ITMI20111182A1 - Vaccino per coronavirus canino - Google Patents

Description

“VACCINO PER CORONAVIRUS CANINOâ€

CAMPO DELL’INVENZIONE

Si descrivono l’isolamento di un nuovo ceppo di coronavirus canino pantropico (CCoV) e una composizione immunogenica comprendente il ceppo di CCoV. Il ceppo à ̈ caratterizzato a livello molecolare e biologico, tra l’altro, mediante analisi di sequenza.

SFONDO DELL’INVENZIONE

I coronavirus sono grandi virus a RNA a singolo filamento, dotati di involucro, che causano malattia respiratoria e/o enterica nei mammiferi e negli uccelli (18). Nei cani, finora sono stati descritti tre coronavirus. I coronavirus canini (CCoV) di tipo I e di tipo II sono virus enterici appartenenti al gruppo antigenico 1 (13), mentre il coronavirus respiratorio canino (CRCoV), riportato la prima volta in Gran Bretagna da Erles et al. (19), Ã ̈ un coronavirus di gruppo 2 che provoca distress respiratorio specialmente quando associato ad altri patogeni (1, 9).

I CCoV di tipo I e II sono ampiamente distribuiti in Europa (7, 14) e di solito sono responsabili della comparsa di una gastroenterite da blanda a moderata nei cuccioli, anche se può verificarsi il decesso in conseguenza di infezioni concomitanti da parte di entrambi i genotipi (5) o da parte di altri patogeni (3-11). Le singole infezioni da CCoV sono generalmente ristrette al tratto gastroenterico, conducendo alla comparsa di anoressia, diarrea e vomito (Tennant et al., 1991).

Per via delle diffuse infezioni associate a CCoV, à ̈ sentita la necessità di disporre di vaccini capaci di proteggere contro le infezioni da CCoV nei canidi.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce a un coronavirus pantropico canino (CCoV) isolato che non esprime una proteina accessoria 3c funzionale. Più precisamente, il ceppo di CCoV non esprime neppure una proteina accessoria 3b funzionale. In una forma di realizzazione dell’invenzione, il ceppo di CCoV isolato comprende un polinucleotide isolato avente almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare. In un’altra forma di realizzazione, il ceppo di CCoV à ̈ inattivato mediante trattamento chimico o al calore. In un’altra forma di realizzazione, il ceppo di CCoV à ̈ attenuato. In un’altra forma di realizzazione, il CCoV isolato comprende SEQ ID NO: 5.

La presente invenzione rende inoltre disponibile un polinucleotide isolato derivante da un coronavirus canino (CCoV), in cui detto polinucleotide isolato presenta almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare. Più in particolare, detto polinucleotide non codifica per una proteina accessoria 3c funzionale. In un’altra forma di realizzazione, detto polinucleotide non codifica per una proteina accessoria 3b funzionale. In un’altra forma di realizzazione, il polinucleotide isolato consiste in SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare.

In un’altra forma di realizzazione la presente invenzione si riferisce a un polipeptide isolato derivante da un CCoV o una pluralità di polipeptidi codificati da un polinucleotide avente almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1. Più in particolare, il polinucleotide non comprende il polinucleotide del ceppo CB/05. In un’altra forma di realizzazione, detto polipeptide presenta almeno il 95% di omologia con una qualunque di SEQ ID NO: da 2 a 10. Più in particolare, detto polipeptide à ̈ scelto tra una qualunque di SEQ ID NO: 4 o 5. Più particolare ancora, detto polipeptide à ̈ SEQ ID NO: 5.

In un’altra forma di realizzazione la presente invenzione si riferisce a una composizione immunogenica comprendente almeno uno tra: (a) il polinucleotide, il polipeptide o il coronavirus canino (CCoV) isolato qui descritto; un eccipiente, diluente, proteina di trasporto o coadiuvante farmaceuticamente accettabile. In un’altra forma di realizzazione, la composizione immunogenica comprende una forma inattivata o attenuata del coronavirus canino (CCoV) isolato. In un’altra forma di realizzazione, la composizione immunogenica comprende un polipeptide isolato derivante da un CCoV o una pluralità di polipeptidi codificati da un polinucleotide avente almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1, in cui detto(i) polipeptide(i) à ̈(sono) antigeni a subunità del CCoV isolato. In un’altra forma di realizzazione, la composizione non comprende una proteina accessoria 3c. In un’altra forma di realizzazione, la composizione non comprende una proteina accessoria 3b.

Un’altra forma di realizzazione l’invenzione si riferisce a una composizione immunogenica come descritto in precedenza, per l’uso nel trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus in un cane. Un’altra forma di realizzazione dell’invenzione si riferisce all’uso della composizione immunogenica nella preparazione di un medicamento per il trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus in un cane. Un’altra forma di realizzazione dell’invenzione si riferisce a un metodo di trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus in un cane e comprende la somministrazione della composizione immunogenica in una quantità efficace per generare una risposta immunogenica nel cane.

Un’altra forma di realizzazione dell’invenzione si riferisce a un vaccino per coronavirus canino (CCoV) comprendente almeno uno tra: (a) un polinucleotide descritto in precedenza, (b) il polipeptide descritto in precedenza e/o (3) il ceppo di coronavirus canino (CCoV) isolato descritto in precedenza.

Queste e altre forme di realizzazione, caratteristiche e vantaggi dell’invenzione diventeranno evidenti dalla descrizione dettagliata e dalle rivendicazioni allegate esposte più avanti.

BREVE DESCRIZIONE DELLA FIGURA

La figura illustra le relazioni filogenetiche del nuovo ceppo di CCoV qui descritto. A livello filogenetico, il ceppo 450/07 era nello stesso cluster del ceppo CB/05 in entrambe le sequenze proteiche S e M/N, anche se una stretta correlazione con ceppi di CCoV/TGEV ricombinanti (CCoV-IIb) rilevati di recente era pure evidente nelle sequenze M/N.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

Nel 2005, una variante pantropica di CCoV (ceppo CB/05) à ̈ stata isolata dagli organi interni di alcuni cuccioli morti (2) e il virus à ̈ stato classificato come biotipo ipervirulento di CCoV-II, condividendo con i ceppi di riferimento appartenenti a questo genotipo un grado elevato di omologia genetica (9-12). Alcune sostituzioni aa nella proteina S, inclusa una mutazione da Asp/His ad Asn a livello del residuo 125, e una delezione di 38 nt in ORF3b sono state proposte come potenziali marcatori per l’elevata patogenicità del ceppo CB/05 (9-12). È stato dimostrato che l’isolato virale soddisfa il postulato di Koch attraverso l’infezione sperimentale di cuccioli sieronegativi per CCoV, che esibivano segni clinici gravi, tra cui una marcata linfopenia, e mortalità (13). In un esperimento successivo, à ̈ stato osservato un riscontro sorprendente. Di fatto, cani sieropositivi guariti da una recente infezione causata da un ceppo di CCoV enterotropico erano suscettibili a una successiva stimolazione sperimentale con ceppo CB/05, mostrando segni clinici blandi e linfopenia (14). Ciò può spiegare la limitata protezione crociata contro la variante pantropica di CCoV enterico e, di conseguenza, dei vaccini per CCoV attualmente disponibili che sono preparati con ceppi enterici.

Con la presente invenzione, abbiamo isolato un nuovo ceppo di CCoV pantropico dai polmoni di un cucciolo che era morto in seguito a malattia sistemica. Il virus à ̈ stato caratterizzato a livello genetico, evidenziando una stretta correlazione (più del 99% di identità aa) rispetto al ceppo prototipico CB/05 in tutte le proteine codificate dall’estremità 3’ del genoma virale. L’amminoacido 125 della proteina S esibiva un residuo di Asn esattamente come il ceppo CB/05 e la delezione di 38 nt in ORF3b à ̈ stata pure confermata, ma il nuovo ceppo evidenziava una delezione aggiuntiva di 164 in ORF3c che verosimilmente impediva la sintesi della proteina accessoria codificata. Si ritiene che i geni delle proteine accessorie di coronavirus siano superflui per la replicazione in vitro, ma essi sono strettamente mantenuti durante l’infezione degli ospiti naturali (26). In entrambi i ceppi pantropici di CCoV, la proteina accessoria 3b era troncata (22 invece di 71 aa codificati dallo stesso gene degli altri CCoV) e in quello più recente (450/07) era improbabile la sintesi del prodotto di ORF3c per via della presenza di un codone di stop precoce nell’estremità 5’ del gene. È stato proposto che delezioni simili nei geni delle proteine accessorie di coronavirus felini svolgano un certo ruolo nella virulenza potenziata evidenziata dal virus della peritonite infettiva felina di biotipo ipervirulento (21). La stretta correlazione genetica osservata tra i ceppi CB/05 e 450/07 à ̈ compatibile con l’ipotesi che il nuovo ceppo à ̈ un discendente diretto del virus prototipico. Ceppi di CCoV-II enterotropici geneticamente correlati a CB/05 sono stati rilevati in anni recenti, ma nessuno di loro evidenziava delezioni in geni di proteine accessorie (9-12). Pertanto, il ceppo 450/07 può aver avuto origine dal virus prototipico attraverso una delezione aggiuntiva di 164 nt in ORF3c.

A livello biologico, gli isolati CB/05 e 450/07 erano entrambi in grado di infettare i cuccioli e di diffondersi nei loro organi interni, causando malattia sistemica e linfopenia. Tuttavia, nonostante la loro stretta correlazione genetica, i due virus mostravano gradi differenti di patogenicità. In condizioni sperimentali, il virus prototipico causava una forma grave di malattia, con il decesso di due dei cinque cuccioli infettati, mentre il nuovo ceppo induceva solo segni clinici da blandi a moderati nella maggior parte dei cuccioli stimolati. Fatto importante, la linfopenia era più marcata nei cuccioli infettati con il ceppo CB/05 (raggiungendo conte linfocitarie inferiori al 60% del valore basale in tutti gli animali) rispetto a quelli stimolati con il nuovo ceppo pantropico che evidenziava una riduzione evidente delle conte linfocitarie solo in alcuni cuccioli. In più, in confronto al ceppo CB/05, i reperti post-mortem indotti dal nuovo virus erano meno gravi e persino i titoli di RNA virale nelle feci e negli organi interni erano più bassi. Questo comportamento può suggerire un potenziale patogeno del ceppo 450/07 più basso rispetto all’isolato pantropico prototipico. L’isolamento di un nuovo ceppo di CCoV pantropico da un cucciolo morto à ̈ degno di nota da un punto di vista epidemiologico dato che sembra suggerire che questa variante à ̈ circolante nei cani. Il pantropismo e il comportamento linfopenico del ceppo CB/05 sono stati dimostrati (anche se in misura minore) anche per il nuovo isolato 450/07 e questo comportamento biologico à ̈ stato provvisoriamente associato con alcune variazioni genetiche uniche (presenza di Asn a livello del residuo 125 della proteina spike). La circolazione di un cluster di CCoV con atteggiamento pantropico e linfopenico evidenzia l’esigenza di sviluppare vaccini omologhi sulla base della scarsa protezione crociata indotta da CCoV enterico (14).

Pertanto una forma di realizzazione della presente invenzione si riferisce a un vaccino o composizione immunogenica comprendente un ceppo di CCoV che non esprime una proteina accessoria 3c funzionale. Un’altra forma di realizzazione si riferisce a un coronavirus canino isolato (CCoV) che non esprime una proteina accessoria 3c funzionale. Più in particolare, il CCoV isolato comprende un polinucleotide avente almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare. In un’altra forma di realizzazione, il CCoV isolato comprende un polipeptide avente SEQ ID NO: 5. In un’altra forma di realizzazione, il CCoV isolato comprende un polipeptide avente SEQ ID NO: 4. In un’altra forma di realizzazione, il CCoV isolato comprende un polipeptide avente una qualunque di SEQ ID NO: 2 o da 6 a 10. In un’altra forma di realizzazione, il CCoV isolato à ̈ inattivato mediante trattamento chimico o al calore, attenuato oppure à ̈ in forma di subunità purificata.

Un’altra forma di realizzazione della presente invenzione si riferisce a un polinucleotide isolato derivante da un coronavirus canino (CCoV), in cui detto polinucleotide isolato presenta almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare. In un’altra forma di realizzazione, detto polinucleotide non codifica per una proteina accessoria 3c funzionale. In un’altra forma di realizzazione, detto polinucleotide non codifica per una proteina accessoria 3b funzionale.

In un’altra forma di realizzazione, detto polinucleotide consiste in SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare.

Un’altra forma di realizzazione della presente invenzione si riferisce a una composizione comprendente un polipeptide isolato di SEQ ID NO: 5.

Un’altra forma di realizzazione si riferisce a una composizione immunogenica comprendente almeno uno tra: (a) il coronavirus canino isolato (CCoV); (b) il polinucleotide isolato; e/o (c) il polipeptide come descritto qui; e un eccipiente, diluente, proteina di trasporto o coadiuvante farmaceuticamente accettabile.

In un’altra forma di realizzazione, la composizione immunogenica à ̈ per l’uso nel trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus in un cane. Un’altra forma di realizzazione si riferisce all’uso della composizione immunogenica nella preparazione di un medicamento per il trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus in un cane. Un’altra forma di realizzazione si riferisce a un metodo di trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus in un cane, che comprende la somministrazione della composizione immunogenica in una quantità efficace per generare una risposta immunogenica nel cane.

Infine, un’altra forma di realizzazione si riferisce a un vaccino per coronavirus canino (CCoV) comprendente (a) il coronavirus canino isolato (CCoV); (b) il polinucleotide isolato; e/o (c) il polipeptide come descritto qui.

Acronimi e Definizioni

I seguenti acronimi e definizioni sono usati in tutta la domanda, a meno che indicato altrimenti In conformità con questa descrizione dettagliata, si applicano le seguenti abbreviazioni e definizioni. Va notato che come usato qui, le forme singolari “un†, “uno/una†e “il/lo/la†includono riferimenti plurali a meno che il contesto indichi chiaramente il contrario. Pertanto, per esempio, un riferimento a “un anticorpo†include una pluralità di tali anticorpi, e un riferimento a “il dosaggio†include il riferimento a uno o più dosaggi e loro equivalenti noti agli esperti del settore, e così via.

Acronimi

aa amminoacido

CaHV herpesvirus di canide

CCoV coronavirus canino

CDV virus del cimurro canino

CPE effetto citopatico

CPV parvovirus canino

CRM197Cross-Reactive Material 197 (gly52glu) di tossoide difterico

D-MEM terreno Dulbecco’s Minimal Essential Medium EDTA etilenediamminotetraacetato

FCA coadiuvante completo di Freund

IFA coadiuvante incompleto di Freund

h ora

i.m. intramuscolare

IF immunofluorescenza

i.p. intraperitoneale

e.v. endovenoso

IgG immunoglobulina G

ISCOM complessi immunostimolanti

KLH emocianina di Megathura crenulata (“keyhole limpet†) KMUA acido N-k-maleimidoundecanoico

KMUS (N-[k-maleimidoundecanoilossi]sulfosuccinimide estere) L liquido

LPS lipopolisaccaride

LT tossina termolabile

MDP muramil dipeptide, noto anche come N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutammina

min minuti

NO non osservato

orf fase di lettura aperta

p.o. per via orale

PBS soluzione salina tamponata con fosfato

PBST PBS con Tween 20

poli rA:poli rU complesso di acido poli-adenilico-poli-uridilico POP-POE poliossipropilenepoliossietilene

PT tossina della pertosse

RAS sistema coadiuvante Ribi<TM>

RPM giri al minuto

s.c. sottocutaneo

TCID50 dose infettiva mediana per coltura tessutale

TGEV coronavirus della gastroenterite trasmissibile (ceppo Purdue)

TNF fattore di necrosi tumorale

WBC globuli bianchi

wk settimana

wt penso

Definizioni

A meno che non sia definito diversamente, tutti i termini tecnici e scientifici usati qui hanno lo stesso significato di quanto comunemente inteso da un ordinario esperto del settore. I seguenti termini sono forniti qui di seguito.

Una “composizione immunogenica†à ̈ una preparazione contenente un immunogeno, tra cui, per es., una proteina, un peptide, una cellula intera, un virus inattivato, a subunità o attenuato, o un polisaccaride, o una combinazione di questi, somministrata per stimolare il sistema immunitario umorale e quello cellulare del ricevente nei confronti di uno o più degli antigeni presenti nella composizione immunogenica. “Immunizzazione†à ̈ il processo di somministrare una composizione immunogenica e stimolare una risposta immunitaria o immunogenica nei confronti di un antigene in un ospite. Ospiti preferiti sono mammiferi, per esempio cani.

Una “risposta immunitaria†si riferisce alle attività del sistema immunitario, tra cui attivazione e proliferazione di specifiche cellule T citotossiche e cellule B risultando in una produzione anticorpale antigene-specifica, dopo contatto con un antigene.

Un “antigene†à ̈ un qualunque agente, per es., una proteina (o frammenti immunogenici di proteine come per esempio un frammento di una proteina di adesione), un peptide o coniugato peptidico, immunogeno, o un polisaccaride, che suscita una risposta immunitaria. In questo caso, l’antigene comprende preferibilmente un antigene di coronavirus. La composizione immunogenica può comprendere uno o più antigeni o immunogeni di coronavirus.

Una “dose unitaria†à ̈ una concentrazione o quantità definita e predeterminata della composizione immunogenica che à ̈ sicura e in grado di suscitare una risposta immunitaria nel ricevente.

Il termine “subunità†si riferisce a una sospensione di materiali antigenici che à ̈ separata dall’organismo ospite virulento.

Il termine “terapeutico†come usato qui significa un trattamento e/o una profilassi. Un effetto terapeutico si ottiene mediante soppressione, remissione, prevenzione o eradicazione di uno stato di malattia causato da CCoV.

Il termine “quantità efficace†come usato qui significa una quantità che à ̈ determinata da valutazioni conosciute nel settore per la vaccinazione e/o il trattamento di infezioni da coronavirus (per es., infezioni da CCoV), in cui per efficace si intende fornire sollievo misurabile in soggetti trattati, per esempio miglioramenti tra cui, ma senza limitarsi a, tasso di sopravvivenza migliorato, recupero più rapido, miglioramento o eliminazione di sintomi, riduzione di complicanze post-infettive e, ove appropriato, titolo anticorpale o titolo incrementato contro l’agente infettivo, e altre misure come noto agli esperti del settore (per es., misurate attraverso un campione di sangue).

Il termine “isolato†si riferisce a una sostanza che à ̈ o in forma sostanzialmente pura, per esempio, superiore a circa il 95% di purezza; o purificata in qualche maniera dal proprio ambiente naturale. Un ceppo “isolato†(per es. di CCoV) indica un ceppo che à ̈ rimosso dal proprio ambiente naturale, come per esempio da un ospite animale/cane, e/o in un terreno di crescita. Il termine “isolato†abbraccia immunogeni o ceppi di CCoV che sono in soluzione con altri agenti/diluenti/eccipienti/coadiuvanti.

Somministrazione “parenterale†di una composizione immunogenica include, per es., tecniche di iniezione o di infusione sottocutanea (s.c.), endovenosa (e.v.), intramuscolare (i.m.) o intrasternale.

“Farmaceuticamente accettabile†significa un materiale che non à ̈ biologicamente o altrimenti indesiderabile, vale a dire il materiale può essere somministrato a un soggetto senza causare effetti biologici inaccettabili (ossia il decesso) o interagire in maniera deleteria con una qualunque delle altre componenti della composizione in cui esso à ̈ contenuto.

Con “coadiuvante†si intende una sostanza che serve per potenziare l’immunogenicità di una composizione immunogenica. Pertanto, i coadiuvanti sono spesso somministrati per aumentare la risposta immunitaria e sono ben noti nel settore. Le caratteristiche desiderabili dei coadiuvanti includono: (1) mancanza di tossicità; (2) capacità di stimolare una risposta immunitaria di durata prolungata; (3) semplicità di preparazione e stabilità di conservazione a lungo termine; (4) capacità di suscitare sia immunità cellulo-mediata (CMI) che risposta immunitaria umorale (HIR) nei confronti di antigeni somministrati tramite varie vie, se necessario; (5) sinergia con altri coadiuvanti; (6) capacità di interagire selettivamente con popolazioni di cellule presentanti antigene; (7) capacità di suscitare specificamente opportune risposte immunitarie specifiche per cellule Th1 o Th2; e (8) capacità di incrementare livelli isotipici anticorpali appropriati (per es., IgA) contro antigeni.

Pertanto, le composizioni immunogeniche come qui descritte comprendono inoltre, in certe forme di realizzazione, uno o più coadiuvanti. Un coadiuvante à ̈ una sostanza che potenzia la risposta immunitaria quando somministrato insieme con un immunogeno o un antigene. È stato mostrato che un certo numero di citochine o linfochine presenta attività immunomodulante, e pertanto esse sono utili come coadiuvanti, tra cui, ma senza limitarsi a, le interleuchine 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (si veda, per es., il brevetto U.S. n. 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e le sue forme mutanti); gli interferoni -α, -β e -γ; il fattore di stimolazione delle colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) (si veda, per es., il brevetto U.S. n. 5,078,996 e numero di accesso ATCC 39900); il fattore di stimolazione delle colonie di macrofagi (M-CSF); il fattore di stimolazione delle colonie di granulociti (G-CSF); e i fattori di necrosi tumorale α e β. Altri coadiuvanti utili per le composizioni immunogeniche descritte qui includono chemiochine, tra cui senza limitazione, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, e RANTES; molecole di adesione, come per esempio una selectina, per es., la L-selectina, la P-selectina e l’E-selectina; molecole simili a mucina, per es., CD34, GlyCAM-1 e MadCAM-1; un membro della famiglia delle integrine come per esempio LFA-1, VLA-1, Mac-1 e p150.95; un membro della superfamiglia delle immunoglobuline come per esempio PECAM, le ICAM, per es., ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3; molecole costimolatorie come per esempio CD40 e CD40L; fattori di crescita tra cui il fattore di crescita vascolare, il fattore di crescita nervosa, il fattore di crescita dei fibroblasti, il fattore di crescita dell’epidermide, B7.2, PDGF, BL-1 e il fattore di crescita vascolare endoteliale; molecole recettoriali tra cui Fas, il recettore di TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, e DR6; e caspasi (ICE).

Opportuni coadiuvanti usati per potenziare ulteriormente una risposta immunitaria includono, senza limitazione, MPLâ„¢ (3-O-deacilato monofosforil lipide A, Corixa, Hamilton, MT), che à ̈ descritto nel brevetto U.S. n. 4,912,094. Ugualmente adatti per l’uso come coadiuvanti sono analoghi sintetici di lipide A o composti di amminoalchilglucosamina fosfato (AGP), o derivati o analoghi di questi, che sono disponibili da Corixa (Hamilton, MT) e che sono descritti nel brevetto statunitense n. 6,113,918. Un tale AGP à ̈ 2-[(R)-3-tetradecanoilossitetradecanoilammino]etil 2-deossi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiossitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoilossitetradecanoil-ammino]-b-D-glucopiranoside, noto anche come 529 (già noto come RC529). Questo coadiuvante 529 à ̈ formulato come forma acquosa (AF) o come emulsione stabile (SE).

Altri coadiuvanti includono muramilpeptidi, per esempio N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutammina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanin-2-(1’-2’ dipalmitoil-sn-glicero-3-idrossifosforilossi)-etilammina (MTP-PE); emulsioni di olio in acqua, come per esempio MF59 (pubblicazione PCT internazionale n. WO 90/14837) (contenente squalene 5%, Tween 80 0,5%, e Span 85 0,5% (facoltativamente contenente varie quantità di MTP-PE) formulato in particelle submicroniche usando un microfluidizzatore come per esempio il Model 110Y Microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA)), e SAF (contenente squalene 10%, Tween 80 0,4%, polimero pluronico a blocchi L121 5% e thr-MDP, o microfluidizzato in un’emulsione submicronica o vortexato per generare un’emulsione con grandezza delle particelle più ampia); coadiuvante incompleto di Freund (IFA); sali di alluminio (allume), come per esempio idrossido di alluminio, fosfato di alluminio, solfato di alluminio; Amphigen; Avridine; L121/squalene; D-lattide-polilattide/glicoside; polioli pluronici; Bordetella uccisa; saponine, come per esempio Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descritto nel brevetto U.S. n. 5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descritto nel brevetto U.S. n. 5,254,339, e complessi immunostimolanti (ISCOMS); Mycobacterium tuberculosis; lipopolisaccaridi batterici; polinucleotidi sintetici come per esempio oligonucleotidi contenenti un motivo CpG (per es., brevetto U.S. n. 6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), descritti nei brevetti europei nn. 1,296,713 e 1,326,634; una tossina della pertosse (PT) o suo mutante, una tossina colerica o suo mutante (per es., pubblicazione internazionale PCT nn. WO 00/18434, WO 02/098368 e WO 02/098369); o una tossina termolabile di E. coli (LT), particolarmente LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; si veda, per es., le pubblicazioni internazionali PCT nn.

WO 93/13302 e WO 92/19265.

Si possono anche usare proteine di trasporto convenzionali con le composizioni immunogeniche/antigeni/ceppi di CcoV qui descritti. Le proteine di trasporto sono preferibilmente proteine che non sono tossiche e reattogeniche ottenibili in quantità e purezza sufficienti. Le proteine di trasporto dovrebbero essere soggette a procedure di coniugazione convenzionali. In una forma di realizzazione particolare, CRM197à ̈ usata come proteina di trasporto. In altre forme di realizzazione, una proteina di trasporto dell’invenzione à ̈ una C5a peptidasi streptococcica (SCP) enzimaticamente inattiva (per es., una o più delle varianti di SCP descritte nei brevetti U.S. nn. 6,270,775; 6,355,255; e 6,951,653). Altre opportune proteine di trasporto includono tossine batteriche inattivate come per esempio il tossoide del tetano, il tossoide della pertosse, il tossoide del colera (per es., CT E29H, descritto nella pubblicazione internazionale PCT No. WO2004/083251), LT di E. coli, ST di E. coli, la proteina DnaK di E. coli e l’esotossina A di Pseudomonas aeruginosa. Si possono usare anche proteine della membrana esterna batterica come per esempio il complesso c della membrana esterna (OMPC), porine, proteine leganti transferrina, la tossina pneumolisina (per es., brevetto U.S. n. 5,565,204), il tossoide della pneumolisina (per es., pubblicazione internazionale PCT n. WO 2005/108580) la proteina A della superficie di pneumococco (PspA), la proteina adesina di pneumococco (PsaA) o la proteina D di Haemophilus influenzae. Si possono usare anche proteine batteriche di shock termico, come per esempio hsp-70 micobatterica. Si possono usare anche altre proteine, come per esempio le proteine SdrG, SitC di Staphilococcus epidermidis e proteine leganti ferrocromo, e le proteine ClfA, ClfB e FnbA di Staphilococcus aureus. Altre proteine ancora, come per esempio l’ovalbumina, l’emocianina di Megathura crenulata (“keyhole limpet “), la glutatione S-trasferasi (GST), l’albumina di siero bovino (BSA), la galattochinasi (galK), l’ubiquitina, la β-galattosidasi, la proteina NS1 influenzale o derivato proteico purificato della tubercolina (PPD) possono essere usate come proteine di trasporto. Si possono usare anche particelle virus-simili, per esempio derivanti da rotavirus VP6 o da batteriofago Qβ.

Un esperto del settore può prontamente selezionare un veicolo appropriato per l’uso in questo contesto. Metodi per accoppiare composti a proteine di trasporto sono noti nel settore. Si veda, per es., ED HARLOW E DAVID LANE, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (1988); e GREG T. HERMANSON, BIOCONJUGATE TECHNIQUES (Academic Press 1996).

Le composizioni descritte possono essere somministrate in una varietà di modi. Occorre notare che la composizione farmaceutica contenente l’immunogeno, o gli immunogeni, può essere somministrata da sola o in combinazione con uno o più veicoli, stabilizzanti, conservanti, coloranti, aromatizzanti ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.

Il CCoV e composizioni correlate descritte possono essere formulati con veicoli ed eccipienti convenzionali, che sono scelti in conformità con la pratica ordinaria. Le formulazioni acquose sono preparate in forma sterile, e quando destinate al rilascio mediante vie diverse dalla somministrazione orale, generalmente sono isotoniche. Tutte le formulazioni contengono facoltativamente eccipienti come quelli forniti per esempio in HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (5<a>ed., Raymond C. Rowe et al., eds., 2006).

Gli eccipienti includono acido ascorbico e altri antiossidanti, agenti chelanti (per es., EGTA ed EDTA), carboidrati (per es., destrina), idrossialchilcellulosa, idrossialchilmetilcellulosa, acido stearico e simili. Il pH delle formulazioni varia da circa 3 a circa 11, ma ordinariamente à ̈ da circa 7 a circa 10.

Esempi di veicoli fisiologicamente accettabili per vie di somministrazione diverse dalla somministrazione orale includono - ma senza limitarsi a - soluzioni saline (per es., soluzione salina normale), soluzione di Ringer, PBS (soluzione salina tamponata con fosfato); polisorbato 80; L-arginina; polivinilpirrolidone; α-D-glucopiranosile; α-D-glucopiranoside (trealosio); e loro combinazioni. Per esempio, può essere presente trealosio nella composizione in una quantità da circa 2 a circa 10% in peso/volume della composizione. In un altro esempio, quando trealosio e polisorbato 80 sono entrambi presenti nella composizione, può essere presente trealosio nella quantità da circa 4 a circa 6% in peso/vol. e il polisorbato 80 può essere presente nella quantità da circa 0,001 a 0,01% (peso/vol.), e generalmente miscele di vari sali fisiologicamente compatibili tra cui sali di potassio o di fosfato con o senza additivi zuccherini (per es., glucosio).

Opportuni eccipienti per l’uso nelle formulazioni immunogeniche sono, per esempio, acqua, soluzione salina, destrosio, glicerolo ed etanolo. Sostanze ausiliarie non tossiche, come per esempio agenti umettanti, tamponi, stabilizzanti o emulsionanti possono essere aggiunti alla composizione.

La somministrazione parenterale, se usata, à ̈ generalmente caratterizzata da iniezione. Iniettabili sterili possono essere preparati in forme convenzionali, o come soluzioni liquide o come sospensioni, forme solide adatte per soluzione o sospensione in liquido prima dell’iniezione, o come emulsioni.

Metodi di trattamento e somministrazione

Per ogni soggetto trattato (“ricevente†), la quantità totale di composizione necessaria per la somministrazione può essere derivata da protocolli per l’immunizzazione. La quantità esatta richiesta per tali composizioni immunogeniche può variare da cane a cane, a seconda della razza, dell’età, del peso e della condizione generale del cane, della sua modalità di somministrazione, se à ̈ somministrata con un altro antigene, coadiuvante e simili. Generalmente, il dosaggio si avvicinerà a quello che à ̈ tipico per la somministrazione di altre composizioni immunogeniche.

La composizione immunogenica à ̈ tipicamente somministrata come composizione sterile. La composizione immunogenica può essere somministrata mediante un qualunque mezzo adatto, per es., per via parenterale (sottocutanea, intramuscolare, endovenosa, intradermica, perilinfatica, intranasale, intrapleurica, intrapolmonare, intratecale ed epidurale) od oralmente. Altre vie includono la rettale, la nasale, l’intranasale, la topica (tra cui boccale e sublinguale) e la vaginale. È evidente che la via preferita può variare con, per esempio, la condizione del ricevente. Una valutazione appropriata del tempo e metodo per il rilascio di composizioni immunogeniche ben rientra nelle competenze del medico/veterinario. Per esempio, la prima dose può essere somministrata alla data scelta e una seconda dose può seguire da svariate settimane a svariati mesi dalla prima dose. Ulteriori dosi di richiamo della composizione immunogenica originale o di forme modificate possono essere somministrate come necessario (per es., annualmente).

Mentre à ̈ possibile che i principi attivi vengano somministrati da soli, può essere preferibile presentarli come formulazioni immunogeniche. Le formulazioni possono includere almeno un principio attivo insieme con un veicolo, eccipienti, coadiuvanti e/o, facoltativamente, altri principi non attivi e/o attivi accettabili.

Le formulazioni includono quelle adatte per le vie di somministrazione precedenti. Le formulazioni possono essere convenientemente presentate in forma a dosaggio unitario e possono essere preparate con uno qualunque dei metodi ben noti nel settore della farmacia. Tecniche e formulazioni sono generalmente reperibili in REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tali metodi includono la combinazione del principio attivo con il veicolo, che costituisce uno o più principi accessori. In generale, le formulazioni sono preparate portando uniformemente e intimamente in associazione il principio attivo con veicoli liquidi o solidi finemente suddivisi o entrambi, e quindi, se necessario, dare forma al prodotto.

La fase oleosa delle emulsioni di questa invenzione può essere costituita da ingredienti noti. Sebbene la fase possa comprendere meramente un emulsionante (altrimenti noto come emulgente), essa comprende desiderabilmente una miscela di almeno un emulsionante con un grasso o un olio o entrambi. Preferibilmente, un emulsionante idrofilo à ̈ incluso insieme con un emulsionante lipofilo, che agisce da stabilizzante. È altresì preferito includere sia un olio sia un grasso.

Emollienti e stabilizzanti di emulsione adatti per l’uso nella formulazione dell’invenzione includono - ma senza limitarsi a - Tween® 60 (così come altri tensioattivi di estere di poliossietilene sorbitano), Span® 80, alcool cetostearilico, alcool benzilico, alcool miristico, gliceril monostearato e sodio laurilsolfato.

Le formulazioni adatte per la somministrazione nasale presentano una grandezza delle particelle, per esempio, nell’intervallo da 0,1 a 500 micron (incluse dimensioni delle particelle in un intervallo tra 0,1 e 500 micron in micron incrementali come per esempio 0,5, 1, 30, 35 ecc.), che si somministra mediante inalazione rapida attraverso il naso. Formulazioni opportune includono soluzioni acquose od oleose del principio attivo. Lo squalene à ̈ un veicolo esemplare.

Formulazioni adatte per la somministrazione parenterale includono soluzioni acquose e non acquose, isotoniche, soluzioni sterili per iniezione che possono contenere antiossidanti, tamponi, batteriostatici e soluti, che rendono la formulazione isotonica con il sangue del ricevente, sospensioni sterili acquose e non acquose che possono includere agenti di sospensione e addensanti.

Le formulazioni sono presentate in contenitori a dosi unitarie o multidose, per esempio, ampolle e fiale sigillate, e possono essere conservate in forma essiccata per congelamento (liofilizzata) che richiede solo l’aggiunta di veicolo liquido sterile, per esempio, acqua per iniezione, immediatamente prima dell’uso. Le soluzioni e sospensioni per iniezione sono preparate da polveri sterili e granuli del tipo descritto di precedenza.

I veicoli veterinari sono materiali utili al fine di somministrare la composizione e possono essere solidi, liquidi o gassosi, purché inerti o accettabili nel settore veterinario e compatibili con il principio attivo. Queste composizioni veterinarie possono essere somministrate per via orale, parenterale o grazie a una qualunque altra via desiderata.

La formulazione della presente invenzione può essere somministrata al cane-paziente in forma iniettabile contenente un qualunque veicolo compatibile, come per esempio vari veicoli, coadiuvanti, additivi e diluenti; oppure i composti utilizzati nella presente invenzione possono essere somministrati per via parenterale al paziente sotto forma di impianti sottocutanei a lento rilascio o di sistemi a rilascio mirato come per esempio matrici polimeriche, liposomi e microsfere. Un impianto adatto per l’uso nella presente invenzione può assumere la forma di un pellet, che si dissolve lentamente dopo essere stato impiantato, o di un modulo di rilascio biocompatibile ben noto agli esperti del settore. Tali forme di dosaggio e moduli ben noti sono disegnati in modo tale che i principi attivi sono rilasciati lentamente nell’arco di un periodo da svariati giorni a svariate settimane.

I composti e le composizioni possono anche essere usati in combinazione con altri principi attivi. Tali combinazioni sono scelte in base alla condizione da trattare, alle reattività crociate dei principi e alle proprietà farmacologiche della combinazione. In più, le composizioni e composti qui descritti possono anche essere somministrati in associazione con altri agenti convenzionali usati per trattare infezioni virali, come per esempio antivirali, antipiretici, immunogeni e analgesici. Questi composti e composizioni possono essere somministrati insieme o nello stesso ciclo di terapia dei composti e composizioni descritte qui. Le singole componenti della combinazione possono essere somministrate o sequenzialmente o simultaneamente in formulazioni farmaceutiche separate o combinate.

Terapie di immunità passiva

Un altro aspetto dell’invenzione sono metodi e composizioni per trattare un soggetto per indurre immunità passiva. Composizioni comprendenti un agente immunoterapico contro infezioni nosocomiali possono essere preparate e somministrate al soggetto animale. Il plasma derivante dall’animale immunizzato à ̈ poi raccolto, e una globulina iperimmune raccolta dal plasma che contiene anti-CCoV e, se inclusi, altri anticorpi anti-proteina veicolo. La globulina iperimmune può essere usata per indurre immunità passiva nei confronti delle infezioni da coronavirus.

Le composizioni immunogeniche sono somministrate a un cane-soggetto per indurre una risposta immunitaria umorale. Il ricevente poi agisce come fonte di immunoglobulina (ossia immunoglobulina iperimmune) che à ̈ prodotta in risposta alla composizione immunogenica. Il cane-soggetto immunizzato dona plasma, da cui la globulina iperimmune à ̈ poi ottenuta mediante, per esempio, tecnologia di frazionamento plasmatico convenzionale. La frazione comprendente anticorpi anti-CCoV può poi essere somministrata a un altro cane-soggetto allo scopo di impartire resistenza contro o per trattare un’infezione da coronavirus canino.

Per una comprensione più chiara, e allo scopo di illustrare più chiaramente l’invenzione, sono esposti qui di seguito specifici suoi esempi. I seguenti esempi sono meramente illustrativi e non vanno intesi come limitanti l’ambito e i principi alla base dell’invenzione in alcun modo.

ESEMPI

A. Caso clinico

Un Miniature Pinscher di 60 giorni di età à ̈ morto evidenziando malattia sistemica caratterizzata da febbre (da 39,5 a 40°C), leucopenia (4,7 × 10<9>cellule/l, intervallo di riferimento da 6 a 17 × 10<9>cellule/l), prevalentemente linfopenia (0,5 × 10<9>cellule/l, intervallo di riferimento da 1,0 a 4,8 × 10<9>cellule/l), letargia, anoressia, vomito e diarrea emorragica. Al cucciolo era stata somministrata,10 giorni prima del decesso, una singola dose di un vaccino contenente parvovirus canino, virus del cimurro canino, adenovirus canino di tipo 2, Leptospira canicola e Leptospira icterohaemorrhagie. Una terapia di supporto con antibiotici (amoxicillina/acido clavulanico) e liquidi (soluzione di Ringer con lattato) non ha sortito alcun miglioramento delle condizioni cliniche che hanno continuato a peggiorare fino al decesso del cucciolo.

L’autopsia ha rivelato lesioni macroscopiche nel tratto alimentare (enterite emorragica), nelle tonsille (aree necrotiche), nei polmoni (polmonite fibrinosa), nel fegato (ingrossamento e aree di necrosi), nella milza (ingrossamento) e nei reni (degenerazione della corteccia). Durante l’esame post-mortem, sono stati raccolti campioni dal cervello, dai polmoni, dalla milza, dal fegato, dai linfonodi mesenterici, dai reni e dal contenuto intestinale.

B. Estrazione di RNA/DNA

Per la purificazione dell’RNA, i campioni di tessuto sono stati omogeneizzati (50% peso/volume) in terreno Dulbecco’s Minimal Essential Medium (D-MEM) usando un Tissue Lyser (QIAGEN S.p.A., Milano, Italia), mentre invece il contenuto intestinale à ̈ stato omogeneizzato (10% peso/volume) in D-MEM vortexando. Dopo una breve centrifugazione a 8000 × g per 3 min, 140 µl dei sopranatanti sono stati sottoposti a estrazione dell’RNA usando il QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN S.p.A.). È stato estratto DNA dai campioni di tessuto e dal contenuto intestinale mediante DNeasy Tissue Kit e QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN S.p.A., Milano, Italia).

C. Indagini virologiche

Contenuto intestinale e campioni tessutali raccolti dal cane morto sono stati testati per la rilevazione molecolare dei principali patogeni virali dei cani, come per esempio CCoV (4, 5), i reovirus (Leary et al., 2002), i rotavirus (20), i calicivirus (24), il parvovirus canino di tipo 2 (CPV-2) (7, 8), gli adenovirus canini di tipo 1 e di tipo 2 (23), il virus del cimurro canino (CDV) (17), l’herpesvirus canino di tipo 1 (CaHV-1) (31).

D. Saggi di RT-PCR in tempo reale per la caratterizzazione di CCoV

La caratterizzazione dei genotipi di CCoV Ã ̈ stata condotta per mezzo di saggi di RT-PCR in tempo reale tipo-specifici (5, 6). Trascrizioni inverse e amplificazioni di PCR in tempo reale sono state condotte come per la rilevazione di CCoV, ma con differenti serie di primer/sonde: la coppia di primer CCoVI-F (CGTTAGTGCACTTGGAAGAAGCT)/CCoVI-R (SEQ ID NO:11) (ACCAGCCATTTTAAATCCTTCA) (SEQ ID NO:12) e la sonda CCoVI-Pb (FAM -CCTCTTGAAGGTACACCAA-TAMRA) (SEQ ID NO:13) sono state usate per la rilevazione di CCoV di tipo I, mentre invece la coppia di primer CCoVII-F (TAGTGCATTAGGAAGAAGCT)/CCoVII-R (SEQ ID NO:14) (AGCAATTTTGAACCCTTC) (SEQ ID NO:15) e la sonda CCoVII-Pb (FAM -CCTCTTGAAGGTGTGCC-TAMRA) (SEQ ID NO:16) sono state impiegate per la rilevazione di CCoV-II. Il profilo termico consisteva in attivazione della iTaq DNA polimerasi a 95°C per 10 min, seguita da 45 cicli di denaturazione a 95°C per 15 s, appaiamento a 53°C (saggio CCoV tipo I-specifico) o 48°C (saggio CCoV tipo II-specifico) per 30 s ed estensione a 60°C per 1 min.

E. Amplificazione e analisi di sequenza dell’estremità 3’ genomica derivante dal campione di polmone CCoV-positivo

L’estremità 3’del genoma del ceppo pantropico di CCoV rilevato nei polmoni à ̈ stata amplificata usando SuperScript<TM>One-Step RT-PCR for Long Templates (Life Technologies, Invitrogen srl, Milano, Italia), come descritto in precedenza (9, 10, 11). Sono stati amplificati sette frammenti parzialmente sovrapposti che abbracciano le ORF 2 (gene S), 3a, 3b, 3c, 4 (gene E), 5 (gene M), 6 (gene N), 7a e 7b. I prodotti amplificati mediante PCR sono stati sequenziati tramite Genome Express (Meilan, Francia) e le sequenze ottenute sono state assemblate e analizzate usando il pacchetto software BioEdit (22) e gli strumenti di analisi dell’NCBI (htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov) e dell’EMBL (http://www.ebi.ac.uk). Sequenze nucleotidiche ottenute in questo studio sono state depositate nella banca dati GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con il numero di accesso GU146061. Le sequenze nucleotidiche (nt) delle differenti ORF sono state convertite in sequenze amminoacidiche (aa), che sono state usate per analisi comparativa con il ceppo pantropico di CCoV prototipico CB/05 (numero di accesso GenBank DQ112226) e con ceppi di coronavirus di riferimento. Le analisi filogenetiche ed evoluzionistiche molecolari sono state condotte usando Mega3 (25). Gli alberi filogenetici, basati sulle proteine S e M-N del ceppo 450/07 sono stati elaborati usando sia metodi Parsimony sia Neighbor-Joining, fornendo un supporto statistico con bootstrap su 1000 replicati.

F. Isolamento virale

Il polmone del cucciolo morto à ̈ stato omogeneizzato (10% peso/volume) in D-MEM con antibiotici (penicillina 5000 UI/ml, streptomicina 2500 µg/ml, amfotericina B 10 µg/ml), e inoculato in cellule di fibroma canino (A-72). Cellule infettate sono state monitorate giornalmente per il verificarsi dell’effetto citopatico (CPE) e, dopo 5 giorni di incubazione, sono state testate per antigene di CCoV tramite un saggio di immunofluorescenza (IF) usando un anticorpo monoclonale avente come bersaglio la proteina N (per gentile concessione del Dr. Gill Chappuis, Merial, Francia).

G. Infezione sperimentale di cani

Nove bracchetti di età da 10 a 11 settimane con profilo anticorpale definito provenienti dalla stessa cucciolata sono stati usati per questo studio di stimolazione dopo un periodo di acclimatazione pari a sette giorni. Lo studio à ̈ stato condotto presso l’unità di isolamento della Clinica degli animali, Facoltà di Medicina Veterinaria di Bari (Italia), secondo le normative sulla salute e benessere degli animali, ed à ̈ stato autorizzato dal Ministero della Salute italiano (autorizzazione n. 57/2006-C). Tutti gli animali erano sieronegativi per CCoV tramite ELISA e mediante test di PCR da tamponi rettali raccolti prima dell’inizio dello studio (giorno -10 e giorno -1). I cani erano inoltre negativi a un test di PCR di disseminazione di CPV da tamponi rettali, ma erano stati vaccinati nel canile contro CPV e testavano positivi per anticorpi sierici per CPV. I cani sono stati alloggiati in gabbie singole in tre stanze separate al loro arrivo per l’acclimatazione e quindi ricollocati al

giorno -3 mediante randomizzazione in due gruppi differenti (T01 e T02,

tabella 1).

Tabella 1. Disegno dello studio: gruppi di trattamento e materiale di

stimolazione

Gruppo di Numero di ID Materiale di trattamento animali dell’animale stimolazione

9315

T01 39317Criolisato di cellule A-9321 72

9316

9318

9320 CCoV 450/07

T02 6 9314 (3<o>passaggio su cellule A-72)

9319

9322

Ciascun cane à ̈ stato alloggiato singolarmente per la somministrazione

della stimolazione e per monitorare i segni clinici. Tutti gli animali sono stati

pesati al giorno di studio -3, -1, 3,e 5. Al giorno di studio 0, i 6 cani del

gruppo di trattamento T02 sono stati stimolati con un volume totale pari a 4

ml (3,0 ml oralmente e 1,0 ml intranasalmente; 0,5 ml per narice) contenente

10<5>TCID50/ml del ceppo 450/07 (3<o>passaggio su cellule A-72). Tre cani di

controllo del gruppo T01 hanno ricevuto lo stesso volume di un criolisato di

cellule A-72 non infettate attraverso la stessa via di somministrazione. Tutti i

cani sono stati monitorati giornalmente per i segni clinici dal veterinario che li

accudiva, a partire dal giorno -1 (prima della stimolazione) e fintanto che gli

animali sono rimasti nello studio. La salute generale di ogni animale à ̈ stata

valutata usando il sistema di punteggio descritto nella tabella 2. I punteggi

sono stati usati per stimare la salute generale dei singoli animali e i loro gruppi di trattamento.

Tabella 2. Sistema di punteggio per le osservazioni della salute generale durante la prova di stimolazione

Parametro Risultato Punteggio Normale 0 Aspetto Depresso/letargico 2 generale Difficoltà respiratorie 3

Decesso 20 Nessuna (<4%): non rilevabile 0 Blanda (4-5%): lieve perdita di elasticità cutanea 1 Moderata (6-8%): ritardo definito di ritorno della

cute in posizione normale; occhi possibilmente affossati nelle orbite; tempo di riempimento 2 Disidratazione capillare leggermente prolungato; possibile secchezza delle membrane mucose

Grave (10-15%): cute distesa che rimane in posizione; tempo di riempimento capillare prolungato; occhi affossati nelle orbite; secchezza

delle membrane mucose possibili segni di shock 3 (frequenza cardiaca aumentata; pulsazioni deboli);

decesso

Nessun segno 0 Morbida 1 Diarrea

Liquida 2

Con presenza di sangue 3

37.0 – 39.4°C 0

<Temperatura>

rettale ≥ 39.5°C<2>

< 37.0°C 3

Perdita di peso 2

<Peso corporeo>Nessuna perdita di peso 1

Guadagno di peso 0

Sono stati raccolti campioni di sangue da ogni cane. Campioni di EDTA-sangue e di siero sono stati raccolti dalla vena giugulare ai giorni di studio -3, 0 (pre-stimolazione), 3 e 5 (giorno dell’autopsia) per le conte complete e differenziali delle cellule ematiche e la rilevazione di anticorpi per CCoV, rispettivamente. Sono state misurate le temperature rettali (°C) all’arrivo, al giorno di studio -3, e quindi giornalmente fino al giorno di studio 5. Tamponi nasali e rettali sono stati raccolti ai giorni di studio -3, -1, 3 e 5.

Cinque giorni dopo la stimolazione, tutti i cani sono stati sedati mediante somministrazione endovenosa di 10 mg/kg di peso corporeo di Zoletil® 100 (Virbac S.r.l., Italia) e sottoposti a eutanasia mediante somministrazione endovenosa di 0,5 ml/kg di peso corporeo di Tanax® (Intervet Italia, Italia). Durante l’autopsia, campioni per l’isolamento virale e la RT-PCR in tempo reale sono stati raccolti dall’intestino tenue, dai linfonodi mesenterici, intermandibolari e popliteali, dal polmone, dal fegato, dalla milza e dal rene. Campioni di tessuto fresco sono stati raccolti in D-MEM e RNA Later Solution (QIAGEN S.p.A.) per l’isolamento virale e i saggi di RT-PCR in tempo reale, rispettivamente, e mantenuti a -70°C fino all’utilizzo.

Campioni di EDTA-sangue e tamponi fecali raccolti intra vitam, così come campioni di tessuto raccolti all’esame autoptico, sono stati testati per CCoV mediante isolamento virale su cellule A-72 (9, 13) e/o tramite RT-PCR in tempo reale (3, 4). Anticorpi per CCoV sono stati ricercati nei campioni di siero tramite ELISA e test di neutralizzazione virale, come descritto in precedenza (29; 13).

RISULTATI

H. Identificazione di un ceppo CB/05-simile in organi interni del cane morto

Il contenuto intestinale e i campioni di tessuto del cane morto (450/07) testavano negativi per tutti i patogeni virali con l’eccezione di CCoV. Mediante RT-PCR in tempo reale (Decaro et al., 2004), la carica più elevata di RNA virale (5,81 x 10<6>RNA copie/µl di stampo) à ̈ stata riscontrata nel campione polmonare, ma il virus à ̈ stato rilevato altresì nel contenuto intestinale (8,57 x 10<5>RNA copie/µl di stampo), nei linfonodi mesenterici (2,31 x 10<5>RNA copie/µl di stampo), nella milza (1,78 x 10<4>RNA copie/µl di stampo), nel fegato (3,43 x 10<3>RNA copie/µl di stampo), nel rene (7,09 x 10<3>RNA copie/µl di stampo). Solo tracce di RNA di CCoV (4,36 x 10<1>copie di RNA/µl di stampo) sono state rilevate nel campione cerebrale. Il virus (ceppo 450/07) à ̈ stato caratterizzato come CCoV-II per mezzo dei saggi TaqMan genotipo-specifici (5, 6).

Il campione polmonare avente il più elevato titolo virale à ̈ stato usato per tentativi di isolamento virale, che avevano già avuto successo al primo passaggio, come confermato dal verificarsi di CPE e dalla colorazione positiva grazie al saggio di IF. Tre passaggi seriali sono stati condotti allo scopo di ottenere uno stock di virus del ceppo 450/07 per l’esperimento di stimolazione, che aveva un titolo pari a 10<5>TCID50/ml di sospensione virale. Lo stock di virus à ̈ stato testato per la presenza di altri patogeni virali del cane e per la sterilità da batteri aerobici e anaerobici, micoplasmi e miceti, e non à ̈ stato rilevato alcun agente contaminante.

L’estremità 3’ del genoma del ceppo 450/07 à ̈ stata amplificata dal materiale polmonare mediante amplificazione di sette frammenti sovrapposti. La sequenza ottenuta era lunga 8618 nt e conteneva l’intera lunghezza delle ORF 2, 3a, 3b, 3c, 4, 5, 6, 7a e 7b. La proteina S (prodotto di ORF2) era lunga 1454 aa esattamente come quella del ceppo prototipico CB/05, con cui il nuovo isolato pantropico era altamente correlato a questo livello (99,5% di identità aa). Un grado elevato di correlazione genetica à ̈ stato riscontrato anche nelle altre proteine strutturali, tra cui le proteine E (82 aa, 100% di identità), M (262 aa, 99,2% di identità) e N (382 aa, 99,7% di identità), codificate dalle ORF 4, 5, e 6, rispettivamente. I prodotti delle ORF 3a (71 aa), 3b (22 aa), 7a (101 aa) e 7b (213 aa) erano intatti rispetto al ceppo prototipico CB/05. La delezione di 38 nt in ORF3b riscontrata nel ceppo CB/05 à ̈ stata rilevata anche nel ceppo 450/07, che esibiva una delezione aggiuntiva di 164 nt in ORF3c. Questa delezione era responsabile di una variazione della fase di lettura (o “frame shift†) e della conseguente introduzione di un codone di stop molto precoce a livello del nt 4824 della regione genomica sequenziata che dovrebbe impedire la sintesi del prodotto di ORF3c.

A livello filogenetico, il ceppo 450/07 era nello stesso cluster del ceppo CB/05 in entrambe le sequenze proteiche S e M/N, anche se una stretta correlazione con ceppi di CCoV/TGEV ricombinanti (CCoV-IIb) rilevati di recente (16) era pure evidente nelle sequenze M/N (figura).

I. Reperti clinici, post-mortem e virologici in cani infettati sperimentalmente

Un sommario dei segni clinici registrati giornalmente à ̈ mostrato nella tabella 3.

Tabella 3. Sommario dei segni clinici osservati ai giorni di studio (D) in cani di controllo (T01) e in cani infettati sperimentalmente con il ceppo 450/07 (T02)

Tutti e sei i cani di T02 e uno dei tre cani di controllo di T01 hanno perso peso al giorno 3 dopo stimolazione in confronto con il loro peso (al basale) al giorno -1 (prima della stimolazione). La temperatura rettale dei cani di T01 e T02 variava tra 37,6°C e 38,9°C dal giorno -8 al giorno 0 prima della stimolazione. Per i cani di T01, la temperatura rettale in seguito a stimolazione variava da 37,6°C a 38,4°C, ma per i cani di T02, l’intervallo dopo stimolazione aumentava per essere tra 37,6°C e 39,5°C. Tuttavia, solo un cane (9319) del gruppo T02 aveva febbre al giorno 4, ma altri tre cani di T02 mostravano un incremento numerico della loro temperatura rettale entro l’intervallo normale dopo stimolazione. Questa variazione di intervallo non era osservata nei cani di controllo di T01. È stato riscontrato che due cani di T02 stimolati con il ceppo 450/07 erano depressi o letargici ai giorni 3 e 4 dopo stimolazione e due cani dello stesso gruppo erano disidratati in modo da blando a severo ai giorni 3 e 4 dopo stimolazione. Feci morbide o diarrea sono state osservate in quattro cani di T02 ai giorni 3 e 4 dopo stimolazione. Tutti e sei i cani di T02 presentavano linfadenomegalia ai giorni 3, 4 o 5 in uno dei cani (9322), ai giorni 4 e 5 su due cani (9314 e 9319) e al giorno 5 negli altri tre cani. Il cane 9322 mostrava inoltre secrezione nasale ai giorni 0, 1 e 4 dopo stimolazione e il cane 9314 mostrava diminuito riempimento capillare e pallore della mucosa al giorno 5. Sulla base del sistema di punteggio riportato in tabella 2, due dei tre cuccioli di controllo avevano un punteggio clinico pari a zero poiché non mostravano alcun segno clinico. Uno dei cani di T01 ha perso peso ai giorni 3 e 5 dopo stimolazione ma non ha mostrato nessun altro sintomo. Questo cucciolo aveva perciò un punteggio pari a 4 con il suo gruppo mostrando un punteggio medio pari a 1,3. Tuttavia, tutti e sei i cuccioli del gruppo T02 mostravano una varietà di segni clinici, che sono perdurati tra uno e tre giorni e perciò i loro punteggi variavano da 2 a 19 (media 5,7).

È stata fatta una media delle conte linfocitarie al giorno -3 e al giorno 0 e delle conte di WBC per µl, che sono state usate come livelli basali per un confronto con i livelli post-stimolazione a 3 giorni. Le conte linfocitarie diminuivano ≥ 30% in cinque cani di T02, ma almeno del 30% nel resto dei cani di T02 e T01. Le conte di WBC sono diminuite ≥30% in quattro dei sei cani di T02, ma almeno del 30% nel resto dei cani di T02 e in tutti i cani di controllo (T01) (tabella 4). La riduzione delle conte linfocitarie à ̈ stata particolarmente drastica per il cane 9322 (75% rispetto ai valori basali), che era quello che ha iniziato a mostrare segni clinici prima e che presentava anche i segni clinici più gravi.

Tabella 4. Percentuale di riduzione delle conte linfocitarie e di WBC al giorno 3 dopo stimolazione in cani di controllo (T01) e in cani infettati sperimentalmente con il ceppo 450/07 (T02)

Media Media Gruppo di ID del % di riduzione del % di riduzione del trattamento cane linfocitaria gruppo di WBC gruppo (%) (%)

9315 6 2

T01 9317 2 6.3 0 12

9321 11 22

9316 40 20

9318 22 39

9320 54 52

T02 48.6 33.83

9322 75 37

9319 47 32

9314 54 23

All’autopsia, quattro cuccioli infettati evidenziavano enterite da blanda a severa in uno o più segmenti intestinali e cinque presentavano ingrossamento dei linfonodi mesenterici, che erano congestionati e con emorragie sparse (tabella 5). Splenomegalia e coinvolgimento di linfonodi poplitei e/o intermandibolari si osservavano in uno (9314) e due cuccioli (9314 e 9322), rispettivamente. Congestione polmonare ed emorragie sul timo erano rilevati solo nel cucciolo 9314, mentre invece in quattro cuccioli era presente abbondante liquido addominale. Di conseguenza, un campione di timo e aliquote del liquido addominale sono stati pure raccolti dalle lesioni.

Tabella 5. Sommario dei reperti post-mortem e rilevazione virale in campioni tessutali di cani di controllo (T01) e di cani infettati sperimentalmente con il ceppo 450/07 (T02)<a>

Gr ID

di del Altri LN Fegato Polmone Milza Rene Duodeno Digiuno Ileo Liquido a<Timo>entericitr. cane LNmesdominare

9315Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg NC NC

T01 9317Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg NC NC

9321Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg NC NC NegPosNeg Neg Neg

<1.68 x>3.93 x9316 Neg 3 (c) Neg Neg Neg<1 Neg Neg>9.02

10<0 (c)>x

10 10<NC NC>

9318Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg<(c)>NC

<9.08 x (c)>9320 Neg 102 (c) Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg NegNC

8.84 x

9314 10<2>7.29 x 2.61 x x 1.22 x 10<5 (b, c)>10<2>7.06 x

10<1 (c)>9.35 x<eg>7.41 x 5.93 x

<2 (c) N 6 (b)>2.16

10<6 (b, c) NC>

T02 (P)<(c)>1010<5 (b)>1010<2>

9319 N<2.80 x>2.01 x 6.11 x 2 x 2.00 x 2 xeg<1 N>10<eg>10<1>2.9 9 x

106 (b, c)10<2>1.7

10<0 (c)>2.86 x

10<4 (c)>4.9<C>10<5 (b, c) 2 (c) N>10

4.31 x

9322 10<2>4.17 x

<6 (b, c 0 Neg>1.5 x

<0>1<Neg e>2.45 x<N g (c)>10 1010<2 (c)>3.33

<2 (c>x

<) Neg>NC<(c)>10<)>6.93 x

10(P)

LN, linfonodo(i); P, popliteo; Neg, negativo; NC, non raccolto.

<a>I titoli di CCoV sono espressi come i numeri di copie di RNA per µl di stampo.

<b>Tessuti che testavano positivi mediante isolamento virale.

<c>Tessuti che evidenziavano lesioni macroscopiche all’esame post-mortem.

Tramite RT-PCR in tempo reale, tre cuccioli di T02 stavano secernendo virus ai giorni 3 e/o 5 nelle loro feci, con titoli variabili da 2,75 x 10<3>a 1,07 x 10<7>copie di RNA di CCoV per µl di stampo, e l’RNA virale à ̈ stato rilevato in un solo campione di sangue del giorno 5 di un cucciolo di T02 (titolo pari a 5,73 x 10<1>copie DNA per µl di stampo). Come atteso sulla base delle cariche virali, CCoV era isolato solo da un tampone rettale del giorno 3 dal cucciolo numero 9314 del gruppo T02. Svariati tessuti raccolti da cinque cuccioli infettati testavano positivi mediante RT-PCR in tempo reale, con i titoli più elevati essendo rilevati nei tessuti linfoidi (tabella 5). CCoV à ̈ stato isolato dai linfonodi mesenterici in tre cani, dal duodeno e dal digiuno in un cane e dall’ileo in due cani di T02. Né i tamponi nasali derivanti da cani di T02 né alcun campione derivante da cani di T01 testavano positivo per CCoV mediante RT-PCR in tempo reale o isolamento virale.

Sia mediante ELISA che test VN, non à ̈ stata rilevata sieroconversione contro CCoV in nessuno dei cani di controllo o di quelli stimolati.

I seguenti riferimenti bibliografici, discussi in parte rilevante supra, sono qui incorporati come riferimento come se esposti qui per intero.

BIBLIOGRAFIA

(1) Buonavoglia, C. & Martella, V. (2007). Canine respiratory viruses. Vet Res 38, 355-373.

(2) Buonavoglia, C., Decaro, N., Martella, V., Elia, G., Campolo, M., Desario, C., Castagnaro, M., & Tempesta, M. (2006). Canine coronavirus highly pathogenic for dogs. Emerg Infect Dis 12, 492-494.

(3) Decaro N., Camero M., Greco G., Zizzo N., Tinelli A., Campolo M., Pratelli A. & Buonavoglia C. (2004a). Canine distemper and related diseases: report of a severe outbreak in a kennel. New Microbiol 27, 177-182.

(4) Decaro, N., Pratelli, A., Campolo, M., Elia, G., Martella, V., Tempesta, M. & Buonavoglia, C. (2004b). Quantitation of canine coronavirus RNA in the faeces of dogs by TaqMan RT-PCR. J Virol Methods 119, 145-150.

(5) Decaro, N., Elia, G., Martella, V., Desario, C., Campolo, M., Di Trani, L., Tarsitano, E., Tempesta, M. & Buonavoglia, C. (2005a). A real-time PCR assay for rapid detection and quantitation of canine parvovirus type 2 DNA in the feces of dogs. Vet Microbiol 105, 19-28.

(6) Decaro, N., Martella, V., Ricci, D., Elia G, Desario C, Campolo M, Cavaliere N, Di Trani L, Tempesta M. & Buonavoglia C. (2005b). Genotype-specific fluorogenic RT-PCR assays for the detection and quantitation of canine coronavirus type I and type II RNA in faecal samples of dogs. J Virol Methods 130, 72-78.

(7) Decaro N., Elia G., Martella V., Campolo M., Desario C., Camero M., Cirone F., Lorusso E., Lucente M.S., Narcisi D., Scalia P. & Buonavoglia C. (2006a). Characterisation of the canine parvovirus type 2 variants using minor groove binder probe technology. J Virol Methods 133, 92-99.

(8) Decaro, N., Martella, V., Desario, C., Bellacicco, A.L., Camero, M., Manna, L., D’aloja, D. & Buonavoglia, C. (2006b). First detection of canine parvovirus type 2c in pups with haemorrhagic enteritis in Spain. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 53, 468-472.

(9) Decaro, N., Campolo, M., Elia, G., Buonavoglia, D., Colaianni, M.L., Lorusso, A., Mari, V. & Buonavoglia C. (2007a). Infectious canine hepatitis: An "old" disease reemerging in Italy. Res Vet Sci 83, 269-273.

(10) Decaro N., Desario C., Elia G., Campolo M., Lorusso A., Mari V., Martella V. & Buonavoglia C. (2007b). Occurrence of severe gastroenteritis in pups after canine parvovirus vaccine administration: a clinical and laboratory diagnostic dilemma. Vaccine 25, 1161-1166.

(11) Decaro, N, Desario, C., Elia, G., Mari, V., Lucente, M.S., Cordioli, P., Colaianni, M.L., Martella, V. & Buonavoglia C. (2007c). Serological and molecular evidence that canine respiratory coronavirus is circulating in Italy. Vet Microbiol 121, 225-230.

(12) Decaro, N., Martella, V., Elia, G., Campolo, M., Desario, C., Cirone, F., Tempesta, M. & Buonavoglia, C. (2007d). Molecular characterisation of the virulent canine coronavirus CB/05 strain. Virus Res 125, 54-60.

(13) Decaro, N. & Buonavoglia, C. (2008). An update on canine coronaviruses: Viral evolution and pathobiology. Vet Microbiol 132, 221-234.

(14) Decaro N., Desario C., Billi M., Mari V., Elia G., Cavalli A., Martella V. & Buonavoglia C. Western European epidemiological survey for parvovirus and coronavirus infections in dogs. Vet J in press a.

(15) Decaro N., Elia G., Martella V., Campolo M., Mari V., Desario C., Lucente M.S., Lorusso E., Kanellos T., Gibbons R.H. & Buonavoglia C.

Immunity after natural exposure to enteric canine coronavirus does not provide complete protection against infection with the new pantropic CB/05 strain. Vaccine in press b.

(16) Decaro N., Mari V., Elia G., Addie D.D., Camero M., Lucente M.S., Martella V. & Buonavoglia C. Recombinant canine coronaviruses in dogs, Europe. Emerg Infect Dis in press c.

(17) Elia, G., Decaro, N., Martella, V., Cirone, F., Lucente, M. S., Lorusso, E., Di Trani, L. & Buonavoglia, C. (2006). Detection of canine distemper virus in dogs by real-time RT-PCR. J Virol Methods 136, 171-176.

(18) Enjuanes, L., Brian, D., Cavanagh, D., Holmes, K., Lai, M.M.C., Laude, H., Masters, P., Rottier, P., Siddell, S., Spaan, W.J.M., Taguchi, F. & Talbot, P. (2000). Family Coronaviridae. In Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses, pp. 835-849. Edited by M.H.V. van Regenmortel, C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K. Estes, S.M. Lemon, J. Maniloff, M.A. Mayo, D.J. McGeoch, C.T. Pringle & R.B. Wickner. New York, USA: Academic Press.

(19) Erles, K., Toomey, C., Brooks, H.W. & Brownlie, J. (2003).

Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease. Virology 310, 216-223.

(20) Gouvea, V., Santos, N., Timenetsky & Mdo C. (1994). Identification of bovine and porcine rotavirus G types by PCR. J Clin Microbiol 32, 13381340.

(21) Haijema, B.J., Rottier, P.J.M., de Groot, R.J. (2007). Feline coronaviruses: a tale of two-faced types. pp. 183-203. In Coronaviruses. Molecular and cellular biology, pp. 183-203. Edited by V. Thiel. Norfolk, United Kingdom: Caister Academic Press.

(22) Hall, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser 41, 95-98.

(23) Hu, R.L., Huang, G., Qiu, W., Zhong, Z.H., Xia, X.Z. & Yin, Z. (2001). Detection and differentiation of CAV-1 and CAV-2 by polymerase chain reaction. Vet Res Commun 25, 77-84.

(24) Jiang, X., Huang, P.W., Zhong, W.M., Farkas, T., Cubitt, D.W. & Matson, D.O. (1999). Design and evaluation of a primer pair that detects both Norwalk- and Sapporo-like caliciviruses by RT-PCR. J Virol Methods 83, 145-154.

(25) Kumar, S., Tamura, K. & Nei, M. (2004). MEGA3: integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief Bioinform 5, 150-163.

(26) Lorusso, A., Decaro, N., Schellen, P., Rottier, P.J., Buonavoglia, C., Haijema, B.J. & de Groot, R.J. (2008). Gain, preservation and loss of a group 1a coronavirus accessory glycoprotein. J Virol 82, 10312-10317.

(27) Pratelli, A., Tempesta, M., Roperto, F.P., Sagazio, P., Carmichael, L. & Buonavoglia, C. (1999). Fatal coronavirus infection in puppies following canine parvovirus 2b infection. J Vet Diagn Invest 11, 550-553. (28) Pratelli, A., Martella, V., Elia, G., Tempesta, M., Guarda, F., Capucchio, M.T., Carmichael, L.E. & Buonavoglia, C. (2001). Severe enteric disease in an animal shelter associated with dual infection by canine adenovirus type 1 and canine coronavirus. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 48, 385-392.

(29) Pratelli, A., Elia, G., Martella, V., Palmieri, A., Cirone, F., Tinelli, A., Corrente, M. & Buonavoglia, C. (2002). Prevalence of canine coronavirus antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay in dogs in the south of Italy. J Virol Methods 102, 67-71.

(30) Pratelli, A., Decaro, N., Tinelli, A., Martella, V., Elia, G., Tempesta, M., Cirone, F. & Buonavoglia, C. (2004). Two genotypes of canine coronavirus simultaneously detected in fecal samples of dogs with diarrhea. J Clin Microbiol 42, 1797-1799.

(31) Schulze, C. & Baumgartner, W. (1998). Nested polymerase chain reaction and in situ hybridization for diagnosis of canine herpesvirus infection in puppies. Vet Pathol 35, 209-217.

(32) Tennant, B.J., Gaskell, R.M., Kelly, D.F., Carter, S.D. & Gaskell, C.J. (1991). Canine coronavirus infection in the dog following oronasal inoculation. Res Vet Sci 51, 11-18.

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Coronavirus canino isolato (CCoV) che non esprime una proteina accessoria 3c funzionale.
2. 2. CCoV isolato secondo la rivendicazione 1, comprendente un polinucleotide isolato avente almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare.
3. 3. CCoV isolato secondo le rivendicazioni 1 o 2, comprendente un polipeptide avente SEQ ID NO: 5.
4. 4. CCoV isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente un polipeptide avente SEQ ID NO: 4.
5. 5. CCoV isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente un polipeptide avente una qualunque di SEQ ID NO: 2 o da 6 a 10.
6. 6. CCoV isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 5, che à ̈ inattivato.
7. 7. CCoV isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 5, che à ̈ attenuato.
8. 8. CCoV isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 5, che à ̈ in forma di subunità purificata.
9. 9. Polinucleotide isolato da un coronavirus canino (CCoV), in cui detto polinucleotide isolato presenta almeno il 95% di omologia con SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare, a condizione che il polinucleotide non comprenda il polinucleotide del ceppo CB/05.
10. 10. Polinucleotide isolato secondo la rivendicazione 9, in cui detto polinucleotide non codifica per una proteina accessoria 3c funzionale.
11. 11. Polinucleotide isolato secondo le rivendicazioni 9 o 10, in cui detto polinucleotide non codifica per una proteina accessoria 3b funzionale.
12. 12. Polinucleotide isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 9 a 11 consistente in SEQ ID NO: 1 o un suo filamento complementare.
13. 13. Composizione comprendente un polipeptide isolato di SEQ ID NO: 5.
14. 14. Composizione immunogenica comprendente almeno uno tra: (a) il coronavirus canino isolato (CCoV) di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8; (b) il polinucleotide isolato di una qualunque delle rivendicazioni da 9 a 12; o (c) il polipeptide secondo la rivendicazione 13; e un eccipiente, diluente, proteina di trasporto o coadiuvante farmaceuticamente accettabile.
15. 15. Composizione immunogenica secondo la rivendicazione 14, che comprende una forma inattivata o attenuata del CCoV isolato.
16. 16. Composizione immunogenica secondo la rivendicazione 14, che comprende il polipeptide della rivendicazione 13, in cui detto polipeptide à ̈ un antigene a subunità del coronavirus canino isolato (CCoV).
17. 17. Composizione immunogenica secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 16, in cui la composizione non comprende una proteina accessoria 3c funzionale.
18. 18. Composizione immunogenica secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 17 per l’uso nel trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus nel cane.
19. 19. Uso della composizione immunogenica secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 17 nella preparazione di un medicamento per il trattamento o prevenzione dell’infezione da coronavirus nel cane.
20. 20. Metodo di trattamento o prevenzione di un’infezione da coronavirus in un cane comprendente la somministrazione della composizione immunogenica secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 17 in una quantità efficace per generare una risposta immunogenica nel cane.
21. 21. Un vaccino per coronavirus canino (CCoV) comprendente (a) il coronavirus canino (CCoV) isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 8; (b) il polinucleotide isolato secondo una qualunque delle rivendicazioni da 9 a 12; o (c) il polipeptide secondo la rivendicazione 13.