WO2013171548A2 - Peptidos que inducen en peces una respuesta inmune contra copepodos y/o un escudo mucoso, vacunas, usos y métodos para modular la respuesta inmune de un pez y/o inducir la generación de un escudo mucoso - Google Patents

Peptidos que inducen en peces una respuesta inmune contra copepodos y/o un escudo mucoso, vacunas, usos y métodos para modular la respuesta inmune de un pez y/o inducir la generación de un escudo mucoso Download PDF

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caligus
seq
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fish
peptide
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PCT/IB2012/052487
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Diego LATORRE
Matías GROSMAN
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Tecnovax Chile S.A.
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Definitions

  • Copepods of the family Caligidae commonly called sea lice are the most reported ecoparasites in wild and cultivable salmon species.
  • Vaccines have been described that use vitogelin 1 as antigens (EP 2 405 003 and WO2007 / 039599), antigens comprising proteins fused to a promiscuous T-cell epitope (US 2010/00221271), however there is still a need to find vaccines highly efficient and easier to prepare for the immunization of fish that can be infested with copepods. In addition, compositions or vaccines that generate in the fish the formation of a mucous shield of protection against copepod infestation are needed.
  • Figure 1 shows the proteins extracted from C rogercresseyi separated on an 8% sodium polyacrylamide dodecyl sulfate gel under reducing conditions. Callel: Molecular Weight Marker (Fermentas # SM1811). Lane 2: C rogercresseyi soluble protein concentrate;
  • Figure 2 shows the amino acid sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3 and the peptides that served as identification are marked; SEQ ID No. 1 Vitellogenin 1 [Lepeophtheirus salmonis], SEQ ID No. 2 Vitellogenin 2 [Lepeophtheirus salmonis] and SEQ ID No. 3 Vitellogenin-like protein [Lepeophtheirus salmonis];
  • Figure 3 shows in a graph the efficacy of the vaccine A of the invention as the percentage of reduction of the amount of post-challenge parasitic stages in the trout immunized with respect to the controls in three stages of the challenge: fixation, development of Chalimus youth stages (I to IV) and adults (males and females).
  • Figure 4 shows in a graph the average abundance of adult male and female parasites found per fish and the standard deviation corresponding to each group (vaccine A and controls);
  • the specific antibody titers were determined by the Elisa technique;
  • Figure 6 shows the amino acid sequence SEQ ID No. 1 and the peptides of the invention are indicated;
  • Figure 7 shows in a graph the efficacy of the vaccines of the invention as the percentage reduction in the amount of post-challenge parasitic stages in Atlantic salmon immunized with respect to controls, in three stages of the challenge: fixation , development of juvenile stages (Chalimus I to IV) and adults (males and females);
  • Figure 8 shows in a graph the average abundance of adult male and female parasites found per fish and the standard deviation corresponding to each group (vaccines 1-7 of the invention and controls);
  • Figure 9 shows in a graph the induction kinetics of specific antibodies in Atlantic Salmon vaccinated with the different vaccines of the invention and their controls, challenged with C rogercresseyi infectious stages.
  • Figure 10 shows in a graph the induction kinetics of specific antibodies in Atlantic Salmon mucus vaccinated with the different vaccines of the invention and their controls, challenged with C rogercresseyi infectious stages
  • Figure 11 shows in a graph the correlation between the reduction percentage of the PRI infestation (%) and the serology expressed as Reverse of the Log of the specific antibody titer for vaccines 1 and A.
  • Figure 12 shows the results of the histological analysis of the epidermis of vaccinated fish with the different vaccines and their controls performed at time 0, 10, 20 and 30 days after vaccination. Skin sections stained with PAS-Alcian Blue are observed where mucus secretory cells are identified.
  • Figure 13 shows the histological analysis of the epidermis of vaccinated fish with the different vaccines and their controls, performed daily 40-50-80 and 120 during the course of immunization and challenge (below). PAS-stained skin cuts are observed where mucus secretory cells are identified.
  • Figure 14 shows the application scheme and timeline where acclimatization is observed, fish immunization, challenge with the parasite and sampling.
  • Fish can be salmonids, such as Atlantic salmon (Salt Psalm), Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Coho salmon (Oncorhynchus kisutch), common trout (Salmo trutta) or Chinook salmon (O.
  • the copepods can be Caligus rogercresseyi, Caligus absens, Caligus Acanthopagri, Caligus disposecus, Caligus aesopus, Caligus affinis, Caligus furcatus, Caligus alaihi, Caligus alatus, Caligus amblygenitalis, Caligus angustatus, Caligus arigus Caligus caligus, Caligus arigus Caligus caligus, Caligus arigus Caligus caligus, Caligus arigus caligus, Caligus arigus caligus, Caligus arigus caligus, Caligus arigus caligus, Caligus arigus caligus, Caligus arigus caligus, Caligus arigus caligus Caligus asymmetricus, Caligus atromaculatus, Caligus balistae, Caligus belones, Caligus
  • the peptide may be conjugated to an antigenic protein, for example the peptide may be covalently conjugated to hemocyanin (KLH - keyhole limpet hemocyanin) of Megathura crenulata, or others.
  • hemocyanin KLH - keyhole limpet hemocyanin
  • a vaccine is provided against copepods that infest fish comprising at least one peptide, wherein said peptide has at least 90%, for example 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 and 99% identity with the Sequences SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27 or SEQ ID No. 28: and excipients and adjuvants.
  • the adjuvant can be any known adjuvant, for example Megathura crenulata hemocyanin (keyhole limpet) (H8283-Sigma), a purified saponin, ⁇ (1-3) D-glucans of yeasts, synthetic or natural microbial derivatives such as monophosphoryl lipid A ( MPL), virosomes, polylactic-glycolic acid microparticles, skeleton of the Mycobacterium phlei cell wall, aminoalkyl glucosaminide phosphate, synthetic acetylated monosaccharides, derivatives of lipid A, flagelin, oligodeoxynucleotides containing CpG motifs, genetically modified bacterial toxins, Vibrio colerae cholera toxin, Escherichia coli heat-absorbed enterotoxin, human immunomodulators , chemokines, immunopotentiators, double stranded RNA, small immunopotentiating molecules such as imiquimod, resi
  • the vaccine is an emulsion and the excipient is a non-mineral oil Montanide ISA 763 Seppic.
  • the fish to be treated can be salmonids, such as Atlantic salmon (Salt Psalm), Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Coho salmon (Oncorhynchus kisutch), common trout (Salmo trutta) or Chinook salmon (O.
  • the copepods can be without limitation, Caligus absens, Caligus Acanthopagri, Caligus disposecus, Caligus aesopus, Caligus affinis, Caligus furcatus, Caligus alaihi, Caligus alatus, Caligus amblygenitalis, Caligus angustatus, Caligus arigus, Caligus arigus, Caligus arigus Caligus arigus , Caligus asymmetricus, Caligus atromaculatus, Caligus balistae, Caligus belones, Caligus bennetti, Caligus berychis, Caligus biaculeatus, Caligus bicycletus, Caligus bifurcatus, Caligus bifurcus, Caligus biseriodentatus, Caligus breig Caligus caligus, Caligus breig Caligus caligus, Caligus
  • a vaccine can comprise a combination of 4 peptides, for example: the peptides of SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19 and SEQ ID No. 20; or the peptides SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23 and SEQ ID No. 24; or the peptides SEQ ID N ° 25, SEQ ID N ° 26, SEQ ID N ° 27 and SEQ ID N ° 28.
  • 4 peptides for example: the peptides of SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19 and SEQ ID No. 20; or the peptides SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23 and SEQ ID No. 24; or the peptides SEQ ID N ° 25, SEQ ID N ° 26, SEQ ID N ° 27 and SEQ ID N ° 28.
  • the adjuvant can be any adjuvant known to those skilled in the art, for example Megathura crenulata hemocyanin (keyhole limpet ) (H8283-Sigma), a purified saponin, ⁇ (1-3) D-glucans from yeasts, synthetic or natural microbial derivatives such as monophosphoryl lipid A (MPL), virosomes, polylactic-glycolic acid microparticles, cell wall skeleton of Mycobacterium phlei, aminoalkyl glucosaminide phosphate, synthetic acetylated monosaccharides, derivatives of lipid A, flagellin, oligodeoxynucleotides containing CpG motifs, genetically modified bacterial toxins, Vibrio colerae cholera toxin, Escherichia coli heat labile enterotoxin, human immunomodulatory cytokine, human immunomodulators , immunopotentiators, double stranded RNA, small immunopotentiating
  • the peptides may be conjugated to an antigenic protein, for example KLH or another known one.
  • the use of the peptide is also provided to prepare a vaccine that induces an immune response in fish or to prepare a composition that generates in the fish the formation of a protective mucous shield.
  • a vaccine is also provided against copepods that infest fish comprising the proteins of SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3; excipients and adjuvants.
  • a method to modulate the immune response of a fish that comprises administering to said fish a necessary amount of a vaccine comprising at least one peptide chosen from SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27 or SEQ ID No. 28; and excipients.
  • the method comprises the administration of between 1 and 500 ⁇ g of the peptide.
  • the vaccine comprises 4 peptides, it is administered between 1 and 500 ⁇ g of each peptide.
  • the peptide may be conjugated to an antigenic protein, for example KLH.
  • a method for generating the formation of a mucous shield in a fish comprises administering to said fish a necessary amount of a vaccine comprising at least one peptide that has at least 90% identity with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 24, SEQ ID N ° 25, SEQ ID N ° 26, SEQ ID N ° 27, SEQ ID N ° 28 and combinations thereof; and excipients.
  • administer between 1 and 500 ⁇ g of the peptide.
  • the fish can be Atlantic salmon (Salmo Salar), Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and Coho salmon (Oncorhynchus kisutch), common trout (Salmo trutta) and Chinook salmon (O. tshawytscha) and the copepods can be from the Caligidae family.
  • the peptide may be conjugated to an antigenic protein, for example hemocyanin hemocyanin of keyhole limpet of Megathura crenulata.
  • the term "vaccine” refers to a composition that induces an immune response in an animal, for example in fish and also refers to a composition that induces the formation of a mucous shield, wherein said shield It is a biological protection against infestation of copepods in fish.
  • Soluble candidate proteins as immunogens were separated by electrophoresis in 8% sodium polyacrylamide dodecyl sulfate gels from a suspension of homogenized adult Caligus rogercresseyi parasites.
  • Table 1 shows the amino acid sequence of Vitelogenin 1 [Lepeophtheirus salmonis], Vitelogenin 2 [Lepeophtheirus salmonis] and Vitelogenin-like protein [Lepeophtheirus salmonis] proteins indicating the homology of the peptides identified with the isolated proteins of Caligus rogercresseyi.
  • Vitelogenin 1 [Lepeophtheirus SLAVYALK (SEQ ID No. 4) salmonis] (SEQ ID No. 1) FYMETIQKV (SEQ ID No. 5)
  • KVETTMGVISPFTKQ (SEQ ID No. 6)
  • Vitelogenin 2 [Lepeophtheirus KALVALFQTKM (SEQ ID No. Salmonis] (SEQ ID No. 2) 212 kDa 7)
  • VKNSVVAFR (SEQ ID No. 11)
  • WGSSYNVYSFLK (SEQ ID No. 16)
  • the peptides obtained from the digestion of the isolated Caligus rogercresseyi proteins of the invention were correlated with known proteins of the vitelogenin family,
  • Figure 2 shows the sequence of Vitelogenin 1 [Lepeophtheirus salmonis], Vitelogenin 2 [ Lepeophtheirus salmonis] and Vitelogenin-like protein [Lepeophtheirus salmonis] and the peptides found that are part of the amino acid sequence of the proteins of the invention are indicated.
  • Vaccine A comprises 1 ⁇ g of each of the following proteins: 220kDa (SEQ ID No. 1), 212kDa (SEQ ID No. 2) and 173kDa (SEQ ID No. 3) in an oily emulsion formulated with non-mineral Montanide oil ISA 763 Seppic (70 v / v oil-30 v / v water), and 10 ⁇ g of Megathura crenulata hemocyanin (keyhole limpet) (H8283-Sigma).
  • Non-specific control composition Each dose contained 3 ⁇ g of BmSS (recombinant BmSS protein from Boophilus microplus intestine) in an oily emulsion formulated with non-mineral oil Montanide ISA 763 Seppic (70 v / v oil-30 v / v water) and 10 ⁇ g of hemocyanin from Megathura crenulata (keyhole limpet) (H8283-Sigma).
  • BmSS synthetic BmSS protein from Boophilus microplus intestine
  • oily emulsion formulated with non-mineral oil Montanide ISA 763 Seppic (70 v / v oil-30 v / v water) and 10 ⁇ g of hemocyanin from Megathura crenulata (keyhole limpet) (H8283-Sigma).
  • Adjuvant control composition Each dose contained 30 ⁇ of PBS in an oily emulsion formulated with Montanide ISA 763 Seppic non-mineral oil (70 v / v oil - 30 v / v water) and 10 ⁇ g of Megathura crenulata hemocyanin (keyhole limpet) ( H8283- Sigma).
  • PBS control composition Each dose contained only 100 ⁇ of PBS.
  • the fish were challenged by infection with C. rogercresseyi During the period of immunization, challenge and monitoring of the fish it was observed that the vaccines did not cause local, systemic, inflammatory and / or granulomatous reactions at the site of administration. Vaccines were safe and safe. No composition or vaccine modified the behavior or appetite of the fish.
  • the average abundance that was calculated as the average adult male and female parasites per fish was determined, considering the total amount of fish in each group (Fig 4).
  • the average amount of adult male and female parasites per fish of the Control PBS group was 4.1 and 4.6 times greater than the amount detected in the fish treated with the vaccine A of the invention.
  • Fish immunized with vaccine A showed a smaller difference in abundance between males and females.
  • Figure 5 shows the specific antibody titres detected by ELISA in the serum of animals treated with the different vaccines. Only vaccine A was found to be immunogenic, showing a significant difference with respect to the antibody titers of the fish inoculated with the nonspecific controls, adjuvant and PBS.
  • the present invention also relates to peptides and combinations thereof conjugates or not, in a composition or oil vaccine preventive and / or activating the humoral immune response of salmonids.
  • the peptides or their combination increase the density of the mucus, the amount and diameter of the secretory cells and the thickness of the epithelium, generating a biological or mucous shield against infestation with pathogens, for example the C. rogercresseyi sea lice, reducing 80% (with respect to control) the amount of lice in juvenile and adult stages after the challenge with the parasite in treated salmonids.
  • the proteins of the invention identified by mass spectroscopy having a molecular weight of 220 kDa (SEQ ID No. 1), 212kDa (SEQ ID No. 2) and 173kDa (SEQ ID No. 3) belong to the multimer of the vitelogenin family.
  • an analysis of the prediction of linear B epitopes with BepiPred 1.0b (Technical University of Denmark) of the 220 kDa protein (Vitellogenin 1 [Lepeophtheirus salmonis] (SEQ) was performed ID No. 1) 12 peptides were selected whose sequence is highlighted in Figure 6.
  • the selected peptides were also conjugated to hemocyanin extracted from mollusk called Lapa californiana (KLH - Keyhole limpet hemocyaninde Lapa californiana).
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptide 2 ESLFVEKDEPVVVTNWKKALL (SEQ ID N ° 18). PM: 2548.01
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptide 3 SQKEIHEVMEESGRACTGKQ (SEQ ID N ° 19) PM: 2282.70
  • KLH was conjugated in the cysteine sequence.
  • Peptide 4 STVSHQIPKPKTPKTVGNLF (SEQ ID No. 20) PM: 2282.70.
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptide 5 KTLKAKSPQLYYVSTVSFSD (SEQ ID N ° 21) PM: 2282.70
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptide 6 QKITQKLQITPRTLQEPELS (SEQ ID N ° 22) PM: 2282.70
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptide 7 HGLPFKYTKTRNFVDVQSVAPTASGFPVRIQ (SEQ ID No. 23) PM: 2282.70
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptide 8 CSQSSTNTVNPNTCEEKERS (SEQ ID N ° 24) PM: 2282.70
  • KLH was conjugated in the sequence cysteine.
  • Peptide 9 PVNESSGSSTPPSSTPGPLL (SEQ ID No. 25) PM: 2282.70
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptide 10 SCQGIPTPEEKTKFEKESHE (SEQ ID No. 26) PM: 2282.70
  • KLH was conjugated in the cysteine sequence.
  • Peptide 11 PTTYNRMIEE ASNCQS SSS SGSGMGGGS (SEQ ID No. 27) PM: 2282.70 It was conjugated to KLH in the sequence cysteine.
  • Peptide 12 SSPSSSDSSSHHAQPSTGRFQ (SEQ ID No. 28) PM: 2282.70
  • Cysteine was added to COOHt, and conjugated to KLH.
  • Peptides 1 to 4 correspond to the amino terminal sequence
  • peptides 5 to 8 correspond to the middle region
  • peptides 9 to 12 correspond to the carboxyl terminal region of vitelogenin 1 protein (SEQ ID No. 1) of Lepeophtheirus salmonis.
  • Vaccine 1 of the invention comprised 50 ⁇ g of each of conjugated peptides 1-4
  • Vaccine 2 of the invention comprised 50 ⁇ g of each of the conjugated 5-8 peptides
  • Vaccine 3 of the invention comprised 50 ⁇ g of each of the conjugated 9-12 peptides (peptides SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27 and SEQ ID No. 28);
  • Each of the vaccines was prepared as an emulsion in non-mineral oil Montanide
  • Vaccine 5 of the invention comprised 50 ⁇ g of each of the unconjugated peptides 1-4 (peptides SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19 and SEQ ID No. 20);
  • Vaccine 6 of the invention comprised 50 ⁇ g of each of the unconjugated 5-8 peptides (peptides SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23 and SEQ ID No. 24);
  • Vaccine 7 of the invention comprised 50 ⁇ g of each of the unconjugated 9-12 peptides (peptides SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27 and SEQ ID No. 28).
  • Each of the vaccines was prepared as an emulsion in non-mineral oil Montanide
  • Composition 8 corresponds to the adjuvant control composition: Each dose contained 30 ⁇ of PBS in an oily emulsion formulated with Montanide ISA 763 Seppic non-mineral oil (70% v / v oil-30% v / v water) and more 10 ⁇ g of keyhole limpet hemocyanin from Megathura crenulata (H8283-Sigma).
  • Composition 9 corresponds to the PBS control composition: Each dose of Control PBS vaccine contained only 0.05 ⁇ of PBS.
  • Vaccines were safe and safe. No composition or vaccine modified the behavior or appetite of the fish.
  • Vaccines 1 and A proved to be the most effective. Vaccine 1 showed a reduction of 81% and 77.7% and vaccine A of 72 and 68.5% in the number of juvenile and adult specimens, respectively. The reduction in the number of specimens was smaller for vaccines 2, 3, 4, 5, 6 and 7 (Fig 7).
  • the average abundance per fish was determined.
  • the average abundance corresponds to the amount of adult male and female parasites found in each fish with respect to the total amount in the totality of the fish of each group.
  • the amount of adult male and female parasites found per fish in the Control PBS group was 5.5 and 3.88 times higher than that detected in fish treated with vaccine 1, which comprised peptides 1-4 conjugated to KLH, observing in the latter vaccine, the smallest difference in the average abundance between males and females (Fig 8).
  • the sera were titrated in serial dilutions to the medium from the 1: 4 dilution.
  • the coefficient of variation of positive and negative sera was calculated in 12 determinations that resulted in values between 4 and 19%.
  • the results show that the immunization of Atlantic Salmon with a 200ug dose of peptide 1-4 (vaccine 1) induces high titers of specific serum antibodies, detected by ELISA (Fig 9).
  • a single immunization was sufficient to induce in the vaccinated fish, serum titers greater than 1.5 and 2 Log between 20 and 40 dpv that were increased to 3 log during the course of immunization.
  • Serum titres obtained from fish treated with vaccine 1 were correlated with the increase in specific antibody levels found in the group of fish vaccinated with vaccine A.
  • Vaccines 2-3-5-6 and 7 induced similar serum titers. and lower than those observed with vaccines 1 and A.
  • Controls with PBS and adjuvant did not induce specific antibody response in vaccinated fish (Fig. 9).
  • the level of specific antibodies was determined by measuring absorbance at 405 nm in mucus extracted from vaccinated fish (Fig 10). The samples were tested undiluted. The results show, for example, that a single immunization of Atlantic Salmon with 200ug of peptide 1-4 formulated with hemocyanin in non-mineral oil (vaccine 1) induced the production of mucus-specific antibodies that were increased during the immunization period . These antibody levels obtained by immunizing the fish with vaccine 1 were correlated with the increase in levels of specific antibodies found in the mucus of the group of fish vaccinated with the vaccine A. Vaccines 2-3-5-6 and 7 induced levels minors of antibodies. Controls with PBS and adjuvant did not induce specific antibody response in the mucus of untreated control fish (Fig 10).
  • the peptides and vaccines of the invention can be used to immunize against any type of copepods, since the peptides used are comprised in vitogelin 1 of for example Lepeophtheirus salmonis or other known copepods.
  • Table 8 Thickness, quantity and diameter of mucus secretory cells at day 80 post-vaccination for the different vaccines and control groups.
  • Table 9 Thickness, quantity and diameter of mucus secreting cells at day 120 post-vaccination for the different vaccines and control groups.
  • the peptides and vaccines of the invention can be used as compositions that generate a mucous shield, and as can be seen the mucous shield decreases the ability to copepod infestation in treated fish.
  • Example 1 Isolation, processing, analysis, identification of proteins and obtaining peptides
  • Proteins were isolated from a suspension of 0.5g adult specimens of C. rogercresseyi in PBS-Tween 0.05%. The samples were frozen and homogenized with Precellys 24 tissue homogenizer (Bertin Technologies-France using 2mL tubes containing ceramic and glass spheres (prefilled bead- tubes Cat. No. 03119.200.RD000 Precellys-France). Two cycles of 50 sec were performed at 6000 rpm, then centrifuged at 5000 rpm for 15 min in a centrifuge (Eppendorf Refrigerated Microcentrifuge Model 5417 R-USA).
  • the supernatant was collected and subsequently concentrated with CentriPlus YM50 (cut off> 50 kDa) (Millipore-Fisher Sci) at 2500 rpm in a Sorvall centrifuge with SS34 rotor.
  • the soluble proteins collected were separated by electrophoresis in 8% sodium polyacrylamide-dodecyl sulfate gels under reducing and non-reducing conditions and colored with Coomassie Brilliant Blue G-250 according to Laemmli et al 1970.
  • Processing was performed by triptic digestion followed by cursed mass spectrometry (Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization-time of flight).
  • the samples subjected to triptic digestion were injected into the column and the peptides were eluted with 0.1M acetic acid-100% acetonitrile with a gradient flow of 0.4 ⁇ 1 / ⁇ for 2 hours.
  • the nanospray source was operated at 2.5 kV.
  • Triptic digestion and maldi-tof mass spectrometry analysis of the bands extracted from the gel determined that different peptide fractions were obtained that were analyzed using the Sequest algorithm and the NCBI NR-2006 database.
  • Conjugated peptides were obtained by solid phase chemical synthesis techniques (SPPS).
  • SPPS solid phase chemical synthesis techniques
  • the SPPS follows a general pattern of repetitive coupling-washing-deprotection-washing cycles.
  • the free terminal amino terminus of a peptide bound in a solid phase is coupled to a single protected N amino acid unit. This unit is then unprotected, thus showing a new amino end to which another amino acid can bind.
  • the conjugation to KLH was performed through the free cysteine group or to the addition thereof using the MBS method (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide Ester or activated maileimide) preferred for coupling of amino acids according to Hermanson.
  • MBS method m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide Ester or activated maileimide
  • the peptides were sequenced using the method described by Merrifield
  • Vaccine A Three soluble high molecular weight proteins were selected from the parasite homogenate. Protein quantification was performed by densitometry in a UV-P System densitometer using BSA (V-Sigma fraction) as a reference. Each dose of vaccine A contained 1 ⁇ g of each of the proteins of 220465.60 Da (SEQ ID No. 1), 212947.00 Da (SEQ ID No. 2) and 173132.50 Da (SEQ ID No.
  • Inespecific Control Composition Recombinant BmSS protein from Boophilus microplus intestine, highly immunogenic and protective in the infestation of bovines with native ticks was used. Each vaccine dose contained 3 ⁇ g of BmSS in an oily emulsion formulated with Montanide ISA 763 Seppic non-mineral oil (70 v / v oil - 30 v / v water) and 10 ⁇ g of keyhole hemocyanin limg of Megathura crenulata (H8283-Sigma) .
  • Adjuvant Control Composition Each dose of adjuvant control vaccine contained 30 ⁇ of PBS in an oily emulsion formulated with Montanide ISA 763 Seppic non-mineral oil (70 v / v oil-30 v / v water) and 10 ⁇ g of Megathura keyhole limpet hemocyanin crenulata (H8283-Sigma).
  • Control PBS vaccine contained only 100 ⁇ of PBS. Once the peptides were obtained, part of them were conjugated with the KLH antigenic protein by a liquid phase conjugation method as described in the examples. The following vaccines were prepared:
  • Vaccine 1 comprised 50 ⁇ g of each of conjugated peptides 1-4 (SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19 and SEQ ID No. 20);
  • Vaccine 2 comprised 50 ⁇ g of each of the conjugated peptides 5-8 (SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23 and SEQ ID No. 24);
  • Vaccine 3 comprised 50 ⁇ g of each of the conjugated peptides 9-12 (SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27 and SEQ ID No. 28);
  • Vaccine 5 comprised 50 ⁇ g of each of conjugated peptides 1-4;
  • Vaccine 6 comprised 50 ⁇ g of each of the 5-8 unconjugated peptides
  • Vaccine 7 comprised 50 ⁇ g of each of the unconjugated 9-12 peptides.
  • composition 8 Control Adjuvants: Each dose of adjuvant control vaccine contained 30 ⁇ of PBS in an oily emulsion formulated with Montanide ISA 763 Seppic non-mineral oil (70 v / v oil-30 v / v water) and more 10 ⁇ g of keyhole limpet hemocyanin of Megathura crenulata (H8283-Sigma).
  • Control PBS Each dose of Control PBS vaccine contained only 0.05 ml of PBS.
  • rainbow trout Oncorhynchus mykiss
  • Group 1 was vaccinated with vaccine A, group 2 with the nonspecific control composition, Group 3 with the adjuvant control composition and Group 4 with PBS only.
  • the tests were carried out in the Aquaculture Unit of the city of Mercedes (Province of wholesome Aires, Argentina).
  • the animals were acclimatized for 4 days in fresh water in 200 L ponds at a temperature between 17-20 ° C, with 5 mg / 1 oxygen (minimum), with a replacement rate of 1L / hour and with a density of up to 20 Kg / m3.
  • the fish were anesthetized with 20% Benzocaine at a dose of 50 ppm.
  • a single immunization (0.1 mL / fish) was performed intraperitoneally in the ventral midline with a 1 mL syringe and 25G x 5/8 "needle.
  • the control group was vaccinated with 0.1 ml / fish of sterile PBS and marked with a fatty fin cut for subsequent identification No injection site reactions / tissue damage / survival were observed After the vaccination, the fish were deposited in the identified ponds where they remained without being subjected to stressful handling until the completion of their immunization period At 450-500 UTA, the fish were transferred to ponds with seawater (25ppt), prior to the challenge with the infecting stages of C. rogercresseyi During this period the temperature was monitored daily
  • Serum and mucus samples were taken prior to vaccination, at the time of challenge and every 10 days after it to determine the immunological response to the vaccine. The average parasite load of the challenged fish was determined. Challenge with C. rogercresseyi
  • ovigerous females were collected and collected weekly with fine tweezers from a filter of an Atlantic Salmon processing plant.
  • the samples were sent to the laboratory transported in plastic containers containing seawater with a constant aeration system.
  • the naupliary stages were removed and deposited in beakers containing 600 ml of filtered and sterilized sea water with constant aeration. They were kept in a Hotcold-S culture chamber at an average temperature of 13 ° C, until the copepodites emerged. Once the infective stages were obtained, the Neubauer chamber count was performed, the specimens being concentrated in 4000 copepodites / 600 mL of filtered water.
  • the challenge was made when the fish reached 600UTA, introducing 4000 copepoditos (in the indicated volume of filtered seawater) every 50 fish / pond, and a 50% fixation rate was expected.
  • the water level was reduced to 50%, the oxygen flow and the water flow stopped for 6 hours after infection (static flow), after which it resumed and the water flow rate remained at 0.5 liters / hour so that it does not impact the fixation of C rogercresseyi.
  • the control group was vaccinated with 0.1 ml / fish of sterile PBS and labeled with fat fin for subsequent identification. Reactions were collected at the injection site. / tissue damage / survival The challenge was made when the Atlantic salmon reached a weight of 80g, at 600UTA.
  • Serum and mucus samples were taken to determine by ELISA the specific antibody titer from day 0 or pre-immune, at 10, 20, 30, 40 days, to the challenge (50 days) and every 10 days post challenge until 120 days post-vaccination (dpv)
  • the 220 kDa (SEQ ID N ° 1), 212 kDa (SEQ ID N ° 2) and 173 kDa (SEQ ID N ° 3) proteins at a concentration of 50 ⁇ g / mL were used as capture antigen.
  • the secondary antibody used was anti-coM salmon IgM (Oncorhyncus kisutch) (monoclonal fraction IgGl) (Bios-Bios Chile Group) and as peroxidase-labeled IgG Anti-mouse conjugate antibody (Dako Denmark goat anti-mouse) and as ABTS substrate (2 , 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid).
  • samples of the epidermis of the scalpel fish were taken, making cuts in the abdominal and lateral areas of the fish on days 10-10-20-30-40-50.80 and 120.
  • the cuts were embedded in formalin buffer 4% and stained with the staining of PAS (periodic acid-Shiff) and PAS-Alcian Blue.
  • the mucus was obtained by scraping the surface of the fish with a scalpel.
  • the extracted material was placed in 15 mL tubes with 2 mL of PBS + protease inhibitor cocktail (Promega G6521 50X) to obtain a dense suspension. It was centrifuged at 3000g for 10 minutes and the supernatant that was kept at -20 ° C was taken. Samples were tested in duplicate and undiluted. Five serum and mucus samples were taken per group and per sampling time for serum analysis, using 3 samples for histological analysis.
  • Tadiso TM Krasnov A, Skugor S, Afanasyev S, Hordvik I, Nilsen F.

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Description

PÉPTIDOS QUE INDUCEN EN PECES UNA RESPUESTA INMUNE CONTRA COPÉPODOS Y/O UN ESCUDO MUCOSO, VACUNAS, USOS Y MÉTODOS PARA MODULAR LA RESPUESTA INMUNE DE UN PEZ Y/O INDUCIR LA GENERACIÓN DE UN ESCUDO MUCOSO.
INTRODUCCIÓN
Los Copépodos de la familia Caligidae comunmente llamados piojos de mar son los ecoparásitos más reportados en las especies de salmones silvestres y cultivables.
En Chile, la especie dominante, afectando la salmonicultura nacional, es Caligus rogercresseyi, el cual está presente en una proporción del 99% en las granjas salmoneras, infestando tanto salmónidos como peces nativos y generando altas tasas de mortalidad. Con el crecimiento mundial del cultivo intensivo de salmónidos durante la última década, el control del piojo de mar, ha llegado a ser una de las principales preocupaciones en la industria, debido a las elevadas pérdidas económicas y efectos medio ambientales que genera.
Estos parásitos se alimentan de la piel, mucus y sangre del pez existiendo una literatura bien documentada acerca de su taxonomía, ciclos de vida y relación parásito-hospedero. La infestación del piojo de mar en salmónidos produce erosión, remoción de la epidermis y escamas, hemorragia de los tejidos del hospedero y desequilibrio osmoregulatorio que puede llevar a la muerte por la incapacidad de mantener la homeostasis. La condición de estrés incrementa la susceptibilidad del salmón a infecciones a causa de la debilidad producida por el ataque del piojo de mar.
A medida que se incrementan los niveles de producción en los centros de cultivo, el alto grado de confinamiento de los salmones conlleva a una incidencia cada vez mayor de plagas ectoparasíticas y enfermedades asociadas, reducción de la tasa de crecimiento de los peces en cultivo y la calidad de los mismos debido al daño en la musculatura que lleva a una pérdida de valor comercial, incremento de los costos de producción debido al costo del tratamiento para combatir la plaga y las diversas enfermedades en los salmónidos, resistencia del parásito a los químicos terapéuticos y toxicidad de éstos productos sobre la vida marina. Se han descripto vacunas que utilizan como antígenos la vitogelina 1 (EP 2 405 003 y WO2007/039599), antígenos que comprenden proteínas fusionadas a un epítope promiscuo de células T (US 2010/00221271), sin embargo aun persiste la necesidad de hallar vacunas altamente eficientes y de elaboración más sencilla para la inmunización de peces que pueden infestarse con copépodos. Se necesitan además composiciones o vacunas que generen en los peces la formación de un escudo mucoso de protección a la infestación por copépodos.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1: La figura 1 muestra las proteínas extraídas de C rogercresseyi separadas en un gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio al 8% en condiciones reductoras. Callel: Marcador de Peso Molecular (Fermentas #SM1811). Calle 2: Concentrado de proteínas solubles de C rogercresseyi;
Figura 2: La figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3 y se marcan los péptidos que sirvieron como identificación; SEQ ID N°l Vitellogenin 1 [Lepeophtheirus salmonis], SEQ ID N° 2 Vitellogenin 2 [Lepeophtheirus salmonis] y SEQ ID N°3 Vitellogenin-like protein [Lepeophtheirus salmonis];
Figura 3: La figura 3 muestra en un gráfico la eficacia de la vacuna A de la invención como el porcentaje de reducción de la cantidad de estadios parasitarios post-desafío en las truchas inmunizadas respecto a los controles en tres etapas del desafío: fijación, desarrollo de estadios juveniles Chalimus (I a IV) y adultos (machos y hembras) .
Figura 4: La figura 4 muestra en un gráfico la abundancia media de parásitos adultos machos y hembras hallados por pez y la desviación estándar correspondiente a cada grupo (vacuna A y controles);
Figura 5: la figura 5 muestra en un gráfico la respuesta inmune inducida en peces vacunados con la vacuna A y controles; se representa el Log del título sérico de anticuerpos específicos de los 4 grupos vacunados (n=5) a distintos tiempos post vacunación. Los títulos de anticuerpos específicos fueron determinados por la técnica de Elisa;
Figura 6: la figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 1 y se señalan los péptidos de la invención;
Figura 7: la figura 7 muestra en un gráfico la eficacia de las vacunas de la invención como el porcentaje de reducción en la cantidad de estadios parasitarios post-desafío en los salmones del Atlántico inmunizados respecto a los controles, en tres etapas del desafio: fijación, desarrollo de estadios juveniles ( Chalimus I a IV) y adultos (machos y hembras);
Figura 8: la figura 8 muestra en un gráfico la abundancia media de parásitos adultos machos y hembras hallados por pez y la desviación estándar correspondiente a cada grupo (vacunas 1-7 de la invención y controles);
Figura 9: la figura 9 muestra en un gráfico la cinética de inducción de anticuerpos específicos en Salmón del Atlántico vacunados con las distintas vacunas de la invención y sus controles, desafiados con estadios infectantes de C rogercresseyi .
Figura 10: la figura 10 muestra en un gráfico la cinética de inducción de anticuerpos específicos en mucus de Salmón del Atlántico vacunados con las distintas vacunas de la invención y sus controles, desafiados con estadios infectantes de C rogercresseyi
Figura 11: la figura 11 muestra en un gráfico la correlación entre el procentaje de reducción de la infestación PRI (%) y la serología expresada como Inversa del Log del título de anticuerpos específicos para las vacunas 1 y A.
Figura 12: la figura 12 muestra los resultados del análisis histológico de la epidermis de peces vacunados con las distintas vacunas y sus controles realizados a tiempo 0 , 10, 20 y 30 días post vacunación. Se observan cortes de piel teñidos con PAS-Alcian Blue donde se identifican las células secretoras de mucus. Figura 13: la figura 13 muestra el análisis histológico de la epidermis de peces vacunados con las distintas vacunas y sus controles, realizados al día 40 -50-80 y 120 durante el transcurso de la inmunización y desafío (abajo). Se observan cortes de piel teñidos con PAS donde se identifican las células secretoras de mucus.
Figura 14: La figura 14 muestra el esquema de aplicación y línea de tiempo donde se observa la aclimatación, inmunización de los peces, desafío con el parásito y toma de muestras.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
Es un objeto de la presente invención proveer un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, por ejemplo 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99% de identidad con las siguientes secuencias: SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 o SEQ ID N° 28, en donde dicho péptido induce en peces una respuesta inmune contra copépodos. Los peces pueden ser salmónidos, tales como salmón del Atlántico (Salmo Salar), Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común (Salmo trutta) o Salmón Chinook (O. tshawytscha); y los copépodos pueden ser Caligus rogercresseyi, Caligus absens, Caligus acanthopagri, Caligus aduncus, Caligus aesopus, Caligus affinis, Caligus furcatus, Caligus alaihi, Caligus alatus, Caligus amblygenitalis, Caligus angustatus, Caligus antennatus, Caligus arii , Caligus ariicolus, Caligus asperimanus , Caligus asymmetricus, Caligus atromaculatus, Caligus balistae , Caligus belones, Caligus bennetti, Caligus berychis, Caligus biaculeatus, Caligus bicycletus, Caligus bifurcatus, Caligus bifurcus , Caligus biseriodentatus, Caligus bocki , Caligus bonito, Caligus brevicaudatus, Caligus brevicaudus, Caligus brevis, Caligus buechlerae, Caligus callaoensis, Caligus callyodoni, Caligus calotomi, Caligus carangis, Caligus caudatus , Caligus centrodonti, Caligus chaenichthyis, Caligus cheilodactyli, Caligus chelifer, Caligus chiastos, Caligus chorinemi, Caligus chrysophrysi, Caligus clavatus, Caligus clemensi, Caligus confusus, Caligus constrictus, Caligus cookeoli, Caligus cordiventris, Caligus cordyla, Caligus cornutus , Caligus coryphaenae, Caligus cossacki, Caligus costatus, Caligus cresseyorum, Caligus cristatus, Caligus crusmae, Caligus cunicephalus, Caligus curtus , Caligus cybii, Caligus dactylopteni , Caligus dactylus, Caligus dakari, Caligus dampieri, Caligus dasyaticus, Caligus debueni, Caligus deformis, Caligus diaphanus, Caligus dicentrarchi, Caligus dieuzeidei, Caligus digitatus, Caligus djedabae, Caligus dubius, Caligus eleutheronemi, Caligus elevatus , Caligus elongatus, Caligus engraulidis, Caligus enormes, Caligus epidemicus , Caligus epinepheli, Caligus equulae, Caligus eventilis, Caligus fistulariae, Caligus flexispina, Caligus fortis, Caligus fronsuganinus , Caligus fugu, Caligus furcisetifer , Caligus gayi, Caligus germoi, Caligus glacialis, Caligus glandifer, Caligus gracilis, Caligus grandiabdominalis, Caligus guerini, Caligus gurnardi, Caligus haemulonis, Caligus hamatus, Caligus hamruri, Caligus hemiconiati, Caligus hobsoni, Caligus hoplognathi, Caligus hottentotus, Caligus hyalinae, Caligus hyalinus, Caligus ignotus, Caligus inanis, Caligus infestans, Caligus inopinatus, Caligus irritans, Caligus isonyx, Caligus itacurussensis, Caligus jawahari , Caligus kabatae, Caligus kahawai, Caligus kala, Caligus kalumai, Caligus kanagurta, Caligus kapuhili, Caligus kirti, Caligus kirtiodes, Caligus klawei, Caligus kurochkini, Caligus kuwaitensis, Caligus labracis, Caligus lacustris, Caligus lalandei, Caligus laticaudus, Caligus latigenitalis, Caligus latus, Caligus lepidopi, Caligus lessonius, Caligus lethrinicola, Caligus lichiae, Caligus ligatus, Caligus ligusticus, Caligus littoralis, Caligus lobodes, Caligus lolligunculae, Caligus longiabdominis, Caligus longicaudatus, Caligus longicaudus, Caligus longicervicis, Caligus longipedis, Caligus longipennatus, Caligus longirostris, Caligus longispinosus, Caligus lunatus, Caligus lutjani, Caligus macarovi, Caligus macrurus, Caligus malabaricus, Caligus mercatorus, Caligus minimus, Caligus mordax, Caligus mortis, Caligus mugilis, Caligus multispinosus, Caligus murrayanus, Caligus musaicus, Caligus mutabilis, Caligus nanhaiensis, Caligus nengai, Caligus nibeae, Caligus nolani, Caligus novocaledonicus, Caligus nuenonnae, Caligus obscurus, Caligus oculicola, Caligus ocyurus, Caligus oligoplitisi, Caligus olsoni, Caligus omissus, Caligus orientalis, Caligus oviceps, Caligus pagelli, Caligus pageti, Caligus pagri, Caligus pagrosomi, Caligus pampi, Caligus parvilatus, Caligus patulus, Caligus pauliani, Caligus pectinatus, Caligus pelagicus, Caligus pelamydis, Caligus penrithi, Caligus phipsoni, Caligus piscinus, Caligus placidus, Caligus platurus, Caligus platytarsis, Caligus polycanthi, Caligus pomacentrus, Caligus pomadasi, Caligus praetextus, Caligus priacanthi, Caligus productos, Caligus pseudokalumai, Caligus pseudoproductus, Caligus pterois, Caligus punctatus, Caligus quadratus, Caligus randalli, Caligus raniceps, Caligus rapax, Caligus rectus, Caligus regalis, Caligus remorae, Caligus reniformis, Caligus robustus, Caligus rotundigenitalis, Caligus rufimaculatus, Caligus russellii, Caligus salmoneus, Caligus saucius, Caligus savala, Caligus schelegeli, Caligus schistonyx, Caligus sciaenops, Caligus sclerotinosus, Caligus scribae, Caligus sensilis, Caligus sensorius, Caligus sepetibensis, Caligus seriolae, Caligus serratus, Caligus sibogae, Caligus sicarius, Caligus similis, Caligus spinosurculus, Caligus spinosus, Caligus stokes, Caligus stromatei, Caligus suj uscus, Caligus tanago, Caligus temnodontis, Caligus tenax, Caligus tenuicaudatus, Caligus tenuifurcatus, Caligus tenuis, Caligus teres, Caligus tetrodontis, Caligus thyrsitae, Caligus torpedinis, Caligus trachynoti, Caligus triabdominalis , Caligus triangularis, Caligus trichiuri, Caligus tripedalis, Caligus truttae, Caligus tylosuri, Caligus undulatus, Caligus unguidentatus, Caligus uranoscopi, Caligus validus, Caligus ventrosetosus, Caligus vexator, Caligus willungae, Caligus wilsoni, Caligus xystercus, Caligus zei, Caligus zylanica, Lepeophtheirus europaensis, Lepeophtheirus grohmanni ,Lepeophtheirus nordmannii, Lepeophtheirus pectorales, Lepeophtheirus salmonis, Lepeophtheirus Thompson o Tigriopus japonicus.
El péptido puede estar conjugado a una proteína antigénica, por ejemplo el péptido puede estar covalentemente conjugado a hemocianina (KLH - keyhole limpet hemocyanin) de Megathura crenulata, u otras.
Se provee una vacuna contra copépodos que infestan peces que comprende al menos un péptido, en donde dicho péptido tiene al menos 90%, por ejemplo 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99% de identidad con las secuencias SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 o SEQ ID N° 28: y excipientes y adyuvantes. El adyuvante puede ser cualquier adyuvante conocido, por ejemplo hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet) (H8283-Sigma), una saponina purificada, β(1-3) D- glucanos de levaduras, derivados microbianos sintéticos o naturales como monofosforil lipido A (MPL), virosomas, micropartículas de ácido poliláctico-glicólico, esqueleto de la pared celular de Mycobacterium phlei, aminoalquil glucosaminida fosfato, monosacáridos acetilados sintéticos, derivados del lipido A, flagelina, oligodeoxinucleótidos conteniendo motivos CpG, toxinas bacterinas genéticamente modificadas, toxina colérica de Vibrio colerae, enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, immunomoduladores endógenos humanos, citoquinas, quimoquinas, inmunopotenciadores, RNAde doble cadena, pequeñas moléculas inmunopotenciadoras como imiquimod, resiquimod.
Preferentemente la vacuna es una emulsión y el excipiente es un aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic. Los peces a tratar pueden ser salmónidos, tales como salmón del Atlántico (Salmo Salar), Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común (Salmo trutta) o Salmón Chinook (O. tshawytscha); y los copépodos pueder ser sin limitación alguna, Caligus absens, Caligus acanthopagri, Caligus aduncus, Caligus aesopus, Caligus affinis, Caligus furcatus , Caligus alaihi, Caligus alatus, Caligus amblygenitalis, Caligus angustatus, Caligus antennatus, Caligus arii , Caligus ariicolus, Caligus asperimanus , Caligus asymmetricus, Caligus atromaculatus, Caligus balistae , Caligus belones, Caligus bennetti, Caligus berychis, Caligus biaculeatus, Caligus bicycletus, Caligus bifurcatus, Caligus bifurcus, Caligus biseriodentatus, Caligus bocki , Caligus bonito, Caligus brevicaudatus, Caligus brevicaudus, Caligus brevis, Caligus buechlerae, Caligus callaoensis, Caligus callyodoni, Caligus calotomi, Caligus carangis, Caligus caudatus , Caligus centrodonti, Caligus chaenichthyis, Caligus cheilodactyli, Caligus chelifer, Caligus chiastos, Caligus chorinemi, Caligus chrysophrysi, Caligus clavatus, Caligus clemensi, Caligus confusus, Caligus constrictus, Caligus cookeoli, Caligus cordiventris, Caligus cordyla, Caligus cornutus , Caligus coryphaenae, Caligus cossacki, Caligus costatus, Caligus cresseyorum, Caligus cristatus, Caligus crusmae, Caligus cunicephalus, Caligus curtus , Caligus cybii, Caligus dactylopteni , Caligus dactylus, Caligus dakari, Caligus dampieri, Caligus dasyaticus, Caligus debueni, Caligus deformis, Caligus diaphanus, Caligus dicentrarchi, Caligus dieuzeidei, Caligus digitatus, Caligus djedabae, Caligus dubius, Caligus eleutheronemi, Caligus elevatus , Caligus elongatus, Caligus engraulidis, Caligus enormes, Caligus epidemicus , Caligus epinepheli, Caligus equulae, Caligus eventilis, Caligus fistulariae, Caligus flexispina, Caligus fortis, Caligus fronsuganinus , Caligus fiigu, Caligus furcisetifer , Caligus gayi, Caligus germoi, Caligus glacialis, Caligus glandifer, Caligus gracilis, Caligus grandiabdominalis, Caligus guerini, Caligus gurnardi, Caligus haemulonis, Caligus hamatus, Caligus hamruri, Caligus hemiconiati, Caligus hobsoni, Caligus hoplognathi, Caligus hottentotus, Caligus hyalinae, Caligus hyalinus, Caligus ignotus, Caligus inanis, Caligus infestans, Caligus inopinatus, Caligus irritans, Caligus isonyx, Caligus itacurussensis, Caligus jawahari , Caligus kabatae, Caligus kahawai, Caligus kala, Caligus kalumai, Caligus kanagurta, Caligus kapuhili, Caligus kirti, Caligus kirtiodes, Caligus klawei, Caligus kurochkini, Caligus kuwaitensis, Caligus labracis, Caligus lacustris, Caligus lalandei, Caligus laticaudus, Caligus latigenitalis, Caligus latus, Caligus lepidopi, Caligus lessonius, Caligus lethrinicola, Caligus lichiae, Caligus ligatus, Caligus ligusticus, Caligus littoralis, Caligus lobodes, Caligus lolligunculae, Caligus longiabdominis, Caligus longicaudatus, Caligus longicaudus, Caligus longicervicis, Caligus longipedis, Caligus longipennatus, Caligus longirostris, Caligus longispinosus, Caligus lunatus, Caligus lutjani, Caligus macarovi, Caligus macrurus, Caligus malabaricus, Caligus mercatorus, Caligus minimus, Caligus mordax, Caligus mortis, Caligus mugilis, Caligus multispinosus, Caligus murrayanus, Caligus musaicus, Caligus mutabilis, Caligus nanhaiensis, Caligus nengai, Caligus nibeae, Caligus nolani, Caligus novocaledonicus, Caligus nuenonnae, Caligus obscurus, Caligus oculicola, Caligus ocyurus, Caligus oligoplitisi, Caligus olsoni, Caligus omissus, Caligus orientalis, Caligus oviceps, Caligus pagelli, Caligus pageti, Caligus pagri, Caligus pagrosomi, Caligus pampi, Caligus parvilatus, Caligus patulus, Caligus pauliani, Caligus pectinatus, Caligus pelagicus, Caligus pelamydis, Caligus penrithi, Caligus phipsoni, Caligus piscinus, Caligus placidus, Caligus platurus, Caligus platytarsis, Caligus polycanthi, Caligus pomacentrus, Caligus pomadasi, Caligus praetextus, Caligus priacanthi, Caligus productos, Caligus pseudokalumai, Caligus pseudoproductus, Caligus pterois, Caligus punctatus, Caligus quadratus, Caligus randalli, Caligus raniceps, Caligus rapax, Caligus rectus, Caligus regalis, Caligus remorae, Caligus reniformis, Caligus robustus, Caligus rogercresseyi, Caligus rotundigenitalis, Caligus rufimaculatus, Caligus russellii, Caligus salmoneus, Caligus saucius, Caligus savala, Caligus schelegeli, Caligus schistonyx, Caligus sciaenops, Caligus sclerotinosus, Caligus scribae, Caligus sensilis, Caligus sensorius, Caligus sepetibensis, Caligus seriolae, Caligus serratus, Caligus sibogae, Caligus sicarius, Caligus similis, Caligus spinosurculus, Caligus spinosus, Caligus stokes, Caligus stromatei, Caligus suj uscus, Caligus tanago, Caligus temnodontis, Caligus tenax, Caligus tenuicaudatus, Caligus tenuifurcatus, Caligus tenuis, Caligus teres, Caligus tetrodontis, Caligus thyrsitae, Caligus torpedinis, Caligus trachynoti, Caligus triabdominalis , Caligus triangularis, Caligus trichiuri, Caligus tripedalis, Caligus truttae, Caligus tylosuri, Caligus undulatus, Caligus unguidentatus, Caligus uranoscopi, Caligus validus, Caligus ventrosetosus, Caligus vexator, Caligus willungae, Caligus wilsoni, Caligus xystercus, Caligus zei, Caligus zylanica, Lepeophtheirus europaensis , Lepeophtheirus grohmanni ,Lepeophtheirus nordmannii , Lepeophtheirus pectoralis , Lepeophtheirus salmonis , Lepeophtheirus thompsoni , Tigriopus japonicus, Paracyclopina nana.
Se provee una vacuna que puede comprender una combinación de 4 péptidos, por ejemplo: los péptidos de SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19 y SEQ ID N° 20; o los péptidos SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23 y SEQ ID N° 24; o los péptidos SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 y SEQ ID N° 28. El adyuvante puede ser cualquier adyuvante conocido por los expertos en el arte, por ejemplo hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet) (H8283-Sigma), una saponina purificada, β(1-3) D- glucanos de levaduras, derivados microbianos sintéticos o naturales como monofosforil lipido A (MPL), virosomas, micropartículas de ácido poliláctico-glicólico, esqueleto de la pared celular de Mycobacterium phlei, aminoalquil glucosaminida fosfato, monosacáridos acetilados sintéticos, derivados del lipido A, flagelina, oligodeoxinucleótidos conteniendo motivos CpG, toxinas bacterinas genéticamente modificadas, toxina colérica de Vibrio colerae, enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, immunomoduladores endógenos humanos, citoquinas, quimoquinas, inmunopotenciadores, RNA de doble cadena, pequeñas moléculas inmunopotenciadoras como imiquimod o resiquimod.
Los péptidos pueden estar conjugados a una proteína antigénica, por ejemplo KLH u otra conocida. Se provee además el uso del péptido para preparar una vacuna que induce en peces una respuesta inmune o para preparar una composición que genera en los peces la formación de un escudo mucoso protector.
Se provee además una vacuna contra copépodos que infestan peces que comprende las proteínas de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3; excipientes y adyuvantes.
Se provee un método para modular la respuesta inmune de un pez que comprende administrar a dicho pez una cantidad necesaria de una vacuna que comprende al menos un péptido elegido de SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 o SEQ ID N° 28; y excipientes. El método comprede la administración de entre 1 y 500 μg del péptido. Cuando la vacuna comprende 4 péptidos se administra entre 1 y 500 μg de cada péptido. El péptido puede estar conjugado a una proteína antigénica, por ejemplo KLH.
Se provee un método para generar la formación de un escudo mucoso en un pez que comprende administrar a dicho pez una cantidad necesaria de una vacuna que comprende al menos un péptido que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28 y combinacones de los mismos; y excipientes. Por ejemplo administrar entre 1 y 500 μg del péptido. Los peces pueden ser salmón del Atlántico (Salmo Salar), Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común (Salmo trutta) y Salmón Chinook (O. tshawytscha) y los copépodos pueden ser de la familia Caligidae. El péptido puede estar conjugado a una proteína antigénica, por ejemplo hemocianina hemocianina de keyhole limpet de Megathura crenulata. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
A los efectos de la presente invención el término "vacuna" se refiere a una composición que induce una respuesta inmune en un animal, por ejemplo en peces y se refiere también a una composición que induce la formación de un escudo mucoso, en donde dicho escudo es una proteccón biológica contra la infestación de copépodos en los peces.
Se realizaron ensayos de eficacia de las proteínas multiméricas de la familia de las vitelogeninas como inmunógenos candidatos para el desarrollo de una nueva vacuna contra C rogercresseyi y otros copépodos.
Las proteínas solubles candidatas como inmunógenos fueron separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida - dodecilsufato de sodio al 8% a partir de una suspensión de parásitos adultos de Caligus rogercresseyi homogeneizados.
Cuando se sometió a electroforesis en geles de poliacrilamida-dodecilsufato de sodio en condiciones no reductoras al concentrado de proteínas solubles proveniente de la suspensión de parásitos adultos homogeneizados se observaron 3 bandas prominentes de 220 kDa (SEQ ID N° 1), 212 kDa (SEQ ID N° 2) y 173 kDa (SEQ ID N° 3). En condiciones reductoras se observaron 4 bandas correspondientes a proteínas de 220 kDa, 173 kDa, 116 kDa y 97 kDa (Figura 1).
El análisis por digestión triptica y Matrix-Assisted Láser Desorption/Ionization (Maldi- tof) de las bandas extraídas del gel determinó que las distintas fracciones peptídicas eran altamente homologas (>90 ) a las secuencias de aminoácidos de fosfolipoglicoproteinas multiméricas de la familia de las vitelogeninas de copépodos, tales como vitelogenina 1, vitelogenina 2 y vitelogenina like de Lepeophtheirus salmonis, Trigiopus japonicus y Paracyclopina nana, respectivamente.
Se analizaron las secuencias de las fracciones peptídicas según los datos disponibles en GenBank. Los resultados mostraron que existía una correlación entre las proteínas aisladas de la invención y las proteínas conocidas de la familia de las vitelogeninas (Figura 2). En la Tabla 1 se muestra la secuencia de aminoácidos de las proteínas Vitelogenina 1 [Lepeophtheirus salmonis], Vitelogenina 2 [Lepeophtheirus salmonis] y Vitelogenina-like protein [Lepeophtheirus salmonis] indicando la homología de los péptidos identificados con las proteínas aisladas de Caligus rogercresseyi.
Tabla 1
REFERENCIA MASA PEPTIDO IDENTIFICADO
220 kDa
Vitelogenina 1 [Lepeophtheirus SLAVYALK (SEQ ID N° 4) salmonis] (SEQ ID N° 1) FYMETIQKV (SEQ ID N° 5)
KVETTMGVISPFTKQ (SEQ ID N° 6)
Vitelogenina 2 [Lepeophtheirus KALVALFQTKM (SEQ ID N° salmonis] (SEQ ID N° 2) 212 kDa 7)
RYYACGPRS (SEQ ID N° 8)
PLIYGETEIK (SEQ ID N° 9)
173 kDa
QYSHFETDYGLGVSK (SEQ ID N° 10
VKNSVVAFR (SEQ ID N° 11)
Vitelogenina-like protein
IYGSHFPRNFVIGVNPLKK
[Lepeophtheirus salmonis] (SEQ ID
(SEQ ID N° 12)
N° 3)
IILGHEFTPGYIENR (SEQ ID N° 13)
NAIVSQFQSVM (SEQ ID N° 14)
SAGSHLDAK (SEQ ID N° 15)
WGSSYNVYSFLK (SEQ ID N° 16) Los péptidos obtenidos a partir de la digestión de las proteínas aisladas de Caligus rogercresseyi de la invención se correlacionaban con proteínas conocidas de la familia de las vitelogeninas, en la Figura 2 se muestra la secuencia de la Vitelogenina 1 [Lepeophtheirus salmonis], Vitelogenina 2 [Lepeophtheirus salmonis] y Vitelogenina- like protein [Lepeophtheirus salmonis] y se señalan los péptidos hallados que forman parte de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de la invención.
Las proteínas aisladas de C. rogercresseyi se utilizaron para elaborar diferentes vacunas para inmunizar peces (truchas), dichas vacunas son las sigientes:
Vacuna A: comprende 1 μg de cada una de las siguientes proteínas: 220kDa (SEQ ID N° 1), 212kDa (SEQ ID N° 2) y 173kDa (SEQ ID N° 3) en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua), y 10 μg de hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet) (H8283-Sigma).
Composición control inespecífico: Cada dosis contenía 3 μg de BmSS (proteína recombinante BmSS de intestino de Boophilus microplus) en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet) (H8283-Sigma).
Composición control adyuvantes: Cada dosis contenía 30 μΐ de PBS en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70 v/v aceite - 30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina de Megathura crenulata (keyhole limpet) (H8283- Sigma).
Composición control PBS: Cada dosis contenía únicamente 100 μΐ de PBS.
Luego de inocular a los peces con la vacuna o sus controles, los peces fueron desafiados mediante una infección con C. rogercresseyi Durante el periodo de inmunización, desafío y seguimiento de los peces se observó que las vacunas no provocaron en el sitio de administración reacciones locales, sistémicas, inflamatorias y/o granulomatosas. Las vacunas resultaron inocuas y seguras. Ninguna composición o vacuna modificó el comportamiento ni el apetito de los peces.
Para observar el grado de fijación de los copépodos se realizó a las 72hs post-desafío un recuento de especímenes parasitarios en el total de los peces desafiados. Los copepoditos se fijaron según la tasa esperada. El grado de protección de las vacunas se representó de acuerdo al porcentaje de reducción del recuento de estadios parasitarios post-desafío en las truchas inmunizadas con cada una de las vacunas respecto de los controles.
En los grupos control se observó un aumento significativo y paulatino del desarrollo de estadios juveniles y adultos de los copépodos parásitos. Solo la vacuna A de la invención resultó ser altamente efectiva reduciendo la cantidad de especímenes juveniles y adultos. Esta vacuna mostró una protección del 70 y 75% según el estadio. En los estanques con peces tratados con la composición de control inespecífica la protección solo alcanzó el 25 y 32%, mientras que en los estanques con peces tratados con la composición control adyuvante la protección solo alcanzó el 19 y 20%, en ambos casos respecto del control con PBS (Fig 3).
Por otra parte, se determinó la abundancia media que se calculó como el promedio de parásitos adultos macho y hembra por pez, considerando la cantidad total de peces de cada grupo (Fig 4). La cantidad promedio de parásitos adultos macho y hembra por pez del grupo Control PBS fue 4,1 y 4,6 veces mayor que la cantidad detectada en los peces tratados con la vacuna A de la invención. Los peces inmunizados con la vacuna A mostraron una menor diferencia en la abundancia entre machos y hembras.
Si se compara la cantidad promedio de parásitos adultos macho y hembra hallados en el grupo control PBS respecto de los grupos tratados con las composiciones control inespecífico y control adyuvante las diferencias no fueron significativas. Se observó que la inmunización con la vacuna A y el posterior desafío de los peces vacunados disminuye la infestación con C. rogercresseyi en un 75%, siendo además esta composición o vacuna segura, inocua y eficaz.
En la figura 5 se muestran los títulos de anticuerpos específicos detectados por ELISA en el suero de los animales tratados con las distintas vacunas. Sólo la vacuna A resultó ser inmunogénica, mostrando una diferencia significativa respecto de los títulos de anticuerpos de los peces inoculados con los controles inespecífico, adyuvante y PBS.
En función de determinar la persistencia de los títulos de anticuerpos en los grupos de peces tratados según de acuerdo con la figura 5, los peces fueron sangrados a diferentes tiempos y los sueros fueron analizados por la técnica de ELISA según se describe en los ejemplos. Tal como puede observarse en la figura 5, solo la vacuna A de la invención indujo una respuesta inmune específica que persistió al menos 120 días y fue significativamente mayor a la inducida por las composiciones control.
La presente invención también se relaciona con péptidos y combinaciones de los mismos conjugados o no, en una composición o vacuna oleosa preventiva y/o activadora de la respuesta inmune humoral de los salmónidos. Los péptidos o su combinación incrementan la densidad del mucus, la cantidad y el diámetro de las células secretoras y el espesor del epitelio, generando un escudo biológico o mucoso contra la infestación con patógenos, por ejemplo el piojo de mar C.rogercresseyi, reduciendo en un 80% (respecto del control) la cantidad de piojos en estadios juveniles y adultos luego del desafío con el parásito en los salmónidos tratados.
Tal como se mencionó más arriba las proteínas de la invención identificadas por espectroscopia de masa que tenían un peso molecular de 220 kDa (SEQ ID N° 1), 212kDa (SEQ ID N° 2) y 173kDa (SEQ ID N° 3) pertenecen al multímero de la familia de las vitelogeninas. En función de hallar péptidos inmunogénicos dentro de la secuencia de las proteínas, se realizó un análisis de la predicción de epitopes B lineales con BepiPred 1.0b (Technical University of Denmark) de la proteína de 220 kDa (Vitellogenin 1 [Lepeophtheirus salmonis] (SEQ ID N° 1). Se seleccionaron 12 péptidos cuya secuencia se resalta en la Figura 6. Los péptidos seleccionados también fueron conjugados a Hemocianina extraída del molusco llamado Lapa californiana (KLH - Keyhole limpet hemocyaninde Lapa californiana).
La secuencia de los péptidos utilizados en la elaboración de las vacunas fue la siguiente: Péptido 1: GYSPSYYGWAPSKEYVYEFE (SEQ ID N° 17). PM: 2525.75 D
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Péptido 2: ESLFVEKDEPVVVTNWKKALL (SEQ ID N° 18). PM: 2548.01
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Péptido 3: SQKEIHEVMEESGRACTGKQ (SEQ ID N° 19) PM: 2282.70
Se conjugó a KLH en la cisteína de la secuencia.
Péptido 4: STVSHQIPKPKTPKTVGNLF (SEQ ID N° 20) PM: 2282,70.
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Péptido 5: KTLKAKSPQLYYVSTVSFSD (SEQ ID N° 21) PM: 2282,70
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Péptido 6: QKITQKLQITPRTLQEPELS (SEQ ID N° 22) PM: 2282,70
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Péptido 7: HGLPFKYTKTRNFVDVQSVAPTASGFPVRIQ (SEQ ID N° 23) PM: 2282,70
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Péptido 8: CSQSSTNTVNPNTCEEKERS (SEQ ID N° 24) PM: 2282,70
Se conjugó a KLH en el cisteína de la secuencia.
Péptido 9: PVNESSGSSTPPSSTPGPLL (SEQ ID N° 25) PM: 2282,70
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Péptido 10: SCQGIPTPEEKTKFEKESHE (SEQ ID N° 26) PM: 2282,70
Se conjugó a KLH en la cisteína de la secuencia. Peptido 11: PTTYNRMIEE ASNCQS S S S SGSGMGGGS (SEQ ID N° 27) PM: 2282,70 Se conjugó a KLH en la cisteína de la secuencia.
Peptido 12: SSPSSSDSSSHHAQPSTGRFQ (SEQ ID N° 28) PM: 2282,70
Se adicionó cisteína al COOHt, y se conjugó a KLH.
Los péptidos 1 a 4 corresponden a la secuencia amino terminal, los péptidos del 5 al 8, corresponden a la región media y los péptidos del 9 al 12 corresponden a la región carboxilo terminal de la pro teína vitelogenina 1 (SEQ ID N° 1) de Lepeophtheirus salmonis.
Durante el periodo de inmunización, desafío y seguimiento de los peces no se observaron reacciones locales, sistémica, inflamatoria y/o granulomatosa en el sitio de administración.
La vacuna 1 de la invención comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 1-4 conjugados
(péptidos SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19 y SEQ ID N° 20);
La vacuna 2 de la invención comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 5-8 conjugados
(péptidos SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23 y SEQ ID N° 24);
La vacuna 3 de la invención comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 9-12 conjugados (péptidos SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 y SEQ ID N° 28);
Cada una de las vacunas se preparó como una emulsión en aceite no mineral Montanide
ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina keyhole limpet de
Megathura crenulata (H8283-Sigma), dando un volumen final de 0.05mL.
La vacuna 5 de la invención comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 1-4 sin conjugar (péptidos SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19 y SEQ ID N° 20);
La vacuna 6 de la invención comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 5-8 sin conjugar (péptidos SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23 y SEQ ID N° 24);
La vacuna 7 de la invención comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 9-12 sin conjugar (péptidos SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 y SEQ ID N° 28).
Cada una de las vacunas se preparó como una emulsión en aceite no mineral Montanide
ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina keyhole limpet de
Megathura crenulata (H8283-Sigma), dando un volumen final de 0.05mL. La composición 8 corresponde a la composición control adyuvante: Cada dosis contenía 30 μΐ de PBS en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70%v/v aceite-30%v/v agua) y mas 10 μg de hemocianina keyhole limpet de Megathura crenulata (H8283-Sigma).
La Composición 9 corresponde a la composición control PBS: Cada dosis de vacuna Control PBS contenía únicamente 0,05 μΐ de PBS.
Las vacunas resultaron inocuas y seguras. Ninguna composición o vacuna modificó el comportamiento ni el apetito de los peces.
A las 72hs post-desafío se realizó un recuento de especímenes parasitarios en el total de los peces desafiados para determinar el grado de fijación. Los copepoditos se fijaron según la tasa esperada. El grado de protección de las vacunas se representó de acuerdo al porcentaje de reducción de la cantidad de estadios parasitarios post-desafío en los salmones tratados con cada una de las vacunas respecto de los controles.
Las vacunas 1 y A resultaron ser las más efectivas. La vacuna 1 mostró una reducción del 81% y 77,7% y la vacuna A de 72 y 68,5 % en la cantidad de especímenes juveniles y adultos, respectivamente. La reducción en la cantidad de especímenes fue menor para las vacunas 2, 3, 4, 5, 6 y 7 (Fig 7).
Los recuentos efectuados en los estanques con peces inmunizados con las vacunas 2 y 3 mostraron un 11- 24,2 % y un 25 - 35,4% de eficacia respecto al control con PBS (Fig 7). En los controles formulados con péptidos sin conjugar (vacunas 5-6-7) se observó una protección del 18-28%, 22- 27% y 28-24 % respectivamente, mientras que la composición control adyuvante mostró una reducción del 18-20% respecto del control PBS (Fig 7).
Por otra parte, se determinó la abundancia media por pez. La abundancia media corresponde a la cantidad de parásitos adultos macho y hembra hallados en cada pez respecto de la cantidad total en la totalidad de los peces de cada grupo. La cantidad de parásitos adultos macho y hembra encontrados por pez en el grupo Control PBS fue 5,5 y 3,88 veces mayor que el detectado en los peces tratados con la vacuna 1 que comprendía a los péptidos 1-4 conjugados a KLH, observándose en ésta ultima vacuna la menor diferencia en la abundancia media entre machos y hembras (Fig 8).
Si se compara la abundancia media hallada en el grupo control PBS con la detectada en la vacuna A, se observa que es 3,6 y 2,84 veces mayor que la registrada en ésta última. Siendo las diferencias observadas estadísticamente significativas.
No se observaron diferencias significativas entre la cantidad de parásitos adultos macho y hembra del grupo control PBS respecto de los grupos control adyuvante y de las vacunas 5, 6 y 7. Mientras que existe una relativa menor abundancia en el grupo tratado con las vacunas 2 y 3 respecto del control PBS.
Se observó que a través de la inmunización con los péptidos 1-4 de la porción amino- terminal de la proteína de 220 kDa (SEQ ID N° 1) de C rogercresseyi conjugados con KLH se ha logrado reducir un 78% la infestación inducida mediante un desafío por infestación con C rogercresseyi, siendo además ésta vacuna segura, inocua y eficaz.
Se observó que la eficacia de la vacuna 1 es algo superior a la hallada inmunizando los peces con la vacuna A que comprende a las proteínas completas. Por otra parte, la síntesis de péptidos tan pequeños, por ejemplo mediante técnicas en fase sólida, es un procedimiento automatizado y sencillo de llevar a cabo. La conjugación con proteínas transportadoras, por ejemplo KLH, induce una respuesta inmunológica aumentada y una protección adecuado de los salmones infestados con C rogercresseyi.
Los sueros fueron titulados en diluciones seriadas al medio a partir de la dilución 1:4. Como un índice de repetibilidad intra-ensayo, se calculó el coeficiente de variación de sueros positivos y negativos en 12 determinaciones que resultó en valores entre 4 y 19%. Los resultados muestran que la inmunización del Salmón del Atlántico con una dosis de 200ug de los péptido 1-4 (vacuna 1) induce altos título de anticuerpos séricos específicos, detectados por ELISA (Fig 9). Una única inmunización fue suficiente para inducir en los peces vacunados, títulos séricos mayores a 1,5 y 2 Log entre los 20 y 40 dpv que se incrementaron a 3 log durante el transcurso de la inmunización. Los títulos séricos obtenidos de los peces tratados con la vacuna 1 se correlacionaron con el incremento de los niveles de anticuerpos específicos encontrados en el grupo de peces vacunados con la vacuna A. Las vacunas 2-3-5-6 y 7 indujeron títulos séricos similares y menores a los observados con las vacunas 1 y A. Los Controles con PBS y adyuvante no indujeron respuesta anticuerpo especifica en los peces vacunados (Fig.9).
Se determinó el nivel de anticuerpos específicos por medición de la absorbancia a 405 nm en los mucus extraídos de los peces vacunados (Fig 10). Las muestras fueron ensayadas sin diluir. Los resultados muestran, por ejemplo, que una única inmunización del Salmón del Atlántico con 200ug de los péptido 1-4 formulado con hemocianina en aceite no mineral (vacuna 1) indujo la producción de anticuerpos específicos en mucus que se incrementaron durante el periodo de inmunización. Estos niveles de anticuerpos obtenidos inmunizando a los peces con la vacuna 1 se correlacionaron con el incremento de niveles de anticuerpos específicos encontrados en el mucus del grupo de peces vacunados con la vacuna A. Las vacunas 2-3-5-6 y 7 indujeron niveles menores de anticuerpos. Los Controles con PBS y adyuvante no indujeron respuesta de anticuerpos especifica en el mucus de los peces control sin tratar (Fig 10).
Es evidente para un experto en la técnica que los péptidos y las vacunas de la invención pueden ser utilizados para inmunizar contra cualquier tipo de copépodos, dado que los péptidos empleados se encuentra comprendidos en la vitogelina 1 de por ejemplo Lepeophtheirus salmonis u otros copépodos conocidos.
La presencia de anticuerpos específicos en suero y mucus de los peces vacunados con las vacunas 1 y A se correlacionó con la reducción significativa en el porcentaje de infestación de los peces post-desafío con C. rogercresseyi. La vacuna formulada con los péptidos 1-4 mostró los mejores resultados. Estos resultados sugieren fuertemente que la detección de anticuerpos séricos-mucosales constituye una herramienta fundamental para demostrar la potencia de una vacuna, y que existe una efectiva correlación entre protección (como porcentaje de reducción de la infestación) y la respuesta inmunológica (Fig 11).
Se llevaron a cabo estudios histológicos evaluando la cantidad de células secretoras de mucus, su diámetro y el espesor del epitelio. Se estudiaron 3 campos por corte. Se realizó el tratamiento estadístico de los resultados de acuerdo al método de Kruskal Wallis por diferencia de medias. Del mismo modo se analizó la correlación entre la reducción de la infestación por desafío con C rogercresseyi y el efecto SHIELD (escudo) producido por la variación en la cantidad y diámetro de células productoras de mucus y, la variación del grosor de la pared. (Tabla 2 a 9)
Tabla 2. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus a tiempo 0 (pre vacunación) para las diferentes vacunas y grupos controles.
Vacuna Espesor D.E. E.E. Vacuna N° D.E. E.E. Vacuna Diámetro D.E. E.E
Células
Vacuna 1 27,92 7,02 1,81 Vacuna 1 13,47 3,66 0,95 Vacuna 1 12,93 1,69 0,44
Vacuna 2 29,06 6,92 1,79 Vacuna 2 12,93 5,18 1,34 Vacuna 2 14,34 1,47 0,38
Vacuna 3 27,64 6,25 1,61 Vacuna 3 13,33 6,59 1,7 Vacuna 3 13,64 1,69 0,44
Vacuna A 29,29 11,1 2,87 Vacuna A 11,73 3,01 0,78 Vacuna A 12,8 2,27 0,59
1
Vacuna 5 31,72 7,09 1,83 Vacuna 5 12,53 3,18 0,82 Vacuna 5 13,44 1,75 0,45
Vacuna 6 25,17 8,44 2,18 Vacuna 6 13,8 5,31 1,37 Vacuna 6 14,73 1,83 0,47
Vacuna 7 29,15 11,3 2,92 Vacuna 7 13,8 5,31 1,37 Vacuna 7 12,96 1,9 0,49
Control 33,42 9,38 2,42 Control 12,6 2,26 0,58 Control 13,44 1,75 0,45 Adyuvante Adyuvant Adyuvant
e e
Control 31,73 8,42 2,17 Control 12,93 3,51 0,91 Control 12,94 1,31 0,34 PBS PBS PBS
Tabla 3. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus al día 10 postvacunación para las diferentes vacunas y grupos controles.
Figure imgf000023_0001
Tabla 4. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus al día 20 postvacunación para las diferentes vacunas y grupos controles.
Vacuna Espesor D.E. E.E. Vacuna N° D.E. E.E. Vacuna Diámetro D.E. E.E
Células
Vacuna 1 28.14 9.02 2.33 Vacuna 1 13.8 5.31 1.37 Vacuna 1 15.16 1.9 0.49
Vacuna 2 27.67 13.7 3.56 Vacuna 2 12.8 2.24 0.58 Vacuna 2 14.45 1.56 0.28
8
Vacuna 3 32.29 7.18 1.85 Vacuna 3 11.2 2.51 0.65 Vacuna 3 13.62 1.72 0.31
Vacuna A 28.83 7.05 1.82 Vacuna A 11.4 2.41 0.62 Vacuna A 15.57 1.4 0.36
Vacuna 5 30.76 5.77 1.49 Vacuna 5 12.6 2.26 0.58 Vacuna 5 13.74 2.23 0.34
Vacuna 6 28.35 6.93 1.79 Vacuna 6 12.93 3.51 0.91 Vacuna 6 14.68 2.01 0.26
Vacuna 7 28.84 7.38 1.91 Vacuna 7 10.67 3.29 0.85 Vacuna 7 15.52 1.43 0.37
Control 28.44 5.82 1.5 Control 11.47 3.36 0.87 Control 13.28 1.47 0.38 Adyuvante Adyuvant Adyuvant
e e
Control 32.21 7.02 1.81 Control 11.68 4.38 1.57 Control 13.03 1.31 0.34 PBS PBS PBS
Tabla 5. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus al día 30 postvacunación para las diferentes vqacunas y grupos controles.
Figure imgf000024_0001
Tabla 6. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus al día 40 postvacunación para las diferentes vacunas y grupos controles.
Vacuna Espesor D.E. E.E. Vacuna N° D.E. E.E. Vacuna Diámetro D.E. E.E
Células
Vacuna 1 39.05* 5.65 2.19 Vacuna 1 16.83* 1.67 0.89 Vacuna 1 18.45* 1.47 0.38
Vacuna 2 38.11 9.15 1.99 Vacuna 2 13.01 3.88 1.49 Vacuna 2 13.53 1.13 0.29
Vacuna 3 35.02 7.13 3.48 Vacuna 3 13.2 2.89 0.93 Vacuna 3 14.17 1.16 0.3
Vacuna A 40.18* 5.7 3.57 Vacuna A 15.21* 2.47 1.56 Vacuna A 17.82* 1.4 0.36
Vacuna 5 33.28 7.41 3.52 Vacuna 5 12.89 3.58 0.79 Vacuna 5 13.44 1.9 0.49
Vacuna 6 34.79 7.83 2.89 Vacuna 6 11.62 2.46 0.89 Vacuna 6 14.69 1.07 0.28
Vacuna 7 31.32 5.07 2.33 Vacuna 7 12.27 3.14 1.12 Vacuna 7 13.53 1.19 0.34
Control 36.58 6.35 3.56 Control 12.23 3.03 1.23 Control 15.65 1.23 0.29 Adyuvante Adyuvant Adyuvant
e e
Control 34.94 7.12 1.85 Control 11.45 2.84 0.92 Control 14.77 1.04 0.33 PBS PBS PBS
Tabla 7. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus al día 50 postvacunación para las diferentes vacunas y grupos controles.
Figure imgf000025_0001
Tabla 8. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus al día 80 postvacunación para las diferentes vacunas y grupos controles.
Vacuna Espesor D.E. E.E. Vacuna N° D.E. E.E. Vacuna Diámetro D.E. E.E
Células
Vacuna 1 49.62* 9.13 3.84 Vacuna 1 17.68* 3.28 1.79 Vacuna 1 19.72* 2.13 0.13
Vacuna 2 39.21 6.18 2.16 Vacuna 2 13.22 3.05 0.94 Vacuna 2 14.7 1.68 0.68
Vacuna 3 37.5 6.3 1.59 Vacuna 3 13.81 2.65 0.72 Vacuna 3 13.38 1.15 0.15
Vacuna A 52.25* 11.2 3.69 Vacuna A 16.85* 3.83 1.39 Vacuna A 18.68* 1.31 0.31
3
Vacuna 5 38.89 8.16 1.31 Vacuna 5 11.89 1.78 0.65 Vacuna 5 13.51 1.33 0.25
Vacuna 6 38.88 7.63 2.1 Vacuna 6 11.27 2.67 0.97 Vacuna 6 14.73 1.3 0.65
Vacuna 7 34.76 8.96 1.18 Vacuna 7 12.92 1.32 0.88 Vacuna 7 13.65 1.23 0.74
Control 35.8 7.31 2.24 Control 13.14 2.18 0.91 Control 15.44 1.62 0.68 Adyuvante Adyuvant Adyuvant
e e
Control 33.19 5.22 1.4 Control 12.04 3.62 1.06 Control 14.84 1.38 0.46 PBS PBS PBS
Tabla 9. Espesor, cantidad y diámetro de células secretoras de mucus al día 120 postvacunación para las diferentes vacunas y grupos controles.
Figure imgf000026_0001
A tiempo 0, las muestras histológicas tomadas en la zona abdominal y lateral del pez se tiñeron con igual intensidad tanto para la tinción de PAS como PAS-Alcian Blue, predominando los mucopolisacaridos neutros. Entre los días 10 y 50 post-vacunación el mucus de los peces inmunizados con Vacuna 1 y Vacuna A se tornó más denso y presentó mayor acidez (Figuras 12 y 13)
El espesor del epitelio y la cantidad de células PAS+ no mostraron diferencias significativas entre el día 0 y el día 20. Estas observaciones se describen en las tablas 2 a 9 y pueden observarse en las figuras 12 y 13.
Al día 30 post-vacunación se observó un engrosamiento significativo del epitelio y aumento de la cantidad y diámetro de las células secretoras de mucus PAS+ en los grupos tratados con las vacunas 1 y A respecto del día 0 y respecto de los controles (PBS y adyuvante). Para las vacunas 2-3-5-6 y 7 los valores fueron menores que los observados con las vacunas 1 y A. Se observó también hiperplasia de las células caliciformes frente al estímulo inmunogénico.
Al día 40 post-vacunación se observó la activación de macrofagos y el aumento del infiltrado linfocitario que coincide con el incremento del título de anticuerpos séricos específicos. Al día 50 post-vacunación se potencia la respuesta inmune y aumenta aun más el espesor del epitelio, la cantidad de células PAS+ y el diámetro de las mismas, fundamentalmente, pero no excluyentemente, en los peces tratados con las vacunas 1 y A.
Desde el día 80 al día 120 post vacunación se observó un aumento significativo en la cantidad de células y en el diámetro de las mismas, manteniéndose en los mismos valores observados durante el desafío. Se registró un aumento relativamente significativo en el espesor del epitelio respecto a los datos del día 50.
No existen diferencias estadísticamente significativas en el espesor de epitelio, el número de células PAS+ y su diámetro en los peces controles. Existen menores variaciones en los peces tratados con las vacunas 2-3-5-6 y 7.
Es evidente para un experto en la técnica que los péptidos y las vacunas de la invención pueden ser utilizados como composiciones que generan un escudo mucoso, y tal como se puede observar el escudo mucoso disminuye la capacidad de infestación de copépodos en los peces tratados.
Esta invención se encuentra mejor ilustrada según los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser interpretados como una limitación impuesta al alcance de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de la misma que luego de leerse la presente descripción, pueden sugerir a aquellos entendidos en el tema sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o alcance de las reivindicaciones anexas.
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento, procesamiento, análisis, identificación de las proteínas y obtención de los péptidos
Las proteínas se aislaron a partir de una suspensión de 0.5g especímenes adultos de C. rogercresseyi en PBS-Tween 0.05%. Las muestras fueron congeladas y homogeinizadas con Precellys 24 tissue homogeneizer (Bertin Technologies-France utilizando tubos de 2mL conteniendo esferas de cerámica y vidrio (prefilled bead- tubes Cat. No. 03119.200.RD000 Precellys-France). Se realizaron 2 ciclos de 50 seg a 6000 rpm, posteriormente se centrifugó a 5000 rpm 15 min en una centrífuga (Eppendorf Refrigerated Microcentrifuge Model 5417 R-USA). El sobrenadante fue colectado y posteriormente concentrado con CentriPlus YM50 (cut off>50 kDa) (Millipore-Fisher Sci) a 2500 rpm en una centrífuga Sorvall con rotor SS34.
Las proteínas solubles colectadas fueron separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio al 8% en condiciones reductoras y no reductoras y coloreadas con Coomassie Brilliant Blue G-250 según Laemmli et al 1970.
El procesamiento se realizó por digestión triptica seguida de espectrometría de masa maldi- tof (Matrix-Assisted Láser Desorption/Ionization- time of flight).
Las bandas extraídas de un gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio al 8% fueron desteñidas con metanol-acetico (20:7), diluidas en 0.1M de carbonato de amonio pH 8.0 y luego sometidas a reducción con 10 mM de Ditiotreitol 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de alquilación con 50mM de iodoacetamida. La digestión triptica y separación bidimensional se realizó según Cordwell et al 1999. Para la espectrometría de masa se utilizó un espectrómetro Thermo Electron LTQ-FT con sistema de nanospray Protana como fuente iónica. Como interfase se emplearon columnas de fase reversa Phenomenex Júpiter 10/C18. Las muestras sometidas a digestión triptica fueron inyectadas en la columna y los péptidos fueron eluídos con 0.1M acido acético- 100% acetonitrilo con un flujo de gradiente de 0.4μ1/ηιίη durante 2 hs. La fuente de nanospray fue operada a 2.5 kV. El análisis por digestión triptica y espectrometría de masas maldi-tof de las bandas extraídas del gel determinó que se obtuvieran distintas fracciones peptídicas que fueron analizadas utilizando el algoritmo Sequest y la base de datos NCBI NR -2006.
Ejemplo 2: obtención de péptidos conjugados
Los péptidos conjugados se obtuvieron mediante técnicas de síntesis química en fase sólida (SPPS). La SPPS sigue una pauta general de ciclos repetitivos de acoplamiento-lavado- desprotección-lavado. El extremo libre amino terminal de un péptido unido en una fase sólida se acopla a una única unidad aminoacídica N protegida. Esta unidad es entonces desprotegida, mostrando así un nuevo extremo amino al cual puede unirse otro aminoácido.
La conjugación a KLH se realizó a través del grupo cisteína libre o a la adición del mismo usando el método MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide Ester o maileimida activada) preferido para acoplamiento de aminoácidos según Hermanson. Los péptidos fueron secuenciados empleando el método descripto por Merrifield
Ejemplo 3: elaboración de las vacunas
Vacuna A: Se seleccionaron tres proteínas solubles de alto peso molecular a partir del homogenato de parásitos. La cuantificación proteica se realizó por densitometría en un densitómetro UV-P System utilizando BSA (fracción V-Sigma) como referencia. Cada dosis de la vacuna A contenía 1 μg de cada una de las proteínas de 220465.60 Da (SEQ ID N° 1), 212947.00 Da (SEQ ID N° 2) y 173132.50 Da (SEQ ID N° 3) en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70 v/v aceite- 30 v/v agua), y 10 μg de hemocianina keyhole limpet de Megathura crenulata (H8283- Sigma).
Composición Control Inespecífica: Se utilizó la proteína recombinante BmSS de intestino de Boophilus microplus, altamente inmunogénica y protectiva en la infestación de bovinos con garrapatas autóctonas. Cada dosis de vacuna contenía 3 μg de BmSS en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70 v/v aceite - 30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina keyhole limpet de Megathura crenulata (H8283- Sigma).
Composición Control Adyuvantes: Cada dosis de vacuna control adyuvantes contenía 30 μΐ de PBS en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina keyhole limpet de Megathura crenulata (H8283-Sigma).
Control PBS: Cada dosis de vacuna Control PBS contenía únicamente 100 μΐ de PBS. Una vez obtenidos los péptidos, parte de los mismos fueron conjugados con la proteína antigénica KLH mediante un método de cnjugación en fase liquida tal como se describe en los ejemplos. Se prepararon las siguientes vacunas:
La vacuna 1 comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos conjugados 1-4 (SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19 y SEQ ID N° 20);
La vacuna 2 comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos conjugados 5-8 (SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23 y SEQ ID N° 24);
La vacuna 3 comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos conjugados 9-12 (SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 y SEQ ID N° 28);
Cada una de las mismas se preparó como una emulsión en aceite no mineral Montanide
ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina keyhole limpet de
Megathura crenulata (H8283-Sigma), dando un volumen final de 0.05mL.
La vacuna 5 comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 1-4 sin conjugar;
La vacuna 6 comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 5-8 sin conjugar;
La vacuna 7 comprendía 50 μg de cada uno de los péptidos 9-12 sin conjugar.
Cada una de las mismas se preparó como una emulsión en aceite no mineral Montanide
ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua) y 10 μg de hemocianina keyhole limpet de
Megathura crenulata (H8283-Sigma) dando un volumen final de 0.05mL.
Composición 8 Control Adyuvantes: Cada dosis de vacuna control adyuvantes contenía 30 μΐ de PBS en una emulsión oleosa formulada con aceite no mineral Montanide ISA 763 Seppic (70 v/v aceite-30 v/v agua) y mas 10 μg de hemocianina keyhole limpet de Megathura crenulata (H8283-Sigma).
Composición 9 Control PBS: Cada dosis de vacuna Control PBS contenía únicamente 0.05 mi de PBS.
Ejemplo 4: Ensayos en peces y desafío: Por ser la especie mas sensible a C. rogercresseyi el ensayo incluyó truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de 30g libres de infestación (n=50/grupo) sin vacunación previa, y sin tratamiento antibiótico previo al inicio del estudio.
El grupo 1 fue vacunado con la vacuna A, el grupo 2 con la composición control inespecífica, el Grupo 3 con la composición control de adyuvantes y el Grupo 4 con PBS solamente.
Los ensayos se realizaron en la Unidad de Acuicultura de la ciudad de Mercedes (Provincia de Buenos Aires, Argentina). Los animales fueron aclimatados durante 4 días en agua dulce en estanques de 200 L a temperatura entre 17-20 °C, con 5 mg/1 de oxígeno (mínimo), con una tasa de recambio de 1L /hora y con una densidad de hasta 20 Kg/m3.
Los peces fueron anestesiados con Benzocaina 20% en una dosis de 50 ppm. Se realizó una única inmunización (0.1 mL/pez) por vía intraperitoneal en la línea media ventral con jeringa de 1 mL y aguja de 25G x 5/8". El grupo control fue vacunado con 0,1 ml/pez de PBS estéril y marcados con corte de aleta adiposa para su posterior identificación. No se observaron reacciones en el sitio de inyección /daños en el tejido/ supervivencia. Posteriormente a la vacunación, los peces se depositaron en los estanques identificados donde permanecieron sin ser sometidos a un manejo estresante hasta completar su periodo de inmunización. A las 450-500 UTA, los peces fueron trasladados a estanques con agua de mar (25ppt), previo al desafío con los estadios infectantes de C. rogercresseyi. Durante todo este período la temperatura fue monitoreada en forma diaria.
Durante los días de aclimatación y durante el período de inmunización los peces fueron alimentados con una dieta comercial a razón del 3,5% peso corporal por día. El esquema de inmunización y toma de muestras se observa en la Figura 14.
Se tomaron muestras séricas y de mucus previas a la vacunación, al momento del desafío y cada 10 días luego del mismo para determinar la respuesta inmunológica a la vacuna. Se determinó la carga parasitaria promedio de los peces desafiados. Desafío con C. rogercresseyi
Para el cultivo de C rogercresseyi, específicamente del estadio copepodito, se recolectaron hembras ovígeras que se recolectaron semanalmente con pinzas finas desde un filtro de una planta de proceso de Salmón del Atlántico. Las muestras fueron remitidas al laboratorio transportadas en envases plásticos conteniendo agua de mar con sistema de aireación constante. Luego del desove se retiraron los estadios naupliares y se depositaron en vasos de precipitado conteniendo 600 mi de agua de mar filtrada y esterilizada con aireación constante. Se conservaron en una cámara de cultivo Hotcold-S a una temperatura promedio de 13°C, hasta que emergieron los copepoditos. Una vez obtenidos los estadios infectivos se realizó el recuento en cámara de Neubauer, concentrándose los especímenes en 4000 copepoditos/600 mL de agua filtrada.
El desafío de realizó cuando los peces alcanzaron las 600UTA, introduciendo 4000 copepoditos (en el volumen indicado de agua de mar filtrada) cada 50 peces/ estanque, y se esperó una tasa de fijación del 50%. El nivel de agua fue reducido al 50%, el flujo de oxígeno y el flujo de agua se detuvo durante 6 horas posteriores a la infección (flujo estático), luego de las cuales se reanudó y el caudal de agua se mantuvo en 0,5 litros/ hora de modo que no impacte en la fijación del C rogercresseyi.
Se determinó la carga parasitaria post-desafio y la eficacia en la reducción de cargas de C rogercresseyi de los grupos vacunados versus los controles al momento de la fijación, al momento del desarrollo de los estadios juveniles (Chalimus I, II, III) y al desarrollo de chalimus IV, hembras y machos adultos.
Tratamiento con las vacunas de péptidos
Por ser la especie mas comercializada se realizó en salmón del Atlántico (Salmo salar) de 30g libres de infestación (n=50/grupo) sin vacunación previa, sin cuadro clínico reciente y sin tratamiento antibiótico previo al inicio del estudio. Los ensayos se realizaron en la Unidad de Acuicultura de la ciudad de Mercedes (Pvcia de Buenos Aires). Los peces fueron anestesiados con Benzocaina a 20% de en una dosis de 50 ppm. Se realizó una única inmunización (0.1 mL/pez) por vía intraperitoneal en la línea media ventral con jeringa de 1 mL y aguja de 25G x 5/8". El grupo control fue vacunado con 0,1 ml/pez de PBS estéril y marcados con corte de aleta adiposa para su posterior identificación. Se recopilaron las reacciones en el sitio de inyección /daños en el tejido/ supervivencia. El desafío se realizó cuando los salmones del Atlántico alcanzaron un peso de 80g, a las 600UTA.
Ejemplo 5: Ensayos séricos e histológicos
Se tomaron muestras séricas y de mucus para determinar por ELISA el título de anticuerpos específicos a partir del día 0 o pre-inmune, a los 10, 20, 30, 40 días, al desafío (50 días) y cada 10 días post desafío hasta 120 días post-vacunación (dpv)
Como antígeno de captura se utilizaron las proteínas de 220 kDa (SEQ ID N° 1), 212 kDa (SEQ ID N° 2) y 173 kDa (SEQ ID N° 3) a una concentración de 50μg/mL. Como anticuerpo secundario se empleó anti IgM de salmón coho (Oncorhyncus kisutch) (IgGl fracción monoclonal) (Grupo Bios-Bios Chile) y como anticuerpo conjugado IgG Anti ratón marcado con peroxidasa (goat anti-mouse Dako Denmark) y como sustrato ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid).
Para el análisis histológico se tomaron muestras de la epidermis de los peces con bisturí realizándose cortes en la zona abdominal y lateral del pez los días 0-10-20-30-40-50,80 y 120. Los cortes se embebieron en formol buffer al 4% y se colorearon con la tinción de PAS (ácido peryodico- Shiff) y PAS- Alcian Blue.
El mucus se obtuvo por raspado de la superficie del pez con bisturí. Se colocó el material extraído en tubos de 15 mL con 2 mL de PBS+ coctel inhibidor de proteasas (Promega G6521 50X) obteniéndose una suspensión densa. Se centrifugó a 3000g 10 minutos y se tomó el sobrenadante que fue mantenido a -20°C. Las muestras se ensayaron por duplicado y sin diluir. Se tomaron 5 muestras séricas y de mucus por grupo y por tiempo de muestreo para análisis de suero, utilizando 3 muestras para análisis histológico.
Bibliografía:
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28 y combinaciones de las mismas, en donde dicho péptido induce en peces una respuesta inmune contra copépodos y/o genera un escudo mucoso.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque los peces son seleccionados del grupo consistente en salmón del Atlántico (Salmo Salar), Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común (Salmo trutta) y Salmón Chinook (O. tshawytscha) y los copépodos son de la familia Caligidae.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una proteína antigénica conjugada ha dicho péptido.
4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína antigénica es hemocianina (KLH - keyhole limpet hemocyanin) de Megathura crenulata.
5. Una vacuna que induce en peces una respuesta inmune contra copépodos y/o un escudo mucoso, caracterizada porque comprende al menos un péptido, en donde dicho péptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28 y combinaciones de las mismas; excipientes y adyuvantes.
6. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque los peces son seleccionados del grupo consistente en salmón del Atlántico (Salmo Salar), Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común (Salmo trutta) y Salmón Chinook (O. tshawytscha) y los copépodos son de la familia Caligidae.
7. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque está en la forma comprendida de una emulsión.
8. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el excipiente es un aceite no mineral.
9. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el péptido comprende una proteína antigénica conjugada ha dicho péptido.
10. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la proteína antigénica es hemocianina keyhole limpet de Megathura crenulata.
11. Una vacuna que induce en peces una respuesta inmune contra copépodos y/o un escudo mucoso, caracterizada porque comprende a los péptidos SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19 y SEQ ID N° 20; y excipientes.
12. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque al menos uno de los péptidos está conjugado a una proteína antigénica.
13. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 1, caracterizada porque los cuatro péptidos están conjugado a una proteína antigénica
14. Una vacuna que induce en peces una respuesta inmune contra copépodos y/o un escudo mucoso, caracterizada porque comprende a los péptidos SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23 y SEQ ID N° 24; y excipientes.
15. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque al menos uno de los péptidos está conjugado a una proteína antigénica.
16. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque los cuatro péptidos están conjugado a una proteína antigénica.
17. Una vacuna que induce en peces una respuesta inmune contra copépodos y/o un escudo mucoso, caracterizada porque comprende a los péptidos SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 y SEQ ID N° 28; y excipientes.
18. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque al menos uno de los péptidos está conjugado a una proteína antigénica.
19. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque los cuatro péptidos están conjugado a una proteína antigénica.
20. La vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 1, 14 y 17, caracterizada porque el copépodo es de la familia Caligidae.
21. La vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 1, 14 y 17, caracterizada porque el excipiente es un aceite no mineral.
22. La vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11, 14 y 17, caracterizada porque los peces son seleccionados del grupo consistente en salmón del Atlántico {Salmo Salar), Trucha arcoíris {Oncorhynchus mykiss) y Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común {Salmo truíta) y Salmón Chinook {O. tshawytscha) y los copépodos son de la familia Caligidae.
23. La vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11, 14 y 17. caracterizada porque está en la forma comprendida de una emulsión.
24. El uso de los péptidos de la reivindicación 1 para preparar una vacuna.
25. El uso de los péptidos de la reivindicación 1 para preparar una composición que induce la formación de un escudo mucoso en los peces.
26. Una vacuna contra copépodos que infestan peces, caracterizada porque comprende-las proteínas de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3; excipientes y adyuvantes.
27. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizada porque el excipiente es aceite no mineral.
28. Un método para modular la respuesta inmune de un pez, caracterizado porque comprende administrar a dicho pez una cantidad necesaria de una vacuna que comprende al menos un péptido que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28 y combinaciones de los mismos; y excipientes.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque el péptido se administra en una cantidad de entre 1 y 500 μg.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque los peces son seleccionados del grupo comprendido por salmón del Atlántico {Salmo Salar), Trucha arcoíris {Oncorhynchus mykiss) y Salmón coho {Oncorhynchus kisutch), trucha común {Salmo trutta) y Salmón Chinook {O. tshawytscha) y los copépodos son de la familia Caligidae.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado el péptido comprende una proteína antigénica conjugada ha dicho péptido.
32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado porque la proteína antigénica es hemocianina hemocianina de keyhole limpet de Megathura crenulata.
33. Un método para modular la respuesta inmune de un pez, caracterizado porque comprende administrar a dicho pez una cantidad necesaria de una vacuna que comprende las proteínas de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3; excipientes y adyuvantes.
34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque cada proteína se administra en una cantidad de entre 1 y 10 μg.
35. El método de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque los peces son seleccionados del grupo comprendido por salmón del Atlántico (Salmo Salar), Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común (Salmo trutta) y Salmón Chinook (O. tshawytscha), y los copépodos son de la familia Caligidae.
36. Un método para generar la formación de un escudo mucoso en un pez, caracterizado porque comprende administrar a dicho pez una cantidad necesaria de una vacuna que comprende al menos un péptido que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27 y SEQ ID N° 28; y excipientes.
37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizado porque el péptido se administra en una cantidad de entre 1 y 500 μg.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizado porque los peces son seleccionados del grupo comprendido por salmón del Atlántico (Salmo Salar), Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y Salmón coho (Oncorhynchus kisutch), trucha común (Salmo trutta) y Salmón Chinook (O. tshawytscha), y los copépodos son de la familia Caligidae.
39. El método de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizado el péptido comprende una proteína antigénica conjugada a dicho péptido.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, caracterizado porque la proteína antigénica es hemocianina hemocianina de keyhole limpet de Megathura crenulata.
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