免疫反应。

18.如权利要求第17项的用途，其中该宿主罹患传染病，且给予该抗原激发免疫反应以对抗造成该传染病的病原体。

19.如权利要求第18项的用途，其中该给予是通过肌肉内注射、腹腔内注射、静脉注射、皮下注射、透皮传输或皮内传输来进行。

20.如权利要求第17至19项中任一项的用途，其中该宿主是人类。

21.如权利要求第17至19项中任一项的用途，其中该宿主是非人类动物。