BR112014004620B1

BR112014004620B1 - uso do ‘peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária’, composição de vacina e combinação de vacina

Info

Publication number: BR112014004620B1
Application number: BR112014004620-4A
Authority: BR
Inventors: María Lugo González Juana; Pablo Estrada García Mario; Carpio González Yamila
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2019-10-29
Also published as: MX2014002214A; ZA201401271B; CU24075B1; US20140294889A1; AU2012303887A1; CU20110167A7; JP2014524450A; RU2014111465A; KR101857705B1; JP6077541B2; BR112014004620A2; ES2648337T3; EP2749291B1; MY191697A; US9549977B2; CL2014000386A1; KR20140064847A; CA2844898C; CN103874510A; NO2749291T3

Abstract

uso do peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária, composição de vacina e combinação de vacina a presente invenção se relaciona com o uso do peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária (pacap) como adjuvante molecular para vacinas. entre outras aplicações, ditas vacinas podem ser empregadas na proteção contra agentes infecciosos, tais como vírus, bactérias e ectoparasitas que afetam os mamíferos, as aves e os organismos aquáticos. o pacap, combinado com um antígeno particular, demonstra sua efetividade como adjuvante ao aumentar a resposta imunológica do hospedeiro contra dito antígeno. este tipo de resposta pode ser observada quando as composições ou combinações de vacinas que compreendem pacap são administradas por via oral, injeção, ou por banhos de imersão no caso dos organismos aquáticos.

Description

“USO DO ‘PEPTÍDEO ATIVADOR DA ADENILATO CICLASE DE PITUITÁRIA', COMPOSIÇÃO DE VACINA E COMBINAÇÃO DE VACINA”

Campo da técnica [0001] A presente invenção se relaciona com o campo da medicina, a biologia molecular e a imunologia, especificamente, com o desenvolvimento das vacinas e de adjuvantes para as mesmas. Em particular, a presente invenção revela o uso do peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária (PACAP) como adjuvante molecular para vacinas, as quais são empregadas em estratégias de imunização.

Estado da técnica anterior [0002] O objetivo fundamental da vacinação é a indução de uma resposta imune específica e efetiva contra um patógeno, que produza a proteção contra uma infecção e/ou contra uma doença e que resulte em sua erradicação. O conceito de que a resposta imune contra um determinado antígeno pode ser melhorada pela adição de determinados compostos na formulação de vacina foi demonstrado há aproximadamente 100 anos, quando os sais de alumínio foram introduzidos nas formulações e foram denominados adjuvantes (G. Leroux-Roels (20 0) Vaccine 28S C25-C36).

[0003] As vacinas tradicionais consistem em micro-organismos patógenos inativados ou atenuados, ou em toxinas derivadas destes microorganismos. Apesar de que o uso de micro-organismos patógenos inativados ou atenuados apresenta uma elevada imunogenicidade, atualmente é pouco atrativo na vacinologia, pela alta toxicidade que apresentam estas preparações. Portanto, existe um interesse crescente nos adjuvantes nas investigações relacionadas com o desenvolvimento de novas gerações de vacinas baseadas em subunidades proteicas recombinantes, peptídeos sintéticos e ácido desoxirribonucleico (DNA) plasmídico. Estas novas variantes, ainda que menos tóxicas, são em sua maioria menos imunogênicas

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 8/34 / 24 quando são administradas sem um adjuvante imunoestimulador. Esta é a razão pela qual, nos últimos anos, incrementou-se a necessidade de obter adjuvantes seguros e mais potentes (Saenz et al. (20 0) Vaccine 28 (47): 75567562).

[0004] Ainda que o uso dos adjuvantes seja bem conhecido, a maneira pela qual estes atuam é menos clara. Considera-se que, de maneira geral, estes últimos incrementam a eficácia das vacinas através de vários mecanismos que incluem: 1) o incremento do processamento e apresentação do antígeno pelas células dendríticas, 2) a indução de um sinal de perigo mediante as vias de sinalização mediadas pelos receptores que reconhecem os padrões associados a patógenos, como os receptores tipo Toll e 3) mediante a ativação de um sinal coestimulador que ativa os linfócitos. Estes mecanismos são desencadeados através da indução de citoquinas e a sobrerregulação da expressão dos sinais coestimuladores apropriados (Secombes (2010) Fish & Shellfish Immunology, 409-416).

[0005] Como adjuvantes foram estudadas várias moléculas endógenas e proteínas (Ying e Kwang (2000) Fish & Shellfish Immunology 10, 375-378; Lingnau et al. (2007) Expert Rev Vaccines 6 (5): 741-6; Zhang et al. (2010) Vaccine 28: 5 14-5127), e foi demonstrado que alguns peptídeos com propriedades imunoestimulantes podem atuar como adjuvantes in vivo, ao estimular a resposta imune de antígenos de natureza peptídica e proteica (Saenz et al. (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562). O PACAP pertence à superfamília da secretina/glucagon/peptídeo intestinal vasoativo (Miyata et al (1989) Biochem Biophys Res Commun 164: 567-574). Ele é um neuropeptídio multifuncional, que desempenha importantes funções como fator hipofisiotrópico e neurotrópico, como neurotransmissor, neuromodulador e vasodilatador nos mamíferos (Arimura A. (1998) Japanese Journal of Physiology 48: 301-31). Ademais, foi demonstrada sua função na regulação da divisão celular, a diferenciação e a morte celular (Sherwood et

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 9/34 / 24 al. (2000) Endocrine Review 21: 619-670). Este peptídeo existe biologicamente em duas formas moleculares, de 38 (PACAP38) e de 27 (PACAP27) aminoácidos, respectivamente (Miyata et al. (1990) Biochemical and Biophysical Research Communications 70:643-8). As ações biológicas do PACAP são mediadas pela interação do peptídeo com dois tipos de receptores que pertencem à família dos receptores acoplados à adenilato ciclase: o receptor de tipo I, que é altamente específico para o PACAP e se nomeia como PAC-1, e os receptores de tipo II, que apresentam a mesma afinidade pelo o PACAP que pelo o peptídeo intestinal vasoativo (VIP), e que são conhecidos como VPAC-1 e VPAC-2 (Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324).

[0006] O PACAP tem uma ampla distribuição nos diferentes tecidos, incluindo aqueles relacionados com o sistema imune, ainda que a presença deste peptídeo e de seus receptores nas células do sistema imune nos mamíferos só foi parcialmente esclarecida (Gaytan et al. (1994) Cell Tissue Res 276:223-7; Abad et al. (2002) NeurolmmunoModulation 10:177-86).

[0007] O PACAP modula a resposta inflamatória, mediante a regulação da interleucina-6 (IL-6) e da interleucina-10 (IL-10) (Martínez et al. (1996) J Immunol 156(11):4128-36; Martínez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67); Martínez et al. (1998) J Leukoc Biol 63(5):591-601).

[0008] Nos macrófagos cativados, o PACAP inibe a produção de citoquinas pro-inflamatórias e estimula a produção de citoquinas antiinflamatórias, permitindo desta forma a homeostase do sistema imune. Adicionalmente, sabe-se que o PACAP reduz a expressão das moléculas coestimuladoras B7.1/B7.2 e a subsequente ativação das células T auxiliadoras (Th, do inglês T helper). Por outro lado, nos macrófagos previamente estimulados o PACAP inibe, através de seus receptores PAC-1, a produção de IL-6, suprimindo assim a inflamação (Martínez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67; Martínez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998;

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63(5):591-601). A ação inibidora do PACAP sobre a transcrição da IL-6 ante uma intensa estimulação inflamatória ou uma intoxicação ajuda na proteção tissular e na homeostase do sistema imune (Martínez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67; Martínez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591-601). Em contraste, nos macrófagos não estimulados, o PACAP induz a expressão de B7.2 e promove a diferenciação celular para um fenótipo Th2 (Delgado e Ganea (2001 ) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 49(2): 101-10). Foi informada a presença de PACAP nos órgãos linfóides de patos (Squillacioti et al. (2005) Anatomía, Histologia, Embryologia. Volume 34, Issue Supplement s1, page 49).

[0009] Foi proposto o uso do PACAP nos mamíferos como agente terapêutico para tratar doenças autoimunes tais como o choque séptico, a artrite reumatóide e a doença de Crohn (Gomariz et al. (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74). Sabe-se que nas doenças autoimunes existe uma resposta imune descontrolada contra sustâncias e tecidos próprios dos organismos. Neste sentido, o PACAP previne a inflamação em modelos animais de doenças autoimunes mediante um balanço adequado de citoquinas e quimioquinas e seus receptores, através do recrutamento de células do sistema imune e mediante a regulação da geração e da ativação de células Th1 e das citoquinas que estas células secretam.

[00010] Além disso, sabe-se que moléculas envolvidas na homeostase do sistema imune tais como os receptores tipo Toll são essenciais para a ativação da resposta imune inata, o que potencializa a resposta imune adaptativa. Todavia, este tipo de resposta pode conduzir à patogênese da inflamação aguda e/ou crônica, a autoimunidade e ao câncer (Gomariz et al. (2010) Current Pharmaceutical Design 16: 1063-1080). Neste sentido, sabe-se que o sistema VIP-PACAP intervêm na regulação da expressão dos genes que codificam estes receptores tipo Toll (Gomariz et al. (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74), podendo provocar ambos peptídeos desordens nas vias de

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 11/34 / 24 regulação da produção destes receptores.

[00011] O PACAP atenua os níveis circulantes e inibe a liberação de citoquinas mediada pela molécula endógena HMGB1 (do inglês, high mobility group box 1) (Tang et al. (2008) International Immunopharmacology 8(12): 1646-1651). Sabe-se que a molécula HMGB1 e os peptídeos derivados da mesma são capazes de atuar como adjuvantes ao aumentar a resposta imune contra antígenos de natureza peptídica e proteica (Saenz et al. (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562).

[00012] O conhecimento sobre a função do PACAP na modulação do sistema imune nos peixes se limita a estudos realizados pelo presente grupo de trabalho nos quais se demonstra que a administração do PACAP de Ciarías gariepinus recombinante, mediante banhos de imersão ou injeção, não só promove o crescimento quanto estimula parâmetros da imunidade inata (lisozima, metabólitos derivados da atividade do óxido nítrico e defesas antioxidantes) e imunidade adquirida (IgM) em larvas e em juvenis dos peixes (Carpió et al. (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:439-45; Lugo et al. (2010) Fish and Shellfish Immunology 29:513-520). Estas propriedades do peptídeo se revelaram no pedido de patente Neuropéptidos para el cultivo de organismos acuáticos, com número de publicação internacional WO2007/059714.

[00013] Na atualidade mantém-se o interesse na identificação de compostos que possam ser empregados como adjuvantes seguros e mais potentes, e que possam ser incorporados nas vacinas existentes e nas que se encontram em desenvolvimento, tanto no campo da medicina humana como na veterinária.

Explicação da invenção [00014] A presente invenção resolve o problema acima mencionado, ao prover uma nova alternativa de adjuvante capaz de potenciar fortemente a resposta imune para um antígeno administrado conjuntamente e portanto,

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 12/34 / 24 constituir um adjuvante altamente eficaz. É um objeto da presente invenção o uso do peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária (PACAP) como adjuvante molecular de antígenos que se encontram presentes em vacinas, as quais são empregadas em diferentes estratégias de imunização. Em uma realização da invenção ditas vacinas, que compreendem PACAP como adjuvante, são desenhadas para a imunização contra agentes infecciosos. Estes agentes infecciosos podem ser vírus, bactérias e ectoparasitas, entre outros. Em uma realização particular, ditos agentes infecciosos afetam mamíferos, aves e peixes.

[00015] O termo peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária (PACAP), como se utiliza na presente invenção, inclui esta molécula em qualquer de suas variantes (PACAP27 ou PACAP38), seja isolada de sua fonte natural, de origem sintética ou produzida mediante a tecnologia do DNA recombinante; e abarca seu emprego como peptídeo ou em forma de ácidos nucleicos.

[00016] No contexto desta invenção o termo adjuvante molecular se refere a qualquer molécula de natureza proteica capaz de modular a resposta imune contra um antígeno de vacina, produzindo um incremento da mesma.

[00017] Não existem investigações até o presente que demonstrem o uso do PACAP como adjuvante molecular. Como se disse anteriormente, foi proposto o uso do peptídeo nos mamíferos como agente terapêutico para tratar doenças autoimunes tais como o choque séptico, a artrite reumatóide e a doença de Crohn (Gomariz et al. (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74). Neste sentido, o PACAP previne a inflamação em modelos animais de doenças autoimunes mediante um balanço adequado de citoquinas e quimioquinas e seus receptores, através do recrutamento de células do sistema imune e mediante a regulação da geração e da ativação de células Th1 e das citoquinas que estas células secretam. Tendo em conta estas constatações, resulta inesperado o efeito encontrado como parte dos estudos da requerente

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 13/34 / 24 que demonstram que a administração do PACAP em combinação com um antígeno incrementa a resposta imunitária contra dito antígeno, mediante a estimulação de citoquinas pro-estimulatórias e do aumento de outros elementos da resposta imune humoral.

[00018] Por outro lado, sabe-se que o sistema VIP-PACAP intervém na regulação da expressão dos genes que codificam os receptores tipo Toll (Gomariz et al. (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74), podendo provocar ambos peptídeos desordens nas vias de regulação da produção destes receptores, o que faz que seu uso como adjuvante para vacinas não seja óbvio. Outro elemento contraposto ao novo uso do PACAP, revelado nesta invenção, é a demonstração de que este peptídeo atenua os níveis circulantes e inibe a liberação de citoquinas mediada pela molécula endógena HMGB1 (Tang et al. (2008) International Immunopharmacology 8(12): 1646-1651 ).

[00019] Na presente invenção demonstra-se pela primeira vez, que o incremento na resposta imune específica contra o antígeno de vacina que se coadministra com o PACAP, é observado tanto ao nível da resposta humoral como a nível de resposta celular.

[00020] É também objeto da presente invenção uma composição de vacina que compreende o peptídeo PACAP como adjuvante, pelo menos um antígeno de interesse de vacina, e veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Esta composição de vacina que contém o PACAP como adjuvante e pelo menos um antígeno de interesse provoca uma resposta imunológica contra o antígeno ou antígenos de interesse, local ou sistêmica. As composições de vacinas ou vacinas, da presente invenção, podem estar baseadas, por exemplo, em proteínas recombinantes, cepas microbianas atenuadas ou ácidos nucleicos. Em uma materialização da invenção ditas composições de vacinas se administram pela via oral, por injeção, ou por banhos de imersão.

[00021] No contexto da invenção, em ditas composições de vacinas, o

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PACAP se administra como peptídeo obtido por isolamento de sua fonte natural, de forma sintética, ou mediante a tecnologia do DNA recombinante. Também pode ser empregado em forma de ácidos nucleicos.

[00022] Em diferentes materializações da presente invenção as vacinas que compreendem PACAP em combinação com vários antígenos se administram a mamíferos, aves e peixes, demonstrando-se por primeira vez um efeito adjuvante para o PACAP. Inesperadamente, se observou que a administração do neuropeptídeo PACAP combinado com um antígeno incrementa os níveis de anticorpos específicos contra dito antígeno em mamíferos, aves e peixes. Adicionalmente, se demonstrou pela primeira vez in vitro que a administração do PACAP incrementa significativamente os transcritos de interleucina 1 beta (IL 1 β) e interleucina 15 (IL15) em leucócitos de peixes.

[00023] Em diferentes realizações da presente invenção, que revela composições ou combinações de vacinas que compreendem o PACAP como adjuvante, utiliza-se diversos antígenos, tais como ovo albumina (OVA), a glicoproteína E2 da envoltura do vírus da Peste Porcina Clássica (VPPC), a hemaglutinina (HA) do vírus da influenza aviária, o polipeptídeo my32 de Caligus rogercresseyi, células inativadas de Aeromonas hydrophila, a poliproteína de 106 kDa (NH2-VP2-VP4VP3-COOH) do vírus da necrose pancreática infecciosa (do inglês: infectious pancreatic necrosis vírus, abreviado IPNV), a glicoproteína G do vírus da septicemia hemorrágica viral (do inglês: viral hemorrhagic septicemia vírus, abreviado VHSV) e o parasita ciliado Ichthyophthirius multifiliis.

[00024] Em uma realização particular da invenção, nas composições de vacinas, se caracterizam porque o PACAP se aplica em uma concentração de PACAP é aplicado como alimento formulado, em uma concentração de 50 750 pg/kg de alimento. Em uma segunda concentração de 0.1-10 pg por grama do peso corporal PACAP é aplicado por injeção. Em outra realizaçãoda

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 15/34 / 24 invenção, PACAP é aplicado em organismos aquáticos mediante banhos de imersão, em uma concentração de 50-1000 gg por litro de água.

[00025] Em outra realização da invenção, os antígenos e o adjuvante PACAP podem ser parte de uma combinação de vacina cujos elementos se administram de forma simultânea, separada ou sequencial no curso de um mesmo protocolo de imunização. Em uma realização particular da invenção, a combinação se aplica na prevenção de infecções virales, bacterianas e doenças parasitárias. Para essa combinação de vacina, PACAp e o antígeno, ou antígenos, são administrados oralmente, por injeção ou por banhos de imersão.

[00026] Em uma realização particular, o PACAP se aplica como alimento formulado, a uma concentração de entre 50 e 750 pg/kg de ração. Em uma segunda realização da invenção, o PACAP se aplica por injeção, em uma concentração de entre 0,1 e 10 gg de peptídeo por grama do peso corporal. Em outra realização da invenção, o PACAP se aplica a os peixes por banhos de imersão, em uma concentração de 50-1000 gg de PACAP por litro de água.

[00027] Outro aspecto desta invenção é um método para aumentar a resposta imune contra um antígeno de vacina em que se aplica uma composição de vacina que compreende o peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária (PACAP) como adjuvante de dito antígeno. De acordo com o método revelado na invenção, o PACAP como adjuvante e o antígeno se podem administrar de forma simultânea, separada ou sequencial no curso de um mesmo esquema de imunização. O PACAP se aplica como adjuvante no método da invenção como peptídeo que ha sido obtido por isolamento de sua fonte natural, por sínteses química ou mediante a tecnologia do DNA recombinante. Também a invenção compreende um método donde o PACAP que se aplica como adjuvante se administra em forma de ácidos nucleicos. De acordo ao método da invenção, o incremento na resposta imune, específica

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 16/34 / 24 contra o antígeno de vacina de interesse, se observa tanto a nível da resposta humoral como a nível de resposta celular.

[00028] Como demonstrado em várias materializações da invenção, o aprimoramento ou aumento na resposta imune contra o antígeno de interesse se reverte em maiores níveis de proteção frente a diversos agentes infecciosos; incluindo entidades virais, bacterianas e ectoparasitas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [00029] Figura 1. Títulos de imunoglobulinas (IgG) totais (A), lgG1 (B) e lgG2a (C) induzidos pela imunização de ratos com OVA coadministrada com o neuropeptídeo PACAP38. Estabeleceu-se 2 grupos de ensaio, de 6 animais cada um. O Grupo controle negativo (tampão fosfato salino (PBS)/OVA) foi inoculado por via intraperitoneal, a os dias 0 e 7 com uma dose de 6 g de OVA em 0,2 mL de PBS. O Grupo que ademais recebeu PACAP38 (PBS/OVA peptídeo) foi inoculado por via intraperitoneal, nos dias 0 e 7 com uma dose de 6 g de OVA + 0,5 de PACAP38 em 0,2 mL de PBS. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas.

[00030] Figura 2. Avaliação de resposta celular em porcos vacinados com a composição de vacina baseada em E2-PACAP, medida em linfócitos de porco isolados no dia 5 posterior a vacinação com E2 (grupo 1), E2+PACAP (grupo 2) e placebo (grupo 3). (A) Ensaio de linfoproliferação: Os resultados se expressam em índices de estimulação (IE), definido como a relação entre os contagens por minuto (cpm) do cultivo estimulado e os cpm do cultivo de controle não tratado. A resposta linfoproliferativa com um IE >2 foi considerada como positiva; (B) Resposta de secreção IFN-γ: foi determinada mediante reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Os valores são expressos como a média aritmética de 2 ^ΔΔΠ. (**) p<0,01.

[00031] Figura 3. Títulos de inibição da hemaglutinação em frangos imunizados com 20 pg de HA ou HA-PACAP (A). As médias aritméticas dos títulos de anticorpos são expressas como o log2 do valor do recíproco da

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 17/34 / 24 diluição mais alta do soro na qual se produz a inibição da hemaglutinação. Resposta celular nos frangos imunizados (B). A resposta de secreção IFN-γ foi determinada mediante PCR em tempo real. Os valores são expressos como a média aritmética de 2 ^ΔΔΠ. (**) p<0,01.

[00032] Figura 4. Análise por PCR em tempo real do efeito in vitro do PACAP38 sobre a transcrição da IL 1 β em leucócitos de sangue periférico (A) e de rim anterior (B) de trutas sãs. Avaliou-se o efeito do PACAP38 nas concentrações de 10^-10, 10^-9 e 10^-8 M, nas 48 horas de tratamento. O experimento foi repetido 4 vezes. Os cultivos de leucócitos foram tratados por duplicação e as reações de PCR foram realizadas em triplicata. Os dados são expressos como a média da expressão relativa do gene de interesse (IL 1 β) com respeito ao gene endógeno de expressão constitutiva fator de elongação 1α (EFa) ± desvio padrão da média (DS). O valor * (p<0.05) indica que a expressão relativa do gene de interesse era estatisticamente superior com respeito a sua expressão relativa nos cultivos de leucócitos não tratados (controle negativo).

[00033] Figura 5. Análises de expressão por PCR em tempo real do efeito in vitro do PACAP38 sobre a transcrição da interleucina 15 (IL 15) em leucócitos de sangue periférico (A) e de rim anterior (B) de trutas sãs. Avaliou-se o efeito do PACAP38 nas concentrações de 10^-10, 10~⁹ e 10^-8 M, nas 48 horas pós tratamento. O experimento foi repetido 4 vezes. Os cultivos de leucócitos foram tratados por duplicação e as reações de PCR foram realizadas em triplicata. Os dados são expressos como a média da expressão relativa do gene de interesse (IL 15) com respeito ao gene endógeno de expressão de IL 15 relacionado ao fator de alongamento endógeno EF1a ± desvio padrão da média (DS). (*) p<0.05.

[00034] Figura 6. Título de anticorpos aglutinantes contra A. hydrophila em carpa comum. Os valores do eixo e representam a média ± erro padrão. (*) p<0.05, (**) p<0.01. Grupo 1: Injetados com PBS, Grupo 2:

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Injetados com células de A. hydrophila inativadas com formalina, Grupo 3: Injetados com células de A. hydrophila inativadas com formalina e PACAP (1 qg/ peixe).

[00035] Figura 7. Efeito da coadministração por via intramuscular da vacina de DNA (pP-IPNV) a uma dose de 1 qg/peixe, com um plasmideo que apresenta a sequência de DNA complementar do PACAP de Ciarías gariepinus, sob o promotor imediato prematuro do citomegalovírus humano (pCMV-PACAP). A 30 dias pós-vacinação, os peixes foram expostos ao vírus mediante injeção intraperitoneal de 100 ql de IPNV (1x107 Dose infectiva média em cultivo de tecido (TCID50) mL-1 por peixe). A 7 dias pós-infecção, foram sacrificados 10 peixes por grupo e avaliou-se a carga viral em rim anterior por transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real. Os valores representam a média ± desvio padrão. As letras diferentes em superescrito representam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. Grupo 1: Peixes injetados com PBS, Grupo 2: Peixes injetados com pP-IPNV, a uma dose de 1 qg/peixe, Grupo 3: Grupo ao que se coadministrou pP-IPNV 1 g/peixe e pCMV-PACAP a uma dose de 0,5 qg de pCMV-PACAP/peixe, Grupo 4: Grupo ao que se coadministrou a vacina pP-IPNV (1 qg/peixe) e pCMV a uma dose de 0,5 qg de pCMV/peixe, Grupo 5: Grupo ao que se coadministrou pP-IPNV a uma dose de 1 qg/peixe e pCMV-PACAP a uma dose de 0,05 qg de pCMV-PACAP/peixe, Grupo 6: Grupo ao que se coadministrou pP-IPNV (1 qg/peixe) e pCMV a uma dose de 0,05 qg de pCMV/peixe.

[00036] Figura 8. Porcentagem de mortalidade acumulada em trutas arcoiris de 10 g imunizadas por via intramuscular com uma vacina de DNA baseada no gene que codifica a glicoproteína G do VHSV (pG-VHSV) e o peptídeo PACAP. A 4 semanas pós-vacinação os peixes foram expostos ao vírus (1x10⁵ TCID50 mL^-1 por peixe) mediante banhos de imersão. Avaliou-se a mortalidade acumulada durante 4 semanas post-desafio. Grupo 1: Peixes

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 19/34 / 24 injetados com PBS. Grupo 2: pG-VHSV (0,01 pg/peixe), Grupo 3: pG-VHSV 0,01 pg/peixe e PACAP 0,1 pg PACAP/peixe, Grupo 4: pG-VHSV 0,01 pg/peixe e PACAP 0,5 pg de PACAP/peixe.

Exposição detalhada de modos de realização/Exemplos de realização Exemplo 1. Efeito da coimunização da OVA e o PACAP sobre a resposta imune humoral em ratos [00037] Selecionou-se 12 ratos BALB/c fêmeas, com um peso corporal de 20 g, e separou-se em 2 grupos de ensaio, de 6 animais cada um. O Grupo de controle negativo (PBS/OVA) foi inoculado por via intraperitoneal, nos dias 0 e 7 com uma dose de 6 pg de OVA em 0,2 mL de PBS. O Grupo tratado com PACAP38 (PBS/OVA+peptídeo) foi inoculado por via intraperitoneal (IP), nos dias 0 e 7 com uma dose de 6 pg de OVA + 0,5 pg de PACAP38 em 0,2 mL de PBS. No dia 15 do protocolo de imunização, extraiu-se sangue dos animais e avaliou-se os títulos de IgG totais, lgG1 e lgG2a.

[00038] Na Figura 1A, B e C apresentam-se os títulos de IgG totais, lgG1 e lgG2a, respectivamente, induzidos pela imunização de ratos com OVA coadministrada com o PACAP38. Os animais do grupo PBS/OVA+peptídeo mostraram um título de IgG totais específicas a OVA estatisticamente superior ao grupo de controle (Figura 1A). De igual forma, observou-se que os títulos de lgG1 e lgG2a específicos a OVA no grupo imunizado com OVA+PACAP foram significativamente superiores aos observados no grupo imunizado sól com OVA.

Exemplo 2. Avaliação da resposta celular em porcos vacinados com a composição de vacina baseada em E2-PACAP [00039] O antígeno E2 é a glicoproteína majoritária do envoltório do VPPC. Com o objetivo de avaliar a resposta celular em porcos vacinados com a composição de vacina baseada em E2-PACAP, e compará-la com a produzida pelo antígeno E2, selecionou-se 18 porcos sadios, de 20 kg de peso

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 20/34 / 24 média, e sorologicamente negativos ao VPPC, procedentes de uma unidade sem antecedentes da doença e sem vacinar nos 3 anos precedentes. Os porcos foram distribuídos em 3 grupos de 6 animais cada um, com água e ração ad libitum. A cada animal se aplicou a composição de vacina com as seguintes quantidades de antígeno: 25 gg de E2 recombinante (Grupo 1) e 25 gg de E2 coadministrado com similar quantidade de PACAP38 (Grupo 2). Estabeleceu como Grupo 3 um grupo placebo. Os imunógenos foram formulados em uma emulsão de adjuvante oleoso e foram inoculados mediante injeção de 2 ml por via intramuscular (IM Realizou-se uma só imunização. Os animais foram confrontados no dia 8 pós-imunização com o VPPC por via IM (105 dose letal média (DL50) do isolamento Margarita). Realizou-se uma análise diária de signos clínicos e tomou-se amostras de sangue nos dias 3 e 5 para avaliar linfoproliferação e expressão de IFN-γ, como indicadores de resposta celular. Nos animais vacinados com E2-PACAP detectou-se um aumento da resposta dos linfócitos durante o ensaio de proliferação (Fig. 2A) e níveis elevados de IFN-γ no dia 5 (Fig. 2B), em comparação com os outros grupos. Isto demonstra que a coadministração do antígeno E2 com PACAP produz uma resposta imune celular contra o VPPC.

Exemplo 3. Efeito da coimunização em frangos da HA do vírus da influenza aviária (vírus A/VietNam1203/2004) e o PACAP sobre a resposta imune humoral e celular.

[00040] Para a imunização utilizou-se frangos Leghorn brancos, de 3 semanas de idade. Distribuiu-se 10 frangos por grupo experimental. Estabeleceu-se 3 grupos experimentais:

Grupo 1: 20 gg de HA

Grupo 2: 20 gg de HA+ 0,5 gg de PACAP27

Grupo 3: 20 gg de soroalbumina bovina [00041] A HA foi obtida por via recombinante, expressa em células de mamíferos. As distintas formulações foram formuladas em Montanide 888 e

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 21/34 / 24 foram administrdas em um volume final de 0,5 mL por via subcutânea. Os animais foram se reimunizados no dia 28 pós-imunização. Amostras de sangue foram recolhidas nos dias 0, 14, 28, 35, 42 e 49, para obter os soros necessários para a detecção de anticorpos protetores, mediante um ensaio de inibição da hemaglutinação, e para a extração de leucócitos, com o objetivo de avaliar a resposta celular produzida pelas vacinas in vitro.

[00042] Os resultados mostraram que os frangos imunizados com HAPACAP mostraram uma resposta humoral superior aos frangos imunizados com HA, a partir do dia 35, posterior à administração da dose de reimunização (Fig. 3A). A resposta celular, medida pela estimulação de IFN-γ, mostrou um incremento no grupo tratado com HA-PACAP em comparação aos grupos imunizados com HA ou o grupo de controle (Fig. 3B).

Exemplo 4. Efeito do PACAP sobre a expressão da ILI-β e IL15 em leucócitos de sangue periférico e de rim anterior de truta arcoiris (Oncorhynchus mykiss} sãs.

[00043] Utilizou-se juvenis de truta arcoiris (O. mykiss), de aproximadamente 50 gramas de peso, livres de VHSV, IPNV e de vírus da anemia infecciosa do salmão (ISAV). Os peixes (n=5) foram anestesiados com o sal do ácido metanossulfônico (Sigma, USA) e deles se extraiu assepticamente, primeiro sangue periférico da veia caudal e, posteriormente, o rim anterior. Isolou-se leucócitos do sangue periférico e do rim anterior a partir de 5 trutas, de forma independente, seguindo o método descrito por Graham e Secombes (Graham e Secombes (1998) Immunology 65:293-7).

[00044] As células foram ressuspensas em meio L-15 com 5% de soro fetal bovino, a uma concentração de 5x106 células por mL, e foram dispensadas em placas de 24 poços a 1 mL por poço. Os leucócitos foram tratados com 3 concentrações de PACAP38 de C. gariepinus, obtido por síntese química (10^-10 M, 10^-9 M e 10^-8 M), por duplicação, e utilizou-se como controle negativo uma suspensão de leucócitos não tratados dispensados por

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 22/34 / 24 duplicação.

[00045] Os níveis de IL1 β e IL 5 foram avaliadas 48 horas depois dos tratamentos. Para isso, purificou-se ácido ribonucleico (RNA) total dos cultivos de leucócitos controles e os tratados com PACAP, mediante o método descrito por Chomczynski e Sacchi (Chomczynski e Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9).

[00046] Tendo em conta que os iniciadores para amplificar IL1 β e IL15 não discriminam entre DNA complementar (DNAc) e DNA genômico, tratou-se os RNA total purificados a partir dos diferentes tecidos com uma nuclease de DNA, especificamente com a RQ1 RNase-free DNAse (Promega).

[00047] Para a síntese dos DNAc utilizou-se um jogo comercial de reativos que emprega a transcriptase reversa SuperScript III (Invitrogen). Finalmente, para as reações de PCR quantitativas (qPCR) utilizou-se uma mescla de PCR de origem comercial: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem). Os resultados das qPCR foram normalizados contra um gene endógeno de expressão constitutiva, especificamente o EF 1a, e realizouse por triplicata. Os resultados foram expressos como ^{2 AC1}, onde o ACt equivale ao resto do valor de ciclo umbral (Ct) do gene avaliado menos o valor de Ct do gene normalizador (EF 1α).

[00048] Os níveis da proteína IL 1β aumentaram depois de 48 horas de tratamento nos cultivos de leucócitos de sangue periférico tratados com 10^-10M de PACAP38. Na dose de 10^-9 M observou-se também um efeito estimulador de PACAP38 sobre a transcrição deste gene, com respeito ao controle negativo, porém os níveis de expressão detectados foram inferiores aos níveis obtidos com a dose de 10^-10 M. Estes resultados demonstram um efeito positivo de PACAP38 sobre a transcrição da IL1 β, a concentrações baixas (na faixa de 10^-9 -10^-10 M) (Figura 4A). Em leucócitos de rim anterior, o efeito do PACAP 38 sobre a transcrição da IL1 β é mais moderado que em

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 23/34 / 24 leucócitos de sangue periférico, observando-se um efeito estimulador na dose de 10^-9 M e 10^-8 M (Figura 4B).

[00049] Adicionalmente, observou-se um efeito estimulador do PACAP38 sobre a expressão da IL15 nos cultivos de leucócitos estimulados com PACAP38 nas dose de 10^-10 e 10~⁹ M. Obteve-se os maiores valores de expressão na dose de 10^-9 M (Figura 5A). Em leucócitos de rim anterior, igualmente ao observado com a expressão da IL 1 β, o efeito foi mais moderado observando-se níveis de expressão da IL15 estatisticamente superiores ao controle negativo, na dose intermedia de 10^-9 M (Figura 5B).

[00050] Exemplo 5. Ensaio de desafio controlado, com infestação por Caligus rogercresseyi em salmões (Salmo salar) previamente imunizados por via intraperitoneal com o antígeno my32, e my32 coadministrado com PACAP.

[00051] A proteína my32 foi obtida de forma recombinante, no precipitado de ruptura de E. coli. Sabe-se que esta proteína, administrada por via intraperitoneal (IP), produzia 57% de inibição da infestação na segunda geração de parasitos em um ensaio de desafio com C. rogercresseyi em S. salar (Carpió et al. (20 1 ) Vaccine. 201 1 29(15):2810-20).

[00052] Para demonstrar o efeito adjuvante do PACAP sobre esta proteína, concebeu-se um experimento de vacinação e desafio em S. salar, em condições controladas, em que se estabeceu 6 grupos experimentais de 25 animais (80 g de peso médio) cada um:

Grupo 1: Injetados IP com PBS

Grupo 2: Injetados IP com PACAP38 a uma dose de 1 pg/peixe

Grupo 3: Injetados IP com my32 a uma dose de 3 pg/grama peso corporal (gpc)

Grupo 4: Coadministração mediante injeção IP de my32 a uma dose de 3 pg/gpc e PACAP a uma dose de 1 pg/peixe

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Grupo 5: Peixes injetados IP com my32, a uma dose de 3 pg/gpc, e alimentados com ração formulado com 250 pg de PACAP/ kg de ração diariamente, durante uma semana pre e pos-imunização com my32. [00053] Durante o curso do experimento os peixes foram alimentados duas vezes ao dia com uma fórmula comercial balanceada não medicada, à razão de 1 % de seu peso corporal, com exceção do grupo 5, a que administrou uma semana pré- e pós-imunização a mesma fórmula comercial formulada com PACAP, segundo descrito por Adelmann et al. ((2008) Vaccine 26, 837-844) para a administração oral de uma cepa atenuada do vírus VHSV.

[00054] Depois de 500 unidades térmicas arbitrárias, os peixes se adaptaram à a água de mar por duas semanas. Posteriormente, adicionou-se a cada tanque 2000 ± 200 copepoditos. Os peixes foram mantidos sem fluxo de água, na obscuridade e nas condições de temperatura, salinidade e oxígênio sugeridas por Stone et al. (Dis Aquat Organ, 2000, 41: 141-149) por 24 dias. A viragem e a filtração de água foram realizadas de forma manual cada 48 horas. Após 24 dias, anestesiou-se e sacrificou-se os peixes, e realizou-se a contagem de parasitas em um estereomicroscópio. Os resultados que são mostrados na Tabela 1 evidenciam uma redução nos níveis de infestação nos grupos tratados com PACAP, my32 e PACAP+my32. A maior redução ocorreu nos grupos 4 e 5, o que evidencia o efeito adjuvante do PACAP sobre o antígeno coadministrado.

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Tabela 1. Contagem de parasitas a 24 dias pós-desafio em experimentos de vacinação e desafio com C. rogrecresseyi

Grupos experimentais	Número de parasitas/peixe	Inibição da infestação
PBS	37 + 3^a	-
PACAP	29 +5^b	22
my32	7 + 8^c	55
PACAP-IP +my32-IP	8+3^d	79
PACAP-oral +my32-IP	5+2^e	86

As letras indicam diferenças estatisticamente significativas A porcentagem de inibição da infestação se calcula como 1 (número de parasitas no grupo experimental/número de parasitas no controle de PBS)*100

Exemplo 6. Efeito adjuvante do PACAP na resposta imune humoral de carpa comum (Cyprinus carpióó versus Aeromonas hydrophila [00055] O experimento foi realizado com carpas (C. carpió) de 40 ± 10 g. Estas foram mantidas em aquários de 600 L a uma temperatura de 28 ± 2°C. Estabeleceu-se 3 grupos experimentais de 10 carpas cada um, nos quais se injetou por via intraperitoneal os seguintes imunógenos:

Grupo 1: PBS

Grupo 2: Células de A. hydrophila inativadas

Grupo 3: Células de A. hydrophila inativadas e 1 gg de PACAP38 por peixe.

[00056] Os peixes foram injetadas no dia 0 e 14 e coletou-se sangue da veia caudal dos mesmos nos dias 0 e 21. Os resultados mostraram que os títulos de anticorpos aglutinantes eram significativamente maiores no grupo imunizado com a bactéria mais o PACAP em comparação com o grupo imunizado com a bactéria somente (Fig. 6). Estes resultados demonstram o efeito de PACAP como adjuvante molecular em peixes. A preparação das células de A. hydrophila e a determinação dos títulos de anticorpos foram realizadas segundo Yin et al. ((1996) Fish & Shellfish Immunology 6, 57-69). Exemplo 7. Ensaio de desafio controlado, com infestação por A. hydrophila em carpa comum (C. carpió) previamente imunizadas por via

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 26/34 / 24 intraperitoneal com a bactéria inativada e a bactéria inativada coadministrada com PACAP.

[00057] O experimento foi realizado com carpa comum (C. carpió) de 30 ± 5 g. Estas foram mantidas em aquários de 250 L a uma temperatura de 30 ± 2°C. Estabeleceu-se 3 grupos experimentais, de 20 carpas cada um, nos quais se injetou intraperitonealmente:

Grupo 1: PBS

Grupo 2: Células de A. hydrophila inativadas

Grupo 3: Células de A. hydrophila inativadas e 1 pg de PACAP38 por peixe.

[00058] Os peixes foram injetados no dia 0 e 14. No dia 21 realizou-se o desafio mediante a injeção IP da DL50 da bactéria e registrou-se a mortalidade durante 7 dias. Calculou-se a porcentagem relativa de sobrevida (RPS) como:

RPS (%)= (% de mortalidade de controles-% mortalidade de tratados)/ (% de mortalidade de controles) x100 [00059] O resultado foi 65% de RPS no Grupo 2 e 95% no Grupo 3, o que demonstra que a administração do PACAP incrementa a taxa de sobrevida dos peixes vacinados e desafiados contra o patógeno.

Exemplo 8. Efeito da coadministração do PACAP com uma vacina de DNA baseada no gene que codifica a poliproteína de 106 kDa (NH2-VP2VP4VP3-COOH) do IPNV em trutas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) desafiadas experimentalmente com o vírus.

[00060] Realizou-se um experimento para avaliar o efeito da coadministração por via intramuscular do PACAP com uma vacina de DNA baseada no gene que codifica a poliproteína de 106 kDa (NH2-VP2-VP4VP3COOH) do IPNV em trutas arcoíris desafiadas experimentalmente com dito vírus. Formou-se 6 grupos experimentais de 15 peixes cada um (12 + 1 g), e foram mantidos em água a 10-12 °C:

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Grupo 1: Peixes injetados com PBS

Grupo 2: Peixes injetados com a vacina de DNA (pP-IPNV) a uma dose de 1 pg pez

Grupo 3: Grupo ao que se le coinjetou a vacina de DNA (pPIPNV) a uma dose de 1 μο/peixe com um plasmídeo que presenta a sequência de DNAc do PACAP de C. gariepinus, bajo o promotor inmediato temprano do citomegalovírus humano (pCMV-PACAP), a uma dose de 0,5 μ9 de pCMV-PACAP/peixe.

Grupo 4: Grupo em que se coinjetou a vacina pP-IPNV (1 μ9/ρβζ) com um plasmídeo de controle negativo que não porta a sequência de DNA complementar de PACAP sob o promotor CMV (pCMV) a uma dose de 0,5 μ9 de pCMV-PACAP/peixe.

Grupo 5: Grupo no que se coinjetou a vacina de DNA (pPIPNV) a uma dose de 1 μ9/ρβζ com um plasmídeo que apresenta a sequência de DNA complementar do PACAP de Ciarías gariepinus sob o promotor imediato prematuro do citomegalovírus humano (pCMV-PACAP) a uma dose de 0,05 pg de pCMV- PACAP/peixe.

Grupo 6: Grupo em que se coinjetou a vacina pP-IPNV (1 pg/peixe) com um plasmídeo de controle negativo que não porta a sequência de DNA complementar de PACAP sob o promotor CMV (pCMV) a uma dose de 0,05 pg de pCMV-PACAP/peixe.

[00061] A 30 dias de pós-vacinação, os peixes foram expostos ao vírus, mediante injeção intraperitoneal de 100 pl de IPNV (1x107 TCID50 mL1 por peixe). A 7 dias de pós-infecção, 10 peixes por grupo foram sacrificados e se avaliou a carga viral em rim anterior.

[00062] Para determinar a carga viral, isolou-se o RNA das amostras individuais e realizou-se a reação de transcrição reversa a partir de 1 pg de RNA. A detecção da expressão do gene VP1 foi avaliada mediante PCR em tempo real. Os resultados são mostrados na Figura 7.

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 28/34 / 24 [00063] A coadministração de pP-IPNV e pCMV-PACAP diminuiu significativamente a carga viral, em comparação com o grupo em que se coinjetou pP-IPNV e os vetores vazios. Não houve diferenças entre as doses de pCMV-PACAP ensaiadas.

Exemplo 9. Efeito da coadministração do peptídeo PACAP com uma vacina de DNA baseada no gene que codifica a glicoproteína G do VHSV em trutas arcoíris (O. mykiss) desafiadas experimentalmente com o vírus.

[00064] Realizou-se um experimento para avaliar o efeito da coadministração por via intramuscular do PACAP de Ciarias gariepinus com uma vacina de DNA baseada no gene que codifica a glicoproteína G do VHSV (pG-VHSV) em trutas arcoíris desafiadas experimentalmente com dito vírus. Formou-se 4 grupos experimentais, de 20 peixes cada um (10 ± 2 g), e foram mantidos em água a 10-12°C:

Grupo 1: Peixes injetados com PBS.

Grupo 2: Grupo no qual se injetou a vacina de DNA pGVHSV (0,01 pg/peixe).

Grupo 3: Grupo no que se coinjetou a vacina de DNA pGVHSV a uma dose de 0,01 pg/peixe com o PACAP de C. gariepinus a uma dose de 0,1 pg de PACAP/peixe.

Grupo 4: Grupo no que se coinjetou a vacina de DNA pGVHSV a uma dose de 0,01 pg/peixe com o PACAP de C. gariepinus a uma dose de 0,5 pg de PACAP/peixe. A 4 semanas pós-vacinação os peixes foram expostos ao vírus, mediante banhos de imersão durante 2 h, em água contendo uma dose infectiva de VHSV de (1x10⁵ TCID50 ml^-1 por peixe). Avaliou-se a mortalidade acumulada durante 4 semanas pós-desafio e os resultados são mostrados na Figura 8.

[00065] A coadministração do peptídeo com a vacina de DNA reduziu a mortalidade em 15 e 29%, em comparação com a administração da vacina de DNA apenas, para as dose de peptídeo de 0,1 e 0,5 pg de PACAP/peixe,

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 29/34 / 24 respectivamente.

Exemplo 10. Efeito da administração do PACAP após a imunização com terontes do parasita ciliado Ichthyophthirius multifiliis sobre a sobrevida de peixe gato do canal (Ictalurus punctatus) [00066] Realizou-se um experimento para avaliar o efeito da administração do PACAP, posterior à imunização com terontes do parasita ciliado /. multifUiis, sobre a sobrevida do peixe gato do canal (/. punctatus), siguiendo o procedimento de vacinação e desafio proposto por Wang e Dickerson ((2002) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9(1), 176-181). Para esto se utilizaron peixes de 12 ± 5 g. Estabeleceu-se 4 grupos experimentais de 25 peixes cada um:

Grupo 1: Peixes imunizados nos dias 1 e 35 com PBS.

Grupo 2: Peixes imunizados no dia 1 com 8000 terontes vivos de I. multifiliis e no dia 35 com 10 000 terontes vivos do parasita.

Grupo 3: Peixes imunizados no dia 1 com 8000 de terontes vivos de I multifiliis e no dia 35 com 10 000 terontes vivos do parasita. A estes peixes também se administrou o PACAP38 mediante 6 banhos de imersão a uma dose de 100 qg de peptídeo/litro de água durante 1 hora, em dias alternados nas duas semanas prévias ao desafio.

Grupo 4: Peixes imunizados no dia 1 com 8000 de terontes vivos de I. multifiliis e no dia 35 com 10 000 terontes vivos do parasita. Estes peixes foram submetidos aos banhos de imersão durante 1 hora porém sem o peptídeo PACAP, mediante um procedimento similar ao Grupo 3.

[00067] Previamente à imunização os peixes foram tratados com formalina para remover os ectoparasitas existentes. Os peixes foram mantidos a 23 ± 2°C, em fluxo continuo de água. No dia 84, os peixes foram desafiados com 15 000 terontes. Os dados da mortalidade foram obtidos durante os 30 dias posteriores ao desafio. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Estes demonstram um incremento de 27% na sobrevida dos peixes imunizados e

Petição 870190081884, de 22/08/2019, pág. 30/34 / 24 tratados de cada vez com o PACAP.

Tabela 2. Sobrevida de I. punctatus imunizados com terontes vivos de I. multifiliis, tratados ou não com PACAP mediante banhos de imersão e desafiados com o parasita.

Grupos experimentais	Número de peixes desafiados/Número de peixes que sobreviveram	Porcentagem de sobrevida (%)
PBS	25/0	0
Terontes vivos	25/15	60
Terontes vivos + PACAPBi	25/22	87
Terontes vivos + Bi	25/14	58

ib: Estes peixes foram submetidos a 6 banhos de imersão durante 1 hora, em dias alternados nas duas semanas prévias ao desafio.

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Claims

1. Uso do “peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária” (PACAP), caracterizado pelo fato de que é como adjuvante molecular para antígenos de vacinas para a prevenção de doenças causadas por agentes infecciosos em peixe.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PACAP é administrado como peptídeo ou como ácidos nucleicos.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PACAP que é obtido a) por isolamento de sua fonte natural, b) de forma sintética, ou c) mediante a tecnologia do DNA recombinante.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agente infeccioso é um vírus, uma bactéria ou um ectoparasita.

5. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o “peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária” (PACAP), pelo menos um antígeno de vacina para a prevenção de doenças causadas por agentes infecciosos em peixe, e veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que ela é administrada por via oral, por injeção, ou por banhos de imersão.

7. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o PACAP é administrado como peptídeo obtido a) por isolamento de sua fonte natural, b) de forma sintética, ou c) mediante a tecnologia do DNA recombinante; ou em forma de ácidos nucleicos.

8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7. caracterizada pelo fato de que o PACAP é empregado em uma concentração de 50-750 pg/kg de ração se aplicado como alimento formulado, em uma concentração de 0,1-10 pg por grama do peso corporal se aplicado por

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2 / 2 injeção; ou em uma concentração de 50-1000 pg por litro de água se aplicado mediante banhos de imersão.

9. Combinação de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende “o peptídeo ativador da adenilato ciclase de pituitária” (PACAP) e pelo menos um antígeno de vacina para a prevenção de doenças causadas por agentes infecciosos em peixe.

10. Combinação de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o PACAP e o antígeno são administrados de forma simultânea, separada ou sequencial no curso de um mesmo esquema de imunização.

11. Combinação de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o PACAP é empregado em uma concentração de 50-750 pg/kg de ração se aplicado como alimento formulado, em uma concentração de 0,1-10 pg por grama do peso corporal se aplicado por injeção; ou em uma concentração de 50- 1000 pg por litro de água se aplicado mediante banhos de imersão.

12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de ser para uso no aumento de uma resposta imune contra um antígeno de vacina.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que antígeno é administrado de forma simultânea, separada ou sequencial no curso de um mesmo esquema de imunização.