CN103874510A - Pacap作为用于疫苗的分子佐剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)作为用于疫苗的分子佐剂的用途。除了其他应用之外，所述疫苗尤其可以用于针对传染因子(例如，影响哺乳动物、鸟类和水生生物的病毒、细菌和外寄生物)的保护作用。与特定抗原相组合的PACAP显示出其作为用于增加宿主针对所述抗原的免疫应答的佐剂的效用。当通过口服途径、通过注射或者在水生生物的情况下通过浸浴来施用包含PACAP的疫苗组合物或疫苗组合时，可以观察到该类型的应答。

Description

PACAP作为用于疫苗的分子佐剂的用途
技术领域
本发明涉及医药、分子生物学和免疫学领域，特别地涉及开发疫苗和用于所述疫苗的佐剂。特别地，本发明揭示了垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)作为用于疫苗的分子佐剂的用途，所述疫苗在免疫接种策略中使用。
发明背景
疫苗接种的主要目的是诱导针对病原体的特异且有效的免疫应答，其产生针对感染和／或针对疾病的保护作用并且导致它们的根除。通过在疫苗制剂中添加确定化合物可以改进针对确定抗原的免疫应答这一概念在大约100年前已经被证实，当时铝盐被引入到制剂中并被称为“佐剂”(G.Leroux-Roels(2010)Vaccine28S C25-C36)。
传统的疫苗由灭活或减毒的病原微生物组成，或者由源自这些微生物的毒素组成。尽管使用灭活或减毒的病原微生物具有高的免疫原性，但是其目前在疫苗学中具有很少的吸引力，这是由于这些制备物所具有的高毒性。因此，在关于开发基于重组蛋白亚基、合成肽和质粒脱氧核糖核酸(DNA)的新一代疫苗的研究中，对于佐剂存在着日益增长的兴趣。这些新型变化形式尽管毒性较小，但是当在没有免疫刺激佐剂的情况下进行施用时，其免疫原性大大降低。正是由于这个原因，近年来对于获得安全且更强有力的佐剂的需求已经增加(Saenz等人，(2010)Vaccine28(47)：7556-7562)。
尽管佐剂的使用是熟知的，但是它们作用的方式还较不清楚。认为，它们通常通过数种机制来提高疫苗的效力，这些机制包括：1)提高树突细胞对于抗原的加工和呈递；2)通过由识别与病原体相关的模式的受体(例如“Toll”型受体)所介导的信号传导途径来诱导“危险”信号；和3)通过激活可激活淋巴细胞的共刺激信号。这些机制通过诱导细胞因子以及上调合适的共刺激信号的表达而引发(Secombes(2010)Fish&Shellfish Immunology，409-416)。
作为佐剂，已经研究了数种内源性分子和蛋白质(Ying和Kwang(2000)Fish&Shellfish Immunology10，375-378；Lingnau等人，(2007)Expert Rev Vaccines6(5)：741-6；Zhang等人，(2010)Vaccine28：5114-5127)，并且已经证明，某些具有免疫刺激特性的肽可以在体内作为佐剂起作用，从而刺激肽或蛋白质性质的抗原的免疫应答(Saenz等人，(2010)Vaccine28(47)：7556-7562)。
PACAP属于肠促胰液素／胰高血糖素／血管活性肠肽超家族(Miyata等人，(1989)Biochem Biophys Res Commun164：567-574)。PACAP是一种多功能的神经肽，其在哺乳动物中作为亲垂体和亲神经的因子例如神经递质、神经调质和血管舒张剂而履行重要的功能(Arimura A.(1998)Japanese Journal of Physiology48：301-31)。此外，还证明了其在细胞分裂、分化和细胞死亡的调节中的功能(Sherwood等人，(2000)EndocrineReview21：619-670)。在生物学上，该肽分别以38个氨基酸(PACAP38)和27个氨基酸(PACAP27)的两种分子形式存在(Miyata等人，(1990)Biochemical and Biophysical Research Communications170：643-8)。PACAP的生物学作用通过该肽与属于腺苷酸环化酶偶联受体家族的两种受体类型的相互作用来介导：I型受体，其高度特异于PACAP并被命名为PAC-1；和II型受体，其具有与对于血管活性肠肽(VIP)的亲和力相同的对于PACAP的亲和力，并被称为VPAC-1和VPAC-2(Vaudry等人，(2000)Pharmacol Rev52：269-324)。
PACAP广泛分布在各种不同的组织中，包括那些与免疫系统相关的组织，尽管该肽及其受体在哺乳动物免疫系统的细胞中的存在只是部分地得到了阐明(Gaytan等人，(1994)Cell Tissue Res276：223-7；Abad等人，(2002)NeuroImmunoModulation10：177-86)。
PACAP通过调控白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)来调节炎症反应(Martínez等人，(1996)J Immunol156(11)：4128-36；Martínez等人，(1998)J Neuroimmunol85(2)：155-67；Martínez等人，(1998)J LeukocBiol63(5)：591-601)。
在经激活的巨噬细胞中，PACAP抑制促炎细胞因子的产生并刺激抗炎细胞因子的产生，从而以这种方式允许实现免疫系统的内环境稳定。另外，还已知PACAP降低共刺激分子B7.1／B7.2的表达和随后的辅助性T细胞(Th)的激活。另一方面，在先前经刺激的巨噬细胞中，PACAP通过其受体PAC-1来抑制IL-6的产生，从而抑制炎症(Martínez等人，(1998)J Neuroimmunol85(2)：155-67；Martínez等人，(1998)J LeukocBiol.1998，63(5)：591-601)。面对强烈的炎症刺激或中毒，PACAP对于IL-6转录的抑制作用有助于组织保护和免疫系统的内环境稳定(Martínez等人，(1998)J Neuroimmunol85(2)：155-67；Martínez等人，(1998)J Leukoc Biol.1998May，63(5)：591-601)。相反地，在未经刺激的巨噬细胞中，PACAP诱导B7.2的表达并促进向Th2表型的细胞分化(Delgado和Ganea(2001)Arch Immunol Ther Exp(Warsz)49(2)：101-10)。已经报道了在鸭的淋巴器官中PACAP的存在(Squillacioti等人，(2005)Anatomia，Histologia，Embryologia.第34卷，IssueSupplement s1，第49页)。
已经提出了在哺乳动物中使用PACAP作为治疗剂以治疗自身免疫疾病，例如败血症性休克、类风湿性关节炎和克罗恩病(Gomariz等人，(2006)Ann.N.Y.Acad.Sci.1070：51-74)。已知在自身免疫疾病中存在有不受控的针对机体自身物质和组织的免疫应答。在这方面，通过适当地平衡细胞因子和趋化因子与其受体、通过募集免疫系统的细胞和通过调节Th1细胞和这些细胞所分泌的细胞因子的产生和激活，PACAP在自身免疫疾病的动物模型中预防炎症。
此外，已知在免疫系统内环境稳定中所牵涉的分子(例如“Toll”型受体)对于先天免疫应答的激活来说是必不可少的，所述先天免疫应答增强了适应性免疫应答。然而，这种类型的应答可以导致急性和／或慢性炎症的发病、自身免疫和癌症(Gomariz等人，(2010)CurrentPharmaceutical Design16：1063-1080)。在这方面，已知VIP-PACAP系统参与编码这些“Toll”型受体的基因的表达的调节(Gomariz等人，(2006)Ann.N.Y.Acad.Sci.1070：51-74)，其中这两种肽都可能引起在这些受体的产生的调节途径中的紊乱。
PACAP减小细胞因子的循环水平并抑制由内源分子HMGB1(高速泳动族盒(high mobility group box)1)所介导的细胞因子释放(Tang等人，(2008)International Immunopharmacology8(12)：1646-1651)。已知HMGB1分子及其衍生肽能够作为佐剂起作用，从而增加针对肽和蛋白质性质的抗原的免疫应答(Saenz等人，(2010)Vaccine28(47)：7556-7562)。
关于PACAP在鱼类免疫系统的调控中的功能的知识局限于由我们的工作组所进行的研究，在所述研究中证明了，通过浸浴或腹膜内注射来进行的尖齿胡鲇(Clarias gariepinus)的PACAP的施用在所述鱼类的幼体和青年体中刺激了先天免疫的参数，例如溶菌酶、衍生自氧化氮合酶活性的代谢物和免疫球蛋白M的产生，以及增加了抗氧化防御的各种不同的参数(Carpio等人，(2008)Fish and Shellfish Immunology25：439-45；Lugo等人，(2010)Fish and Shellfish Immunology29：513-520)。该肽的这些特性公开在具有国际公开号WO2007／059714的专利申请“Neuropéptidos para el cultivo de organismos acufáticos”中。
目前，在人类医学和兽医学领域中，仍然有兴趣鉴定出这样的化合物，其可以用作安全且更强有力的佐剂，并且可以掺入到现有的疫苗和正在开发的疫苗中。
发明描述
本发明通过提供新的佐剂备选方案而解决了上述问题，所述佐剂能够大大地增强对于共同施用的抗原的免疫应答，并因而成为高度有效的佐剂。本发明的目标是“垂体腺苷酸环化酶激活肽”(PACAP)作为存在于在各种不同免疫接种策略中所使用的疫苗之中的抗原的分子佐剂的用途。在本发明一个实施方案中，所述包含作为佐剂的PACAP的疫苗被设计成用于针对传染因子的免疫接种。这些传染因子尤其可以为病毒、细菌和外寄生物。在一个特别的实施方案中，所述传染因子影响哺乳动物、鸟类和鱼类。
本发明中所使用的术语“垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)”包括以任何其变体(PACAP27或PACAP38)形式的该分子，其分离自其天然来源、具有合成来源或者通过重组DNA技术产生；并且包括其作为肽或者以核酸的形式进行的使用。
在本发明的情形中，术语“分子佐剂”是指能够调控针对疫苗抗原的免疫应答从而使其增加的任何具有蛋白质性质的分子。
迄今为止尚没有证明了PACAP作为分子佐剂的用途的研究。如上面所述的，已经提出了在哺乳动物中使用该肽作为治疗剂以治疗自身免疫疾病，例如败血症性休克、类风湿性关节炎和克罗恩病(Gomariz等人，(2006)Ann.N.Y.Acad.Sci.1070：51-74)。在这方面，通过适当地平衡细胞因子和趋化因子与其受体、通过募集免疫系统的细胞和通过调节Th1细胞和这些细胞所分泌的细胞因子的产生和激活，PACAP在自身免疫疾病的动物模型中预防炎症。鉴于这些发现，作为我们的研究的一部分而发现的该效果经证明是出人意料的，我们的研究证明PACAP与抗原相联合的施用通过促刺激细胞因子的刺激和体液免疫应答的其他要素的增长而增加了针对所述抗原的免疫应答。
此外，已知VIP-PACAP系统参与编码“Toll”型受体的基因的表达的调节(Gomariz等人，(2006)Ann.N.Y.Acad.Sci.1070：51-74)，其中这两种肽都可能引起在这些受体的产生的调节途径中的紊乱，这使得其作为用于疫苗的佐剂的用途不是显而易见的。与本发明中所揭示的PACAP的新用途相反的另一要素是显示了该肽减小细胞因子的循环水平并抑制由内源分子HMGB1所介导的细胞因子释放(Tang等人，(2008)International Immunopharmacology8(12)：1646-1651)。
在本发明中首次证明了，在体液应答水平上和在细胞应答水平上均观察到针对与PACAP共施用的疫苗抗原的特异性免疫应答的增加。
本发明的目标还为疫苗组合物，其包含作为佐剂的PACAP、至少一种疫苗目的抗原和药学上可接受的载体或稀释剂。该包含作为佐剂的PACAP和至少一种目的抗原的疫苗组合物引起局部或全身的针对所述目的抗原的免疫应答。本发明的疫苗组合物或疫苗可以基于，例如重组蛋白、减毒的微生物株系或核酸。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物可以通过口服途径、通过注射或者通过浸浴来进行施用。
在本发明的情形中，在所述疫苗组合物中，所述PACAP作为通过从其天然来源中分离、以合成方式或者通过重组DNA技术而获得的肽来进行施用。其还可以以核酸的形式来进行使用。
在本发明的各种不同的实施方案中，将包含与数种抗原相联合的PACAP的疫苗施用给哺乳动物、鸟类和鱼类，其中首次证明了PACAP的佐剂效应。出人意料地，观察到在哺乳动物、鸟类和鱼类中与抗原相联合的神经肽PACAP的施用增加了针对所述抗原的特异性抗体的水平。另外，首次在体外证明了，PACAP的施用显著地增加在鱼类白细胞中白介素1β(IL1β)和白介素15(IL15)的转录物。
在公开了包含作为佐剂的PACAP的疫苗组合物或疫苗组合的本发明的各种不同的实施方案中，使用了各种各样的抗原，例如卵清蛋白(OVA)、典型猪瘟病毒(CSFV)的包膜的糖蛋白E2、禽流感病毒的血凝素(HA)、Caligus rogercresseyi的多肽my32、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的经灭活的细胞、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的106kDa的多蛋白(NH2-VP2-VP4VP3-COOH)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的糖蛋白G和纤毛寄生物多子小瓜虫(Ichthyophthiriusrnultifiliis)。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述疫苗组合物的特征在于，如果作为配合饲料进行应用，那么以50-750μg／Kg饲料的浓度来使用所述PACAP；如果通过注射进行应用，那么以0.1-10μg／克体重的浓度来使用所述PACAP；或者如果通过浸浴进行应用，那么以50-1000μg／升水的浓度来使用所述PACAP。当所述组合物用作鱼类的疫苗时，最后的那种是特别合适的。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗原和所述佐剂PACAP可以构成疫苗组合的一部分，所述疫苗组合的要素可以在同一个免疫接种方案的过程中同时地、分开地或顺次地进行施用。在本发明的一个特别的实施方案中，所述组合用于预防病毒、细菌和寄生物感染。为此，在本发明的一个实施方案中，所述PACAP和所述抗原通过口服途径、通过注射或者通过浸浴来进行施用。
在一个特别的实施方案中，将所述PACAP作为配合饲料进行应用，以50-750μg／Kg饲料的浓度。在本发明的第二个实施方案中，所述PACAP通过注射进行应用，以0.1-10μg肽／克体重的浓度。在本发明的另一个实施方案中，将所述PACAP通过浸浴应用给鱼类，以50-1000μgPACAP／升水的浓度。
本发明的目标还为增加针对疫苗抗原的免疫应答的方法，其中使用包含作为所述抗原的佐剂的“垂体腺苷酸环化酶激活肽”(PACAP)的组合物。根据本发明中所公开的方法，所述作为佐剂的PACAP和所述抗原可以在同一个免疫接种计划的过程中同时地、分开地或顺次地进行施用。在本发明的方法中，将PACAP作为佐剂进行使用，作为通过从其天然来源中分离、通过化学合成或者通过重组DNA技术而获得的肽。本发明还包括其中将用作佐剂的PACAP以核酸的形式进行施用的方法。根据本发明的方法，在体液应答水平上和在细胞应答水平上均观察到针对目的疫苗抗原的特异性免疫应答的增加。
根据在本发明的数个实施方案中所证明的，针对目的抗原的免疫应答的提高或增加最终变为更高水平的针对各种不同传染因子(其中包括病毒、细菌和外寄生物实体)的保护作用。
附图简述
图1.通过用与神经肽PACAP38共施用的OVA对小鼠进行免疫接种而诱导的总免疫球蛋白(IgG)(A)、IgG1(B)和IgG2a(C)的滴度。设立了两个试验组，每组6只动物。在第0和7天，以在0.2mL PBS中的6μgOVA的剂量，通过腹膜内途径对阴性对照组(磷酸盐缓冲盐水(PBS)／OVA)进行接种。在笫0和7天，以在0.2mL PBS中的6μgOVA+0.5μgPACAP38的剂量，通过腹膜内途径对还接受PACAP38的组(PBS／OVA+肽)进行接种。不同的字母指明了在统计学上显著的差异。
图2.在用基于E2-PACAP的疫苗组合物进行疫苗接种的猪中细胞应答的评价，测量了在用E2(组1)、E2+PACAP(组2)和安慰剂(组3)进行疫苗接种后第5天分离的猪淋巴细胞。(A)淋巴细胞增殖测定法：将结果表示为刺激指数(SI)，其被定义为经刺激的培养物的每分钟计数(cpm)与未经处理的对照组的cpm之间的比率。SI>2的淋巴细胞增殖应答被认为是阳性的。(B)IFN-γ分泌应答：其通过实时聚合酶链反应(PCR)来测定。将值表示为2-ΔΔCt的算数平均值。(**)p<0.01。
图3.在用20μgHA或HA-PACAP进行免疫接种的鸡中的血凝抑制的滴度(A)。将抗体滴度的算数平均值表示为产生血凝抑制的最高血清稀释度的倒数值的log2。在经免疫接种的鸡中的细胞应答(B)。通过实时PCR来测定IFN-γ分泌应答。将值表示为2-ΔΔCt的算数平均值。(**)p<0.01。
图4.通过实时PCR来分析PACAP38对于在健康鳟鱼的外周血白细胞(A)和头肾白细胞(B)中IL1β转录的体外效应。在处理48小时之时，评价了浓度为10-10、10-9和10-8M的PACAP38的效应。该实验重复4次。将白细胞培养物以两次重复进行处理，并且以三次重复来进行PCR反应。将数据表示为相对于组成型表达的内源基因延伸因子1α(EF1α)而言的目的基因(IL1β)的相对表达的平均值±平均值的标准差(SD)。*(p<0.05)指明，目的基因的相对表达在统计学上高于在未经处理的白细胞培养物(阴性对照)中的其相对表达。
图5.通过实时PCR来分析PACAP38对于在健康鳟鱼的外周血白细胞(A)和头肾白细胞(B)中白介素15(IL15)转录的体外效应。在处理48小时之时，评价了浓度为10-10、10-9和10-8M的PACAP38的效应。该实验重复4次。将白细胞培养物以两次重复进行处理，并且以三次重复来进行PCR反应。将数据表示为相对于组成型表达的内源基因EF1α而言的目的基因(IL15)的相对表达的平均值±平均值的标准差(SD)。*(p<0.05)指明，目的基因的相对表达在统计学上高于在未经处理的白细胞培养物(阴性对照)中的其相对表达。
图6.在普通鲤鱼中针对嗜水气单胞菌的凝集抗体的滴度。y轴的值表示平均值±标准误差。(*)p<0.05，(**)p<0.01。组1：用PBS进行注射；组2：用经福尔马林灭活的嗜水气单胞菌细胞进行注射；组3：用经福尔马林灭活的嗜水气单胞菌细胞和PACAP(1μg／鱼)进行注射。
图7.通过肌内途径共施用剂量为1μg／鱼的DNA疫苗(pP-IPNV)与质粒的效应，所述质粒具有在人巨细胞病毒即时早期启动子控制下的尖齿胡鲇PACAP的互补DNA序列(pCMV-PACAP)。在疫苗接种后30天，通过腹膜内注射100μL IPNV(1×107半数组织培养感染量(TCID50)／mL／每鱼)来将鱼暴露于病毒。在感染后7天，每组处死10条鱼并通过实时反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来评价在头肾中的病毒载量。所述值表示平均值±标准差。不同的上标字母表示组之间的在统计学上显著的差异。组1：用PBS进行注射的鱼；组2：用剂量为1μg／鱼的pP-IPNV进行注射的鱼；组3：共施用pP-IPNV(1μg／鱼)和pCMV-PACAP(剂量为0.5μgpCMV-PACAP／鱼)的组；组4：共施用pP-IPNV疫苗(1μg／鱼)和pCMV(剂量为0.5μg pCMV／鱼)的组；组5：共施用pP-IPNV(剂量为1μg／鱼)和pCMV-PACAP(剂量为0.05μgpCMV-PACAP／鱼)的组；组6：共施用pP-IPNV(1μg/鱼)和pCMV(剂量为0.05μgpCMV／鱼)的组。
图8.在通过肌内途径用基于编码VHSV糖蛋白G的DNA疫苗(pG-VHSV)和肽PACAP进行免疫接种的10g的虹鳟中的累积死亡率百分比。在疫苗接种后4周，通过浸浴来将鱼暴露于病毒(1×105TCID50／mL／鱼)。在攻击后4周期间，评价累积死亡率。组1：用PBS进行注射的鱼；组2：pG-VHSV(0.01μg／鱼)；组3：pG-VHSV(0.01μg／鱼)和PACAP(0.1μg PACAP／鱼)；组4：pG-VHSV(0.01μg／鱼)和PACAP(0.5μgPACAP／鱼)。
实施例
实施例1.在小鼠中OVA和PACAP的共免疫接种对于体液免疫应答的效应
选择12只体重为20g的雌性BALB／c小鼠，并将其分成2个试验组(每组6只动物)。在第0和7天，以在0.2mL PBS中的6μgOVA的剂量，通过腹膜内途径对阴性对照组(PBS／OVA)进行接种。在笫0和7天，以在0.2mL PBS中的6μg OVA+0.5μg PACAP38的剂量，通过腹膜内(IP)途径对用PACAP38进行处理的组(PBS／OVA+肽)进行接种。在免疫接种方案的第15天，从动物中抽取血液并评价总IgG、IgG1和IgG2a的滴度。
在图1A、B和C中，分别显示了通过用与PACAP38共同施的OVA对小鼠进行免疫接种而诱导的总IgG、IgG1和IgG2a的滴度。“PBS／OVA+肽”组的动物显示出在统计学上高于对照组的对于OVA的特异性总IgG的滴度(图1A)。同样地，观察到，在用OVA+PACAP进行免疫接种的组中对于OVA的特异性IgG1和IgG2a的滴度显著地高于在仅用OVA进行免疫接种的组中所观察到的那些。
实施例2.在用基于E2-PACAP的疫苗组合物进行疫苗接种的猪中细胞应答的评价
抗原E2是CSFV的包膜的主要糖蛋白。为了评价在用基于E2-PACAP的疫苗组合物进行疫苗接种的猪中的细胞应答并将该细胞应答与由抗原E2所产生的细胞应答相比较，选择出18只平均体重为20Kg且在血清学上CSFV阴性的健康猪，它们来自没有该疾病既往史并且在先前的3年中未进行疫苗接种的单位。将所述猪分配到3个组中，每组6只动物，水和饲料随意取用。向每只动物应用具有下列抗原量的疫苗组合物：25μg的重组E2(组1)；和25μg的与相似量的PACAP38共施用的E2(组2)。设立组3作为安慰剂组。将免疫原配制成油性佐剂的乳液，并且通过经由肌内(IM)途径注射2mL来进行接种。进行单次免疫接种。在免疫接种后第8天，通过IM途径用CSFV(105半数致死量(LD50)的“Margarita”分离物)攻击动物。进行临床体征的每天分析，并且在第3和5天取血样以评价淋巴细胞增殖和IFN-γ表达(作为细胞应答的指示物)。相比于其他组而言，在用E2-PACAP进行疫苗接种的动物中，在第5天检测到在增殖测定法期间淋巴细胞应答的增加(图2A)和升高的IFN-γ水平(图2B)。这证明，抗原E2与PACAP的共施用产生了针对CSFV的细胞免疫应答。
实施例3.在鸡中用禽流感病毒(A／VietNam1203／2004病毒)的HA和PACAP进行共免疫接种对于体液和细胞免疫应答的效应
为了免疫接种，使用3周龄的白色来亨鸡。分配成10只鸡／实验组。设立3个实验组：
组1：20μg HA
组2：20μg HA+0.5μg PACAP27
组3：20μg牛血清白蛋白。
以重组方式获得HA，在哺乳动物细胞中表达。将各种制剂佐以Montanide888，并且以0.5mL的终体积通过皮下途径进行施用。在免疫接种后第28天对动物进行再次免疫接种。在第0、14、28、35、42和49天取血样，以便获得血清以用于通过血凝抑制测定法来检测保护性抗体，和以便提取出白细胞以评价由各种不同免疫原产生的细胞应答。
结果显示，从在施用再次免疫接种剂量后的笫35天开始，用HA-PACAP进行免疫接种的鸡显示出比用HA进行免疫接种的鸡优异的抗体应答(图3A)。相比于用HA进行免疫接种的组或对照组而言，通过IFN-γ的刺激来测量的细胞应答在用HA-PACAP进行处理的组中显示出增加(图3B)。
实施例4.PACAP对于在健康虹鳟(裂喉大麻哈鱼(Oncorhynchusmykiss))的外周血和头肾的白细胞中IL1*β和IL15的表达的效应
使用没有VHSV、IPNV和感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)的体重为大约50克的虹鳟(裂喉大麻哈鱼)的青年体。将鱼(n=5)用甲磺酸盐(Sigma，USA)进行麻醉，并且无菌地首先从尾静脉获取外周血，然后获取头肾。根据由Graham和Secombes(Graham和Secombes(1998)Immunology65：293-7)所描述的方法，独立地从5条鳟鱼中分离外周血和头肾的白细胞。
将细胞以5×106个细胞／mL的浓度重悬浮在具有5％胎牛血清的L-15培养基中，并且以1mL／孔分配在24-孔平板中。以两次重复，将白细胞用3个浓度的通过化学合成获得的尖齿胡鲇PACAP38(10-10 M、10-9M和10-8M)进行处理，并且使用以两次重复进行分配的未经处理的白细胞的悬浮液作为阴性对照。
在处理后48小时，评价IL1β和IL15的水平。为此，从对照白细胞培养物和用PACAP进行处理的白细胞培养物中纯化总核糖核酸(RNA)，通过由Chomczynski和Sacchi(Chomczynski和Sacchi(1987)Anal.Biochem.162：156-9)所描述的方法。考虑到为扩增ILlβ和IL15而设计的引物在互补DNA(cDNA)和基因组DNA之间没有区别，用DNA的核酸酶，特别是用RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega)处理从各种不同组织中纯化出的总RNA，目的是去除可能存在于样品中的基因组DNA。
为了合成cDNA，使用一套商业的采用反转录酶SuperScript III(Invitrogen)的试剂。最后，关于定量PCR(qPCR)反应，使用商业来源的PCR混合物：Power SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystem)。将qPCR的结果针对组成型表达的内源基因(特别是EF1α)进行标准化，并且以三次重复来施行。将结果表示为2-ΔCt，其中ACt等价于所评价的基因的阈值循环(Ct)值减去标准化者基因(EF1α)的Ct值所得的余额。
在用10-10M的PACAP38进行处理的外周血白细胞培养物中，IL1β的水平在处理48小时后增加。在10-9M的剂量下，也观察到相对于阴性对照而言PACAP38对于该基因的转录的刺激效应，但检测到的表达水平低于用10-10M的剂量所获得的水平。这些结果显示了以低浓度(在10-9-10-10M的范围内)，PACAP38对于IL1β的转录的正效应(图4A)。在头肾白细胞中，PACAP38对于IL1β的转录的效应比在外周血白细胞中更温和，其中在10-9M和10-8M的剂量下观察到刺激效应(图4B)。
另外，在以10-10和10-9M的剂量用PACAP38进行刺激的白细胞培养物中，观察到PACAP38对于IL15的表达的刺激效应。在10-9M的剂量下获得最高的表达值(图5A)。在头肾白细胞中，如关于IL1β的表达所观察到的一样，效应是更温和的，其中在10-9M的中间剂量下观察到在统计学上高于阴性对照的IL15的表达水平(图5B)。
实施例5.受控攻击测定法，其中在事先通过腹膜内途径用抗原my32和用与PACAP共施用的my32进行免疫接种的鲑鱼(大西洋鲑(Salmosalar))中用Caligus rogercresseyi进行侵染
在大肠杆菌(E.coli)破裂沉淀物中以重组形式获得蛋白my32。已知，在大西洋鲑中的C.rogercresseyi攻击测定法之中，通过腹膜内(IP)途径施用的该蛋白质在第二代寄生物中产生57％的侵染抑制(Carpio等人，(2011)Vaccine.201129(15)：2810-20)。
为了证明PACAP对于该蛋白质的佐剂效用，设计了在受控条件下的在大西洋鲑中的疫苗接种和攻击实验，在该实验中设立6个实验组，每组25只动物(平均体重为80g)：
组1：用PBS进行IP注射；
组2：用剂量为1μg／鱼的PACAP38进行IP注射；
组3：用剂量为3μg／克体重(gbw)的my32进行IP注射；
组4：通过IP注射剂量为3μg／gbw的my32和剂量为lμg／鱼的PACAP38来进行共施用；
组5：用剂量为3μg／gbw的my32进行IP注射并且在用my32实施免疫接种之前和之后一周期间每天用配制有250μgPACAP／Kg饲料的饲料进行饲喂的鱼。
在该实验过程中，将鱼依照1％的其体重每天两次用不含药用成分的平衡商业配方进行饲喂，除了组5之外，对于组5在免疫接种之前和之后一周供给配制有PACAP的相同的商用配方，根据Adelmann等人((2008)Vaccine26，837-844)对于口服施用病毒VHSV的减毒株所描述的。
在500个任意热单位后，使鱼适应海水两周。然后，向每个槽中添加2000±200只桡足幼体。在无水流的情况下，在黑暗中，和在由Stone等人(Dis Aquat Organ，2000，41：141-149)所建议的温度、盐度和氧的条件下，将鱼维持24天。每48小时手工进行水的更换和过滤。
在24天时，将鱼麻醉并处死，并且在立体显微镜下进行寄生物的计数。表1中所呈现的结果表明在用PACAP、my32和PACAP+my32进行处理的组中侵染水平降低。最大的降低发生在组4和5中，这证明了PACAP对于共施用的抗原的佐剂效应。
表1.在疫苗接种和C.rogrecresseyi攻击实验中，
在攻击后24天时的寄生物的计数
实验组 寄生物数目／鱼 侵染抑制(％)
PBS 37±3a -
PACAP 29±5b 22
my32 17±8c 55
PACAP-IP+my32-IP 8±3d 79
PACAP-口服+my32-IP 5±2e 86
字母指明了在统计学上显著的差异。
将侵染抑制百分比计算为“(1-在实验组中的寄生物数目／在PBS对照中的寄生物数目)×100”。
实施例6.在普通鲤鱼(Cyprinus carpio)针对嗜水气单胞菌的体液免疫应答中PACAP的佐剂效应
该实验用40±10g的鲤鱼(普通鲤鱼)来进行。将这些鱼维持在处于28±2℃的温度的600L的水族槽中。设立3个实验组，每组10条鲤鱼，向这些鲤鱼通过腹膜内途径注射下列免疫原：
组1：PBS；
组2：灭活的嗜水气单胞菌细胞；
组3：灭活的嗜水气单胞菌细胞和1μgPACAP38／鱼。
在第0和14天对鱼进行注射，并且在第0和21天从鱼的尾静脉收集血液。结果显示，相比于仅用该细菌进行免疫接种的组而言，在用该细菌加上PACAP进行免疫接种的组中凝集抗体的滴度显著更高(图6)。这些结果证明了PACAP在鱼中作为分子佐剂的效应。嗜水气单胞菌细胞的制备以及抗体滴度的测定根据Yin等人((1996)Fish&ShellfishImmunology6，57-69)来进行。
实施例7.受控攻击测定法，其中在事先通过腹膜内途径用灭活的细菌和用与PACAP共施用的灭活的细菌进行免疫接种的普通鲤鱼中用嗜水气单胞菌进行侵染
该实验用30±5g的普通鲤鱼来进行。将这些鱼维持在处于30±2℃的温度的250L的水族槽中。设立3个实验组，每组20条鲤鱼，对这些鲤鱼以腹膜内方式进行注射：
组1：PBS；
组2：灭活的嗜水气单胞菌细胞；
组3：灭活的嗜水气单胞菌细胞和1μgPACAP38／鱼。
在第0和14天对鱼进行注射。在第21天，通过IP注射LD50的该细菌来进行攻击，并且在7天期间记录死亡率。将相对存活百分比(RPS)计算为：
RPS(％)=(对照的鱼的死亡率的％-经处理的鱼的死亡率的％)／(对照的鱼的死亡率的％)×100。
作为结果，在组2中获得65％的RPS而在组3中获得95％的RPS，这证明了PACAP的施用增加了经免疫接种并受攻击的鱼针对该病原体的存活率。
实施例8.PACAP与基于编码IPNV的106kDa多蛋白(NH2-VP2-VP4VP3-COOH)的基因的DNA疫苗的共施用在用该病毒实验性地进行攻击的虹鳟(裂喉大麻哈鱼)中的效应
进行实验以评价通过肌内途径共施用PACAP与基于编码IPNV的106kDa多蛋白(NH2-VP2-VP4VP3-COOH)的基因的DNA疫苗在用所述病毒实验性地进行攻击的虹鳟中的效应。设定6个实验组，每组15条鱼(12±1g)，并且将其维持在10-12℃的水中。
组1：用PBS进行注射的鱼；
组2：用剂量为1μg／鱼的DNA疫苗(pP-IPNV)进行注射的鱼；
组3：向其共注射剂量为lμg／鱼的DNA疫苗(pP-IPNV)与剂量为0.5μgpCMV-PACAP／鱼的具有在人巨细胞病毒立即早期启动子控制下的尖齿胡鲇PACAP的cDNA序列(pCMV-PACAP)的质粒的组；
组4：向其共注射pP-IPNV疫苗(1μg／鱼)与剂量为0.5μgpCMV／鱼的不携带在CMV启动子(pCMV)控制下的PACAP的互补DNA序列的阴性对照质粒的组；
组5：向其共注射剂量为1μg／鱼的DNA疫苗(pP-IPNV)与剂量为0.05μgpCMV-PACAP／鱼的具有在人巨细胞病毒立即早期启动子控制下的尖齿胡鲇PACAP的互补DNA序列(pCMV-PACAP)的质粒的组；
组6：向其共注射pP-IPNV疫苗(1μg／鱼)与剂量为0.05μgpCMV／鱼的不携带在CMV启动子(pCMV)控制下的PACAP的互补DNA序列的阴性对照质粒的组。
在疫苗接种后30天，通过腹膜内注射100μL IPNV(1×107TCID50／mL／鱼)来将鱼暴露于病毒。在感染后7天，每组处死10条鱼并评价头肾中的病毒载量。
为了测定病毒载量，从各个样品中分离出RNA并且从1μgRNA开始进行反转录反应。通过实时PCR来评价VP1基因的表达的检测。结果显示在图7中。
相比于共注射pP-IPNV和空载体的组而言，pP-IPNV与pCMV-PACAP的共施用显著地降低了病毒载量。在所测试的pCMV-PACAP剂量之间没有差异。
实施例9.肽PACAP与基于编码VHSV糖蛋白G的基因的DNA疫苗的共施用在用该病毒实验性地进行攻击的虹鳟(裂喉大麻哈鱼)中的效应
进行实验以评价通过肌内途径共施用尖齿胡鲇PACAP与基于编码VHSV糖蛋白G的基因的DNA疫苗(pG-VHSV)在用所述病毒实验性地进行攻击的虹鳟中的效应。设定4个实验组，每组20条鱼(10±2g)，并且将其维持在10-12℃的水中。
组1：用PBS进行注射的鱼；
组2：向其注射DNA疫苗pG-VHSV的组(0.01μg／鱼)；
组3：向其共注射剂量为0.01μg／鱼的DNA疫苗pG-VHSV与剂量为0.1μgPACAP／鱼的尖齿胡鲇PACAP的组；
组4：向其共注射剂量为0.01μg／鱼的DNA疫苗pG-VHSV与剂量为0.5μgPACAP／鱼的尖齿胡鲇PACAP的组。
在疫苗接种后4周，通过在包含(I×105TCID50／mL／鱼)的感染剂量的VHSV的水中浸浴2小时来将鱼暴露于病毒。在攻击后4周期间评价累积死亡率，并且结果显示在图8中。
相比于施用单独的DNA疫苗而言，对于0.1和0.5μgPACAP／鱼的肽剂量，该肽与DNA疫苗的共施用将死亡率分别降低了15％和29％。
实施例10.在用纤毛寄生物多子小瓜虫的掠食体进行免疫接种后，PACAP的施用对于斑鲴(Ictalurus punctatus)存活率的效应
进行实验以评价在用纤毛寄生物多子小瓜虫的掠食体进行免疫接种后，PACAP的施用对于斑鲴存活率的效应，根据由Wang和Dickerson((2002)Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology9(1)，176-181)所建议的疫苗接种和攻击程序。为此，使用12±5g的鱼。设立4个实验组，每组25条鱼：
组1：在第1和35天用PBS进行免疫接种的鱼。
组2：在第1天用8000只多子小瓜虫的活掠食体和在第35天用10000只该寄生物的活掠食体进行免疫接种的鱼。
组3：在第1天用8000只多子小瓜虫的活掠食体和在第35天用10000只该寄生物的活掠食体进行免疫接种的鱼。还在攻击前两周内，以每隔一天一次，通过6次浸浴(以100μg肽／L水的剂量，1小时)向这些鱼施用PACAP38。
组4：在第1天用8000只多子小瓜虫的活掠食体和在第35天用10000只该寄生物的活掠食体进行免疫接种的鱼。这些鱼通过与组3相似的程序而经历浸浴1小时，但没有肽PACAP。
在免疫接种之前，用福尔马林处理鱼以去除存在的外寄生物。将鱼维持在23±2℃下和连续水流中。
在第84天，用15000只掠食体对鱼进行攻击。在攻击后30天期间获取死亡率数据。结果显示在表2中。这些结果显示了经免疫接种并同时用PACAP进行处理的鱼的存活率的27％的增加。
表2.用多子小瓜虫的活掠食体进行免疫接种的、通过浸浴用PACAP进行处理或未用其进行处理的并用该寄生物进行攻击的斑鲴的存活率
Figure BPA0000186410570000181
ib：这些鱼在攻击前两周内，以每隔一天一次，经历6次浸浴(1小时)。

Claims (17)

1.垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)作为疫苗抗原的分子佐剂的用途。
2.权利要求1的用途，其特征在于，所述PACAP作为肽或者以核酸的形式来进行施用。
3.权利要求1的用途，其特征在于，作为肽进行施用的PACAP以下列方式来获得：a)通过从其天然来源中分离，b)以合成方式，或者c)通过重组DNA技术。
4.权利要求1的用途，其特征在于，所述疫苗抗原用于预防由传染因子引起的疾病。
5.权利要求4的用途，其特征在于，所述疾病发生在哺乳动物、鸟类和鱼类中。
6.权利要求4的用途，其特征在于，所述传染因子为病毒、细菌或外寄生物。
7.疫苗组合物，其包含垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、至少一种疫苗抗原和药学上可接受的载体或稀释剂。
8.权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物用于预防由传染因子引起的疾病。
9.权利要求7的组合物，其特征在于，所述组合物通过口服途径、通过注射或者通过浸浴来进行施用。
10.权利要求7的组合物，其特征在于，所述PACAP作为a)通过从其天然来源中分离，b)以合成方式，或者c)通过重组DNA技术而获得的肽来进行施用；或者以核酸的形式来进行施用。
11.权利要求9和10的组合物，其特征在于，如果作为配合饲料进行应用，那么以50-750μg／Kg饲料的浓度来使用所述PACAP；如果通过注射进行应用，那么以0.1-10μg／克体重的浓度来使用所述PACAP；或者如果通过浸浴进行应用，那么以50-1000μg／升水的浓度来使用所述PACAP。
12.疫苗组合，其包含垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)和至少一种疫苗抗原。
13.权利要求12的组合，其特征在于，所述PACAP和所述抗原在同一个免疫接种计划的过程中同时地、分开地或顺次地进行施用。
14.权利要求13的组合，其特征在于，如果作为配合饲料进行应用，那么以50-750μg／Kg饲料的浓度来使用所述PACAP；如果通过注射进行应用，那么以0.1-10μg／克体重的浓度来使用所述PACAP；或者如果通过浸浴进行应用，那么以50-1000μg／升水的浓度来使用所述PACAP。
15.增加针对疫苗抗原的免疫应答的方法，其特征在于，所述方法包括使用包含作为所述抗原的佐剂的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的组合物。
16.权利要求15的方法，其特征在于，所述包含作为佐剂的PACAP的组合物和所述抗原在同一个免疫接种计划的过程中同时地、分开地或顺次地进行施用。
17.权利要求15的方法，其特征在于，所述PACAP作为a)通过从其天然来源中分离，b)以合成方式，或者c)通过重组DNA技术而获得的肽来进行使用；或者以核酸的形式来进行使用。
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