ES2648337T3 - Uso del PACAP como adyuvante molecular para vacunas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se relaciona con el uso del péptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP) como adyuvante molecular para vacunas. Entre otras aplicaciones, dichas vacunas pueden emplearse en la protección contra agentes infecciosos, tales como virus, bacterias y ectoparásitos que afectan a los mamíferos, las aves y a los organismos acuáticos. El PACAP, combinado con un antígeno particular, demuestra su efectividad como adyuvante al aumentar la respuesta inmunológica del huésped contra dicho antígeno. Este tipo de respuesta puede observarse cuando las composiciones o combinaciones vacunales que comprenden PACAP se administran por vía oral, inyección, o por baños de inmersión en el caso de los organismos acuáticos.

Description

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DESCRIPCION
Uso del PACAP como adyuvante molecular para vacunas Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la medicina, la biología molecular y la inmunología, específicamente, con el desarrollo de vacunas y de adyuvantes para las mismas. En particular, la presente invención describe el uso del péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria (PACAP) como adyuvante molecular para vacunas, las que se emplean en estrategias de inmunización.
Antecedentes de la invención
El objetivo fundamental de la vacunación es la inducción de una respuesta inmune específica y efectiva contra un patógeno, que también produzca la protección contra una infección y/o contra una enfermedad y que resulte en su erradicación. El concepto de que la respuesta inmune contra un determinado antígeno puede mejorarse por la adición de determinados compuestos en la formulación vacunal se demostró hace aproximadamente 100 años, cuando se introdujeron sales de aluminio en las formulaciones y se les denominó "adyuvantes" (G. Leroux-Roels (2010) Vaccine 28S C25-C36).
Las vacunas tradicionales consisten en patógenos inactivados o atenuados, o en toxinas derivadas de estos microorganismos. Aunque el uso de microorganismos patógenos inactivados o atenuados presenta una elevada inmunogenicidad, actualmente es poco atractivo en la vacunología, por la alta toxicidad que presentan estas preparaciones.
Por tanto, existe un interés creciente en los adyuvantes en las investigaciones relacionadas con el desarrollo de nuevas generaciones de vacunas basadas en subunidades proteicas recombinantes, péptidos sintéticos y plásmidos de ácido desoxirribonucleico (ADN). Estas nuevas variantes, aunque menos tóxicas, son en su mayoría menos inmunogénicas cuando se administran sin un adyuvante inmunoestimulador. Debido a esto, en los últimos años, ha aumentado la necesidad de obtener adyuvantes más seguros y más potentes (Saenz y otros (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562).
Aunque el uso de los adyuvantes es bien conocido, la manera en que estos actúan está menos clara. Se considera que, de manera general, estos aumentan la eficacia de las vacunas a través de varios mecanismos que incluyen: 1) el aumento del procesamiento y presentación del antígeno por las células dendríticas, 2) la inducción de una señal de "peligro" mediante las vías de señalización mediadas por los receptores que reconocen los patrones asociados a patógenos, como los receptores tipo "Toll" y 3) mediante la activación de una señal coestimulatoria que activa los linfocitos. Estos mecanismos se desencadenan a través de la inducción de citoquinas y la sobrerregulación de la expresión de las señales coestimulatorias apropiadas (Secombes (2010) Fish & Shellfish Immunology, 409-416).
Se han estudiado varias moléculas endógenas y proteínas como adyuvantes (Ying y Kwang (2000) Fish & Shellfish Immunology 10, 375-378; Lingnau y otros (2007) Expert Rev Vaccines 6 (5): 741-6; Zhang y otros (2010) Vaccine 28: 5114-5127). También se sabe que algunos péptidos con propiedades inmunoestimulantes pueden actuar como adyuvantes in vivo, al estimular la respuesta inmune a los antígenos de naturaleza peptídica o proteica (Saenz y otros (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562).
El PACAP pertenece a la superfamilia de la secretina/glucagón/péptido intestinal vasoactivo (Miyata y otros (1989) Biochem Biophys Res Commun 164: 567-574). Es un neuropéptido multifuncional, que desempeña importantes funciones como factor hipofisiotrópico y neurotrófico, como molécula neurotransmisora, neuromoduladora y vasodilatadora en los mamíferos (Arimura A. (1998) Japanese Journal of Physiology 48: 301-31). Se ha demostrado su función en la división celular, la diferenciación y la muerte celular (Sherwood y otros (2000) Endocrine Review 21: 619670). Este péptido existe en dos formas moleculares, de 38 (PACAP38) y de 27 (PACAP27) aminoácidos (Miyata y otros (1990) Biochemical and Biophysical Research Communications 170:643-8). Las acciones biológicas del PACAP se ejercen a través de una familia de tres receptores VIP/PACAP que pertenecen a los receptores acoplados secretina proteína G: el receptor de tipo I, que es altamente específico para el PACAP y se nombra PAC-1; y los receptores de tipo II, que presentan la misma afinidad por el PACAP que por el péptido intestinal vasoactivo (VIP), y que se conocen como VPAC-1 y VPAC-2 (Vaudry y otros (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324).
El PACAP tiene una amplia distribución en varios tejidos, que incluyen aquellos relacionados con el sistema inmune, aunque la presencia de este péptido y de sus receptores en las células del sistema inmune de los mamíferos solo ha sido parcialmente esclarecida (Gaytan y otros (1994) Cell Tissue Res 276:223-7; Abad y otros (2002) NeuroimmunoModulation 10:177-86).
El PACAP modula la respuesta inflamatoria a través de la regulación de la interleuquina-6 (IL-6) y de la interleuquina-10 (IL-10) (Martínez y otros (1996) J Immunol 156(11):4128-36; Martínez y otros (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67); Martínez y otros (1998) J Leukoc Biol 63(5):591-601).
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En los macrófagos activados, el PACAP inhibe la producción de citoquinas pro-inflamatorias y estimula la producción de citoquinas anti-inflamatorias, lo cual permite la homeostasis del sistema inmune. Además, se conoce que el PACAP reduce la expresión de las moléculas coestimulatorias B7.2/B7.1 y la subsiguiente activación de las células T auxiliadoras (Th). Por otra parte, en los macrófagos activados el PACAP inhibe la producción de IL-6 a través de sus receptores PAC-1, lo cual suprime la inflamación (Martínez y otros (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67; Martínez y otros (1998) J Leukoc Biol. 1998; 63(5):591-601). La acción inhibidora del PACAP sobre la transcripción de la IL-6 en respuesta a intensos estímulos inflamatorios ayuda a la protección tisular y ala homeostasis del sistema inmune (Martínez y otros (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67; Martínez y otros (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591- 601). En cambio, en los macrófagos no estimulados, el PACAp induce la expresión de B7.2 y promueve la diferenciación celular hacia Th2 (Delgado y Ganea (2001) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 49(2): 101-10). Se ha informado la presencia de PACAP en los órganos linfoides de patos (Squillacioti y otros (2005) Anatomía, Histología, Embryologia. Volumen 34, Issue Supplements 1, página 49).
Se ha propuesto el uso del PACAP en los mamíferos como agente terapéutico para tratar enfermedades autoinmunes tales como el choque séptico, la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn (Gomariz y otros (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74). Se conoce que en las enfermedades autoinmunes existe una respuesta inmune descontrolada contra sustancias y tejidos propios de los organismos. En este sentido, el PACAP previene la inflamación en modelos animales de enfermedades autoinmunes mediante un balance adecuado de citoquinas y quimiocinas y sus receptores, a través del reclutamiento de células del sistema inmune y mediante la regulación de la generación y de la activación de células Th1 y de las citoquinas que estas células secretan.
Por otra parte, se conoce que moléculas involucradas en la homeostasis del sistema inmune tales como los receptores tipo "Toll" son esenciales para la activación de la respuesta inmune innata, lo que potencia la respuesta inmune adaptativa. Sin embargo, esta respuesta puede conducir a la patogénesis de la inflamación aguda y/o crónica, a la autoinmunidad y al cáncer (Gomariz y otros (2010) Current Pharmaceutical Design 16: 1063-1080). En este sentido, se conoce que el sistema VIP-PACAP interviene en la regulación de la expresión de los genes que codifican estos receptores (Gomariz y otros (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74). Por lo tanto, ambos péptidos pueden provocar desórdenes en las vías de regulación de la producción de estos receptores.
El PACAP atenúa los niveles circulantes de citoquinas mediados por la molécula endógena HMGB1 (High Mobility Group Box 1) (Tang y otros (2008) International Immunopharmacology 8(12): 1646-1651) e inhibe su liberación. Se conoce que la molécula HMGB1 y los péptidos derivados de la misma son capaces de actuar como adyuvantes al aumentar la respuesta inmune contra antígenos de naturaleza peptídica y proteica (Saenz y otros (2010) Vaccine 28 (47): 7556-7562).
El documento núm. WO 2006/064378 A2 describe el uso de un péptido gastrointestinal como adyuvante vacunal, y en particular como adyuvante mucosal.
El conocimiento sobre la función del PACAP en la modulación del sistema inmune en los peces se limita a estudios realizados por nuestro grupo de investigación. Nosotros demostramos que el PACAP de Clarias gariepinus que se administra mediante baños de inmersión o inyección, no solamente promueve el crecimiento, sino que también estimula parámetros de la inmunidad innata (lisozima, metabolitos derivados del óxido nítrico y las defensas antioxidantes) y la inmunidad adquirida (IgM) en larvas y en juveniles de peces (Carpioy otros (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:439-45; Lugo y otros (2010) Fish and Shellfish Immunology 29:513-520). Estas propiedades del PACAP se describieron en la solicitud de patente internacional Núm. WO2007/059714, "Neuropéptidos para el cultivo de organismos acuáticos".
En la actualidad se mantiene el interés en la identificación de compuestos que puedan emplearse como adyuvantes seguros y más potentes, y que puedan incorporarse a las vacunas existentes y a las que se encuentran en desarrollo, tanto en el campo de la medicina humana como la veterinaria.
Descripción detallada de la invención
La presente invención resuelve el problema antes mencionado, al proporcionar una nueva alternativa de adyuvante capaz de potenciar fuertemente la respuesta inmune hacia un antígeno que se coadministra y, por lo tanto, constituye un adyuvante altamente eficaz. En este documento se describe el uso del "péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria" (PACAP) como adyuvante molecular de antígenos que se encuentran presentes en vacunas que se emplean en diferentes estrategias de inmunización. La invención proporciona PACAP para usar como adyuvante molecular para antígenos vacunales en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos en peces. Estos agentes infecciosos pueden ser virus, bacterias y ectoparásitos, entre otros.
El término "péptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP)", como se utiliza en la presente invención, incluye esta molécula en cualquiera de sus variantes (PACAP27 o PACAP38), ya sea aislada de su fuente natural, producida por síntesis química o producida mediante la tecnología del ADN recombinante; e incluye su uso como péptido o en forma de ácidos nucleicos.
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En el contexto de esta invención el término "adyuvante molecular" se refiere a cualquier molécula de naturaleza proteica capaz de modular la respuesta inmune contra un antígeno vacunal, y aumentarla.
Hasta el presente no existen investigaciones que demuestren el uso del PACAP como adyuvante molecular. Como se dijo anteriormente, se ha propuesto el uso de este péptido en los mamíferos como agente terapéutico para tratar enfermedades autoinmunes tales como el choque séptico, la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn (Gomariz y otros (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74). En este sentido, el PACAP previene la inflamación en modelos animales de enfermedades autoinmunes a través de un balance adecuado de citoquinas y quimiocinas y sus receptores, a través del reclutamiento de células inmunes y mediante la regulación de la generación y de la activación de células Th1 y de las citoquinas que estas células secretan. Teniendo en cuenta estos hallazgos, resulta inesperado el efecto encontrado como parte de nuestros estudios que demuestran que la administración del PACAP en combinación con un antígeno aumenta la respuesta inmune contra dicho antígeno, mediante la estimulación de citoquinas pro-estimulatorias y del aumento de otros elementos de la respuesta inmune humoral.
Además, se conoce que el sistema VIP-PACAP interviene en la regulación de la expresión de los genes que codifican los receptores tipo "Toll" (Gomariz y otros (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1070: 51-74). En este sentido, ambos péptidos pueden provocar desórdenes en las vías de regulación de la producción de estos receptores, lo que hace que su uso como adyuvante para vacunas no sea obvio. Otro elemento contrapuesto al nuevo uso del PACAP, que se describe en esta invención, es la demostración de que este péptido atenúa los niveles circulantes e inhibe la liberación de citoquinas mediada por la molécula endógena HMGB1 (Tang y otros (2008) International Immunopharmacology 8(12): 1646-1651).
En la presente descripción se demuestra, por primera vez, que el aumento en la respuesta inmune específica contra el antígeno vacunal que se coadministra con PACAP se observa tanto al nivel de la respuesta inmune humoral como al nivel celular.
Un objeto de la presente invención es una composición vacunal para usar en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos en peces, en donde dicha composición comprende el péptido PACAP como adyuvante, al menos un antígeno de interés vacunal, y vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Esta composición vacunal que contiene el “péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria” (PACAP) como adyuvante y al menos un antígeno de interés, provoca una respuesta inmunológica contra el antígeno o antígenos de interés que puede ser local o sistémica. Las composiciones vacunales o vacunas que se describen en este documento pueden basarse, por ejemplo, en proteínas recombinantes, microorganismos atenuados o ácidos nucleicos. En una modalidad de la invención, las composiciones vacunales mencionadas se administran por la vía oral, por inyección, o por baños de inmersión.
En el contexto de la presente invención, en dichas composiciones vacunales, el PACAP se administra como péptido obtenido por aislamiento de su fuente natural, obtenido por síntesis química, o mediante la tecnología del ADN recombinante. El PACAP también puede emplearse como ácidos nucleicos.
En la presente se describe que las vacunas que contienen PACAP en combinación con algunos antígenos, se pueden administrar a mamíferos, aves y peces, lo cual muestra, por primera vez, un efecto adyuvante para el PACAP. Inesperadamente, se observó que la administración del neuropéptido PACAP combinado con un antígeno, aumenta los niveles de anticuerpos específicos contra dicho antígeno en mamíferos, aves y peces. Además, por primera vez se demostró in vitro, que el PACAP aumenta significativamente los transcritos de interleucina 1 beta (IL1) y de interleucina 15 (IL 15) en leucocitos de peces.
En diferentes modalidades de la presente invención, que describen composiciones o combinaciones vacunales que comprenden PACAP como adyuvante, se utilizan diversos antígenos, tales como ovoalbúmina (OVA), la glicoproteína E2 de la envoltura del virus de la Peste Porcina Clásica (CSFV), la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza aviar, el polipéptido my32 de Caligus rogercresseyi, células inactivadas de Aeromonas hydrophila, la poliproteína de 106 kDa (NH2-VP2-VP4VP3-COOH) del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), la glicoproteína G del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) y el parásito ciliado Ichthyophthirius multifiliis.
En una modalidad particular de la invención, en las composiciones vacunales el PACAP se aplica como una formulación de pienso en una concentración de 50 - 750 |jg/ Kg de pienso. En una segunda modalidad de la invención, el PACAP se aplica por inyección, a una concentración de 0.1-10 jg por gramo del peso corporal. En otra modalidad de la invención, el PACAP se aplica a peces en baños de inmersión, a una concentración de 50-1000 jg por litro de agua.
En este documento también se describe que el antígeno y el adyuvante PACAP pueden ser parte de una combinación cuyos elementos se administren de forma simultánea, separada o secuencial durante el mismo protocolo de inmunización.
La invención proporciona una combinación vacunal para usar en la prevención de enfermedades causadas por diversos agentes infeccioso en peces, que comprende el “péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria” (PACAP) y al menos un agente vacunal. En este documento se describe que la combinación se puede usar en la prevención de
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enfermedades virales, bacterianas y parasitarias. Para esta combinación vacunal, el PACAP y el antígeno o antígenos, se administran oralmente, mediante inyección o mediante baños de inmersión.
En una modalidad particular, el PACAP se aplica como un pienso formulado, a una concentración de 50-750 pg/Kg de pienso. En una segunda modalidad, el PACAP se aplica mediante inyección, a una concentración de 0.1-10 pg del péptido por gramo de peso corporal. En otra modalidad de la invención, el PACAP se aplica a peces mediante baños de inmersión a una concentración de 50-1000 pg de PACAP por litro de agua.
En este documento también se describe un método para aumentar la respuesta inmune contra un antígeno, en donde se emplea una composición vacunal que comprende el “péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria” (PACAP) como un adyuvante para dicho antígeno.
De acuerdo con el método que se describe en este documento, el PACAP como adyuvante y el antígeno se pueden administrar de manera simultánea, separada, o secuencial, durante el mismo protocolo de inmunización. El PACAP se usa como adyuvante en el método como un péptido que se ha obtenido a partir de su fuente natural, por síntesis química o por tecnología de ADN recombinante. En este documento también se describe un método en donde el PACAP que se usa como adyuvante se administra en forma de ácidos nucleicos. De acuerdo con el método que se describe en este documento, el aumento en la respuesta inmune específica al antígeno vacunal que se coadministra con el PACAP tiene lugar tanto en la respuesta inmune específica humoral como celular.
Según se demuestra en varias modalidades de la invención, el aumento o la mejora en la respuesta inmune contra el antígeno de interés se expresa con mayores niveles de protección frente a diversos agentes infecciosos, entre los que se incluyen entidades virales, bacterianas y ectoparásitos.
La invención también se refiere a una composición que comprende PACAP como un adyuvante para usar en aumentar la respuesta inmune a un antígeno vacunal en peces.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Títulos de inmunoglobulinas (IgG) totales (A), IgG1 (B) e lgG2a (C) inducidos en ratones por inmunización con OVA coadministrada con el neuropéptido PACAP38. Se utilizaron 2 grupos de ensayo, de 6 animales cada uno. El Grupo Control Negativo (tampón fosfato salino (PBS)/OVA) se inoculó por vía intraperitoneal a los días 0 y 7 con una dosis de 6 pg de OVA en 0.2 mL de PBS. El Grupo que además recibió PACAP38 (PBS/OVA+péptido) se inoculó por vía intraperitoneal a los días 0 y 7 con una dosis de 6 pg de OVA + 0.5 pg de PACAP38 en 0.2 mL de PBS. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
Figura 2. Evaluación de la respuesta inmune celular en cerdos vacunados con la composición vacunal que se basa en E2-PACAP. La respuesta inmune celular se midió en linfocitos de cerdo aislados el día 5 posterior a la vacunación con E2 (grupo 1), con E2+PACAP (grupo 2) y con placebo (grupo 3). (A) Ensayo de linfoproliferación: Los resultados se expresan como índice de estimulación (SI), que se define como la relación entre los conteos por minuto (cpm) del cultivo estimulado y los cpm del control no tratado. La respuesta linfoproliferativa con un SI>2 se consideró como positiva; (B) la secreción de IFN-y se determinó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Los valores se expresan como la media aritmética de 2‘ññCt. (**) p<0.01.
Figura 3. Títulos de inhibición de la hemaglutinación en pollos inmunizados con HA o HA-PACAP (A) Las medias aritméticas de los títulos de anticuerpos se expresan como el log2 del valor del recíproco de la dilución más alta del suero a la cual se produce la inhibición de la hemaglutinación. Respuesta celular en los pollos inmunizados (B) La secreción de IFN-y se determinó mediante PCR en tiempo real. Los valores se expresan como la media aritmética de 2'
ááct. (**) p<0.01.
Figura 4. Análisis por PCR en tiempo real del efecto in vitro del PACAP38 sobre la transcripción de la IL 1p en leucocitos de sangre periférica (A) y de riñón anterior (B) de truchas arcoíris no inmunizadas. Se evaluó el efecto del PACAP a las concentraciones de 10‘10M, 10‘9M y 10‘8M, a las 48 horas de tratamiento. El experimento se repitió 4 veces. Los cultivos de leucocitos se trataron por duplicado y las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del IL 1p con respecto al factor de elongación endógeno 1aEF ± desviación estándar (SD). (*) p<0.05). * (p<0.05) indica que la expresión relativa del gen de interés fue estadísticamente superior con respecto a su expresión relativa en los cultivos de leucocitos no tratados (control negativo).
Figura 5. Análisis de la expresión por PCR en tiempo real del efecto in vitro del PACAP38 sobre la transcripción de la IL 15 en leucocitos de sangre periférica (A) y de riñón anterior (B) de truchas arcoíris no inmunizadas. Se evaluó el efecto del PACAP38 a las concentraciones de 10‘1°, 10‘9y 10‘8 M, a las 48 horas de tratamiento. El experimento se repitió 4 veces. Los cultivos de leucocitos se trataron por duplicado y las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa de IL 15 con respecto al factor de elongación endógeno EF1a + desviación estándar de la media (SD). * (p<0.05)
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Figura 6. Título de anticuerpos aglutinantes contra A. hydrophila en carpa común. Los valores del eje Y representan la media aritmética de los títulos de anticuerpos ± error estándar (*) p<0.05, (**) p<0.01. Grupo 1: Inyectados con PBS, Grupo 2: Inyectados con células de A. hydrophila inactivadas con formalina, Grupo 3: Inyectados con células de A. hydrophila inactivadas con formalina y PACAP (1 |jg por pez).
Figura 7. Efecto de la coadministración por vía intramuscular de la vacuna de ADN (pP-IPNV) a una dosis de 1 jg/pez, con un plásmido de ADN complementario del PACAP de Clarias gariepinus, bajo el control del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (pCMV-PACAP). A los 30 días después de la vacunación, los peces se expusieron al virus mediante inyección intraperitoneal de 100 jL de IPNV (1x107 (TCID50) mL-1 por pez). A los 7 días después de la infección, se sacrificaron 10 peces por grupo y se evaluó la carga viral en el riñón anterior por RT-PCR en tiempo real. Los valores representan la media ± desviación estándar. Las letras diferentes en supraíndices representan diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Grupo 1: inyectados con PBS, Grupo 2: inyectados con pP- IPNV, a una dosis de 1 jg/pez, Grupo 3: coinyectados con pP-IPNV (1 jg/pez) y pCMV-PACAP (0.5 jg /pez), Grupo 4: coinyectados con pP-IPNV (1 jg/pez) y pCMV (0.5 jg /pez), Grupo 5: coinyectados con pP-IPNV (1 jg/pez) y pCMV- PACAP (0.05 jg/pez, Grupo 6: coinyectados con pP-IPNV (1 jg/pez) y pCMV (0.05 jg /pez).
Figura 8. Mortalidad acumulada en truchas arcoíris inmunizadas por vía intramuscular con una vacuna de ADN que se basa en el gen que codifica la glicoproteína G del VHSV (pG-VHSV) y el péptido PACAP. A las 4 semanas después de la vacunación los peces se expusieron al virus (1x105 TCID50 mL’1 por pez) mediante baños de inmersión. Se evaluó la mortalidad acumulada durante 4 semanas después del reto. Grupo 1: inyectados con PBS, Grupo 2: inyectados con pG- VHSV (0,01 jg/pez), Grupo 3: inyectados con pG-VHSV 0,01 jg/pez y PACAP 0,1 jg PACAP/pez, Grupo 4: inyectados con pG-VHSV 0,01 jg/pez y PACAP 0,5 jg/pez.
Ejemplos
Ejemplo 1. Efecto de la coinmunización con OVA y PACAP sobre la respuesta inmune humoral en ratones
Se seleccionaron 12 ratones BALB/c hembra, con un peso corporal de 20 g, y se separaron en 2 grupos de ensayo, de 6 animales cada uno. El Grupo control negativo (PBS/OVA) se inyectó por vía intraperitoneal, a los días 0 y 7 con una dosis de 6 jg de OVA en 0,2 mL de PBS. El Grupo tratado con PACAP38 (PBS/OVA+péptido) se inyectó por vía intraperitoneal en los días 0 y 7 con una dosis de 6 jg de OVA + 0,5 jg de PACAP38 en 0,2 mL de PBS. En el día 15 del protocolo de inmunización, se extrajo sangre de cada animal y se evaluaron los títulos de IgG totales, lgG1 e lgG2a.
En las Figuras 1A, B y C se presentan los títulos totales de IgG, lgG1 e lgG2a, respectivamente, inducidos por la inmunización de ratones con OVA coadministrada con PACAP38. Los animales del grupo PBS/OVA+péptido mostraron un título total específico de IgG contra OVA estadísticamente superior al grupo control (Figura 1A). De igual forma, se observó que los títulos de lgG1 e lgG2a específicos contra oVa en el grupo inmunizado con OVA+PACAP fueron significativamente superiores a los que se observan en el grupo inmunizado sólo con OVA.
Ejemplo 2. Evaluación de la respuesta inmune celular en cerdos vacunados con la composición vacunal basada en E2- PACAP
El antígeno E2 es la glicoproteína mayoritaria de la envoltura del CSFV. Con el objetivo de evaluar la respuesta inmune celular en cerdos vacunados con la composición vacunal basada en E2-PACAP, y compararla con la producida por el antígeno E2, se seleccionaron 18 cerdos sanos, de 20 Kg de peso promedio, serológicamente negativos al CSFV, procedentes de una granja sin antecedentes de la enfermedad y sin vacunar contra VVPC en los 3 años precedentes. Los cerdos se distribuyeron en 3 grupos de 6 animales cada uno, con agua y pienso ad libitum. Cada composición vacunal se aplicó en inmunización simple, como sigue: 25 jg de E2 recombinante (Grupo 1) y 25 jg de E2 coadministrado con similar cantidad de PACAP38 (Grupo 2). Se estableció como Grupo 3 un grupo placebo. Los inmunógenos se formularon en una emulsión de adyuvante oleoso y se inocularon mediante inyección intramuscular con un volumen final de 2 mL. Los animales se retaron el día 8 después de la inmunización con el CSFV por vía IM (105 LD50 del aislamiento "Margarita"). Se realizó un análisis diario de signos clínicos y se tomaron muestras de sangre en los días 3 y 5 para evaluar linfoproliferación y expresión de IFN-y, como indicadores de respuesta inmune celular. En los animales inmunizados con E2-PACAP se detectó un aumento de la respuesta de los linfocitos (Fig. 2A) y niveles elevados de IFN-y en el día 5 (Fig. 2B), en comparación con los otros grupos. Esto demuestra que la coadministración del antígeno E2 con PACAP produce una respuesta inmune celular contra el CSFV en cerdos.
Ejemplo 3. Efecto de la coinmunización de la HA del virus de la influenza aviar (virus A/VietNam1203/2004) y del PACAP sobre la respuesta inmune humoral y celular en pollos.
Para la inmunización se utilizaron pollos Leghorn blancos, de 3 semanas de edad. Se emplearon3 grupos experimentales con10 pollos cada uno.
Grupo 1: inyectados con 20 jg de HA
Grupo 2: inyectados con 20 jg de HA+ 0.5 jg de PACAP27
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Grupo 3: inyectados con 20 |jg de seroalbúmina bovina
La HA se obtuvo por vía recombinante, expresada en células de mamíferos. Las vacunas se formularon con Montanide 888 y se administraron en un volumen final de 0.5 mL por vía subcutánea. Los animales se reinmunizaron al día 28 después de la inmunización. Se tomaron muestras de sangre a los días 0, 14, 28, 35, 42 y 49, para evaluar los títulos de los anticuerpos protectores mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación, y también para aislar leucocitos, con el objetivo de evaluar la respuesta inmune celular producida por las vacunas in vitro.
Los pollos inmunizados con HA-PACAP mostraron una respuesta humoral superior a los pollos inmunizados con HA, a partir del día 35de la reinmunización (Fig. 3A). El grupo tratado con HA-PACAP mostró un aumento en la respuesta inmune celular, medida por la estimulación de IFN-y, en comparación con los grupos inmunizados con HA o con el grupo control (Fig. 3B).
Ejemplo 4. Efecto del PACAP sobre la expresión de la ILI-p e IL15 en leucocitos de sangre periférica y de riñón anterior de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) no inmunizadas.
Se utilizaron juveniles de trucha arcoíris (O. mykiss), de aproximadamente 50 gramos de peso, libres de VHSV e IPNV. Los peces (n=5) se anestesiaron con la sal del ácido metanosulfónico (Sigma, USA) y se les extrajo, asépticamente, sangre periférica de la vena caudal y después se extrajo el riñón anterior.
Se aislaron leucocitos de la sangre periférica y del riñón anterior según el método descrito por Graham y Secombes (Graham y Secombes (1998) Immunology 65:293-7).
Las células se resuspendieron en L-15 con 5% de FCS, a una concentración de 5x106 células por mL, y se dispensaron en placas de 24 pocillos a 1 mL por pocillo. Los leucocitos se trataron con 3 dosis de PACAP38 de Clarias gariepinus, (10'1° M, 10'9 M y 10'8 M) obtenido por síntesis química, por duplicado. Como control negativo se usaron leucocitos no tratados que se dispensaron por duplicado.
Los niveles de IL1 p e IL 15 se evaluaron 48 horas después del tratamiento. Para ello, se purificó ARN total a partir de cultivos de leucocitos tratados con PACAP, mediante el método descrito por Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9).
Como los cebadores diseñados para amplificar IL1 p e IL15 no discriminan entre ADN complementario (ADNc) y ADN genómico, los ARN totales purificados a partir de los diferentes tejidos se trataron con una nucleasa de ADN, específicamente con la DNAsa libre de RNasaRQ1 (Promega).
Para la síntesis de los ADNc se utilizó un juego comercial de reactivos que emplea la reverso transcriptasa SuperScript III (Invitrogen). Finalmente, para el PCR cuantitativo (qPCR) se utilizó una mezcla comercial de pCR: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem). Los resultados del qPCR se normalizaron contra un gen endógeno de expresión constitutiva, específicamente contra el factor de elongación 1a(EF 1a), y se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como 2'ACt, donde el ACt equivale al resto del valor Ct del gen blanco menos el valor de Ct del gen normalizado (EF 1a).
Los niveles de la proteína IL 1p aumentaron después de las 48 horas de tratamiento en los cultivos de leucocitos de sangre periférica tratados con 10'10M de PACAP38. A la dosis de 10'9M también hay un efecto estimulador del PACAP38 sobre la trascripción de IL 1p, con respecto al grupo control negativo, pero los niveles de expresión detectados en este caso fueron inferiores a los niveles obtenidos con la dosis de 10'10 M. Estos resultados demuestran un efecto positivo del PACAP38 sobre la trascripción de la IÍ1 p, a concentraciones bajas (en el intervalo de 10-9 -1010 M) (Figura 4A). En leucocitos de riñón anterior, el efecto del PACAP 38 sobre la trascripción de la IL1 p fue moderado con respecto a leucocitos de sangre periférica, y se observó un efecto estimulador solo a la dosis de 10'9 M (Figura 4B).
Además, hemos observado un efecto estimulador del PACAP38 sobre la expresión de la IL15 en los cultivos de leucocitos de sangre periférica estimulados con PACAP38 a las dosis de 10'10y 10'9M. Se obtuvieron los mayores valores a la dosis de 10'10 M (Figura 5A). En leucocitos de riñón anterior, al igual que se observó con la transcripción de la IL 1 p, el efecto fue moderado. Los niveles de expresión de IL15 en los grupos tratados con PACAP fueron estadísticamente superiores al control negativo, a la dosis intermedia de 10'9 M (Figura 5B).
Ejemplo 5. Ensayo de reto controlado, con infestación por Caligus rogercresseyi en Salmo salar previamente inmunizados por vía intraperitoneal con el antígeno my32, y my32 coadministrado con PACAP.
La proteína my32 se obtuvo de forma recombinante, en la bolilla de células rotas transformadas de E. coli BL21(DE3)- pET28a-my32. Se conoce que esta proteína, administrada por vía intraperitoneal (IP), produce un 57% de inhibición de la infestación en la segunda generación de parásitos en un ensayo de reto con C. rogercresseyi en S. salar (Carpioy otros (2011) Vaccine 29(15):2810-20).
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Para demostrar el efecto adyuvante del PACAP sobre esta proteína, nosotros diseñamos un experimento de vacunación y reto en S. salar, en condiciones controladas. En este experimento se establecieron 6 grupos experimentales de 25 animales (80 g de peso promedio) cada uno:
Grupo 1: Inyectados IP con PBS
Grupo 2: Inyectados IP con PACAP38 a una dosis de 1 pg/pez
Grupo 3: Inyectados IP con my32 a una dosis de 3 pg/gramos de peso corporal (gbw)
Grupo 4: Coadministración mediante inyección IP de my32 a una dosis de 3 pg/gbw y PACAP a una dosis de 1 pg/pez Grupo 5: Peces inyectados IP con my32, a una dosis de 3 pg/gbw, y alimentados con pienso con 250 pg de PACAP/ Kg de pienso diariamente, durante una semana antes y después de la inmunización con my32.
Durante el transcurso del experimento los peces se alimentaron dos veces al día con una fórmula comercial balanceada no medicada, a razón de 1 % de su peso corporal, con excepción del grupo 5, al que se le suministró una semana antes y después de la inmunización la misma fórmula comercial con PACAP, según se describió por Adelmann y otros ((2008) Vaccine 26, 837- 844) para la administración oral de una cepa atenuada del virus VHSV.
Después de 500 unidades térmicas arbitrarias, los peces se adaptaron a agua de mar durante dos semanas. Posteriormente, se retaron al añadir a cada tanque 2000 ± 200 copépodos. Los peces se mantuvieron sin flujo de agua, en la oscuridad y en las condiciones de temperatura, salinidad y oxígeno sugeridas por Stone y otros (Dis Aquat Organ, 2000, 41: 141-149) por 24 días. El recambio y filtrado de agua se realizó de forma manual cada 48 horas. A los 24 días, se anestesiaron y sacrificaron los peces, y se realizó el conteo de parásitos en un microscopio estereoscópico. Los resultados que se muestran en la Tabla 1 evidencian una reducción en los niveles de infestación en los grupos tratados con PACAP, my32 y PACAP+my32. La mayor reducción ocurrió en los grupos 4 y 5, lo que evidencia el efecto adyuvante del PACAP sobre el antígeno.
Tabla 1. Conteo de parásitos a los 24 días del reto con C. rogrecresseyi
Grupos experimentales
Número de parásitos/pez Inhibición de la infestación (%)
PBS
37 ±3* -
PACAP
29 ±56 22
my32
17 ± 8C 55
PACAP-IP +my32-IP
8 + 3° 79
PACAP-oral +my32-IP
5± 2' 86
Las letras indican diferencias estadísticamente significativas
El porciento de inhibición de la infestación se calcula como (1 - T/C) *100(T: número de parásitos por pez en el grupo vacunado, C: número de parásitos por pez en el grupo placebo)
Ejemplo 6. Efecto adyuvante del PACAP en la respuesta inmune humoral de carpa común (Cyprinus carpió) contra Aeromonas hydrophila
El experimento se realizó con carpas (C. carpió) de 40 ± 10 g. Estas se mantuvieron en acuarios de 600 L a una temperatura de 28 ± 2 °C. Se establecieron 3 grupos experimentales de 10 carpas cada uno, a los cuales se inyectaron, por vía intraperitoneal, los siguientes inmunógenos:
Grupo 1: PBS
Grupo 2: Células de A. hydrophila inactivadas
Grupo 3: Células de A. hydrophila inactivadas y 1 pg de PACAP38 por pez.
Los peces se inyectaron los días 0 y 14 y se colectó sangre de la vena caudal de los mismos en los días 0 y 21. Los resultados mostraron que los títulos de anticuerpos aglutinantes fueron significativamente mayores en el grupo inmunizado con la bacteria y PACAP en comparación con el grupo inmunizado con la bacteria solamente (Fig. 6). Estos resultados demuestran el efecto del PACAP como adyuvante molecular. La preparación de las células de A. hydrophila y la determinación de los títulos de anticuerpos se realizaron según Yin y otros ((1996) Fish & Shellfish Immunology 6, 57-69).
Ejemplo 7. Ensayo de reto controlado con A. hydrophila en carpa común (C. carpió) previamente inmunizadas por vía intraperitoneal con la bacteria inactivada y la bacteria inactivada coadministrada con PACAP.
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El experimento se realizó con carpa común (C. carpió) de 30 ± 5 g. Estas se mantuvieron en acuarios de 250 L a una temperatura de 30 ± 2 °C. Se establecieron 3 grupos experimentales, de 20 carpas cada uno, a las cuales se inyectó por vía intraperitoneal:
Grupo 1: PBS
Grupo 2: Células de A. hydrophila inactivadas
Grupo 3: Células de A. hydrophila inactivadas y 1 |jg de PACAP38 por pez.
Los peces se inyectaron los días 0 y 14. El día 21 se realizó el reto mediante la inyección IP de la DL50 de la bacteria y se registró la mortalidad durante 7 días. Se calculó el porciento relativo de sobrevida (RPS) como:
RPS (%)= (% de mortalidad de controles-% mortalidad de tratados)/ (% de mortalidad controles) x100
Como resultado se obtuvo un 65% de RPS en el Grupo 2 y un 95% en el Grupo 3, lo que demuestra que la
administración del PACAP aumenta la tasa de sobrevida de los peces vacunados y retados contra el patógeno.
Ejemplo 8. Efecto de la coadministración de PACAP con una vacuna de ADN basada en el gen que codifica la poliproteína de 106 kDa (VP2-VP4VP3- NH2-COOH) del IPNV en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) retadas experimentalmente con este virus.
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la coadministración por vía intramuscular de PACAP con una vacuna de ADN basada en el gen que codifica la poliproteína de 106 kDa (VP2-VP4VP3- NH2-COOH) del IPNV en las truchas arcoíris retadas experimentalmente con dicho virus. Se conformaron 6 grupos experimentales de 15 peces cada uno (12 + 1 g), y se mantuvieron en agua a 10-12 °C:
Grupo 1: Peces inyectados con PBS
Grupo 2: Peces inyectados con la vacuna de ADN (pP-IPNV) a una dosis de 1 jg pez
Grupo 3: Peces coinyectados con la vacuna de ADN (pP-IPNV) a una dosis de1 jg/pez y un plásmido que presenta la secuencia de ADNc del PACAP de C. gariepinus, bajo el control del promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (pCMV-PACAP), a una dosis de 0.5 jg de pCMV-PACAP/pez.
Grupo 4: Peces coinyectados con la vacuna pP-IPNV (1 jg/pez) con un plásmido control negativo a una dosis de 0.5 jg/pez.
Grupo 5: Peces coinyectados con la vacuna de ADN (pP-IPNV) a una dosis de 1 jg/pezy un plásmido que presenta la secuencia de ADNc del PACAP de C. gariepinus (pCMV-PACAP) a una dosis de 0.05 jg de pCMV- PACAP/pez.
Grupo 6: Peces coinyectados con la vacuna pP-IPNV (1 jg/pez) con un plásmido control negativo a una dosis de 0.05 jg de pCMV/pez.
A los 30 días después de la vacunación, los peces se expusieron al virus mediante inyección intraperitoneal de 100 jL de IPNV (1x107 TCID50 mL1 por pez).
A los 7 días después de la infección, se sacrificaron 10 peces por grupo y se evaluó la carga viral en el riñón anterior.
Para determinar la carga viral, se aisló el ARN de las muestras individuales y se realizó la reacción RT-PCR a partir de 1 jg de ARN. La detección de la expresión del gen VP1 se evaluó mediante PCR en tiempo real. Los resultados se muestran en la Figura 7.
La coadministración de pP-IPNV y pCMV-PACAP disminuyó significativamente la carga viral, en comparación con el grupo al que se le coinyectó pP-IPNV y los vectores vacíos. No hubo diferencias entre las dosis de pCMV-PACAP ensayadas.
Ejemplo 9. Efecto de la coadministración del PACAP con una vacuna de ADN basada en el gen que codifica la glicoproteína G del VHSV en truchas arcoíris (O. mykiss) retadas experimentalmente con dicho virus.
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la coadministración por vía intramuscular de PACAP de C. gariepinus con una vacuna de ADN basada en el gen que codifica la glicoproteína G del VHSV (pG-VHSV) en truchas arcoíris retadas experimentalmente con dicho virus. Se conformaron 4 grupos experimentales, de 20 peces cada uno (10 ± 2 g), y se mantuvieron en agua a 10-12 °C:
Grupo 1: Peces inyectados con PBS.
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Grupo 2: Peces inyectados con la vacuna de ADN pG-VHSV (0,01 pg/pez).
Grupo 3: Peces coinyectados con la vacuna de ADN pG-VHSV a una dosis de 0,01 pg/pez con PACAP de C. gariepinus a una dosis de 0,1 pg de PACAP/pez.
Grupo 4: Peces coinyectados con la vacuna de ADN pG-VHSV a una dosis de 0,01 pg/pez con PACAP de C. gariepinus a una dosis de 0,5 pg de PACAP/pez.
A las 4 semanas después de la vacunación los peces se expusieron al virus mediante baños de inmersión. El reto se llevó a cabo durante 2h, en agua con una dosis infectiva de VHSV de (1x105TCID5o mL'1 por pez). Se evaluó la mortalidad acumulada a las 4 semanas después del reto y los resultados se muestran en la Figura 8.
La coadministración del péptido con la vacuna de ADN redujo la mortalidad en un 15 y 29%, en comparación con la administración de la vacuna de ADN sola, para las dosis de 0,1 y 0,5 pg de PACAP/pez, respectivamente.
Ejemplo 10. Efecto de la administración de PACAP sobre la sobrevida de pez gato del canal (Ictalurus punctatus) tras la inmunización con terontes del parásito ciliado Ichthyophthirius multifiliis
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración de PACAP posterior a la inmunización con terontes del parásito ciliado /. multifiliis, sobre la sobrevida del pez gato del canal (/. punctatus). El procedimiento de vacunación y reto se llevó a cabo según el propuesto por Wang y Dickerson ((2002) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9(1), 176-181). Se establecieron 4 grupos experimentales de 25 peces (12 ± 5 g) cada uno:
Grupo 1: Peces inmunizados los días 1 y 35 con PBS.
Grupo 2: Peces inmunizados el día 1 con 8000 terontes vivos de /. multifiliis y el día 35 con 10 000 terontes vivos del parásito.
Grupo 3: Peces inmunizados el día 1 con 8000 terontes vivos de /. multifiliis y el día 35 con 10 000 terontes vivos del parásito. A estos peces también se les administró el PACAP mediante baños de inmersión a una dosis de 100 pg de PACAP/L de agua durante 1 hora, en días alternos en las dos semanas previas al reto (6 baños de inmersión).
Grupo 4: Peces inmunizados el día 1 con 8000 terontes vivos de /. multifiliis y el día 35 con 10 000 terontes vivos del parásito. Estos peces también se sometieron a los baños de inmersión durante 1 hora sin el péptido PACAP, mediante un procedimiento similar al Grupo 3.Previo a las inmunizaciones los peces se trataron con formalina para eliminar los ectoparásitos existentes. Los peces se mantuvieron a 23 ± 2 °C, en flujo continuo de agua. El día 84 se retaron los peces con 15 000 terontes. Los datos de mortalidad se obtuvieron dentro de los 30 días posteriores al reto. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Estos resultados demuestran un aumento de un 27% en la sobrevida de los peces inmunizados y tratados a la vez con PACAP.
Tabla 2. Sobrevida de /. punctatus inmunizados y retados con terontes vivos de I. multifiliis, después de tratamiento con PACAP mediante baños de inmersión.
Grupos experimentales
Número de peces retados/Número de peces que sobrevivieron Porcionto de sobrevida <%)
PBS
25/0 0
Terontes vivos
25/15 60
Terontes vivos+PACAP Bi
25/22 87
Terontes vivos+ Bi
25/14 56
Bi: Estos peces se sometieron a 6 baños de inmersión durante 1 hora, en días alternos en las dos semanas previas al reto

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    Reivindicaciones
    1. El “péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria” (PACAP) para usar como un adyuvante molecular para antígenos vacunales en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos en peces.
  2. 2. El péptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido es para administrar como un péptido o como un ácido nucleico.
  3. 3. El péptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido PACAP se obtiene a) por aislamiento a partir de su fuente natural, b) por síntesis química, o c) por tecnología de ADN recombinante.
  4. 4. El péptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente infeccioso es un virus, una bacteria o un ectoparásito.
  5. 5. Composición vacunal para usar en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos en peces, en donde dicha composición comprende el “péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria” (PACAP), al menos un antígeno vacunal y vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
  6. 6. La composición para usar de acuerdo con de la reivindicación 5, la cual es para administración oral, para administración por inyección o para administración por baños de inmersión.
  7. 7. La composición para usar de acuerdo con de la reivindicación 5, en donde el PACAP es para administrar como un péptido que se obtiene a) por aislamiento a partir de su fuente natural, b) por síntesis química, o c) por técnicas de ADN recombinante; o como ácido nucleico.
  8. 8. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el PACAP se usa en una concentración de 50 a 750 pg/Kg de pienso si es para aplicación como un pienso formulado, en una concentración de 0,1-10 pg por gramo de peso corporal si es para aplicación por inyección, o en una concentración de 50-1000 pg por litro de agua si es para aplicación por baños de inmersión.
  9. 9. Combinación vacunal para usar en la prevención de enfermedades causadas por agentes infecciosos en peces, que comprenden el “péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria” (PACAP) y al menos un antígeno vacunal.
  10. 10. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el PACAP y el antígeno son para administrar de manera simultánea, separada o secuencial durante el mismo protocolo de inmunización.
  11. 11. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el PACAP se usa en una concentración de 50 a 750 pg/Kg de pienso si es para aplicar como un pienso formulado, en una concentración de 0,1-10 pg por gramo de peso corporal si es para aplicar por inyección, o en una concentración de 50-1000 pg por litro de agua si es para aplicar en baños de inmersión.
  12. 12. Una composición que comprende el “péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria” (PACAP) como adyuvante para usar en aumentar la respuesta inmune contra el antígeno vacunal en peces.
  13. 13. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antígeno es para administración simultánea, separada o secuencial durante el mismo protocolo de inmunización.
  14. 14. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el péptido PACAP se obtiene por a) aislamiento a partir de su fuente natural, b) por síntesis química, o c) por tecnología de ADN recombinante; o como un ácido nucleico.
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