BR112017012546B1 - Composição de vacina antirrábica, kit farmacêutico e uso da composição de vacina antirrábica - Google Patents
Composição de vacina antirrábica, kit farmacêutico e uso da composição de vacina antirrábica Download PDFInfo
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Abstract
COMPOSIÇÃO DE VACINA ANTIRRÁBICA, KIT FARMACÊUTICO E USO DA COMPOSIÇÃO DE VACINA ANTIRRÁBICA. A presente invenção proporciona uma composição antirrábica compreendendo IPRV e o adjuvante PIKA e a sua utilização farmacêutica. A presente invenção também descreve um método para a profilaxia ou tratamento terapêutico da infecção por vírus da raiva, o método compreende uma etapa de administração da composição de vacina antirrábica a um hospedeiro. A composição antirrábica é mais estável e segura e é capaz de induzir concentrações prévias e superiores do anticorpo neutralizante.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao campo imunológico, mais particularmente, se refere a uma composição antirrábica para o tratamento profilático e/ou terapêutico da raiva causada pela infecção pelo vírus da raiva, ao método e ao uso da mesma e, mais particularmente, a uma composição de vacina antirrábica para o tratamento profilático e/ou terapêutico da raiva causada por infecção pelo vírus da raiva com um regime acelerado.
[002] O vírus da raiva é um vírus envelopado com gene de RNA de fita simples que codifica cinco proteínas estruturais. A raiva é uma zoonose que é transmitida a partir do animal para o humano através de contaminação que transporta o vírus transmitido pela saliva ou através de membrana da mucosa intacta. A taxa de mortalidade é de quase 100% após o início dos sintomas clínicos, e continua a ser uma das mais letais doenças infecciosas conhecidas.
[003] Na região mais desenvolvida, as infecções por raiva através de espécies caninas são raras devido às vacinações obrigatórias para animais de estimação, como nos Estados Unidos, poucos casos de raiva em humanos são causados por morcegos raivosos. Nos países em desenvolvimento, a raiva humana transmitida por cães raivosos é mais prevalente, causando 25.000 a 30.000 mortes por ano em índios apenas. Cães de rua ou filhotes sem vacinação são potenciais portadores e convivem com vítimas, como crianças em vilas. Os programas de vacinação de cães de rua geralmente têm falhado nessas regiões. De acordo com o relatório da OMS, há mais de 60.000 pessoas que morrem de raiva, anualmente, em todo o mundo. A região de maior prevalência é a Ásia e a África. O mais recente surto de raiva em Bali Indonésia colocou em risco mais de 130 vidas.
[004] Até a presente data, não existe tratamento eficaz para a raiva, após ter sido infectada. O tratamento, tal como fármaco antiviral, esteroide, imunomodulador e infusão de imunoglobulina têm sido, geralmente, ineficaz. Felizmente, a infecção por raiva pode ser prevenida através da vacinação após exposição a potenciais animais com raiva através do tratamento imediato da ferida local e profilaxia pós-exposição adequada (PEP). Em casos mais graves, pode ser necessária a coadministração de imunoglobulina da raiva (RIG). Para as pessoas com alto risco ocupacional de mordedura de animais também são recomendadas a profilaxia contra o vírus da raiva. Concentrações de anticorpos de raiva iguais ou superiores a 0,5 IU (unidades internacionais), determinados pelo teste de rápida inibição de focos fluorescentes (RFFIT) contra um soro de referência da OMS, são considerados protetores em espécies de mamíferos. Os detalhes do teste estão descritos em: Laboratory Techniques in Rabies, Edited by F X Meslin, M M Kaplan H Koprowski, 4th Edition, ISBN 92 4 1544 1.
[005] As vacinas antirrábicas disponíveis comercialmente são baseadas em cepas fixas de vírus da raiva, tais como a cepa Pitman-Moore (PM), a cepa Kissling (CVS) ou cepas Flury de baixa passagem em ovos (LEP) ou cepas Flury de alta passagem em ovos (HEP), cepa fixa Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA) do vírus Street-Alabama-Dufferin (SAD) e diferentes variantes de SAD. Estas cepas virais são adaptadas em quatro grandes sistemas de cultura que são aprovados pela OMS, incluindo a célula diploide humana, pinto ou embrião de pato, células de rim de hamster e linhagem de células vero.
[006] Adjuvantes são compostos que, geralmente, quando administrados com um antígeno (misturado com ou fornecido antes da administração do antígeno) aumentam ou modificam a resposta imune a esse antígeno particular. O alumínio foi adicionado rotineiramente à vacina antirrábica como um adjuvante para aumentar a potência da vacina inativa. Contudo, verificou-se que o alumínio atrasa a produção de anticorpos e é ineficaz em proporcionar uma melhor proteção no teste de pós-exposição. Portanto, pesquisas que buscam o adjuvante adequado para vacina antirrábica ainda estão em andamento.
[007] Além disso, a vacina inativa é instável durante a purificação, liofilização e armazenamento. Por conseguinte, são adicionados agentes estabilizantes químicos e/ou biológicos à solução de vacina. Exemplos de agentes estabilizantes químicos até agora conhecidos são albumina humana, hidrolisado de gelatina, álcoois de açúcar, aminoácidos e outras substâncias não tóxicas. A patente norte-americana US 4.164.565, de Prince e seus colaboradores, descreve a utilização de albumina como estabilizante em vacinas. Uma composição típica de vacina antirrábica compreenderia assim um antígeno do vírus da raiva inativado cultivado em linhagem celular adequada, com ou sem adjuvante e estabilizado com albumina e outros agentes estabilizantes ou excipientes.
[008] Para fins profiláticos, as vacinas são normalmente administradas em 3 doses para gerar cerca de 3 a 4 anos de imunidade. Após a exposição ao vírus da raiva, as vacinas são geralmente administradas em 4 doses nos dias 0, 3, 7 e 14 ou em 5 doses com o regime de Essen envolvendo 5 injeções nos dias 0, 3, 7, 14 e 28.
[009] As vacinas antirrábicas pós-exposição são rotineiramente administradas para prevenir a doença fatal após a exposição a animais suspeitos. Apesar de milhões de pessoas receberem a profilaxia pós- exposição (PEP) todos os anos após serem expostas a animais com suspeita de raiva, ainda há relatos de morte relacionados à raiva após a PEP, ou mesmo com coadministração de imunoglobulina.
[010] Uma análise de estudo de 1120 casos de raiva humana em Guangxi, China mostra que 27,2% das mortes foram causadas por falha de vacinação; entre os quais 78,2% dos casos de morte ocorrem antes da quinta injeção. Estas falhas podem estar associadas à produção tardia de anticorpos neutralizantes do vírus da raiva (RVNA) pela vacina antirrábica, falta de resposta imunológica mediada por células T, falta de resposta imunológica devido as variações individuais ou desvios das diretrizes de tratamento pós-exposição da OMS, tais como, a não aplicação da injeção de imunoglobulina.
[011] Estudos têm demonstrado que animais e seres humanos podem produzir anticorpos de neutralização do vírus da raiva após a infecção ou em resposta à vacinação. Estudos anteriores com animais mostraram que as IgM’s e as IgG’s induzidas pela vacina desempenham um papel importante na proteção do animal imunizado a partir do desafio viral. Assim, uma produção precoce de concentrações mais elevadas de anticorpo neutralizante é vital na proteção de pacientes com potencial exposição ao vírus.
[012] Por outro lado, existem estudos que testam e recomendam novos regimes de vacinação que poderiam melhorar a eficácia da vacinação, reduzir a complexidade clínica (ou seja, menos injeções ou menor duração clínica) e custo. A patente europeia EP 1.593.392 proporciona um método de pré e pós imunização de vacina antirrábica com uma dose reduzida.
[013] Neste pedido de patente, revela-se uma vacina antirrábica mais potente que seja capaz de induzir concentrações prévias e superiores do anticorpo neutralizante do vírus da raiva. A formulação específica aqui descrita compreendendo antígeno da raiva purificado inativado, adjuvante de PIKA e albumina de soro humano misturada numa solução tampão com ou sem outros excipientes é segura e estável para uso humano com uma longa vida de prateleira. Descrevemos ainda um método de administração da composição com um novo regime de vacinação que requer menos visitas clínicas e uma duração de imunização mais curta.
[014] As seguintes referências podem ser de interesse: • WUNNER, W. H., LARSON, J. K., DIETZSCHOLD, B., & SMITH, C. L. (1988). The molecular biology of rabies viruses. Review of Infectious Diseases, 10 (Supplement 4), S771-S784; • SUDARSHAN, M.K., MADHUSUDANA, S.N., MAHENDRA, B.J., RAO, N.S., ASHWATH NARAYANA, D.H., et al. (2007). Assessing the burden of human rabies in India: results of a national multi-certer epidemiological survey. Int J Infect Dis 11:29-35; • JACKSON, A.C., WARRELL, M.J., PUPPRECHT, C.E., ERTL, H.C., DIETZSCHOLD, B., et al. (2003). Management of rabies in humans. Clin Infect Dis 36:60-63; • World Health Organization (2014). Rabies Fact Sheet N° 99. Retrieved from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/; • PUTRA, A. A. G, HAMPSON, K., GIRARDI, J., HIBY, E., KNOBEL, D., MARDIANA, W., & SCOTT-ORR, H (2013). Response to a rabies epidemic, Bali, Indonesia, 2008-2011. Emerging infectious diseases, 19(4), 648; • World Health Organization (2010). Current strategies for human rabies pre and post-exposure prophylaxis. Retrieved from http://www.who.int/rabies/human/WHO_strategy_prepost_exposure/e n/; • patente norte-americana US 4.164.565; • WANG, S. et al. (2010). A new PIKA adjuvant rabies vaccine. Journal of Applied preventive medicine 16(1), 1-4; • DESHMUKH, D.G., DAMLE, A.S., BAJAJ, J.K., BHAKRE, J.B., PATIL, N.S. Fatal rabies despite post-exposure prophylaxis. Indian J Med Microbiol. 2011 Apr-Jun; 29(2): 178-80; • SHANTAVASINKUL, P., TANTAWICHIEN, T., WACHARAPLUESADEE, S., JEAMANUKOOLKIT, A., UDOMCHAISAKUL, P., CHATTRANUKULCHAI, P., & HEMACHUDHA, T. (2010). Failure of rabies postexposure prophylaxis in patients presenting with unusual manifestations. Clinic Infectious Diseases, 50(1), 77-79 • WILDE, H., SIRIKAWIN, S., SABCHAROEN, A., KINGNATE, D., TANTAWICHIEN, T., HARISCHANDRA, P.A., CHAIYABUTR, N., DE SILVA, D.Q. FERNANDO, L., LIYANAGE, J.B., SITPRIJA, V. Failure of postexposure treatment of rabies in children. Clin Infect Dis. 1996 Feb; 22(2):228-32; • patente europeia EP 1.593.392; • BERTOLETTI, A. (2012) PIKA dose response to determine effective concentration for monocyte-derived DC activation. Singapore Institute for Clinical Sciences, Biomedical Sciences Institutes; e • World Health Organization (2007). Rabies vaccines WHO position paper (1st ed.). Retrieved from http://www.who.int/immunization/sage/SAGEmeetingRabies_PP_Draft _octl2.pdf.
[015] Considerando as deficiências do estado da técnica, citadas acima, a presente invenção proporciona uma composição de vacina antirrábica, compreendendo ou consistindo: a) vírus da raiva purificado inativado (referido como IPRV), b) adjuvante PIKA e c) albumina de soro humano (referido como HSA). Em algumas formas de realização, a composição de vacina antirrábica compreende 0,2 IU a 4,0 IU por dose unitária de IPRV, 250 μg a 5.000 μg por dose unitária do adjuvante PIKA e 0,1% a 0,9% por concentração de HSA (antes da liofilização ou após a reconstituição).
[016] A dose unitária adequada para a presente composição de vacina é preparada com um volume que é selecionado a partir do grupo que consiste em 0,1 ml, 0,15 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml e a faixa entre quaisquer dois dos seguintes volumes: 0,1 ml, 0,15 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml e 2,0 ml. Entende-se que um volume de administração muito grande e muito pequeno leva aos inconvenientes na prática clínica, quando aplicados a indivíduos humanos. Por conseguinte, a dose unitária para adultos pode tipicamente ser preparada em 0,5 ml ou 1,0 ml para injeção (forma líquida ou após reconstituição de uma forma em pó liofilizado) e 0,15 ml ou 0,2 ml para aplicação intranasal.
[017] Em algumas realizações, a quantidade de IPRV é selecionada do grupo que consiste 0,2 IU, 0,5 IU, 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, 2,5 IU, 3,0 IU, 3,5 IU, 4,0 IU por dose unitária e a faixa entre quaisquer dois dos seguintes valores de IU: 0,2 IU, 0,5 IU, 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, 2,5 IU, 3,0 IU, 3,5 IU e 4,0 IU. Em algumas formas de realização, a quantidade de IPRV é a partir de 0,2 IU a 4,0 IU por dose unitária. Em algumas realizações particulares, a quantidade de IPRV é selecionada a partir do grupo que consiste 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, 2,5 IU por dose unitária e a faixa entre quaisquer dois das seguintes doses unitárias: 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, e 2,5 IU por dose unitária. Numa concretização particular, a quantidade de IPRV para o humano adulto pode ser a partir de 1,0 IU a 2,0 IU por dose unitária, por exemplo, 1,0 IU ou 2,0 IU por dose unitária. Em outras realizações, quando aplicadas em crianças, a quantidade de IPRV por dose unitária pode ser reduzida; por exemplo, a quantidade de IPRV pode ser de 0,5 IU a 1,0 IU por dose unitária, por exemplo, 0,5 IU ou 1,0 IU por dose unitária. Em algumas concretizações particulares, a concentração do referido IPRV está entre 0,05 IU/ml e 40,0 IU/ml, tais como, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 IU/ml e a faixa entre quaisquer dois das seguintes concentrações: 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 IU/ml.
[018] Em algumas formas de realização, a quantidade adequada do adjuvante PIKA para a presente composição de vacina é selecionada a partir do grupo que consiste 250 μg, 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 3000 μg, 4000 μg, 5000 μg por dose unitária e a faixa entre quaisquer duas das seguintes quantidades: 250 μg, 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 3000 μg, 4000 μg, 5000 μg por dose unitária. Em algumas realizações particulares, para a administração humana, a quantidade do adjuvante PIKA é de 250 μg a 4000 μg por dose unitária. Em algumas concretizações particulares, a quantidade do adjuvante PIKA é selecionada a partir do grupo que consiste 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 2500 μg por dose unitária e o valor entre quaisquer duas das seguintes quantidades: 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 2500 μg por dose unitária. Em outras realizações, quando aplicadas às crianças, a quantidade do adjuvante PIKA por dose unitária pode ser reduzida, por exemplo, a quantidade do adjuvante PIKA é selecionada a partir do grupo que consiste 250 μg, 500 μg, 750 μg 1000 μg, 1250 μg por dose unitária e o valor entre quaisquer duas das seguintes quantidades: 250 μg, 500 μg, 750 μg 1000 μg, 1250 μg por dose unitária.
[019] Qualquer adjuvante PIKA adequado pode ser utilizado na composição de vacina da presente invenção. O PIKA é um análogo químico sintético de um dsRNA que se mostrou ser um agonista de TLR3 através de estudos pré-clínicos. O adjuvante PIKA é composto por Poli I:C, um antibiótico (por exemplo, kanamicina) e um íon positivo (por exemplo, cloreto de cálcio). O PIKA é solúvel em solução aquosa com pH entre 6,0 e 8,0. A menos que indicado ao contrário, o adjuvante PIKA adequado para a composição de vacina antirrábica da presente invenção é o adjuvante PIKA descrito na publicação internacional WO 2006/131023, aqui incorporado por referência na sua totalidade. Nas formas de realização relacionadas, o adjuvante PIKA é heterogêneo com relação ao peso molecular, onde o peso molecular é de cerca de 66.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 66.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 138.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 150.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 138.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 150.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 300.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 300.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 337.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 337.000 a 1.200.000 Daltons, ou de cerca de 500.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 500.000 a 2.000.000 Daltons.
[020] Em concretizações relacionadas, as moléculas do adjuvante PIKA na composição de vacina antirrábica apresentam um peso molecular médio igual ou superior a 100.000 Daltons ou igual ou superior a 120.000 Daltons ou igual ou superior a 138.000 Daltons ou igual ou superior a 150.000 Daltons ou igual ou superior a 250.000 Daltons ou igual ou superior a 300.000 Daltons ou igual ou superior a 337.000 Daltons ou igual ou superior a 500.000 Daltons ou igual ou superior a 750.000 Daltons ou igual ou superior a 1.000.000 Daltons ou igual ou superior a 1.200.000 Daltons ou igual ou superior a 1.500.000 Daltons ou igual ou superior a 2.000.000 Daltons.
[021] Em algumas formas de realização, a proporção de IPRV e o adjuvante PIKA é selecionada a partir do grupo constituído por: l IU/100 μg, l IU/125 μg, l IU/200 μg, l IU/250 μg, l IU/300 μg, l IU/350 μg, l IU/400 μg, l IU/450 μg, l IU/500 μg, l IU/550 μg, l IU/600 μg, l IU/700 μg, l IU/800 μg, l IU/1000 μg, l IU/1500 μg, l IU/2000 μg e a relação entre quaisquer duas relações acima. Em uma forma de realização particular, a razão entre IPRV e o adjuvante PIKA é de 1 IU/500 μg. Em uma realização particular, a quantidade de IPRV é de 2,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 1.000 μg por dose unitária. Numa outra concretização particular, a quantidade de IPRV é de 4,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 2.000 μg por dose unitária Em outra concretização particular, a quantidade de IPRV é de 3,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 1.000 μg por dose unitária. Ainda, em outra concretização particular, a quantidade de IPRV é de 1,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 1.000 μg por dose unitária. Também, em outra realização, a quantidade de IPRV é de 1,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 2.000 μg por dose unitária.
[022] Em algumas concretizações, a composição de vacina da presente invenção compreende, ainda, um tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas formas de realização, o tampão farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo constituído por: PBS, acetato, tris-(hidroximetil)aminometano, bicarbonatos e carbonatos. Em algumas formas de realização, o pH do tampão é selecionado a partir do grupo que consiste: 7,00, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,30, 7,35, 7,40, 7,45, 7,50, 7,55, 7,60, 7,65, 7,70, 7,75, 7,80 7,85, 7,90, 7,95, 8,00 e a faixa entre quaisquer dois dos seguintes valores de pH: 7,00, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,30, 7,35, 7,40, 7,45, 7,50, 7,55, 7,60, 7,65, 7,70, 7,75, 7,80 7,85, 7,90, 7,95 e 8,00. Em algumas concretizações particulares, o tampão é PBS e o pH do tampão PBS é selecionado do grupo que consiste: 7,3, 7,4, 7,5 e a faixa entre quaisquer dos valores acima.
[023] Em algumas formas de realização, a quantidade de HSA adequada para a presente composição de vacina é selecionada a partir do grupo que consiste 0,15%, 0,20%, 0,25%, 0,30%, 0,35%, 0,40%, 0,45%, 0,50%, 0,60% por concentração (antes da liofilização ou após reconstituição) e o valor entre quaisquer dois valores acima. A albumina humana é adicionada à vacina antirrábica como um estabilizador para o processamento, liofilização e armazenamento. Os técnicos no assunto compreenderão que a albumina é um alérgeno conhecido para alguns animais, mas a albumina humana por si só é um fármaco aprovado para uso humano e pode ser utilizado com segurança em aplicações humanas.
[024] Em algumas concretizações, a composição de vacina antirrábica de acordo com a presente invenção compreende ainda a maltose. Em algumas formas de realização, a quantidade de maltose está entre 1,0% e 6,0% por concentração (antes da liofilização ou após a reconstituição). Em realizações, a quantidade de maltose é selecionada a partir do grupo que consiste 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 6,0% por concentração e a faixa entre quaisquer dois valores acima. Em algumas concretizações particulares, a quantidade de maltose é de 5,0% por concentração.
[025] Em algumas formas de realização, a composição de vacina antirrábica de acordo com a presente invenção não compreende gelatina.
[026] Salvo indicação contrária, qualquer antígeno da raiva disponível pode ser utilizado para preparar a composição de vacina antirrábica de acordo com a presente invenção. A OMS aprovou várias cepas de vírus da raiva para a produção de vacinas, incluindo, mas não se limitando, a cepa Pitman-Moore (PM), cepas de vírus Pasteur (PV), a cepa do vírus de desafio (CVS), cepas de baixa passagem em ovos (LEP) e cepas de alta passagem em ovos (HEP) a partir de cepas embrio-adaptadas, de pinto Flury, cepa Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA) do vírus Street-Alabama- Dufferin (SAD) e diferentes variantes de SAD. Estas cepas aprovadas de vírus são adaptadas em cultura de tecido cerebral, embrião de pinto ou pato, linhagem celular primária (tal como linhagem celular de rim de hamster), célula diploide humana ou linhagem celular contínua (tal como linhagem celular Vero). As cepas de vírus acima podem ser utilizadas para fabricar vacinas após inativação e purificação. Em algumas formas de realização, o IPRV é selecionado a partir do grupo que consiste cepa CTN, cepa aG, cepa Pitman-Moore (PM) e cepa de vírus Pasteur (PV). Em algumas concretizações particulares, o IPRV é selecionado do grupo constituído por cepa CTN-1, cepa Pitman-Moore L503 e cepa PV-2061.
[027] Em algumas concretizações particulares, o IPRV é preparado em células Vero ou células de rim de hams ter primário (PHK). O IPRV é produzido através da propagação da cepa de vírus fixado numa célula Vero ou célula PHK. Após a coleta do sobrenadante do meio de cultura, o vírus é colhido, concentrado, inativado, purificado e armazenado como o antígeno.
[028] Salvo indicação em contrário, a composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, pode ser preparada numa forma líquida, incluindo, mas não se limitando, a solução ou suspensão. Em algumas outras concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica é preparada sob a forma sólida, tal como a forma liofilizada ou seca por congelamento.
[029] Em algumas concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, compreende ou consiste 2,0 IU/ml de IPRV, 1,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,3% de HSA. Em algumas outras concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, compreende ou consiste 2,0 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA, 0,3% de HSA. Em algumas outras realizações particulares, a composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, compreende ou consiste 1,0 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,3% de HSA; ou 1,5 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,3% de HSA; ou 2,0 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,5% de HSA; ou 4,0 IU/ml de IPRV, 1,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,5% de HSA.
[030] A presente invenção também proporciona um kit farmacêutico, compreendendo ou consistindo: a) a composição de vacina antirrábica da presente invenção, b) um recipiente, tal como um frasco ou ampola, c) uma bula e, opcionalmente, d) água para injeção. Em algumas formas de realização particulares, para a conveniência de transporte e armazenamento, o kit farmacêutico é preparado numa forma liofilizada. Por conseguinte, um kit farmacêutico compreende ou consiste: a) composição de vacina antirrábica liofilizada, b) um frasco que contém a composição de vacina antirrábica liofilizada e c) uma bula. Quando necessário, a água para injeção pode ser incorporada no kit farmacêutico para reconstituir a composição de vacina antirrábica líquida antes da utilização. Em algumas formas de realização particulares, a bula sugere o regime de administração: regime 2-2-1 para proteção pós-exposição e/ou regime 2-1 para profilaxia, onde o referido regime 2-2-1 refere-se a 2 doses unitárias administradas no dia 0, 2 doses unitárias administradas no dia 3 e 1 dose unitária administrada no dia 7; em que o regime 2-1 refere-se a 2 doses unitárias administradas no dia 0 e a 1 dose unitária administrada no dia 7. Numa outra concretização particular, a bula sugere o seguinte regime de administração: regime 2-2-2 onde que o referido regime 2-2-2 refere-se a 2 doses unitárias administradas nos dias 0, 3 e 7, respectivamente. Numa outra forma de realização particular, a bula sugere o seguinte regime de administração: regime 1-1-1 para proteção pós-exposição, em que o referido regime 1-1-1 refere-se a 1 dose unitária administrada nos dias 0, 3 e 7, respectivamente.
[031] A presente invenção também proporciona um método para induzir uma resposta imune ao vírus da raiva pela administração a um hospedeiro da composição de vacina antirrábica contendo adjuvante PIKA, de acordo com a presente invenção. O hospedeiro pode ser um ser humano ou um animal não humano. A administração pode ser feita por injeção ou por inalação.
[032] Também é aqui revelada uma composição de vacina antirrábica para utilização num método de tratamento médico. Em particular, a invenção proporciona uma composição de vacina antirrábica para utilização num método de tratamento ou prevenção da raiva. A composição de vacina antirrábica pode ser para a utilização num método de indução de uma resposta imune a um vírus da raiva. A composição de vacina antirrábica é útil nos métodos de tratamento médico e prevenção e métodos de indução de uma resposta imune aqui revelada.
[033] A invenção também proporciona a utilização de uma composição de vacina antirrábica na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da raiva. Num aspecto, a presente invenção proporciona a utilização da composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da raiva provocada pela infecção por vírus da raiva. Num outro aspecto, a presente invenção também provê uma composição de vacina antirrábica para o tratamento ou profilaxia da raiva causada pela infecção por vírus da raiva. O medicamento é útil nos métodos de tratamento médicos e prevenção e métodos de indução de uma resposta imune aqui descrita.
[034] No estado da técnica, existem dois regimes de vacinas intramusculares habitualmente utilizados: um é o regime de Essen que envolve 5 injeções administradas nos dias 0, 3, 7, 14 e 28 após a exposição; o outro é o regime de Zagreb que envolve 4 injeções em que são administradas duas injeções no dia 0 em locais diferentes e outras duas injeções administradas no dia 7 e no dia 21. No entanto, o regime de administração existente é geralmente limitado, devido ao calendário de imunização extenso exigindo 5 visitas clínicas e as baixas concentrações de produção de anticorpos no estágio inicial da imunização. Em contraste, a presente invenção proporciona um método para o tratamento da infecção por vírus da raiva com um regime acelerado. Em algumas concretizações particulares, o método compreende uma etapa de administração da composição de vacina antirrábica da presente invenção a um hospedeiro, em que o referido hospedeiro foi exposto ao vírus da raiva. Em algumas concretizações particulares, o hospedeiro é humano. Em algumas outras concretizações particulares, o hospedeiro é animal não humano, tal como roedor, cão e macaco.
[035] A presente invenção proporciona um regime de administração acelerada, em que uma composição de vacina é administrada a um hospedeiro por 5 vezes dentro de 7 dias após a exposição do vírus da raiva, sendo o dia 0 o dia em que o hospedeiro foi exposto ao vírus da raiva. Em algumas concretizações particulares, a composição de vacina é administrada a um hospedeiro com base no seguinte regime: 1) uma primeira administração no dia 0 pós-exposição, 2) uma segunda administração no dia 0 pós-exposição, 3) uma terceira administração no dia 2 ou 3 pós-exposição, 4) uma quarta administração no dia 2 ou 3 pós-exposição e 5) uma quinta administração no dia 6 ou 7 após a exposição, respectivamente. Como alternativa, em algumas outras concretizações particulares, a composição de vacina é administrada a um hospedeiro com base no seguinte regime: uma primeira e uma segunda administração no dia 0 pós-exposição; uma terceira e uma quarta administração no dia 2 ou 3 dias após a exposição e uma quinta e/ou sexta administração no dia 7 após exposição, respectivamente. As composições de vacina antirrábica, aqui descritas, podem ser administradas de acordo com o regime de administração acelerada.
[036] Em outro aspecto, a presente invenção também provê um método para a profilaxia da raiva provocada pela infecção por vírus da raiva e uma composição de vacina antirrábica para utilização em tal método. Em algumas concretizações particulares, o método compreende uma etapa de administração da composição de vacina antirrábica da presente invenção a um hospedeiro, em que o referido hospedeiro não está exposto ao vírus da raiva. Em algumas concretizações particulares, o hospedeiro é humano. Em outras concretizações particulares, o hospedeiro é animal não humano, tal como roedor, cão e macaco. Em algumas concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica da presente invenção é administrada a um hospedeiro por três vezes ao longo de 7 dias. Em algumas concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica da presente invenção é administrada a um hospedeiro com base no seguinte regime: 1) uma primeira administração no dia 0; 2) uma segunda administração no dia 0 e 3) uma terceira administração no dia 7, respectivamente. A profilaxia ou prevenção inclui o tratamento de um indivíduo, particularmente, um humano que não tem a doença ou seja assintomático para a doença. Métodos particularmente preferidos de prevenção da raiva, ou profilaxia são métodos de profilaxia pré- exposição (PEP), nos quais a vacina é administrada antes do indivíduo ser exposto ao, ou esteja em risco de exposição do vírus da raiva vivo. O indivíduo pode ter sido identificado como predisposto ou em risco de desenvolver a doença. Neste caso ou no caso da raiva, o indivíduo pode ter sido determinado por estar predisposto ou em risco de desenvolver raiva. Por exemplo, porque visitaram ou pretendem visitar um país ou local onde se sabe que a raiva está presente ou porque trabalham com o vírus ou com animais.
[037] No contexto da presente invenção, a administração é realizada por injeção parenteral, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intravenosa, injeção subcutânea, administração tópica, administração transdérmica e administração intradérmica. Em algumas concretizações particulares, a administração para animais pode ser realizada por injeção intraperitoneal. Em algumas outras concretizações particulares, a administração para humanos é realizada por injeção intramuscular ou injeção intravenosa. Numa outra concretização particular, a administração é realizada por inalação, administração retal, administração nasal, administração oral (incluindo inalação).
[038] A figura 1 mostra os dados de toxicidade da vacina antirrábica com PIKA e cálculo da conversão da dose.
[039] A figura 2 mostra o processo de produção do antígeno IPRV.
[040] A figura 3 mostra a indução de anticorpos por várias composições de imunização.
[041] A figura 4 mostra a concentração de IgG sérica induzida pela vacina antirrábica contendo PIKA em macaco imunizado.
[042] A figura 5 mostra o anticorpo neutralizante induzido pela vacina antirrábica contendo PIKA em macaco imunizado (unidade IU do eixo Y).
[043] A presente invenção pode ser mais facilmente compreendida por referência às seguintes descrições pormenorizadas de certas formas de realização e aos exemplos aqui incluídos. Ao longo desta invenção, em que as publicações são referenciadas, as divulgações destas publicações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade nesta invenção, de modo a descrever mais completamente o estado da técnica a que se refere esta descrição.
[044] Antes de a presente invenção ser ainda descrita, deve ser entendido que esta invenção não está limitada às concretizações particulares descritas, como tal podendo variar. Deve também ser entendido que a terminologia aqui utilizada é apenas para fins de descrições, particularmente, e não pretende ser limitativa, uma vez que o escopo da presente descrição será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que comumente entendido pelos técnicos no assunto. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam também ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Deve-se notar que, tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[045] O termo “adjuvante”, tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer substância ou mistura de substâncias que aumenta ou diversifica a resposta imune de um hospedeiro a um composto antigênico.
[046] “PIKA” refere-se a uma composição compreendendo poli I:C, um antibiótico (por exemplo, kanamicina) e um íon positivo (por exemplo, cálcio). PIKA exibe características de um adjuvante com efeitos adversos reduzidos (por exemplo, toxicidade reduzida) com relação a, por exemplo, PICKCa e maior potência (por exemplo, estimula uma resposta imune melhorada) em relação, por exemplo, a Av-PICKCa.
[047] “Vacina antirrábica PIKA” refere-se a uma composição de vacina antirrábica contendo o antígeno IPRV e o adjuvante PIKA. As expressões “vacina antirrábica PIKA”, “composição de vacina antirrábica PIKA”, “composição de vacina contendo PIKA”, “composição de vacina antirrábica contendo adjuvante PIKA”, “vacina antirrábica com adjuvante PIKA” e “composição vacinal aditivada com PIKA” podem ser utilizas indiferentemente.
[048] O termo “animal” inclui seres humanos e todos os mamíferos domésticos e selvagens, incluindo, sem limitação, bovinos, cavalos, vacas, suínos, ovelhas, cabras, cães, gatos, roedores, macacos e semelhantes.
[049] “Antígeno” refere-se a uma substância que, quando administrada induz a uma resposta imune, por exemplo, a formação de anticorpos, incluindo os anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno. Dois dos aspectos característicos dos antígenos são a sua imunogenicidade, que é a sua capacidade para induzir uma resposta imune in vivo e a sua antigenicidade que é a sua capacidade de serem reconhecidos seletivamente pelos anticorpos cujas origens são os antígenos.
[050] Os termos “imunidade mediada por células” e “resposta imune mediada por células” referem-se a defesa imunológica fornecida pelos linfócitos, tais como que a defesa fornecida pelos linfócitos de células T quando entram em proximidade com as suas células vítima. Uma resposta imune mediada por células normalmente inclui a proliferação de linfócitos. Quando a “proliferação de linfócitos” é medida, a capacidade dos linfócitos de proliferarem em resposta a um antígeno específico é medida. A proliferação de linfócitos pretende se referir a células B, células T auxiliares ou proliferação de células T linfócitos citotóxicas (CTL).
[051] A expressão “resposta imune aumentada” ou outras semelhantes significam que a resposta imune é elevada, melhoradas ou aprimoradas para o benefício do hospedeiro, em relação ao estado da resposta imune anterior, por exemplo, antes da administração de uma composição imunogênica da presente invenção.
[052] As expressões “imunidade humoral” e “resposta imune humoral” referem-se a forma de imunidade em que moléculas de anticorpo são produzidas em resposta a estimulação antigênica.
[053] O termo “resposta imune” refere-se a qualquer resposta a um composto antigênico através do sistema imunológico de um indivíduo vertebrado. Exemplos de respostas imunes incluem, mas não estão limitados a, imunidade celular e humoral, bem como local e sistêmica, tais como as respostas CTL, incluindo a indução específica do antígeno de CD8+CTL, respostas de células T auxiliar, incluindo respostas proliferativas de células T e a liberação de citocinas e as respostas de células B, incluindo resposta de anticorpo.
[054] O termo “indução de uma resposta imune” é aqui usado, de forma geral, para englobar a indução e/ou a potencialização de uma resposta imune.
[055] O termo “indução de uma resposta imune” refere-se a uma resposta imune que é estimulada, inicializada ou induzida.
[056] A expressão “potencializar uma resposta imune” se refere a uma resposta imunológica pré-existente que é melhorada, adicionada, suplementada, amplificada, melhorada, aumentada ou prolongada.
[057] Os termos “tratamento”, “tratando”, “tratar” e similares são aqui utilizados para referir-se geralmente a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir de forma completa ou parcial uma doença ou seu sintoma e/ou pode ser terapêutico no que diz respeito a uma estabilização completa ou parcial ou cura para uma doença e/ou um efeito adverso atribuível à doença. “Tratamento” como utilizado aqui cobre qualquer tratamento de uma doença num indivíduo, particularmente, um humano e inclui: (i) prevenir que a doença ocorra num indivíduo que possa estar predisposto para a doença, mas ainda não foi diagnosticado como a tendo; (ii) inibir a doença, ou seja, deter o seu desenvolvimento; ou (iii) aliviar a doença, isto é, causando a regressão da doença. Os termos “profilaxia” ou “prevenção” e similares são aqui utilizados para referir-se genericamente ao tratamento dado para prevenir ou retardar o desenvolvimento da doença.
[058] O termo “mistura” inclui qualquer método para combinar os componentes da composição; tais métodos incluem, mas não estão limitados a, mistura, dispensação, dissolução, emulsificação, coagulação, suspensão ou de outra forma combinando fisicamente os componentes da composição.
[059] A expressão “dose unitária”, como aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade pré- determinada da presente composição calculada presente numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado. Em qualquer um dos casos, o termo “dose unitária” não deve ser entendido como o volume da composição de vacina contida num recipiente (tal como um frasco).
[060] A invenção atual fornece uma composição de vacina antirrábica que compreende ou consiste: a) vírus da raiva purificado inativado (referido como IPRV), b) o adjuvante PIKA, e c) albumina de soro humano (referido como HSA). Em algumas formas de realização, a composição de vacina antirrábica compreende 0,2 IU a 4,0 IU por dose unitária de IPRV, 250 μg a 5.000 μg por dose unitária do adjuvante PIKA e 0,1% a 0,9% por concentração de HSA, onde a concentração é definida como o peso em volume (p/v) durante a formulação, isto é, 0,1% de HSA refere-se a 1 mg de teor de HSA em 1 ml de volume total. Durante o processo de secagem por congelamento, a água é removida por sublimação a partir da fase sólida para a fase gasosa. A mesma quantidade de HSA como medida por peso é retida no pó liofilizado e a concentração em termo de peso/volume (p/v) vai ser restaurada após a reconstituição.
[061] A dose unitária adequada para a presente composição de vacina é preparada em um volume que é selecionado a partir do grupo consistindo 0,1 ml, 0,15 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, e o intervalo entre quaisquer dois dos seguintes volumes: 0,1 ml, 0,15 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml. Entende-se que grandes e pequenos volumes de administração levam a inconveniência na prática clínica, quando aplicada a indivíduos humanos. Por conseguinte, a dose unitária para adultos humanos pode ser geralmente preparada em 0,5 ml ou 1,0 ml para injeção (forma líquida ou depois de reconstituir da forma de pó liofilizado) e 0,15 ml ou 0,2 ml para aplicação na forma intranasal.
[062] Em certas formas de realização, a quantidade de IPRV é selecionada a partir do grupo consistindo 0,2 IU, 0,5 IU, 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, 2,5 IU, 3,0 IU, 3,5 IU, 4,0 IU por dose unitária e a faixa entre quaisquer dois dos seguintes valores de IU: 0,2 IU, 0,5 IU, 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, 2,5 IU, 3,0 IU, 3,5 IU e 4,0 IU. Em algumas formas de realização, a quantidade de IPRV é a partir de 0,2 IU a 4,0 IU por dose unitária. Em algumas realizações particulares, a quantidade de IPRV é selecionada a partir do grupo que consiste 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, 2,5 IU por dose unitária e a faixa entre quaisquer dois das seguintes doses unitárias: 1,0 IU, 1,5 IU, 2,0 IU, e 2,5 IU por dose unitária. Numa concretização particular, a quantidade de IPRV para o humano adulto pode ser a partir de 1,0 IU a 2,0 IU por dose unitária, por exemplo, 1,0 IU ou 2,0 IU por dose unitária. Em outras realizações, quando aplicadas em crianças, a quantidade de IPRV por dose unitária pode ser reduzida; por exemplo, a quantidade de IPRV pode ser a partir de 0,5 IU a 1,0 IU por dose unitária, por exemplo, 0,5 IU ou 1,0 IU por dose unitária. Em algumas concretizações particulares, a concentração do referido IPRV está entre 0,05 IU/ml e 40,0 IU/ml, tais como, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 IU/ml e a faixa entre quaisquer dois das seguintes concentrações: 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 IU/ml.
[063] Em algumas formas de realização, a quantidade adequada do adjuvante PIKA para a presente composição de vacina é selecionada a partir do grupo que consiste 250 μg, 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 3000 μg, 4000 μg, 5000 μg por dose unitária e a faixa entre quaisquer duas das seguintes quantidades: 250 μg, 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 3000 μg, 4000 μg, 5000 μg por dose unitária. Em algumas realizações particulares, para a administração humana, a quantidade do adjuvante PIKA é de 250 μg a 4000 μg por dose unitária. Em algumas concretizações particulares, a quantidade do adjuvante PIKA é selecionada a partir do grupo que consiste 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 2500 μg por dose unitária e a faixa entre quaisquer duas das seguintes quantidades: 500 μg, 1000 μg, 1500 μg, 2000 μg, 2500 μg por dose unitária. Em outras realizações, quando aplicadas às crianças, a quantidade do adjuvante PIKA por dose unitária pode ser reduzida, por exemplo, a quantidade do adjuvante PIKA é selecionada a partir do grupo que consiste 250 μg, 500 μg, 750 μg 1000 μg, 1250 μg por dose unitária e a faixa entre quaisquer duas das seguintes quantidades: 250 μg, 500 μg, 750 μg 1000 μg, 1250 μg por dose unitária.
[064] Dos muitos adjuvantes disponíveis para utilização em mamíferos, apenas alguns, incluindo hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, têm sido amplamente utilizados em vacina antirrábica para humano. Outros adjuvantes têm sido rejeitados para uso em humanos porque eles causam reações locais ou sistemáticas graves. Por exemplo, o adjuvante completo de Freund que contém óleo mineral, não é metabolizável e provoca câncer em animais de laboratório. Recentemente, a vacina antirrábica, sem sal de alumínio foi desenvolvida. Ela pode gerar concentrações comparáveis de anticorpos neutralizantes de raiva como as vacinas com adjuvante de alumínio.
[065] O adjuvante PIKA que é composto por Poli I:C, um antibiótico (por exemplo, kanamicina) e um íon positivo (por exemplo, cálcio) como descrito na publicação internacional WO 2006/131023, aqui incorporado por referência na sua totalidade, foi aprovado para aumentar a imunogenicidade de antígenos da raiva em estudos em animais. Nas formas de realização relacionadas, o adjuvante PIKA é heterogêneo com relação ao peso molecular, onde o peso molecular é de cerca de 66.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 66.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 138.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 138.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 150.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 150.000 a 660.000 Daltons ou cerca de 300.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 300.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 337.000 a 660.000 Daltons ou de cerca de 337.000 a 1.200.000 Daltons, ou de cerca de 500.000 a 1.200.000 Daltons ou de cerca de 500.000 a 2.000.000 Daltons.
[066] Em concretizações relacionadas, as moléculas do adjuvante PIKA na composição de vacina antirrábica apresentam um peso molecular médio igual ou superior a 100.000 Daltons ou igual ou superior a 120.000 Daltons ou igual ou superior a 138.000 Daltons ou igual ou superior a 150.000 Daltons ou igual ou superior a 250.000 Daltons ou igual ou superior a 300.000 Daltons ou igual ou superior a 337.000 Daltons ou igual ou superior a 500.000 Daltons ou igual ou superior a 750.000 Daltons ou igual ou superior a 1.000.000 Daltons ou igual ou superior a 1.200.000 Daltons ou igual ou superior a 1.500.000 Daltons ou igual ou superior a 2.000.000 Daltons.
[067] Qualquer adjuvante PIKA adequado pode ser utilizado na composição de vacina da presente invenção. Em algumas formas de realização, o peso molecular do adjuvante PIKA está dentro da faixa de 66.000 Daltons a 200.000 Daltons. Numa forma de realização preferida, o peso molecular do adjuvante PIKA é de 66.000 Daltons a 660.000 Daltons.
[068] Em algumas formas de realização, a proporção do IPRV e do adjuvante PIKA é selecionada a partir do grupo constituído por: l IU/100 μg, l IU/125 μg, l IU/200 μg, l IU/250 μg, l IU/300 μg, l IU/350 μg, l IU/400 μg, l IU/450 μg, l IU/500 μg, l IU/550 μg, l IU/600 μg, l IU/700 μg, l IU/800 μg, l IU/1000 μg, l IU/1500 μg, l IU/2000 μg e a relação entre quaisquer duas proporções a seguir: l IU/100 μg, l IU/125 μg, l IU/200 μg, l IU/250 μg, l IU/300 μg, l IU/350 μg, l IU/400 μg, l IU/450 μg, l IU/500 μg, l IU/550 μg, l IU/600 μg, l IU/700 μg, l IU/800 μg, l IU/1000 μg, l IU/1500 μg, l IU/2000 μg. Em uma forma de realização particular, a razão entre IPRV e o adjuvante PIKA é de 1 IU/500 μg. Em uma realização particular, a quantidade de IPRV é de 2,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 1.000 μg por dose unitária. Numa outra concretização particular, a quantidade de IPRV é de 4,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 2.000 μg por dose unitária Em outra concretização particular, a quantidade de IPRV é de 3,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 1.000 μg por dose unitária. Ainda, em outra concretização particular, a quantidade de IPRV é de 1,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 1.000 μg por dose unitária. Também, em outra realização, a quantidade de IPRV é de 1,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA é de 2.000 μg por dose unitária.
[069] É conhecido no estado da técnica que, de acordo com a norma OMS, a potência da vacina antirrábica purificada inativada com ou sem adjuvante maior do que 2,5 IU, baseado no teste de potência NIH ou variação do teste NIH, é adequado para o tratamento da profilaxia ou da pós-exposição da infecção pelo vírus da raiva. Na produção atual, a potência da vacina é geralmente maior do que 4,5 IU na produção e a potência diminui ao longo do tempo de armazenamento. Dentro do prazo de validade da vacina, a potência não deve diminuir abaixo de 2,5 IU.
[070] A baixa dose do antígeno usado na presente invenção pode ser potencializada pela adição do adjuvante PIKA para produzir a imunidade de proteção altamente eficaz em ratos e macaco após a vacinação (ver exemplos 1-3 e 6). O estudo em animal também mostra que a composição antirrábica contendo o adjuvante PIKA pode induzir altas e antecipadas concentrações da produção de anticorpos específicos (ver exemplo 1).
[071] Assim, a composição de vacina antirrábica resultante alcança alta potência com menor quantidade do antígeno. Na realidade, a composição de vacina antirrábica com baixa dose de antígeno reduz o custo de produção e o potencial efeito colateral, enquanto a vacina é eficaz na indução de uma resposta imune contra a infecção do vírus da raiva.
[072] Além disso, verificou-se que uma vacina antirrábica com adjuvante PIKA resultante apresenta forte termoestabilidade, quando a quantidade acima descrita de HSA e a de maltose são adicionadas sem a presença de gelatina. O HSA e a maltose são conhecidos como agente estabilizador para vacina antirrábica; no entanto, nunca foi sabido que uma combinação dos mesmos, em uma quantidade específica, a composição de vacina de acordo com a presente invenção exibe termoestabilidade.
[073] A menos que indicado de outra forma, qualquer antígeno da raiva disponível pode ser utilizado para preparar a composição de vacina antirrábica de acordo com a presente invenção. As cepas mais comumente utilizadas do vírus da raiva para a produção de vacina, incluindo, mas não se limitando a cepa CTN-1, a cepa aG, a cepa Pitman Moore (PM), a cepa Kissling (CVS) ou cepas Flury de baixa passagem em ovos (LEP) ou cepas Flury de alta passagem em ovos (HEP), cepa fixa Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA) do vírus Street- Alabama-Dufferin (SAD) e diferentes variantes de SAD.
[074] Em algumas formas de realização particular, o antígeno da vacina antirrábica purificada inativada é obtida a partir da cepa do vírus da raiva aG cultivada numa linhagem celular de rim de hamster (PHK). O vírus é preparado e perfundido para a célula PHK. As células foram então cultivadas em meio de cultura de vírus antes de serem coletadas para gerar a solução de colheita do vírus.
[075] Numa outra forma de realização particular da presente invenção, o antígeno da vacina antirrábica inativada purificada é obtido a partir da cepa do vírus da raiva CTN-1 cultivada na linhagem celular Vero. A cepa do vírus da raiva CTN-1 é inoculada e perfundida na linhagem celular Vero e, em seguida, colhida para gerar a solução viral.
[076] A solução viral colhida, em seguida, passa através do processo de concentração e de inativação para produzir o antígeno inativado. A solução do vírus inativado purificado foi então obtida por meio de cromatografia em coluna após a adição do HSA (ver figura 1 para uma ilustração do processo de produção). Em algumas formas de realização particular, a quantidade de HSA adequada para a presente composição de vacina é selecionada a partir do grupo consistindo 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5% por concentração e o valor entre quaisquer dois valores acima.
[077] Em algumas formas de realização, o adjuvante PIKA é produzido a partir de polímeros de polinucleotídeos de cadeia simples, polyI e polyC, seguido pela adição de sulfato de mono-kanamicina (kanamicina) e cloreto de cálcio (CaCl2) para gerar o adjuvante final. Em algumas formas de realização, o pH do adjuvante PIKA é selecionado a partir do grupo que consiste: 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95, 8,0 e o valor entre quaisquer dois dos valores de pH acima: 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95, 8,0. Em algumas formas de realização particulares, o pH do adjuvante PIKA é de 6,0 a 8,0.
[078] Em algumas formas de realização, a composição de vacina antirrábica é produzida pela combinação do IPRV e do adjuvante PIKA em uma solução tampão de fosfato. O IPRV e o adjuvante PIKA são misturados sob uma seleção de pH a partir de um grupo de: 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95, 8,0 e o valor entre quaisquer dois dos seguintes valores de pH: 6,0, 6,05, 6,1, 6,15, 6,2, 6,25, 6,3, 6,35, 6,4, 6,45, 6,5, 6,55, 6,6, 6,65, 6,7, 6,75, 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95, e 8,0.
[079] Em algumas formas de realização, a composição de vacina antirrábica de acordo com a presente invenção não compreende gelatina.
[080] Em algumas formas de realização, o produto final compreende: 2,0 IU/ml de IPRV, 1,0 mg/ml do adjuvante PIKA, 5,0% de maltose e 0,3% de HSA. Em algumas outras realizações particulares, a composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, compreende ou consiste: 2,0 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,3% de HSA. Em algumas outras concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, compreende ou consiste: 1,0 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,3% de HSA; ou 1.5 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,3% de HSA; ou 2.0 IU/ml de IPRV, 2,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,5% de HSA; ou 4.0 IU/ml de IPRV, 1,0 mg/ml do adjuvante PIKA e 0,5% de HSA.
[081] O produto final é colocado dentro de um frasco esterilizado com o volume de enchimento de 1 ml/frasco para formar uma dose unitária e, em seguida, tampado. Os técnicos no assunto compreenderão que o volume de enchimento de 1 ml/frasco envolve erro operacional. Portanto, o volume de enchimento de 1 ml/frasco pode variar de 0,90 a 1,20 ml/frasco, tal como 1,10 a 1,12 ml/frasco.
[082] Deve notar-se que o volume de enchimento não é limitado a 1 ml/frasco, e pode ser qualquer valor adequado selecionado a partir de um grupo de: 0,1 ml, 0,2 ml, 0,3 ml, 0,4 ml, 0,5 ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml, 1,0 ml, 1,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml/frasco, e qualquer volume entre quaisquer dois valores acima. Numa forma de realização preferida, quando aplicada ao indivíduo adulto humano, grandes e pequenos volumes de administração levam a inconveniência na prática clínica, assim, o volume de administração para humanos é de 1 ml. Assim, a composição da presente invenção é preparada numa forma de 1 ml/frasco. Quando aplicada a uma criança ou outro tipo de indivíduos, o preenchimento do volume de da dose unitária pode ser ajustada em conformidade.
[083] Em algumas formas de realização, a forma líquida da vacina antirrábica também pode ser preparada na sua forma sólida correspondente. Em tal situação, a composição de forma líquida é posteriormente submetida a liofilização. Essa forma sólida de vacina antirrábica é embalada, opcionalmente, em conjunto com água para injeção. A vacina é reconstituída antes da utilização, o volume final para injeção é selecionado a partir de um grupo de: 0,1 ml, 0,15 ml, 0,2 ml, 0,25 ml, 0,3 ml, 0,4 ml, 0,5 ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml, 1,0 ml, 1,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, e qualquer volume entre quaisquer dois valores citados.
[084] Em algumas formas de realização, a forma líquida de vacina antirrábica de concentração adequada é preparada para aplicação intranasal. Em tal situação, o volume de administração da composição de vacina antirrábica varia de 0,05 ml a 0,1 ml, de 0,1 ml a 0,15 ml, de 0,15 ml a 0,2 ml, de 0,2 ml a 0,25 ml, de 0,25 ml a 0,3 ml, de 0,3 ml a 0,35 ml, de 0,35 ml a 0,4 ml, de 0,4 ml a 0,45 ml, de 0,45 ml a 0,5 ml e qualquer intervalo entre quaisquer dois dos seguintes volumes: 0,05 ml a 0,1 ml, de 0,1 ml a 0,15 ml, de 0,15 ml a 0,2 ml, de 0,2 ml a 0,25 ml, de 0,25 ml a 0,3 ml, de 0,3 ml a 0,35 ml, de 0,35 ml a 0,4 ml, de 0,4 ml a 0,45 ml, de 0,45 ml a 0,5 ml. A concentração do referido IPRV é de 0,05 IU/ml a 40,0 IU/ml, tal como 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 IU/ml, e o valor entre quaisquer dois dos valores acima.
[085] Em princípio, a forma de avaliar a segurança da droga refere-se a uma abordagem de identificação do risco e redução do risco. Para as primeiras aplicações em humanos, a segurança pode ser avaliada em espécies de animais escolhidos usados para o teste. A conversão de dados de toxicidade em animal para a dose máxima segura recomendada em humanos pode incluir os seguintes passos: 1) determinar o nível de efeito adverso não observado (NOAEL), 2) converter o NOAEL para dose equivalente em humano (HED) na maioria das espécies de teste relevantes e 3) aplicação de um fator de segurança adequado (por exemplo, 10).
[086] De acordo com a orientação do FDA para a indústria “Estimando a dose máxima segura de início” nos ensaios clínicos iniciais para Terapêutica em voluntários saudáveis adultos, a dose equivalente para humanos pode ser calculada a partir dos estudos animais pré-clínicos selecionados a partir de um modelo animal descrito na tabela a seguir: TABELA 1: CONVERSÃO DE DOSES DE ANIMAL PARA DOSES EQUIVALENTES EM HUMANOS
[087] Quaisquer animais adequados acima para a avaliação da segurança do produto em investigação pode ser selecionado como o modelo animal para estudo. Tipicamente, pelo menos um tipo de animal roedor experimental e, pelo menos um tipo de animal primata experimental devem ser selecionados para avaliação antes da aplicação em seres humanos. Os animais de teste devem ser testados em termos de toxicidade aguda com aplicação única e a toxicidade em longo prazo com a aplicação repetida.
[088] A composição de vacina antirrábica, aqui divulgada, contendo o adjuvante PIKA foi testada em roedores e primatas para mostrar o excelente perfil de segurança (ver os detalhes dos testes de segurança nos exemplos 5 e 7).
[089] Vacinas são normalmente transportadas ou armazenadas antes de sua utilização. A vida de prateleira normal para as vacinas variam de 1 a 3 anos. Dessa forma, é necessário a termoestabilidade da vacina para garantir a potência da vacina no momento da sua administração. Devido à alta prevalência da doença da raiva, as vacinas são geralmente distribuídas para os países tropicais onde não existem sistemas de distribuição refrigerada. Nestas zonas, as preparações de vacinas fornecidas devem ter estabilidade térmica em altas temperaturas.
[090] A composição de vacina antirrábica aqui divulgada foi testada tanto sob 2 a 8°C quanto em 37°C, durante um período de tempo prolongado para confirmar a termoestabilidade (detalhe do exemplo 13).
[091] Em algumas formas de realização, um kit da invenção compreende uma composição de vacina antirrábica numa formulação líquida estéril (por exemplo, aquosa), quando a formulação for estéril e for fornecida num recipiente esterilizado, um frasco estéril, uma ampola estéril ou uma seringa estéril.
[092] Em algumas realizações, um kit da invenção compreende uma composição de vacina antirrábica, liofilizada e num recipiente estéril; e um recipiente que compreende um líquido estéril para reconstituição da composição liofilizada. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda instruções para a reconstituição da composição liofilizada.
[093] Um kit da invenção, em algumas formas de realização, ainda incluirá instruções de uso, incluindo, por exemplo, quantidades de dosagem e as frequências de dosagem. As instruções estão, em algumas formas de realização, impressas diretamente sobre o kit. Em outras formas de concretização, as instruções são material impresso fornecido como uma bula. As instruções também podem ser fornecidas em outros meios de comunicação, por exemplo, disco compacto - CD, um disco digital versátil e similares.
[094] A presente invenção também proporciona um kit farmacêutico, que compreende ou consiste: a) a composição de vacina antirrábica da presente invenção, b) um recipiente, tal como um frasco ou uma ampola, c) uma bula e, opcionalmente, d) água para injeção. Em algumas formas de realização particulares, para a conveniência do transporte e armazenamento, o kit farmacêutico é preparado numa forma liofilizada. Por conseguinte, o kit farmacêutico compreende ou consiste a) composição de vacina antirrábica liofilizada, b) um frasco que contém a composição de vacina antirrábica liofilizada e c) uma bula. Quando necessário, a água para injeção pode ser incorporada no kit farmacêutico para reconstituir a composição de vacina antirrábica líquida antes da utilização. Em algumas formas de realização particulares, as instruções para o uso sugerem o seguinte regime de administração: regime 2-2-1, regime 2-2-2, regime 1-1-1 e/ou regime 21, em que o referido regime 2-2-1 refere-se a 2 doses unitárias administradas no dia 0, 2 doses unitárias administradas no dia 3 e 1 dose unitária administrada no dia 7; em que o regime 2-2-2 refere-se a 2 doses unitárias nos dias 0, 3 e 7; onde o regime 1-1-1 refere-se a 1 dose unitária administrada nos dias 0, 3 e 7; em que o regime 2-1 refere-se a 2 doses unitárias administradas no dia 0 e 1 dose unitária administrada no dia 7.
[095] A presente invenção também proporciona um método para induzir uma resposta imune ao vírus da raiva pela administração a um hospedeiro da composição de vacina antirrábica contendo o adjuvante PIKA, de acordo com a presente invenção. O hospedeiro pode ser um ser humano ou animal não humano. A administração pode ser feita por injeção ou por inalação.
[096] Também se descreve aqui uma composição de vacina antirrábica para utilização num método de tratamento médico. Em particular, a invenção proporciona uma composição de vacina antirrábica para utilização num método de tratamento ou prevenção da raiva. A composição de vacina antirrábica pode ser para a utilização num método de indução de uma resposta imune a um vírus da raiva. A composição de vacina antirrábica é útil nos métodos de tratamento médico e prevenção e métodos de indução de uma resposta imune aqui descrita.
[097] A invenção também fornece a utilização de uma composição de vacina antirrábica no preparo de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da raiva. Em um aspecto, a presente invenção proporciona a utilização da composição de vacina antirrábica, de acordo com a presente invenção, no preparo de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da raiva causada pela infecção por vírus da raiva. Num outro aspecto, a presente invenção também proporciona uma composição de vacina antirrábica para o tratamento ou profilaxia da raiva causada por infecção pelo vírus da raiva. O medicamento é útil em métodos aqui descritos de prevenção e tratamento médico e métodos de indução de uma resposta imune.
[098] No estado da técnica, existem dois regimes de vacinas intramusculares habitualmente utilizados: um é o regime de Essen que envolve 5 injeções administradas nos dias 0, 3, 7, 14 e 28 após a exposição; o outro é o regime de Zagreb que envolve 4 injeções em que são administradas duas injeções no dia 0 em locais diferentes e outras duas injeções são administradas no dia 7 e no dia 21. No entanto, o regime de administração existente é geralmente limitado, devido ao calendário de imunização extenso exigindo 5 visitas clínicas e as baixas concentrações de produção de anticorpos no estágio inicial da imunização. Considerando isto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento da infecção por vírus da raiva com um regime acelerado. Em algumas concretizações particulares, o método compreende uma etapa de administração da composição de vacina antirrábica da presente invenção a um hospedeiro, em que o referido hospedeiro foi exposto ao vírus da raiva. Em algumas concretizações particulares, o hospedeiro é humano. Em algumas outras concretizações particulares, o hospedeiro é animal não humano, tal como roedor, cão e macaco.
[099] Em algumas formas de realização particulares, a presente invenção proporciona um regime de administração acelerada, em que uma composição de vacina da presente invenção é administrada a um hospedeiro por 5 vezes dentro de 7 dias após a exposição do vírus da raiva. Em algumas concretizações particulares, a composição de vacina da raiva da presente invenção é administrada a um hospedeiro com base no seguinte regime: 1) uma primeira administração no dia 0 pós- exposição, 2) uma segunda administração no dia 0 pós-exposição, 3) uma terceira administração no dia 2 ou 3 pós-exposição, 4) uma quarta administração no dia 2 ou 3 pós-exposição e 5) uma quinta administração no dia 6 ou 7 após a exposição, opcionalmente, 6) uma sexta administração no dia 6 ou 7 pós-exposição, respectivamente. Como alternativa, em algumas outras concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica da presente invenção é administrada a um hospedeiro com base no seguinte regime: uma primeira e uma segunda administração no dia 0 pós-exposição; uma terceira e uma quarta administração no dia 2 ou 3 dias após a exposição e uma quinta e/ou sexta administração no dia 7 após exposição, respectivamente.
[0100] Em outro aspecto, a presente invenção também provê um método para a profilaxia da infecção do vírus da raiva e uma composição de vacina antirrábica para utilização em tal método. Em algumas concretizações particulares, o método compreende uma etapa de administração da composição de vacina antirrábica da presente invenção a um hospedeiro, em que o referido hospedeiro não está exposto ao vírus da raiva. Em algumas concretizações particulares, o hospedeiro é humano. Em outras concretizações particulares, o hospedeiro é animal não humano, tal como roedor, cão e macaco. Em algumas concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica da presente invenção é administrada a um hospedeiro por três vezes ao longo de 7 dias. Em algumas concretizações particulares, a composição de vacina antirrábica da presente invenção é administrada a um hospedeiro com base no seguinte regime: 1) uma primeira administração no dia 0; 2) uma segunda administração no dia 0 e 3) uma terceira administração no dia 7, respectivamente. A profilaxia ou prevenção inclui o tratamento de um indivíduo, particularmente, um humano que não tem a doença ou seja assintomático para a doença. Métodos particularmente preferidos de prevenção da raiva, ou profilaxia são métodos de profilaxia pré- exposição (PEP), nos quais a vacina é administrada antes do indivíduo ser exposto ao, ou esteja em risco de exposição ao vírus da raiva vivo. O indivíduo pode ter sido identificado como predisposto ou em risco de desenvolver a doença. Neste caso ou no caso da raiva, o indivíduo pode ter sido determinado por estar predisposto ou em risco de desenvolver raiva. Por exemplo, pelo fato de visitaram ou pretenderem visitar um país ou localização onde se sabe que a raiva está presente ou porque trabalham com o vírus ou com animais.
[0101] No contexto da presente invenção, a administração é realizada por injeção parenteral, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intravenosa, injeção subcutânea, administração tópica, administração transdérmica e administração intradérmica. Em algumas concretizações particulares, a administração para animais pode ser realizada por injeção intraperitoneal. Em algumas outras concretizações particulares, a administração para humanos é realizada por injeção intramuscular ou injeção intravenosa. Numa outra concretização particular, a administração é realizada por inalação, administração retal, administração nasal, administração oral (incluindo inalação).
[0102] Camundongos OF1 são administrados com IPRV (cepa PV produzida em células BHK 21, 0,2 IU) com ou sem adjuvante PIKA (75 μg) nos dias 0, 3, 7, 14 e 30. Amostras de sangue são tomadas 5 vezes ao longo de um período de 60 dias pós imunização, e testado para anticorpos neutralizantes do vírus através do Teste Rápido de Inibição de Foco Fluorescente (RFFIT) e também ensaiado para IgG, IgM utilizando ELISA.
[0103] Camundongos OF1 são infectados via subcutânea com vírus da raiva selvagem (5x106 icLD50), após eles terem sido administrados com adjuvante PIKA sozinho (50 μg), doses altas ou baixas de IPRV (0,1 ou 0,2 IU, cepa PV) sem adjuvante, com 50 μg de Al2O3, ou com 50 μg de PIKA em 6 horas, 3 e 7 dias após a infecção. As taxas de sobrevivência dos camundongos são observadas.
[0104] (1) A resposta imune humoral (isto é, concentrações de anticorpos utilizando o teste RFFIT) foi observada como sendo mais elevada em animais que receberam a composição de vacina antirrábica com PIKA. Enquanto que a composição de vacina contendo PIKA poderia induzir altas produção de IgG e IgM o quanto antes como em 4 dias após a imunização. A composição de vacina com adjuvante de alumínio diminui a concentração de anticorpo numa fase inicial. As concentrações de anticorpos IgG gerados pela composição de vacina antirrábica com ou sem adjuvante estão apresentados na figura 3.
[0105] (2) De acordo com teste de desafio viral de dose letal 95% de camundongos morreram sem vacinação ou com vacina de adjuvante de alumínio e a composição de vacina antirrábica com PIKA forneceu 90% de proteção, mesmo quando foi utilizada nível sub-ótimo de IPRV (0,1 IU). Todos os camundongos imunizados com o nível ótimo de IPRV (0,2 IU) com adjuvante PIKA sobreviveram, enquanto que apenas 30% dos camundongos sobreviveram, quando imunizados com nível ótimo de IPRV e adjuvante de alumínio.
[0106] Como conclusão, a composição de vacina antirrábica compreendendo o adjuvante PIKA poderia induzir 6 a 7 vezes mais elevadas concentrações de anticorpos neutralizantes após a imunização em comparação com a vacina de adjuvante de alumínio tradicional. O elevado nível de IgG é mantido ao longo de um período de observação de 60 dias, o que proporcionou uma proteção humoral de longa duração após a imunização.
[0107] O aumento antecipado dos anticorpos neutralizantes também poderia fornecer uma proteção mais eficaz para os pacientes que receberam a vacinação pós-exposição. Uma conclusão mais direta pode ser desenhada, a medida que todos os camundongos imunizados com a vacina antirrábica com adjuvante PIKA sobreviveram ao desafio viral letal.
[0108] Protocolo: Camundongos C3H foram imunizados com o controle PBS, IPRV (0,1 IU) com ou sem adjuvante PIKA (10 μg), por via subcutânea. Uma semana mais tarde, os camundongos foram sacrificados e os esplenócitos foram isolados para avaliar a produção de IL-2 usando o método Gillis. Resumidamente, os esplenócitos foram cultivados e estimulados com o controle, IPRV, adjuvante PIKA ou ConA. O sobrenadante foi, em seguida, colhido após 24 horas e filtrado antes da titulação com IL-2. O sobrenadante foi adicionado à cultura de células CTLL, cujo crescimento é dependente da presença de IL-2. A produção de IL-2 foi titulada através da medição da proliferação celular de CTLL. Além disso, foi adicionada 3H-timidina para determinar a proliferação de esplenócitos através da medição pela incorporação 3H- timidina após estimulação.
[0109] Resumo dos resultados: a composição de vacina antirrábica contendo 0,1 IU de IPRV e 10 μg do adjuvante PIKA pode aumentar a produção de IL-2 e a proliferação de esplenócitos. Quando usado para a estimulação in vitro, o adjuvante PIKA sozinho induz a fraca produção de IL-2 e a alta proliferação de esplenócitos, indicando que o adjuvante PIKA envolve múltiplos mecanismos celulares para ativar esplenócitos além das células T auxiliares que requerem IL-2.
[0110] Protocolo: 3 grupos de camundongos Kunming (20 g em média) foram imunizados com controle de solução salina, 0,1 IU IPRV com ou sem o adjuvante PIKA (10 μg). Os camundongos receberam administração intraperitoneal com as composições acima nos dias 0, 3, 7 e 14. Os macrófagos peritoneais foram coletados e isolados em 4 horas após cada imunização para inspeção microscópica. A atividade fagocítica dos macrófagos foi contabilizada e apresentada na tabela abaixo: TABELA 2: ÍNDICE DE FAGOCITOSE DE MACRÓFAGOS Nota: A porcentagem indicando o número de macrófagos com atividade de fagocitose sobre número de macrófagos sem atividade de fagocitose; Número entre parênteses indicando o número de glóbulos vermelhos por cada macrófagos fagocitado.
[0111] A tabela 2 mostra que o adjuvante PIKA poderia reforçar as atividades dos macrófagos, enquanto o IPRV sozinho inibe a ativação dos macrófagos.
[0112] O antígeno da raiva (0,1 ou 0,2 IU) produzido em células PHK com ou sem o adjuvante PIKA (10 ou 50 μg) contra o padrão. Os camundongos BALB/c foram imunizados por via intraperitoneal com uma ou duas doses das três composições acima no dia 0 ou nos dias 0 e 7, respectivamente. Os camundongos foram sacrificados sete dias após a imunização (ou seja, no dia 7 para os camundongos que receberam uma dose e no dia 14 para camundongos que receberam duas doses). Os esplenócitos foram isolados para testar a produção de IFN-Y utilizando ELISPOT.
[0113] Resultado: a composição de vacina antirrábica contendo IPRV produzido na célula PHK e o adjuvante PIKA induziu a produção de IFN-Y em camundongos o cedo dentro dos 7 dias após a primeira dose. O grupo sem o adjuvante PIKA não apresentou produção significativa de IFN-Y. Em camundongos que receberam duas doses da composição de vacina antirrábica contendo IPRV produzido em célula PHK e adjuvante PIKA (50 μg) gerou duas vezes mais IFN-Y do que o grupo padrão. Mesmo com níveis sub-ótimo do adjuvante PIKA (10 μg), os camundongos geraram níveis significativos de IFN-Y após a segunda dose. Isto mostrou que a composição de vacina antirrábica com o adjuvante PIKA pode proporcionar a resposta imune mediada por células T tão logo após a imunização e aumentar em até 14 dias após a imunização.
[0114] A composição de vacina antirrábica contendo nível sub- ótimo de IPRV (0,1 IU) e adjuvante (10 μg) dos dois exemplos acima é equivalente a composição de uso humano de 24,39 IU de IPRV e 2439 μg do adjuvante PIKA por dose unitária (ver a figura 1 e tabela 1 para conversão). Isto é um indicativo para uma dose humana de cerca de 2,4 IU IPRV e 240 μg do adjuvante PIKA, quando um fator de segurança 10 comumente utilizado é aplicado. Para o nível ótimo de IPRV (0,2 IU) e (50 μg ou 75 μg) do adjuvante é utilizado, a dose indicativa para um ser humano é de cerca de 4 IU de IPRV e 1,200 μg do adjuvante PIKA.
[0115] O mesmo lote de IPRV é usado para preparar composições de vacina sem adjuvante, com o adjuvante de alumínio e com o adjuvante PIKA. Os camundongos foram imunizados com diferentes preparações de composições de vacina antirrábica e desafiados com a cepa CVS intracerebralmente. O ED50 foi medido usando o método do NIH. A quantidade do adjuvante adicionado e resultante do ED50 está apresentada na tabela 3: TABELA 3: TESTE DE POTÊNCIA DA COMPOSIÇÃO DE VACINA ANTIRRÁBICA
[0116] Resultados: O ED50 das composições de vacina com adjuvante PIKA diminuiu cerca de 10 vezes enquanto que as composições de vacina com adjuvante de alumínio diminuíram apenas cerca de uma vez. Como conclusão, o adjuvante PIKA apresenta melhor efeito de potencialidade significante ao antígeno da raiva em comparação com adjuvante de alumínio.
[0117] A vacina antirrábica existente geralmente contém o antígeno IPRV maior do que 4.5 IU. No entanto, para a vacina antirrábica com PIKA da presente invenção, o nível de antígeno proposto é < 4,5 IU. Este foi recomendado com base em estudos pré- clínicos, incluindo o teste com hamster golden no teste de proteção pós- exposição (exemplo 5). Os resultados mostraram que a composição de vacina antirrábica com PIKA contendo 2 IU de antígeno apresentou uma proteção melhor do que a composição de vacina disponível comercialmente contendo antígeno > 4,5 IU. Como tal, nós testamos vários níveis de antígeno a partir de 0,25 a 3,0 IU na forma de dosagem final; isto é para reduzir potencialmente o efeito colateral e também reduzir o custo da vacina, enquanto ainda mantém um bom nível de eficácia com a adição do adjuvante PIKA. Para fins de teste, a dose de PIKA foi mantida constante em 1,0 mg. Além disso, a influência na eficácia da vacina com base na quantidade diferente de PIKA e concentrações de albumina humana também foram estudadas.
[0118] Enquanto outros componentes (PIKA, HSA e maltose) da vacina antirrábica foram mantidas constantes, a eficácia imunoprotetora das composições de vacina com diferentes concentrações do antígeno estão examinadas na tabela 4 abaixo: TABELA 4: EFICÁCIAS IMUNOPROTETORAS DE VACINAS COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ANTÍGENO
[0119] Análise: A potência da vacina com as concentrações dos antígenos entre 0,5 e 3,0 IU/dose (uma quantidade relativa da unidade internacional) adicionadas foram sempre maiores do que 2,5 IU/dose (uma unidade internacional da potência relativa), que preencheram os requisitos padrão para vacina antirrábica recomendados pela OMS, bem como na Farmacopeia da República Popular da China, edição 2010, Volume 3.
[0120] Com as quantidades do IPRV, HSA e maltose mantidas constantes, a eficácia imunoprotetora das vacinas com diferentes quantidades do adjuvante PIKA foram examinadas na tabela 5: TABELA 5: EFICÁCIAS IMUNOPROTETORAS DAS VACINAS COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DO ANTÍGENO
[0121] Análise: Quando a quantidade do adjuvante PIKA adicionado estiver entre 0,25 e 2,0 μg/dose as eficácias das composições antirrábicas resultantes foram sempre superiores a 2,5 IU/dose, o que preenche os requisitos padrão para a vacina antirrábica recomendadas pela OMS. Quando utilizado como medicamento antiviral, até 4 mg de PIKA é aprovado para ser usado repetidamente em indivíduos humanos com bons efeitos terapêuticos e bem tolerado. Além disso, l,0 mg do adjuvante PIKA foi usado no ensaio de fase I humana para potencializar o antígeno da raiva com boa eficácia de profilaxia. Portanto, a quantidade do adjuvante PIKA que varia de 0,25 a 4 mg de PIKA deve ser seguro e eficaz para ser adicionada à formulação final.
[0122] A estabilidade da vacina antirrábica com PIKA liofilizada em várias concentrações de HSA foi examinada na tabela 6 abaixo: TABELA 6: INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE HSA NA ESTABILIDADE DA VACINA ANTIRRÁBICA
[0123] Análise: Com o resto das concentrações (Antígeno, PIKA e Maltose) mantidas constantes, a potência da vacina e a estabilidade acelerada foram sempre superiores a 2,5 IU/dose, quando a concentração de HSA estava entre 0 e 1,0%. Estes resultados preenchem os requisitos da norma da OMS para produtos similares no mercado.
[0124] Assim, uma formulação equilibrada da composição de vacina antirrábica contendo o adjuvante PIKA compreenderá 2.0 IU de IPRV; 1 mg do adjuvante PIKA; 0,3% de albumina humana (3 mg em 1 ml da composição de vacina final antes da liofilização ou após da reconstituição); e 5% de maltose (ou seja, 50 mg em 1 ml da composição de vacina final antes da liofilização ou após a reconstituição).
[0125] Protocolo: Sete grupos hams ter Golden fêmeas de 7 a 8 semanas de idade, de 100 a 150 g de peso corporal (15 por grupo) foram infectados com 0,1 ml de cepa BD06 do vírus da raiva selvagem 50 LD50. A vacina foi administrada por via intramuscular nas patas traseiras. Foram observadas as taxas de sobrevivência dos animais durante 45 dias. As informações do agrupamento foram a seguintes:
[0126] Grupo 1: controle de solução salina com regime de imunização 1-1-1-1-1 (isto é, uma injeção de dose unitária em 2 horas e 3, 7, 14, 28 dias após a exposição);
[0127] Grupo 2: Uma vacina antirrábica comercialmente disponível (IPRV da cepa LEP Flurry produzida em células de embrião de pinto, > 2,5 IU) com o mesmo regime de imunização do grupo 1;
[0128] Grupo 3: Imunoglobulina de raiva humana em 2 locais, ou seja, metade de 1,5 IU administrada a pata posterior direita e outra metade administrado na pata traseira esquerda 2 horas após a exposição;
[0129] Grupo 4: a composição de vacina antirrábica contendo IPRV da cepa CTN-1 produzida numa linhagem celular Vero e adjuvante PIKA com regime de imunização 1-1-1-1-1;
[0130] Grupo 5: a composição de vacina antirrábica contendo IPRV da cepa CTN-1 produzido numa linhagem celular Vero e adjuvante PIKA com regime de imunização 2-2-1 (isto é, injeção de dose dupla em 2 horas, 2 dias após a exposição e uma injeção de dose unitária 7 dias após a exposição).
[0131] Grupo 6: a composição de vacina antirrábica contendo IPRV da cepa aG produzido na célula PHK e adjuvante PIKA com regime de imunização 1-1-1 -1-1;
[0132] Grupo 7: a composição de vacina antirrábica contendo IPRV da cepa aG produzido na célula PHK e adjuvante PIKA com regime de imunização 2-2-1 (isto é, injeção de dose dupla em 2 horas, 2 dias após a exposição e uma injeção de dose unitária 7 dias após a exposição).
[0133] Composições: a composição de vacina antirrábica utilizada nos Grupos 4 e 5 contendo 2,0 IU/ml de IPRV, 1000 μg de adjuvante PIKA, 5% de maltose e 0,3% de HSA, injetado com dose unitária de 0,1 ml, é equivalente à dose humana pela composição de peso corporal de 10,8 IU de IPRV e 5405 μg do adjuvante PIKA por dose unitária (ver a figura 1 e a tabela 1 para a conversão). Depois de dividir com um fator de segurança 10, o resultado deste estudo é indicativo para aplicação em seres humanos com cerca de 1,0 IU de IPRV e 500 μg de PIKA.
[0134] Resumo dos resultados: A vacina antirrábica comercialmente disponível com regime de imunização padrão apenas forneceu uma proteção limitada após o teste de proteção pós-exposição, ao passo que a composição de vacina antirrábica contendo PIKA poderia fornecer melhor proteção significativa utilizando o mesmo regime. Ambas as composições de vacina antirrábica com PIKA com regime melhorado e a imunização passiva com imunoglobulinas protegeu 80% dos indivíduos (p < 0,005). A taxa de proteção para todos os grupos de teste foi mostrada abaixo: TABELA 7: TESTE DE PROTEÇÃO À EXPOSIÇÃO EM HAMSTERS GOLDEN
[0135] Em conclusão, a vacina comercialmente disponível apenas forneceu uma proteção limitada, enquanto que a composição de vacina antirrábica da presente descrição proporciona forte proteção significativa. Ao utilizar regime acelerado 2-2-1 (isto é, dose dupla para as primeiras duas injeções), a composição de vacina antirrábica contendo IPRV de cepa CTN-1 produzida em células Vero e adjuvante PIKA poderia proporcionar o mesmo nível de proteção da imunoglobulina de raiva humana.
[0136] Protocolo: Quatro grupos de camundongos (20 por grupo) expostos à alta dose do vírus da raiva CQ92 foram imunizados com 0,06 ml de vacina antirrábica comercialmente disponível a partir de várias fontes, a composição de vacina antirrábica contendo adjuvante PIKA ou PBS como um controle negativo nos dias 0, 3, 6 e 9.
[0137] Composição: a composição de vacina antirrábica contendo adjuvante PIKA, utilizada no Grupo 1 contendo 1,5 IU/ml do IPRV de cepa PM produzida em célula PHK, 1000 μg do adjuvante PIKA e 0,2% de HSA, injetado com uma dose unitária de 0,06 ml, é equivalente à composição de uso humano de 21,95 IU do IPRV e 14.634 μg do adjuvante PIKA por dose unitária (ver a figura 1 e a tabela 1 para a conversão). Isto é indicativo para uma dose humana de cerca de 2 IU do IPRV e 1500 μg do adjuvante PIKA, quando um fator de segurança 10 comumente utilizado é aplicado.
[0138] Os camundongos foram então observados durante 21 dias após a última injeção. As taxas de sobrevivência estão apresentadas na tabela 8 abaixo: TABELA 8: TESTE DE PROTEÇÃO À PÓS-EXPOSIÇÃO EM CAMUNDONGOS
[0139] Resumo dos resultados: Os camundongos a partir dos grupos de vacina comparativos conferem um nível similar de proteção como o grupo de controle sob o desafio viral de dose letal. A vacina antirrábica com PIKA confirma uma proteção de 80% para o camundongo no teste de proteção pós-exposição, quando é usada a dose mais baixa do antígeno. Em suma, a composição da presente invenção aumenta muito a taxa de proteção de vacina antirrábica contra infecção viral de dose letal em camundongos com um nível reduzido de antígeno.
[0140] Protocolo: Cinco grupos de camundongos Kunming (KM) de 3 a 5 semanas de idade, 20 camundongos (10 machos e 10 fêmeas, pesando 20 g em média em cada grupo), foram administrados com uma dose unitária de 0,2 ml da composição definida no quadro a seguir: TABELA 9: TOXICIDADE AGUDA EM ROEDOR
[0141] Os camundongos foram, em seguida, monitorados por 4 horas após a administração da droga para reações tóxicas, morte e sintomas clínicos anormais, seguido por observação diária durante 14 dias. O peso corporal foi medido antes da primeira injeção e nos dias 1, 4, 7, 11 e 14 após a injeção. A ingestão de alimentos foi gravada nos dias 1, 7 e 14 após a injeção. Os camundongos foram sacrificados no dia 14 seguido pelo exame de macro-patologia nos seguintes órgãos: coração, fígado, baço, pulmão, rim, glândula supra-renal, cérebro, estômago, intestino, traqueia, testículo, epidídimo, útero, ovário, glândula timo, gânglios linfáticos (incluindo nódulos linfáticos cervicais, nódulos linfáticos mesentéricos e nódulos linfáticos ilíacos Peyer), músculo membro posterior esquerda e direita.
[0142] Resultados: Os animais no grupo de estudo não apresentaram variações significativas na ingestão de alimentos e no peso corporal, em comparação com os grupos controle. Não foram observados sintomas clínicos anormais nos 14 dias após a administração da droga ao passo que todos os animais sobreviveram à dose máxima do fármaco administrada sem efeitos tóxicos observáveis e anormalidades durante o exame visual dos órgãos.
[0143] Em conclusão, a composição de vacina antirrábica contendo adjuvante PIKA é bem tolerada em camundongos KM para a dose máxima de 0,4 IU do antígeno da raiva com 200 μg do adjuvante PIKA. Os camundongos que receberam a composição de vacina antirrábica contendo 0,4 IU de IPRV e 200 μg do adjuvante PIKA tiveram uma margem de segurança (MOS) de 150 a 300 vezes, quando 2 IU de IPRV e 1000 μg de PIKA estava para ser usado na aplicação em seres humanos. O cálculo da MOS está apresentada na tabela 10 abaixo: TABELA 10: TOXICIDADE AGUDA EM CAMUNDONGOS KUNMING - MARGEM DO CÁLCULO DE SEGURANÇA
[0144] Protocolo: Sete grupos de porquinho-da-índia DunkinHartley, pesando 299,6 g a 339,1 g, 6 animais (3 machos e 3 fêmeas) por grupo, foram administrados intramuscularmente com três doses das composições estabelecidas na tabela 11 a seguir a cada dois dias. Os animais foram desafiados por via intravenosa com o dobro da dose de imunização de 10 a 14 dias após a imunização: TABELA 11: REAÇÃO ALÉRGICA EM ROEDOR - PLANO DE IMUNIZAÇÃO E DESAFIO
[0145] Resultados: Todos os animais do grupo de controle negative não mostraram nenhum sinal de reação alérgica, enquanto os animais do grupo controle positivo começaram a mostrar reação alérgica em 1 minuto após o desafio. Os sintomas incluindo: coceira no nariz, tosse, vermelhidão, ataxia e espasticidade. O grupo da composição de vacina antirrábica ou do adjuvante PIKA em animal sem albumina humana não mostrou qualquer reação alérgica óbvia durante a imunização e o desafio, enquanto os grupos composição de vacina antirrábica e adjuvante PIKA contendo albumina humana mostrou diferente grau de reação alérgica. Dois pares dos animais (1 macho e 1 fêmea), tomados a partir do grupo 6 e 7 (com 0,3% de HSA) foram administrados com 1 ml adicional (o volume de desafio) de baixa ou alta dose de vacina antirrábica com PIKA sem albumina humana, respectivamente (marcados como grupo 6.1 e 7.1). Nenhuma reação alérgica foi observada com o teste de desafio adicional na ausência de albumina humana.
[0146] Como conclusão, a composições de vacina antirrábica contendo adjuvante PIKA e adjuvante PIKA sem a adição de albumina humana são não-alérgicas e bem tolerada em animais de teste após doses múltiplas de até 3 IU de antígeno da raiva e 1500 μg do adjuvante PIKA por via intramuscular. A MOS para a composição de vacina antirrábica utilizada na reação alérgica é 25 vezes para o grupo de dose baixa e 50 vezes para o grupo de dose elevada. O determinado é apresentado abaixo: TABELA 12: REAÇÃO ALÉRGICA EM PORQUINHOS-DA-ÍNDIA - MARGEM DO CÁLCULO DE SEGURANÇA
[0147] Protocolo para a avaliação da segurança: Quatro grupos de macacos Rhesus de 2 a 3 anos de idade com 8 animais por grupo (4 machos e 4 fêmeas) entre 2,5 kg e 4,0 kg em peso foram administrados com a composição de vacina antirrábica com PIKA em doses crescentes (dois grupos), PIKA sozinho ou 0,9% de NaCl (grupo de controle) através da injeção no músculo deltóide cinco vezes dentro de um período de 6 semanas, isto é, nos dias 0, 2, 7, 28 e 42. As primeiras duas injeções foram administradas em dois locais (isto é, dose dupla), ver tabela 13 abaixo. TABELA 13: GRUPOS DE ESTUDO DE TOXICIDADE CRÓNICA EM PRIMATAS
[0148] O local da injeção e os sintomas clínicos sistêmicos dos macacos foram observados várias vezes antes e depois da imunização. As amostras de sangue foram obtidas 4 vezes no dia 0 (isto é, período de quarentena do animal), 44 e 70. As amostras sanguíneas foram utilizadas para testes hematológicos, coagulação sanguínea e bioquímica sérica.
[0149] Protocolo para a eficácia: As respostas imunes humorais e a potência foram medidas nos dias 44 e 70. Dois macacos machos e duas fêmeas foram sacrificados nos dias 45 e 70 para exame histológico. Os órgãos foram pesados, cortados e fixados antes da coloração para exame microscópio de luz.
[0150] 1. Nenhuma anormalidade no local da injeção ou sintomas clínicos sistêmicos foram observados em todos os animais administrados com adjuvante PIKA ou composição de vacina antirrábica com PIKA. Todos os valores no teste estavam dentro da faixa dos anteriores centro de dados, não foram relatadas mudanças significativas. O peso de diversos órgãos não mostrou nenhuma diferença significativa entre os outros grupos de teste e o de controle.
[0151] 2. As respostas imunes humorais representadas pelas concentrações médias geométricas do IgG específico para raiva e a potência de anticorpos neutralizantes em soros sanguíneos foram avaliados utilizando testes ELISA ou FAVN, respectivamente. As tabelas 14-15 e as figuras 4-5 ilustram o aumento da resposta imune nos primatas administrados com a composição de vacina antirrábica contendo PIKA e PIKA sozinho. TABELA 14: IGG SÉRICO (TESTE ELISA) TABELA 15: POTÊNCIA (TESTE FAVN)
[0152] No dia 44, os grupos de altas e baixas doses da vacina antirrábica com PIKA induzida em média com 4,795 e 7,366 IU de anticorpos neutralizantes, respectivamente, em macacos, ou seja, 9,6 e 14,7 vezes mais potente do que o nível de proteção de 0,5 IU requerido pela OMS. A potência do anticorpo neutralizante diminuiu ligeiramente para 5,653 no grupo de alta dose e aumentou no grupo de baixa dose para 5,670 no dia 70.
[0153] Em resumo, a composição de vacina antirrábica contendo IPRV produzido em células Vero é bem tolerada e apresenta boa imunogenicidade em macacos Rhesus depois de repetidas injeções intramusculares ao longo de um período de observação de 84 dias. Os anticorpos específicos são importantes na neutralização do vírus livre e o combate contra a infecção viral da raiva.
[0154] O cálculo da margem de segurança (MOS) é apresentado na tabela 16 abaixo e é determinado por: MOS = a dose primata total testada (mg/kg)/ dose humana total proposta (mg/kg). TABELA 16: TOXICIDADE CRÔNICA EM PRIMATAS - MARGEM DE SEGURANÇA
[0155] A margem de segurança para a vacina antirrábica com PIKA quando 2 IU de IPRV e 1000 μg do adjuvante PIKA com 0,3% de HSA for usado em humano adulto através da dosagem de teste de toxicidade de macaco é 28 vezes maior para um grupo da dose completa e 14 vezes maior para um grupo de metade da dose.
[0156] Um ensaio clínico de fase I com a composição de vacina antirrábica contendo o adjuvante PIKA (1 IU de IPRV e 1000 μg do adjuvante PIKA) foi conduzido. Voluntários saudáveis foram divididos em três grupos com 10 indivíduos em cada grupo. Os indivíduos em cada grupo foram administrados com a composição de vacina antirrábica com PIKA ou uma vacina de comparação (9,4 IU de IPRV) sem adjuvante nos dias 0, 3, 7, 14 e 28. As amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 7, 10, 30 e 60 para a avaliação da concentração de anticorpo neutralizante com o resultado mostrado a seguir: TABELA 17: A coNcENTRAÇÃo Do ANTicoRPo NEuTRALiZANTE (iu/ML)
[0157] Resumo dos resultados: Não houve efeito adverso óbvio observado durante o teste. A vacina antirrábica contendo o adjuvante PIKA foi capaz de induzir o anticorpo neutralizante bem antes do dia 7 após a imunização primária. Comparando com a vacina de comparação, a vacina antirrábica com PIKA produziu de forma antecipada altas concentrações de anticorpo neutralizante.
[0158] Num outro ensaio piloto humano envolvendo 4 voluntários saudáveis, os indivíduos foram administrados com a composição de vacina antirrábica contendo 2 IU de IPRV e 1000 μg do adjuvante PIKA utilizando o regime 2-2-1 nos dias 0, 3 e 7 (isto é, 4 IU de IPRV e 2000 μg do adjuvante PIKA, no total, foram administradas nos dias 0 e 3, em dois locais diferentes). As amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 7 e 14 após a imunização. A resposta imune humoral foi avaliada com os resultados apresentados na tabela 18: TABELA 18: CONCENTRAÇÃO MÉDIA DO ANTICORPO NEUTRALIZANTE (IU/ML) EM 4 INDIVÍDUOS HUMANOS
[0159] Resumo dos resultados: Os quatro voluntários não relataram qualquer efeito adverso evidente durante o ensaio. A composição de vacina antirrábica foi capaz de induzir o anticorpo neutralizante superior a 0,5 IU bem antes do dia 7 após a imunização primária. Isto é considerado protetivo, de acordo com o padrão da OMS. Dessa forma, a dose da vacina de até 4 IU de IPRV e 2000 μg do adjuvante PIKA para as primeiras duas injeções é segura e eficaz na indução precoce e elevada do nível de imunidade protetora em indivíduos humanos.
[0160] Voluntários saudáveis foram imunizados com a vacina antirrábica contendo 1,5 IU de IPRV e 1000 μg/ml do adjuvante PIKA. As células mononucleares sanguíneas periféricas foram isoladas a partir das amostras de sangue coletadas de 2,5 anos após a imunização. As células foram estimuladas com o controle de PBS ou diferente nível de IPRV e testado para a produção de interferon-Y utilizando um teste ELISPOT. Os resultados mostraram que os voluntários ainda produzem níveis significativos de interferon-Y após estimulação de 2,5 anos depois da imunização com a vacina antirrábica contendo o adjuvante PIKA.
[0161] Um ensaio de estabilidade de longo prazo em temperaturas de 2 a 8°C e um ensaio acelerado a 37°C foram planejados para analisar a estabilidade da composição de vacina. Quatro lotes da composição de vacina antirrábica liofilizada (1,0 ml/frasco) foram testados (no. de lote II-20130401, II-20130402, II-20130501 e II-20130901).
[0162] As composições no. de lote II-20130402, a composição de vacina antirrábica compreende: 2,0 IU/dose de IPRV, 1000 μg/dose do adjuvante PIKA, 5,0% de maltose, 0,3% de HSA, e 7,60 ± 0,05 de tampão PBS. no. de lote II-20130401, a composição de vacina antirrábica compreende: 1,5 IU/dose de IPRV, 2000 μg/dose do adjuvante PIKA, 5,0% de maltose, 0,3% de HSA, e 7,60 ± 0,05 de tampão PBS.
[0163] no. de lote II-20130501, a composição de vacina antirrábica compreende: 2,0 IU/dose de IPRV, 2000 μg/dose do adjuvante PIKA, 5,0% de maltose, 0,3% de HSA, e 7,60 ± 0,05 de tampão PBS.
[0164] no. de lote II-20130901, a composição de vacina antirrábica compreende: 4,0 IU/dose de IPRV, 1000 μg/dose do adjuvante PIKA, 5,0% de maltose, 0,5% de HSA, e 7,60 ± 0,05 de tampão PBS.
[0165] Os quatro lotes das composições de vacina acima foram armazenadas a 2 a 8°C para o teste de estabilidade de longo prazo, a qual foi planejada de acordo com os padrões das Farmacopeias europeia e chinesa e ao longo de um período de 42 meses. Os itens testados incluíram aparência, pH, teor de umidade, endotoxina, esterilidade, potência, identificação, resíduo de albumina de soro bovino, resíduo sulfato de gentamicina, resíduo de proteína a partir da célula hospedeira, teor de kanamicina, teor do PIKA, peso molecular do PIKA e os resíduos de DNA da célula hospedeira.
[0166] Os resultados até 6 meses foram satisfatórios de acordo com os padrões da Farmacopeia chinesa (2010 ed.) e da Farmacopeia europeia (E7.0), a potência da vacina foi ainda significativamente mais elevada do que o padrão de 2,5 IU/ml requerido pela OMS. Nenhum desvio significativo de aparência, pH, teor de umidade, endotoxina e esterilidade foram observados a partir do mês 0.
[0167] Um teste de estabilidade acelerada foi também realizado nos 3 lotes acima através do armazenamento da vacina a 37°C durante 6 meses. Ela agiu como uma indicação preliminar para a estabilidade de longo prazo. Os testes de qualidade para aparência, pH, teor de umidade, endotoxina, esterilidade e a potência da vacina foram realizadas nos meses 1, 2, 3, e 6, respectivamente. Os resultados do teste para os quatro lotes da composição de vacina antirrábica descrita acima estão resumidos na tabela 19. TABELA 19: RESULTADOS DO TESTE DE ESTABILIDADE ACELERADA
[0168] A composição de vacina foi fabricada e testada de acordo com o padrão de BPF. Após o armazenamento a 37°C durante 1, 2, 3, e 6 meses, a vacina foi ainda significativamente mais elevada do que 2,5 IU/ml, que é a exigência de padrão da OMS. Nenhum desvio significativo de aparência, pH, teor de umidade, endotoxina e esterilidade foram observados a partir do mês 0. Os resultados agiram como uma indicação preliminar para a estabilidade de longo prazo da composição de vacina antirrábica.
Claims (19)
1. COMPOSIÇÃO DE VACINA ANTIRRÁBICA, caracterizado pelo fato de compreender: a) vírus da raiva purificado inativado (IPRV); b) adjuvante PIKA contendo Poli I: C, canamicina e cloreto de cálcio, em que o peso molecular é de 66.000 a 1.200.000 Daltons; c) albumina do soro humano (HSA); e d) maltose, onde a quantidade de IPRV é de 0,2 IU a 4,0 IU por dose unitária, a quantidade do adjuvante PIKA é de 250 μg a 5000 μg por dose unitária, a quantidade de HSA é de 0,1% a 0,9% por concentração, e a quantidade da dita maltose está entre 1,0% e 6,0% por concentração.
2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da quantidade do dito IPRV ser de 0,5 IU a 3,0 IU por dose unitária, de preferência, de 1,0 IU a 2,5 IU por dose unitária.
3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da quantidade do dito adjuvante PIKA estar entre 500 μg a 4000 μg por dose unitária, de preferência, de 1000 μg a 3000 μg, preferivelmente, de 1500 μg a 2500 μg, mais preferencialmente, 2000 μg por dose unitária.
4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da quantidade do dito HSA ser selecionada a partir da faixa entre quaisquer dois dos valores seguintes: 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6% por concentração.
5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da proporção de IPRV ao adjuvante PIKA ser selecionada a partir do grupo que consiste: l IU/100 μg, l IU/125 μg, l IU/200 μg, l IU/250 μg, l IU/300 μg, l IU/350 μg, l IU/400 μg, l IU/450 μg, l IU/500 μg, l IU/550 μg, l IU/600 μg, l IU/700 μg, l IU/800 μg, l IU/1000 μg, l IU/1500 μg, l IU/2000 μg e a relação entre quaisquer duas proporções a seguir: l IU/100 μg, l IU/125 μg, l IU/200 μg, l IU/250 μg, l IU/300 μg, l IU/350 μg, l IU/400 μg, l IU/450 μg, l IU/500 μg, l IU/550 μg, l IU/600 μg, l IU/700 μg, l IU/800 μg, l IU/1000 μg, l IU/1500 μg, l IU/2000 μg, opcionalmente, a proporção do IPRV ao adjuvante PIKA ser de l IU/550 μg.
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato da quantidade de IPRV ser 2,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA ser de 1000 μg por dose unitária.
7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato da quantidade de IPRV ser de 2,0 IU por dose unitária, a quantidade do adjuvante PIKA ser de 2000 μg por dose unitária e a quantidade de HSA ser de 0,3% por concentração.
8. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato da quantidade de IPRV ser de 1,5 IU por dose unitária, a quantidade do adjuvante PIKA ser de 2000 μg por dose unitária e a quantidade de HSA ser de 0,3% em concentração.
9. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato da quantidade de IPRV ser de 4,0 IU por dose unitária e a quantidade do adjuvante PIKA ser de 1000 μg por dose unitária e a quantidade de HSA ser de 0,5% por concentração.
10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da dita composição compreender ainda um tampão farmaceuticamente aceitável e o pH do dito tampão estar entre 7,0 e 8,0.
11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da dita composição ser isenta de gelatina.
12. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato do dito IPRV ser selecionado a partir do grupo que consiste em cepa CTN, a cepa PM, a cepa aG e a cepa PV; opcionalmente, a cepa CTN-1, a cepa Pitman-Moore L503 ou a cepa PV-2061.
13. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato da dita composição estar numa forma líquida, opcionalmente, em solução ou em suspensão.
14. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato da concentração do dito IPRV ser de 0,05 IU/ml a 40,0 IU/ml.
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato da dita dose unitária ser preparada para um volume entre quaisquer dois dos seguintes volumes: consistindo 0,1 ml, 0,15 ml, 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.
16. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato da dita composição estar na forma sólida, opcionalmente, na forma liofilizada.
17. KIT FARMACÊUTICO, caracterizado pelo fato de compreender: a) a composição de vacina antirrábica, conforme definida nas reivindicações 1 a 16; b) um frasco; c) uma bula; e d) opcionalmente, água para a injeção.
18. USO DA COMPOSIÇÃO DE VACINA ANTIRRÁBICA, conforme definida nas reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser utilizado na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da infecção pelo vírus da raiva.
19. USO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de o medicamento ser de via intramuscular, intradérmica, transdérmica, subcutânea, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, inalação, retal, nasal, oral ou via tópica.
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