CN1056315C - 聚肌胞复合物免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含卡那霉素和钙离子的聚肌胞(PICKCa)作为免疫佐剂或增强剂的应用，特别是涉及含PICKCa的疫苗用于预防和治疗，以及将PICKCa应用于哺乳动物或人的病毒感染期。
Description
本友明涉及一种新的免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗，特别是涉及一种聚肌胞复合物免疫佐剂及其应用。
免疫佐剂是一种能提高抗原免疫反应的因子。由于这种因子的作用是加强几乎所有T细胞依赖性抗原的免疫反应，所以免疫佐剂的作用是非特异性的。免疫佐剂又称免疫增强剂，除了能提高抗原的免疫效果外，也用于非特异性地提高机体抗细菌、真菌、病毒、寄生虫感染和肿瘤的能力。
众所周知，疫苗是人类防治病毒病最有力的武器。在现有技木中，由于各种遗传工程疫苗，合成多肽，亚单位疫苗以及一些小颗粒的全病毒灭活疫苗的免疫效果不好，通常都须用佐剂。目前国际上批准的人用佐剂只有铝佐剂。铝佐剂的缺点是不能刺激机体产生细胞免疫，也不能促进某些抗原的体液免疫，以及其它一些弊病，因而远远满足不了实际需要(Anthony D.Chinnah，et al；Vaccine，Vol.10，Issue 8，1992，551)。
为了克服现有技术的不足，本友明的目的在于提供一种新型的佐剂以及含有该佐剂的疫苗。这种新型佐剂安全稳定，能诱生干扰素，白细胞介素-II，并抑制病毒繁殖，提高疫苗的效价，显著提高机体IgM，IgG和中和抗体的产生。
本友明涉及含卡那霉素和钙离子的聚肌胞(Polyriboinosinic-Polyribocytididylic acid(PIC)containing Kanamycin and Calcium)作为免疫佐剂的应用。本文中以下将所述的含卡那霉素和钙离子的聚肌胞简称为PICKCa。
早在70年代，国际上就已发现了PIC，双链聚肌胞具有很好的诱生干扰素作用，在此之后又发现了其衍生物，即含多聚赖氨酸和羧甲基纤维素的聚肌胞(PICcontaining polyL-Lysin and Carboxymethylcellulose，PICLC)。但是PIC不能于灵长类以上的动物，包括人体，而PICLC的毒性太大也不能用于人体。于是人们继续研究，终于发现了PICKCa，这种药品只是用于对某些病毒病的治疗。本领域技术人员熟知，感染和发病是完全不同的两个概念。PICKCa的发现是用于病毒感染后，并且确诊患上病毒病时才使用。而且PICKCa对病毒病的治疗效果也不尽人意。特别应当指出的是迄今为止没有任何资料报道将该已知的药品作为免疫佐剂来加以使用。
PICKCa的用量是公知，因此通常每支疫苗中，可加入1～2mg PICKCa，按不同疫苗的要求进行免疫注射。因此，本友明对PICKCa的用量不加以进一步的说明。
本发明涉及的佐剂PICKCa具有如下有益的效果：
1、PICKCa同病毒抗原或灭活疫苗结合后能显著地提高该抗原或疫苗的免疫效果，即具有显著的免疫佐剂的作用。
2、由于PICKCa本身在人体上已经使用，使得PICKCa很容易被人们接受，并替代目前使用的铝佐剂而独树一帜，成为很有前途的新佐剂。
3、PICKCa单独用于病毒性疾病感染的潜伏期具有显著的抗病毒效果。
4、PICKCa与病毒抗原或灭活疫苗结合后，用于病毒病的治疗较单纯应用PICKCa又进一步增加了治疗效果。
由于免疫佐剂的非特异性，PICKCa将在病毒、细菌、寄生虫感染治疗和抗肿瘤中产生重要作用，特别是将对多种疫苗产生显著的免疫佐剂作用。本文所涉及的疫苗包括人用狂犬病疫苗，流行性出血热疫苗，但不限制于此。
图表说明：
表1：PICKCa诱生干扰素的测定。
表2：PICKCa诱生白细胞介素II的测定。
表3：用PICKCa来诱生小鼠体内IgG和中和抗体的测定。
表4：PICKCa降低感染狂犬病病毒小白鼠的死亡率。
表5：PICKCa与狂犬病毒抗原结合后，免疫OF1小鼠，在不同时间分离血清，检测其IgM、IgG中和抗体的结果。
表6，表7：PICKCa促进疫苗效价的结果。
表8：说明PICKCa与狂犬病毒抗原结合后，进一步降低感染狂犬病毒小鼠死亡率的结果。
表9：对于PICKCa和疫苗结合后的安全性的检测。
表10：显示PICKCa促进流行性出血热灭活疫苗抗体产生的情况。
为了进一步理解本友明，以下将结合实施例详细说明本友明的实质。下述的实施例并非意在限定本发明，只是帮助人们理解本发明。实验例1PICKCa诱生干扰素
取OFl小鼠20只肌注PICKCa，每只0.05～0.1mg。在不同时间分离小鼠血清，通过抑制VSV病毒在L929细胞产生的病变，然后通过显色法测定血清干扰素的产生情况。测定方法见Mossman T.，Rapid Colormetric Assay for CellularGrowth And Survival：Application to Proliferation And Cytotoxicity Assays，J.Immun.Meth.1983，65：55-63。
该试验的结果见表1。
该试验结果表明PICKCa能诱生高滴度干扰素，并在注射2小时即可达到高峰。实验例2PICKCa诱生白细胞介素II(IL-2)及其测定
取C3H小鼠，用抗原，即灭活提纯狂犬病毒(IPRV)和PICKCa免疫小鼠。每只腹腔注射0.1ml。取小鼠脾脏，用3H标记CTLL细胞法测定IL-2。该方法见Joffret M.L.，et al，Appraisal of Rabies Vaccine Potency by Determination of invitro，Specific Interleukin-2 Production，Biologicals，1991，19(2)：113-123。
该试验的结果见表2。表明PICKCa能够非特异性地提高IL-2产量。实验例3
A/J小鼠用活的狂犬病毒野毒株RD9147感染后，用PICKCa治疗，用ELISA法(Perrin P.T.，Techniques for the Preparation of Rabies Conjugates in LaboratoryTechniques in Rabies(4th，edition)WHO)或RFFIT方法(Smith J.，A RapidReproducible Fest for Determining Rabies Neutralizing Antibody，Bull.Wld hith Org.1973，48：535-541)测定小鼠体内狂犬病毒IgG和中和抗体的滴度。每只小鼠体内狂犬病毒株0.1ml，然后在5小时，3天和7天各肌注PICKCa 0.05ml/只，并于不同时间抽血检测IgG和中和抗体的滴度，其结果见表3。
结果表明：小鼠在受到RD9147感染后，用PICKCa治疗其IgG和中和抗体的滴度大大降低。表明由于PICKCa显著抑制了病毒的繁殖，而使之不能刺激机体产生抗体。实验例4PICKCa降低感染狂犬病小白鼠的死亡率
将40只OFl小鼠随机分成4组，每组10只，用狂犬病野毒株RD4077感染小鼠，每只0.1ml感染后的6小时，第3，7，14和18天用PICKCa治疗，每只0.05ml，肌注，观察小鼠的死亡率。其结果见表4。
该结果说明PICKCa在狂犬病毒感染的潜伏期，能够极其显著地降低小白鼠的死亡率。实验例5PICKCa同狂犬病毒疫苗结合后的安全性测定
选用2组狂犬病毒疫苗分别加入PICKCa，分别对小鼠进行脑内和腹腔注射，观察其死亡情况。
结果(见表9)表明安全。本试验按“中国药典”急性毒性试验测量方法进行。实施例1
OFl小鼠46只随机分成4组。本试验是PICKCa与狂犬病毒抗原结合后，即制成疫苗，免疫OFl小鼠，以该抗原组和抗原加铝佐剂组以及空白为对照，在不同的时间分离小鼠血清，检测IgM，IgG和中和抗体，其结果是表5。
本试验中IgG和中和抗体的测定方法同实验例3中所用的方法相同，IgM的测定用ELISA法。
该结果显示抗原+PICKCa组能刺激机体提前和提高产生IgM，IgG，特别是中和抗体，而铝佐剂却使抗体产生滞后，说明以PICKCa为佐剂，其效果大大地高于Al2O3的佐剂效果。实施例2，3PICKCa促进疫苗的效价
如表6所示，用NIH法WHO Laboratory Techniques in Rabies(3rd edition)1973检测，PICKCa可降低使用半数有效抗原量(ED50)5-10倍，而铝佐剂仅降低1-2倍。
如表7表示，用NIH法测定PICKCa对人用狂犬疫苗的佐剂效果。表明PICKCa可显著提高人用狂犬疫苗的效力(国际单位)，使之均可从不合格而达到国际标准以上(2.5国际单位)。实施例4
PICKCa与狂犬病毒抗原结合后，肌注小白鼠，又进一步降低了感染狂犬病毒的小白鼠的死亡率。
本试验的目的是当小鼠用野毒株感染后观察PICKCa或Al2O3同灭活提纯狂犬病毒结合后，对小鼠的保护作用。
如表8所示PICKCa与狂犬病疫苗结合后治疗感染了狂犬病野毒株的小白鼠，较单纯用PICKCa治疗，又进一步降低了小白鼠的死亡率，单纯灭活疫苗治疗效果微乎其微，而加入铝佐剂则完全不起作用。实施例5PICKCa促进流行性出血热灭活疫苗抗体的产生
本试验采用Al(OH)3作对照。PICKCa与出血热灭活疫苗等量混合后，肌注实验家兔，1ml/只，隔周一次，在第14和21天抽血，用ELISA和RPHI检测抗体产生情况。
其结果见表10。表明PICKCa促进流行性出血热疫苗ELISA抗体效价4-8倍，RPHI抗体2倍，而铝佐剂仅分别为0～4倍，对RPHI抗体反而降低。
表1 PICKCa诱生小鼠干扰素的测定
时间(小时) 注射后干扰素滴度(国际单位×10-3)
PICKCa
0 ＜5
1 ＜5
2 320
3 24
4 5
6 ＜5表2用PICKCa和灭活提纯狂犬病毒(IPRV)免疫小鼠诱生白细胞介素-II的测定
体外刺激IL-2的测定(cpm×10-3)免疫 PICKCa注射(μg) 培养液 IPRV PICKCaPBS* 0 1.1 1.1 0.9PBS 75 0.5 0.6 0.9IPRV 0 0.6 13.9 2.7IPRV 75 3.7 15.7 2.0
(0)** (12.0)** *PBS：磷酸盐酸缓冲液**：与培养液IL-2的差值表3：用ELISA或RFFIT法测定RD9147狂犬病野毒株感染后，并且用PICKCa处理后A/J小鼠体内狂犬病IgG和中和抗体的滴度不同日期 感染后PICKCa ELISA测IgG的 RFFIT测中和抗体感染鼠的血清 治疗时间 滴度(MIU/ml) 的滴度(IU/ml)RD9147 3天 / / 0.28RD9147 3天 第7小时 / ＜0.28RD9147 8天 / 2528 1.60RD9147 8天 第5小时，第3天 ＜224 ＜0.25
和7天RD9147 15天 / 11520 3.38RD9147 15天 第3小时，第 3120 ＜0.28
3，7，10，14天PBS 15天 / 68 ＜0.28表明PICKCa显著抑制了狂犬病毒在小鼠体内的繁殖。表4 PICKCa降低用RD4077狂犬病野毒株感染的OF1小鼠死亡率组 RD4077稀释度 死亡率 潜伏期(天)PICKCa 纯 4/10 17，18，20，22
10-1 0/10对照组 纯 10/10 10，11，12，13，14，13，13，17，17，17
10-1 10/10 11，13，14，14，17，17，17，19，表5用狂犬病毒抗原(V427)或同该抗原结合的PICKCa或者Al2O3免疫OF1小鼠，测定其狂犬病IgM，IgG和中和抗体的滴度免疫血清 IgM滴度ELISA IgG滴度ELISA 中和抗体滴度
法AU/ml 法MIU/ml RFFIT法IU/ml第4天Ag 180 87 0.25Ag+PICKCa 413 264 1.01Ag+Al2O3 231 97 ＜0.13第7天Ag 615 1522 1.01Ag+PICKCa ＞1600 4166 6.65Ag+Al2O3 169 351 0.43第14天Ag 479 4900 2.54Ag+PICKCa 522 26320 17.24Ag+Al2O3 408 12000 11.97第30天Ag 107 1800 3.01Ag+PICKCa 150 13600 15.63Ag+Al2O3 190 4000 6.86第60天Ag 117 5000 2.10Ag+PICKCa 150 18800 15.96Ag+Al2O3 98 6000 7.64空白对照 16 40 -表6 NIH试验测定注射PICKCa或Al2O3后的小鼠对灭活狂犬病毒的保护作用佐剂 注射剂量(μg) 注射日期 半数有效量
0 7无 0 0 221PICKCa 100 100 22
800 800 40Al2O3 3000 3000 93
1000 1000 132表7 NIH试验测定PICKCa对人用狂犬病疫苗的激刺效价编号 试验组 ED50 效价 CVSLD50
疫苗81163+PICKCa
4℃下4周 2.18 4.33IU/2ml 5
37℃下4周 1.96 2.64IU/2ml 51 疫苗89163
4℃下4周 1.80 1.82IU/2ml 5
37℃下4周 1.71 1.48IU/2ml 5
参照品84-5 2.53 4.9IU/安瓿 5
疫苗890842+PICKCa
4℃下4周 1.99 4.58 IU/2ml 5
37℃下4周 1.74 2.60 IU/2ml 52
疫苗890842
4℃下4周 1.53 1.58IU/2ml 5
参照品84-5 2.32 4.9IU/安瓿 5
参照品84-5+PICKCa 2.49 14.1IU/安瓿 32
参照品84-5 2.03 4.9IU/安瓿 32表8 PICKCa，Al2O3及其与狂犬病毒抗原结合后，对感染狂犬病毒小鼠的治疗效果
用IPRV治疗后(注射量μg)的死亡率其他治疗 0 140 560无 95(19/20)* 95(19/20) 20(7/10)PICKCa 30(3/10) 95(19/20) 70(7/10)Al2O3 100(10/10) 95(19/20) 70(7/10)*：小鼠死亡数/感染狂犬病毒小鼠数表9 狂犬病疫苗与PICKCa结合后对18克体重小白鼠的安全性测定实验组数 组别 0.03mli.c 0.5mli.p1 疫苗89163+PICKCa 存活率2/2 存活率5/52 疫苗89163+PICKCa 存活率2/2 存活率5/5表10 在家兔体内测定PICKCa或铝佐剂对流行性出血热疫苗产生的抗体的影响
14天血清 21天血清兔号 免疫组别 ELISA RPHI ELISA RPHI
1 疫苗+Al(OH)3 2048 / 2048 /
+PICKCa
2 疫苗+Al(OH)3 2048 / 1024 /
+PICKCa
3 疫苗+PICKCa 4096 32 4096 32
4 疫苗+PICKCa 4096 32 4096 32
5 疫苗+Al(OH)3 1024 / 512 8
6 疫苗+Al(OH)3 2048 / 1024 8
7 疫苗 512 16 512 16
8 疫苗 512 16 512 16ELISA：酶联免疫吸附测定RPHI：反应被动血凝抑制试验
Claims (3)
1、含卡那霉素和钙离子的聚肌胞在制备免疫佐剂中的应用。
2、一种含有佐剂的疫苗，其特征在于：所述的佐剂是含卡那霉素和钙离子的聚肌胞。
3、含卡那霉素和钙离子的聚肌胞的免疫佐剂在制备用于哺乳动物或人的治疗性疫苗中的应用。
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Cited By (1)
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Families Citing this family (10)
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| BR112017012546B1 (pt) * | 2014-12-23 | 2024-04-30 | Yisheng Biopharma (Singapore) Pte Ltd | Composição de vacina antirrábica, kit farmacêutico e uso da composição de vacina antirrábica |
| CN105396130A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-03-16 | 林海祥 | 皮氨钙佐剂及含有皮氨钙佐剂的疫苗 |
| CN106075432A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-11-09 | 林海祥 | 皮卡钙联合佐剂及含有皮卡钙联合佐剂的疫苗 |
| CN107441485B (zh) * | 2016-06-01 | 2021-07-23 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种复合疫苗佐剂组合物 |
| CN109078180B (zh) * | 2018-06-29 | 2019-05-31 | 信福(北京)医药科技有限公司 | 用于增强免疫响应的复合物 |
| WO2021238982A1 (zh) * | 2020-05-29 | 2021-12-02 | 辽宁依生生物制药有限公司 | 包含聚核苷酸的药物组合物及其用于预防或治疗covid-19的用途 |
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1993
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| 药物分析杂志13(4) 1993.1.1 用PEG法测定PICKCA和PI.PC分子量的研究 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008542405A (ja) * | 2005-06-08 | 2008-11-27 | ニューバイオメッド ピーアイケイエイ プライベート リミテッド | ポリイノシン酸‐ポリシチジル酸に基づくアジュバント |
Also Published As
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