BR102019021511A2 - Método de produção de proteínas recombinantes do toxocara canis, visadas como vacina para controle da toxocaríase canina - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a metodologia de produção das proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan do Toxocara canis como antígenos eficazes para o uso como vacina no controle da infecção em cães domésticos e vadios. O método proposto permite produzir proteínas recombinantes de Toxocara canis em um sistema heterólogo que serão utilizadas como vacina com baixo custo de produção, e capaz de gerar uma proteção efetiva contra o parasito, controlando a infecção nos animais e de forma indireta nos humanos. A metodologia proposta terá baixo custo de obtenção, purificação e produção em larga escala dos antígenos recombinantes que constiturão a vacina anti-toxocaríase canina.

Description

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DO TOXOCARA CANIS, VISADAS COMO VACINA PARA CONTROLE DA TOXOCARÍASE CANINA Campo de aplicação

[001] A presente invenção refere-se métodos biotecnológicos para produzir as proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan do parasito Toxocara canis, como antígenos eficazes para serem utilizados como vacina para o controle da toxocaríase canina.

[002] O Toxocara canis e o T. cati tem grande homologia entre si. Além disto existe infecção cruzada (gatos infectados com T. canis e cães com T. cati) (ROHDE, K. Helminths of cats and dogs in Malaya. University of Singapore, p. 301, 1962.; LEE, C. C.; CHENG, N.; BOHARI, Y. Toxocara canis from domestic cats in Kuala Lumpur. Tropical Biomedicine, v. 10, p. 79, 1993.); possivelmente estas moléculas serão capazes de imunizar gatos, uma vez que elas reagiram cruzadamente mas em intensidade sub-significância estatística com outros helmintos; até hoje não existe diagnóstico imunológico que faça diagnóstico específico de toxocaríase canina e felina. Numa segunda fase estes antígenos serão utilizados para imunização de felinos.

[003] O método proposto permite imunizar cães contra Toxocara spp. com grande eficiência, rapidez, baixo custo, sendo que não existe metodologia previamente descritas para controlar a infecção por T. canis; possibilitando um controle eficiente da infecção entre a população destes animais de forma indireta em humanos. Além disso, o método proposto permite purificar estas proteínas recombinantes e produzi-las em larga escala.

Estado da técnica

[004] A infecção parasitária causada pelo Toxocara canis (helminto de cães) tem diversos animais inclusive o homem, como hospedeiros paratênicos, onde suas larvas causam uma infecção denominada larva migrans visceral (LMV) ou toxocaríase. Esta infecção é cosmopolita, presente a nível mundial, principalmente em países em desenvolvimento. No entanto, como em outras infecções parasitarias, não existe um método de controle eficiente e definitivo, apenas medidas paliativas, sendo uma doença extremamente negligenciada pela saúde pública (MACPHERSON, Calum N.L. The epidemiology and public health importance of toxocariasis: A zoonosis of global importance. International Journal for Parasitology, v. 43, n. 12-13, p. 999-1008, 2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpara.2013.07.004>).

[005] O ciclo de vida do Toxocara canis é complexo; filhotes infectados com o parasito, liberam nas fezes um grande número de ovos no ambiente, após várias semanas esses ovos tornam-se infectantes (AGUIAR-SANTOS, Ana Maria et al. Human toxocariasis: Frequency of anti-Toxocara antibodies in children and adolescents from an outpatient clinic for lymphatic filariasis in Recife, Northeast Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, v. 46, n. 2, p. 8185, 2004). A infecção nos hospedeiros definitivos ocorre por quatro vias, intrauterina (cães) e lactação (cães), ingestão de ovos embrionados presentes no meio ambiente e finalmente por ingestão das larvas (excretadas nas fezes infectadas dos filhotes e ingeridos pela mãe ou ingestão de hospedeiros paratênicos portadores de larva nos órgãos e sistemas (fígado, pulmões, olhos, cérebro e músculos,) (OVERGAAUW, P a. Aspects of Toxocara epidemiology: toxocarosis in dogs and cats. Critical reviews in microbiology, v. 23, n. 3, p. 233251, 1997.)

[006] Quando se fala de reservatório de larvas somáticas, estas larvas acumulam-se nos tecidos caninos similar ao que acontece nos hospedeiros paratênicos; as larvas conseguem sobreviver por longos períodos de tempo nestes hospedeiros (CARDILLO, N. et al. Experimental infection with Toxocara cati in BALB-c mice, migratory behaviour and pathological changes. Zoonoses and Public Health, v. 56, n. 4, p. 198-205, 2009; SPRENT, J F A. Observations on the development of Toxocara canis in the dog. Parasitology, v. 48, n. 1-2, p. 184-209, 1958.).

[007] A infecção transplacentaria e intrauterina é a mais importante já que quase 100% dos filhotes de mães infectadas nascem com a infecção; esta forma de infecção ocorre a partir do dia 42°. da gestação por meio de larvas somáticas reativadas. A infecção por lactação aporta menor quantidade de larvas em comparação à infecção transplacentária (LLOYD, S.; AMERASINGHE, P. H.; SOULSBY, E. J.L. Periparturient immunosuppression in the bitch and its influence on infection with Toxocara canis. Journal of Small Animal Practice, v. 24, n. 4, p. 237-247, 1983; PARSONS, J. C. Ascarid infections of cats and dogs. Veterinary Clinics of North America - Small Animal Practice, v. 17, n. 6, p. 1307-1339, 1987. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/S0195-5616(87)50004-3>; MACPHERSON, Calum N.L. The epidemiology and public health importance of toxocariasis: A zoonosis of global importance. International Journal for Parasitology, v. 43, n. 12-13, p. 999-1008, 2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpara.2013.07.004>).

[008] No caso da ingestão de larvas somáticas, esta acontece após a predação de pequenos mamíferos que são hospedeiros paratênicos de Toxocara spp. e desta forma os cães se infectam-se com larvas que serão liberadas no intestino e se desenvolverão na maioria dos casos diretamente em vermes adultos neste habitat (SPRENT, J F A. Observations on the development of Toxocara canis in the dog. Parasitology, v. 48, n. 1-2, p. 184-209, 1958; MACPHERSON, Calum N.L. The epidemiology and public health importance of toxocariasis: A zoonosis of global importance. International Journal for Parasitology, v. 43, n. 12-13, p. 9991008, 2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpara.2013.07.004>).

[009] No caso da infecção por ovos férteis de Toxocara spp. os ovos eclodem e as larvas migram pela traqueia, chegam ao intestino delgado, tornam-se adultos e os ovos aparecem nas fezes dos animais infectados entre 4 a 5 semanas após a infecção primaria; as infecções em filhotes de mais de 6 meses de idade é menos comum e, portanto os contagens de ovos nas fezes destes animais são menores comparados com os animais de menor idades (FAHRION, A. S.; STAEBLER, S.; DEPLAZES, P. Patent Toxocara canis infections in previously exposed and in helminth-free dogs after infection with low numbers of embryonated eggs. Veterinary Parasitology, v. 152, n. 1-2, p. 108-115, 2008; CLAEREBOUT, E. et al. Giardia and other intestinal parasites in different dog populations in Northern Belgium. Veterinary Parasitology, v. 161, n. 1-2, p. 41-46, 2009; SCHNIEDER, Thomas; LAABS, Eva Maria; WELZ, Claudia. Larval development of Toxocara canis in dogs. Veterinary Parasitology, v. 175, n. 3-4, p. 193-206, 2011. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.vetpar.2010.10.027>).

[010] Os patógenos são reconhecidos inicialmente pelo sistema imune inato com as células dendríticas, reagindo à moléculas estranhas como lipopolissacarídeo bacteriano, DNA não metilado e carboidratos. Esses sinais desencadeiam o início de respostas específicas do sistema imune adaptativo. Atualmente, poucos desses “padrões moleculares associados a patógenos” (PAMPs) foram definidos para helmíntos, mas sua existência em T. canis pode ser inferida pela forte resposta imune adaptativa que ocorre nessa infecção. A principal característica desta resposta imune adaptativa é a produção de anticorpos específicos contra T. canis, associados à atividade das células CD4 + T-helper tipo 2 (Th2) (DEL PRETE, G F et al. Purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis and excretory-secretory antigen(s) of Toxocara canis expand in vitro human T cells with stable and opposite (type 1 T helper or type 2 T helper) profile of cytokine production. The Journal of clinical investigation, v. 88, n. 1, p. 346-50, 1991).

[011] A resposta Th2 é caracterizada pela liberação de um subconjunto específico de mediadores, particularmente citocinas tipo 2 IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, durante a infecção. Subsequentemente, a IL-4 promove a diferenciação de células B e a troca de classe de anticorpos, enquanto a IL-5 impulsiona a diferenciação de eosinófilos, ambos característicos da infecção por Toxocara spp (BEAVER, P. C. et al. CHRONIC EOSINOPHILIA DUE TO VISCERAL LARVA MIGRANS. American Academy of Pediatrics, v. 01, n. 1098-4275, 1952).

[012] As investigações de novas vacinas para doenças negligenciadas como as parasitoses ainda apresentam alguns desafios técnicos e científicos operacionais a serem enfrentados durante seus processos de desenvolvimento (BETHONY, J. M.; HOTEZ, P. J.; COLE, R. N.; REED, S.; GUO, X.; KAMHAWI, S.; VALENZUELA, J. G.; LIGHTOWLERS, M. W.; LOUKAS, A.; PETRI, W. Vaccines to combat the neglected tropical diseases. Immunological Reviews, v. 239, n. 1, p. 237-270, 2011; BOTTAZZI, M. E.; MILES, A. P.; DIEMERT, D.; HOTEZ, P. J. An ounce of prevention on a budget: A nonprofit approach to developing vaccines against neglected diseases. Expert Review of Vaccines, v. 5, n. 2, p. 189-198, 2006). Esses desafios começam durante a fase de escolha de antígenos com a avaliação, classificação e seleção de um pipeline candidato robusto e ideal. Posteriormente outros desafios ocorrem durante o desenvolvimento do produto nos estágios de testes pré-clínicos e clínicos.

[013] Um obstáculo inicial na descoberta de antígenos é a seleção bem-sucedida de antígenos alvos promissores, provenientes de vários projetos de genoma de parasitos. Assim, genomas bacterianos tem sido avaliados para serem utilizados como sistemas de expressão como o caso de Escherichia coli de moderado a alto rendimento, que produziram vacinas bacterianas novas e promissoras como a vacina contra o meningococo do sorogrupo B (SERRUTO, D.; BOTTOMLEY, M. J.; RAM, S.; GIULIANI, M. M.; RAPPUOLI, R. The new multicomponent vaccine against meningococcal serogroup B, 4CMenB: Immunological, functional and structural characterization of the antigens. Vaccine, v. 30, n. SUPPL. 2, p. B87-B97, 2012) e algumas espécies de Streptococcus (SEIB, K. .; ZHAO, X.; RAPPUOLI, R. Developing Vaccines in the Era of Reverse Vaccinology. New Generation Vaccines, Fourth Edition, p. 12-24, 2012 ); entretanto, na área da veterinária esses esforços tem sido mias focados no desenvolvimento de vacinas contra helmintos como Echinococcus granulosus e Taenia ovis em ovinos, Taenia saginata no gado e Ascaris suum em suinos (LIGHTOWLERS, M. W.; ROLFE, R.; GAUCI, C. G. Taenia saginata: Vaccination against cysticercosis in cattle with recombinant oncosphere antigens. Experimental Parasitology, v. 84, n. 3, p. 330-338, 1996; WOOLLARD, D. J.; GAUCI, C. G.; HEATH, D. D.; LIGHTOWLERS, M. W. Epitope specificities and antibody responses to the EG95 hydatid vaccine. Parasite Immunology, v. 20, n. 11, p. 535-540, 1998; ISLAM, M. K.; MIYOSHI, T.; TSUJI, N. Vaccination with recombinant Ascaris suum 24-kilodalton antigen induces a Th1/Th2-mixed type immune response and confers high levels of protection against challenged Ascaris suum lung-stage infection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology, v. 35, n. 9, p. 1023-1030, 2005; GAUCI, C. G.; VERÁSTEGUI, M. R.; GILMAN, R. H.; LIGHTOWLERS, M. W. Taenia solium and Taenia ovis: Stage-specific expression of the vaccine antigen genes, TSOL18, TSOL16, and homologues, in oncospheres. Experimental Parasitology, v. 113, n. 4, p. 272-275, 2006).

[014] O desenvolvimento de vacinas inicia com testes laboratoriais para detecção de anticorpos específicos e de populações de células T específicas contra os antígenos estudados; em seguida procura-se reduções substanciais da carga parasitária após imunizações com os antígenos candidatos e desafio com o parasito em animais de laboratório. Esses achados são utilizados para identificar parâmetros imunológicos para medir a proteção durante o teste clínico (GIERSING, B. K.; DUBOVSKY, F.; SAUL, A.; DENAMUR, F.; MINOR, P.; MEADE, B. Potency assay design for adjuvanted recombinant proteins as malaria vaccines. Vaccine, v. 24, n. 20, p. 4264-4270, 2006).

[015] Após o termino dos protocolos pré-clínicos e a seleção do antígeno alvo final, os processos partem para uma produção dos antígenos em larga escala e com boas práticas de fabricação completas (BPFC) para produzir material clínico suficiente para testes clínicos de fase I (SEID, C. A. et al. Expression, purification, and characterization of the Necator americanus aspartic protease-1 (Na-APR-1 (M74)) antigen, a component of the bivalent human hookworm vaccine. Human Vaccines and Immunotherapeutics, v. 11, n. 6, p. 1474-1488, 2015; GOUD, G. N.; DEUMIC, V.; GUPTA, R.; BRELSFORD, J.; ZHAN, B.; GILLESPIE, P.; PLIESKATT, J. L.; TSAO, E. I.; HOTEZ, P. J.; BOTTAZZI, M. E. Expression, purification, and molecular analysis of the Necator americanus glutathione S-transferase 1 (Na-GST-1): A production process developed for a lead candidate recombinant hookworm vaccine antigen. Protein Expression and Purification, v. 83, n. 2, p. 145-151, 2012).

[016] Outra dificuldade para o desenvolvomento de vacinas anti-parasitárias é que existem poucos modelos animais inteiramente permissivos que reproduzem o ciclo de vida completo do parasito ou que imitam o quadro clinico e gravidade da doença no hospedeiro do parasito para o qual se desenvolve a vacina. Sendo os agentes causadores dessas doenças organismos multicelulares, muitas vezes com uma ontogênese em estágios múltiplos e tendo vias metabólias e bioquímicas complexas e as vezes semelhantes a dos homens e outros mamíferos. Entretanto, existe o modelo murinho, que permite modelar as infecções parasitárias em camundongos sejam de tipo selvagens, transgênicos ou knock outs (LEGRAND, N. et al. Humanized Mice for Modeling Human Infectious Disease: Challenges, Progress, and Outlook. Cell Host and Microbe, v. 6, n. 1, p. 5-9, 2009).

[017] Embora quase todos os estudos imunológicos sobre T. canis tenham-se focado no ciclo das larvas migratórias nos hospedeiros paratênicos, a resposta imune dos caninos (hospedeiros definitivos do parasito) aos vermes adultos intestinais é de importância central. Um objetivo é desenvolver uma vacina eficaz contra a toxocaríase canina, que idealmente construiria imunidade nos estágios tanto das larvas migrando nos tecidos, quanto dos parasitos adultos no intestino. A imunidade a vermes ascarídeos é dependente de mecanismos do perfil Th2 que age para expelir os parasitos intestinais, mas também tem sido relatado que as células T reguladoras Foxp3+ são numerosas em cães com infecções por nematóides intestinais (JUNGINGER, Johannes et al. Immunohistochemical investigation of Foxp3 expression in the intestine in healthy and diseased dogs. Veterinary Research, v. 43, n. 1, p. 23, 2012.), sugerindo que a tolerância à mucosa conferida pela células reguladoras e suas citocinas IL-10 e TGF-beta está envolvida na persistência da infecção. Assim, estratégias de intervenção para neutralizar Tregs poderiam promover imunidade protetora, como foi relatado em alguns modelos animais de infecção por helmintos (TAYLOR, M. D. et al. CTLA-4 and CD4+CD25+ Regulatory T Cells Inhibit Protective Immunity to Filarial Parasites In Vivo. The Journal of Immunology, v. 179, n. 7, p. 4626-4634, 2014.). A imunidade ao estágio larval é igualmente importante, e a vacina ideal deve ter também ação contra esta fase do parasito.

[018] Até o momento, tentativas de gerar imunidade protetora contra larvas em roedores de laboratório tiveram resultados controversos. Enquanto um relato inicial observou que a imunização com extratos somáticos de ovos ou vermes adultos resultou em aproximadamente metade do número de larvas sobreviventes do desafio (IZZAT, N.N.; OLSON, L J. Resistance of mice to Toxocara canis: effect of prechallenge infections and injections of worm extracts. Canadian Journal of Zoology, v. 48, n. Snedecor 1956, 1970), a suscetibilidade à infecção larval foi inalterada em camundongos imunizados com ovos irradiados com UV ou ES larval antígenos (ABO-SHEHADA, M. N.; AL-ZUBAIDY, B. A.; HERBERT, I. V. Acquired immunity to Toxocara canis infection in mice. Veterinary Parasitology, v. 38, n. 4, p. 289-298, 1991). Da mesma forma, um estudo mais recente não encontrou evidências de proteção pela administração de um segundo desafio de larvas a camundongos previamente infectados, além de serem mais propensos ao encistamento das larvas no cérebro (KOLBEKOVÁ, Petra et al. Toxocara canis larvae reinfecting BALB/c mice exhibit accelerated speed of migration to the host CNS. Parasitology Research, v. 109, n. 5, p. 1267-1278, 2011.). Uma abordagem mais sistemática, comparando imunização e regimes adjuvantes e seguindo mais de perto a resposta imune resultante, ajudaria a esclarecer esta questão.

Problemas do estado da técnica

[019] A vacinação contra a toxocaríase pode ser apropriada para uso em cães, já que esse processo cortaria o ciclo de infecção de hospedeiros paratênicos como o hospedeiro humano. Particularmente uma vacina anti-larva preenche o espaço deixado pelos anti-helmínticos atuais, que limpam os vermes intestinais, mas não matam as larvas dos tecidos. Essas larvas são capazes de migrar através da placenta para infectar filhotes nascituros, e a vacinação pode oferecer o único meio de interromper a transmissão e garantir o nascimento de ninhadas livres de parasitos.

[020] Apesar do potencial para o controle da doença, muito pouco foi feito para identificar antígenos vacinais em potencial do T. canis. Alguns pesquisadores testaram antígenos do TES (NICHOLAS, W. L.; STEWART, A. C.; MITCHELL, G. F. Antibody responses to Toxocara canis using sera from parasite-infected mice and protection from toxocariasis by immunisation with es antigens. Australasian Society for Immunology Inc., v. 62, n. 01 October 1984, p. 619-626, 1984; SUGANE, K.; KUSAMA, Y.; TAKAMOTO, M.; TOMINAGA, A.; TAKATSU, K. Eosinophilia, IL-5 level and recovery of larvae in IL-5 transgenic mice infected with Toxocara canis. Journal of Helminthology, v. 70, n. 02, p. 153, 1996.) ou extratos brutos de larvas (BARRIGA, O. O. A critical look at the importance, prevalence and control of toxocariasis and the possibilities of immunological control. Veterinary Parasitology, v. 29, n. 2-3, p. 195-234, 1988.) e encontraram proteção parcial em modelos de camundongos. Outro grupo relatou que ovos irradiados com radiação ultravioleta forneceram um efeito protetor (ABO-SHEHADA, M. N.; AL-ZUBAIDY, B. A.; HERBERT, I. V. Acquired immunity to Toxocara canis infection in mice. Veterinary Parasitology, v. 38, n. 4, p. 289298, 1991). Ainda não foram publicados relatos sobre o uso da nova geração de antígenos recombinantes ou glicanos definidos na estimulação da imunidade protetora contra o estágio larval.

[021] Diferentes estudos avaliaram a atividade biológica dos antígenos de Toxocara (TES) em estudos de imunização realizados em hospedeiros experimentais paratênicos; antígenos somáticos larvares inteiros ou ovos irradiados infectantes também foram investigados. ABO-SHEHADA et. Al. (ABO-SHEHADA, M. N.; AL-ZUBAIDY, B. A.; HERBERT, I. V. Acquired immunity to Toxocara canis infection in mice. Veterinary Parasitology, v. 38, n. 4, p. 289298, 1991.) (ABO-SHEHADA; AL-ZUBAIDY; HERBERT, 1991) examinaram os efeitos de quatro preparados antigênicos de T. canis, administradas intraperitonealmente (i.p.) em água destilada ou solução salina fisiológica, contra uma infecção provocada por 1000 ovos férteis de T. canis em camundongos. O antígeno de ovo irradiado com UV deu a melhor proteção com aproximadamente 40% de redução de larvas e foi observada uma resposta imune protetora significativa. Houve menor número de larvas estabelecidas na musculatura e no cérebro e uma maior proporção foi retirada do fígado. A administração de uma dose de vacina TES (8 mg de proteína) permitiu pequeno grau de proteção, mas o antígeno extraído de fêmea adulta e o antígeno somático de larva do segundo estágio (L2) não proporcionaram nenhum tipo de proteção.

[022] Outra publicação usando extratos solúveis de adultos fêmeas ou machos, ou ovos embrionados de T. canis, administrados a camundongos em duas doses sem adjuvante, foram ligeiramente protetores contra infecção por 2000 ovos embrionados (CONCEPCION, J. E.; BARRIGA, O. O. Transfer of infection-induced immune protection to Toxocara canis in a mouse model. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 9, p. 371-382, 1985). Comprovou-se que ovos irradiados retém as propriedades antigênicas das moléculas. Sabe-se que a irradiação pode interferir na síntese de proteínas e na função de enzimas. Em relação ao tipo de irradiação utilizado para a preparação da vacina contra Toxocara spp., foi relatado que ovos irradiados com raios gama (1 Mrad) perderam sua infectividade quase completamente, pois apenas algumas larvas foram recuperadas do trato digestivo de camundongos inoculados e nenhuma migração larval visceral foi observada (KAMIYA, MASAO; OOI, HONG-KEAN; NOMURA, TATSUJI. The effect of irradiation on the viability and migratory ability of second-stage larvae of Toxocara canis in mice. Veterinary Parasitology, v. 24, p. 87-92, 1987).

[023] A irradiação de larvas infectantes de T. canis com raios X reduziu a patogenicidade, mas não impediu completamente sua migração (BARRIGA, Omar O.; MYSER, Willard C. Effects of Irradiation on the Biology of the Infective Larvae of Toxocara canis in the Mouse. The Journal of Parasitology, v. 73, n. 1, p. 89, 1987). O efeito de frações solúveis ou de ovos de T. canis embrionados foi estudado em camundongos; frações antigênicas foram administradas junto com adjuvante completo de Freund (CFA) ou lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS). Enquanto a injeção de extrato solúvel reduziu a carga parasitária de camundongos em 37%, o extrato solúvel com LPS reduziu em 76% e o extrato particulado com CFA aumentou o número de larvas em 60% em comparação com camundongos não imunizados (BARRIGA, Omar O. A critical look at the importance, prevalence and control of toxocariasis and the possibilities of immunological control. Veterinary Parasitology, v. 29, n. 2-3, p. 195-234, 1988).

[024] Em conjunto, estes resultados sugerem que moléculas candidatas a vacina protetora podem estar presentes igualmente em ovos maduros contendo larvas infectantes, antígenos TES larvares ou podem ser uma parte das proteínas somáticas larvais, chamadas "antígenos ocultos" (MUNN, Edward A. Rational design of nematode vaccines: Hidden antigens. International Journal for Parasitology, v. 27, n. 4, p. 359-366, 1997). Vale ressaltar que a dose de antígenos e adjuvantes utilizados são fatores importantes para induzir uma memória imunológica eficiente. Embora a caracterização de moléculas nativas de Toxocara spp. e seus análogos recombinantes esteja em andamento, o efeito de uma única molécula candidata ainda não foi elucidado em ensaios de vacinação in vivo.

Vantagens da invenção

[025] Atualmente não existe nenhum método para o controle da infecção por Toxocara spp. que represente o controle definitivo da infecção e que seja de fácil produção e baixo custo. Baseados nesta premissa, a busca de proteínas recombinantes a serem utilizadas como alvos vacinais, faz-se necessário. O desenvolvimento tecnológico tem levado a melhorias significativas no desenvolvimento de novas ferramentas na produção de tratamentos e profilaxia baseados em antígenos recombinantes, sendo considerados alvos promissores, além de permitir o desenho racional de estratégias efetivas de tratamento e controle de enfermidades de diversas causas, inclusive parasitárias. A produção de proteínas recombinantes visadas como vacina para o controle da toxocaríase animal e de forma indireta para a toxocaríase humana deve ser focado no uso de antígenos capazes de induzir uma resposta imune duradoura e eficiente, sendo uma maior vantagem se essas proteínas recombinantes puderem ser reconhecidas por anticorpos de outros parasitos.

[026] Encontram-se no estado da técnica alguns artigos que descrevem a utilização de produtos excretados/secretados, antígenos somáticos e ovos irradiados como possíveis vacinas para a toxocaríase.

[027] No estado da arte são descritos métodos para vacinação contra toxocaríase em modelos experimentais. O artigo intitulado “Acquired immunity to Toxocara canis infection in mice”, de 1991 (ABO-SHEHADA, M. N.; AL-ZUBAIDY, B. A.; HERBERT, I. V. Acquired immunity to Toxocara canis infection in mice. Veterinary Parasitology, v. 38, n. 4, p. 289-298, 1991.), refere-se a um método de imunização de camundongos no qual foram utilizadas quatro formulações de possíveis vacinas, as mesmas que foram administradas vía intraperitoneal, ovos irradiados com luz ultravioleta que proteção de 40%, administração de TES, de 27%, e o antígeno somático de verme adulto assim como o antígeno somático das larvas L3 não conferiram nenhum tipo de proteção contra a infecção.

[028] O artigo intitulado “Eosinophilia, IL-5 level and recovery of larvae in IL-5 transgenic mice infected with Toxocara canis”, de 1996 (SUGANE, K. et al. Eosinophilia, IL-5 level and recovery of larvae in IL-5 transgenic mice infected with Toxocara canis. Journal of Helminthology, v. 70, n. 02, p. 153, 1996), refere-se a uma possível formulação de vacinação utilizando TES onde se observou que os camundongos imunizados com o antígeno TES em ACF por três injeções subcutâneas, tiveram uma redução no número de larvas em aproximadamente de 70%; no artigo intitulado “ANTIBODY RESPONSES TO TOXOCARA CANIS USING SERA FROM PARASITE-INFECTED MICE AND PROTECTION FROM TOXOCARIASIS BY IMMUNISATION WITH ES ANTIGENS” de 1984, (NICHOLAS, W. L.; STEWART, A. C.; MITCHELL, G. F. Antibody responses to Toxocara canis using sera from parasite-infected mice and protection from toxocariasis by immunisation with es antigens. Australasian Society for Immunology Inc., v. 62, n. 01 October 1984, p. 619-626, 1984.) utilizou-se uma formulação semelhante utilizando produtos excretados/secretados de larvas de T. canis e observou-se o mesmo tipo de proteção em camundongos vacinados com TES em ACF.

[029] O artigo intitulado “Immune responses in mice immunized with Toxocara canis antigens” (DVOROZNAKOVA, E.; BOROŠKOVÁ, Z.; TOMAŠOVIČOVÁ, O. ; Helminthologia, v. 39, n. 2, p. 59-66, 2002.), descreve o método de vacinação onde foram comparadas as respostas imunes de camundongos imunizados com antígenos excretórios-secretórios (TES) e somáticos (S) de Toxocara canis. Ambos os antígenos TES e S foram administrados em duas doses com adjuvante incompleto de Freund (AIF) e subsequentemente os camundongos foram expostos a infecção com 1000 ovos de T. canis. Houve efeitos protetores moderados no grupo vacinado com o TES (40,5%) em adjuvante incompleto de Freund (AIF), também houve uma resposta imune menor no grupo vacinado com o antígeno somático solúvel de larvas L2 (30%) nos camundongos desafiados.

[030] A presente invenção refere-se a um método de produção de proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan que serão utilizadas como vacina contra infecção por Toxocara canis, para estimular uma resposta imune eficaz e duradoura, sendo capaz de estimular a produção de anticorpos específicos como IgG, IgG1, IgG2a e IgE contra T. canis além do estimulo de citocinas como IL-5 e INFƔ. A utilização das moléculas recombinantes rTcCad e rTcVcan, nos forneceu resultados satisfatórios e mais robustos para uso no modelo animal de toxocaríase e resultou em um método eficiente para controle desta infecção parasitaria.

[031] O nosso método mostrou-se mais eficaz que os trabalhos acima mencionados como mostrado como a proteina rTcCad estimulando a produção significativa de IgG (P = 0.0053), IgG1 (P<0,0001), para IgG2a (P< 0,0001) e IgE específica (P = 0.005) e obtendo uma redução de 51,96% nas larvas de T. canis no fígado, 60,42% no músculo e 87,5% no cérebro. Já com a proteína rTcVcan encontramos uma produção de IgG (P = 0.0354), IgG1 (P = 0.0028) and IgG2a (P = 0.0451) e uma redução de 53,16% nas larvas de T. canis no fígado, 58,04% no músculo e 87,5% no cérebro. A formulação das proteínas recombinantes utilizadas como vacinas aqui descritas, demonstraram excelentes resultados tanto na estimulação da produção de anticorpos específicos assim como na redução da quantidade de larvas presentes nos tecidos dos animais vacinados. As formulações aqui descritas utilizaram o adjuvante de Freund; o mesmo não é utilizado para imunização de cães, por tanto outros adjuvantes estão sendo testados no nosso laboratório para a vacina canina.

[032] As proteínas recombinantes empregadas na presente invenção são obtidas através de um sistema de expressão de proteínas em E. coli. As proteínas rTcCad e rTcVcan mostram um controle da infecção estimulando a produção de anticorpos específicos, citocinas de perfil Th1/Th2, além de mostrar uma redução significativa na migração das larvas de T. canis.

[033] As proteínas rTcCad e rTcVcan conseguiram controlar a infecção reduzindo de forma significante o número de larvas recuperadas dos animais vacinados e desafiados com ovos infectantes de T. canis.

[034] Estudos da arte têm demostrado que as moléculas de vacina protetora podem ser uma parte de proteínas somáticas larvais, os chamados "antígenos ocultos" (Rational design of nematode vaccines: Hidden antigens) de 1997, (MUNN, Edward A. Rational design of nematode vaccines: Hidden antigens. International Journal for Parasitology, v. 27, n. 4, p. 359-366, 1997). Vale ressaltar que a dose de antígenos e adjuvantes utilizados são fatores importantes para induzir a memória imunológica eficiente. As moléculas utilizadas para desenvolver as formulações vacinais são proteínas de superfície que podem ser consideradas como parte dos “antígenos ocultos” motivo pelo qual as proteínas utilizadas conseguiram estimular de forma significativa a produção de anticorpos e citocinas de perfis Th1/Th2 para controlar e reduzir o número de larvas migratórios nos hospedeiros testados. Paralelamente durante os testes iniciais das formulações aqui descritas também foram testadas proteínas recombinantes provenientes dos produtos excretados/secretados do T. canis ditas moléculas mostraram ser mens eficientes no controle da infecção ( ~ 20% de controle no índice de supervivência das larvas) quando comparadas com as proteínas de superfície. Por tanto, a utilização dessas moléculas recombinantes representa uma abordagem viável e promissória para o desenvolvimento de uma vacina para o controle da toxocariase em animais domésticos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[035] A Figura 1 mostra a expressão das proteínas recombinantes rTcVcan (A) e rTcCad (B) em E. coli BL21 (DE3) em SDS-PAGE 12%, coradas com Coomassie Brilliant Blue. São aplicados em cada canaleta 25μg de proteína de cada recombinante. MW: Padrão de peso molecular de proteína (Molecular Wheight (MW)); Canaleta 1: cultura Pré-indução; Canaleta 2: cultura induzida por 1h com 1mM de IPTG, 37°C; Canaleta 3: cultura induzida por 4hs com 1mM de IPTG, 37°C; Canaleta 4: fração insolúvel da proteína recombinante; Canaleta 5: proteína purificada. As proteínas rTcCad e rTcVcan são expressas nas suas formas insolúveis, com pesos moleculares de 23.46 kDa e 42,55 kDa respectivamente.

[036] A Figura 2 o gráfico de barras da análise do imunoensaio (ELISA) para determinar a estimulação de produção de IgG nos grupos vacinados com as proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan. São testados soros dos animais imunizados com as proteínas recombinantes (significância estatística: ****p<0.0001; ***p<0.001; **p<0.001 e *p<0.005). A distribuição dos resultados se deu em forma grupal sendo avaliado cada um dos grupos vacinados e comparados com o grupo PBS. O gráfico relaciona o resultado de densidade óptica obtidos em cada ensaio.

[037] A Figura 3 representa o gráfico de barras da análise do imunoensaio (ELISA) para determinar a estimulação de produção de IgG1 nos grupos vacinados com as proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan. São testados soros dos animais imunizados com as proteínas recombinantes (significância estatística: ****p<0.0001; ***p<0.001; **p<0.001 e *p<0.005). A distribuição dos resultados se deu em forma grupal sendo avaliado cada um dos grupos vacinados e comparados com o grupo PBS. O gráfico relaciona o resultado de densidade óptica obtidos em cada ensaio.

[038] A Figura 4 representa o gráfico de barras da análise do imunoensaio (ELISA) para determinar a estimulação de produção de IgG2a nos grupos vacinados com rTcCad e rTcVcan. Os asteriscos indicam que houve uma diferença estatisticamente significativa comparando os grupos não vacinados (controle) e vacinados (testes) ****p<0,0001; ***p<0,001, **p<0,01 e *p<0,05.

[039] A Figura 5 representa o gráfico de barras da análise do imunoensaio (ELISA) para determinar a estimulação de produção de IgE nos grupos vacinados com rTcCad e rTcVcan. Os asteriscos indicam que houve uma diferença estatisticamente significativa comparando os grupos não vacinados (controle) e vacinados (testes) ****p<0,0001; ***p<0,001, **p<0,01 e *p<0,05.

[040] A Figura 6 representa o gráfico de barras da análise do imunoensaio (ELISA) para determinar a produção de IL-5 em sobrenadantes de culturas de esplenocitos dos camundongos vacinados com as proteínas recombinantes. Os esplenocitos são isolados dos camundongos após 30 dias de vacinação e estimuladas pelos antígenos. A citocina IL-5 é dosada mediante o imunoensaio de ELISA específico para a citocina. Cada amostra é examinada em duplicado (significância estatística: ****p<0.0001; ***p<0.001; **p<0.001 e *p<0.005).

[041] A Figura 7 representa o gráfico de barras da análise do imunoensaio (ELISA) para determinar a produção de INFy em sobrenadantes de culturas de esplenócitos dos camundongos vacinados com as proteínas recombinantes. Os esplenocitos são isolados dos camundongos após 30 dias de vacinação e estimuladas pelos antígenos. A citocina INFƔ é dosada mediante o imunoensaio de ELISA específico para a citocina. Cada amostra é examinada em duplicado (significância estatística: ****p<0.0001; ***p<0.001; **p<0.001 e *p<0.005).

[042] A Figura 8 o gráfico de barras da análise do nível de IL-10 produzido por esplenocitos dos camundongos vacinados e controles não vacinados estimulados com rTcCad, e rTcVcan. Os esplenocitos são isolados dos camundongos após 30 dias de vacinação e estimuladas pelos antígenos. A citocina IL-10 é dosada mediante o imunoensaio de ELISA específico para a citocina. Cada amostra é examinada em duplicado (significância estatística: ****p<0.0001; ***p<0.001; **p<0.001 e *p<0.005).

[043] A Figura 9 representa o gráfico de barras da análise do número de larvas de T. canis recuperadas após o protocolo de digestão dos fígados dos animais de cada grupo tratado com as proteínas recombinantes. Os camundongos são vacinados e então posteriormente desafiados com 500 ovos embrionados de T. canis. Os asteriscos indicam que houve uma diferença estatisticamente significativa comparando controles não vacinados e grupos vacinados. ****p<0,0001; ***p<0,001, **p<0,01 e *p<0,05.

[044] A Figura 10 representa o gráfico de barras da análise do número de larvas de T. canis recuperadas após o protocolo de digestão do músculo esquelético dos animais de cada grupo tratado com as proteínas recombinantes. Os camundongos são vacinados e então posteriormente desafiados com 500 ovos embrionados de T. canis. Os asteriscos indicam que houve uma diferença estatisticamente significativa comparando controles não vacinados e grupos vacinados. ****p<0,0001; ***p<0,001, **p<0,01 e *p<0,05.

[045] A Figura 11 representa o gráfico de barras da análise do número de larvas de T. canis no cérebro dos animais infectados no modelo animal. Os camundongos são vacinados e então posteriormente desafiados com 500 ovos embrionados de T. canis. Os asteriscos indicam que houve uma diferença estatisticamente significativa comparando controles não vacinados e grupos vacinados. **** P <0,0001; *** P <0,001, ** P <0,01 e * P <0,05.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[046] As proteínas rTcCad e rTcVcan, são proteínas de superfície do parasito T. canis. As mencionadas proteínas possuem funções tanto metabólicas como de permeabilidade da membrana citoplasmática no organismo nativo. A rTcCad tem um peso molecular de aproximadamente 23.460 daltons (23.46 kDa) e rTcVcan tem um peso molecular de aproximadamente 42.550 daltons (42.55 kDa). Modelos murinos tem mostrado que camundongos vacinados com proteínas somáticas ou de superfície exibem maior proteção imune quando desafiados com os patógenos (9,10). Portanto, as proteínas rTcCad e rTcVcan são potenciais candidatas a alvo vacinal como é observado nesta invenção.

[047] O método proposto é realizado através do uso de uma formulação utilizando as proteínas recombinantes rTCad e rTcVcan do Toxocara canis em adjuvante completo de Freud (ACF) e em dois reforços utilizando o adjuvante incompleto de Freud (AIF), como antígenos capazes de induzir uma resposta imune eficiente e duradoura capaz de controlar a toxocariase murina. Outros adjuvantes serão testados para a vacina canina.

[048] O método proposto para a imunização dos animais experimentais contra a toxocaría utiliza as proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan, esse mesmo método será aplicado na imunização de cães com algumas modificações, os conjugados podem ser adicionados a diluentes ou veículos imunologicamente aceitáveis da maneira convencional para preparar soluções ou suspensões líquidas injetáveis, inicialmente os conjugados são ligados a adjuvantes aceitados para a experimentação como são o adjuvante completo de Freud (ACF) e o adjuvante incompleto de Freud (AIF). Adicionalmente, as formulações podem ser ligadas aoutros veículos como Pam3CSK4 VacciGrade™, Alhydrogel® Adjuvant 2%, Quil-A®, o método proposto compreende as seguintes etapas:

• a. Produção e purificação das proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan por superexpressão de forma heteróloga, utilizando as sequências das proteínas recombinantes Tcan_06969 (KHN87575.1) e Tcan_14421 (KHN75413.1), otimizadas para expressão proteica em organismo procarioto (Codon usage), sintetizados e clonados no vetor de expressão pET-21a(+).
• b. Uma vacina compreendendo um conjugado imunogênico que compreende (a) a proteína rTcCad de T. canis expressa por via recombinante obtido em “a” e (b) , o Adjuvante Completo de Freud/Adjuvante Incompleto de Freud.
• c. Uma vacina compreendendo um conjugado imunogênico que compreende (a) a proteína rTcVcan de T. canis expressa por via recombinante obtido em “a” e (b) , o Adjuvante Completo de Freud/Adjuvante Incompleto de Freud.
• d. Um método de indução de uma resposta de anticorpos e celular para as proteínas recombinantes de T. canis em cães que compreende a administração ao referido animal de uma quantidade imunogênica da vacina obtido em “b”.

[049] Como detalhado no Exemplo 1 abaixo, os vetores de expressão contendo o gene da rTcCad e rTcVcant são preparados e inseridos por choque térmico nos hospedeiros E. coli de linhagem BL21 (DE3).

[050] Os conjugados que são processados de acordo com esta invenção são preferencialmente utilizados na preparação de vacinas para conferir proteção cães contra a infecção causada por Toxocara canis. Estudos de homólogos das proteínas utilizadas nesta invenção não tem mostrado que estas sejam ou possuam algum tipo de atividade tóxica.

[051] Os conjugados desta invenção são administrados de uma maneira convencional, tal como injeção subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular em animais domésticos para induzir uma resposta imunitária ativa para gerar proteção contra infecção causada pelo patógeno T. canis. A dosagem a ser administrada é determinada por meios conhecidos pelos especialistas na técnica.

[052] Vale ressaltar que, embora o ACF e o AIF sejam mediadores para ativar diferentes vias da resposta imune nos hospedeiros, os camundongos que recebem apenas o adjuvante durante o modelo experimental não presentaram títulos elevados de anticorpos, citocinas nem se observou uma diminuição na migração das larvas de T. canis nos tecidos comparados com os camundongos que receberam o conjugado vacinal. Assim, o efeito protetor do conjugado parece ser devido as proteínas recombinantes utilizadas atuando conjuntamente com o adjuvante utilizado.

[053] Para que esta invenção possa ser melhor compreendida, os exemplos seguintes são apresentados. Os exemplos são apenas para fins de ilustração e não devem ser interpretados como limitativos do âmbito da invenção

EXEMPLO 1 - Produção das proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan

[054] A produção das proteínas recombinantes é realizada por superexpressão mediante um sistema heterologo, utilizando as sequências das proteínas recombinantes rTcCad [Tcan_06969 (KHN87575.1)] e rTcVcan [Tcan_14421 (KHN75413.1)], otimizadas para expressão proteica em organismo procarioto (OptimumGeneTM), substituindo códons na sequência original do cDNA por códons mais utilizados pelo hospedeiro sem alterar a sequência proteica. A modo de purificar uma quantidade suficiente de rTcCad e rTcVcan, é realizado o seguinte procedimento de expressão e cromatografia de afinidade.

[055] O pré-inóculo bacteriano de E. coli de linhagem BL21 (DE3) contendo os vetores de expressão que a sua vez contém os genes codificadores das proteínas rTcCad e rTcVcan é incubado overnight e adicionado em 1 litro de meio de cultura Luria Bertani (LB) pH 7.4 contendo ampicilina (50μg/ml).

[056] A E. coli BL21 (DE3) recombinante é então cultivada a 37°C com agitação vigorosa (200 rpm/min) até ser atingida uma densidade ótica 0.6 - 0.8 no filtro de leitura de 600nm. Atingida a densidade ótica IPTG é adicionado à cultura (a uma concentração de 1 mM) como um indutor, e as células de E. coli são mantidas sob agitação e a uma temperatura constante de 37°C durante 4 horas para as proteínas rTcCad e rTcVcan. A expressão das proteínas recombinantes é observada no gel SDS-PAGE coradas com azul de Coomassie (Fig. 1).

[057] As células são centrifugadas a 5.000g durante 30 minutos a 4°C, o pellet é ressuspendido em 25 mL de tampão de lises desnaturante (10mM Na2HPO4, 10mM NaH2PO4, 0,5M NaCl, 10mM imidazol e 8M de ureia) pH7.4, as células são lisadas por sonicação (45Htz) com ciclos de 1 minuto em sonicação e 1 minuto de descanso a 4°C, sendo repetido por 5x.

[058] O lisado é centrifugado a 5000g durante 30 minutos a 4°C. Os sobrenadantes são coletados e centrifugado mais uma vez a 5000g durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante resultante e filtrado com um filtro para seringa de 0.45μm.

[059] A purificação é feita mediante cromatografia de afinidade utilizando o sistema automatizado AKTA Pure25 (GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Bjorkgatan 30 751 84 Uppsala, Sweden) utilizando a coluna HisTrap FF 5 mL (GE Healthcare, Healthcare, Bio-Sciences AB, Bjorkgatan 30 751 84 Uppsala, Sweden) seguindo as especificações de programação do equipo para a coluna utilizada, adicionado o sobrenadante no equipamento a coluna é lavada com tampão fosfato de sódio para condições desnaturantes (10mM Na2HPO4, 10mM NaH2PO4, 10mM imidazol) pH 7,4 para remover materiais indesejados. As proteínas rTcCad e rTcVcan são eluidas com tampão de eluição para condições desnaturante (10mM Na2HPO4, 10mM NaH2PO4, 0,5M NaCl, 500mM imidazol e 8M de ureia) pH7.4. As frações identificadas com a proteína de interesse são agrupadas para realizar o processo de dialise.

[060] A dialise das proteínas eluídas é feita mediante cromatografia de afinidade utilizando o sistema automatizado AKTA Pure25 (GE Healthcare, Healthcare, BioSciences AB, Björkgatan 30 751 84 Uppsala, Sweden) utilizando a coluna HiTrap® Desalting (GE Healthcare, Healthcare, Bio-Sciences AB, Björkgatan 30 751 84 Uppsala, Sweden) seguindo as especificações de programação do equipo para a coluna utilizada, é utilizado o tampão fosfato de sódio (10mM Na2HPO4, 10mM NaH2PO4) pH 7,4. O rendimento da produção de proteína é avaliado mediante dosagem de proteínas utilizando o sistema Qubit™ Protein Assay Kit (InvitrogenTM).

[061] Adicionalmente, a metodologia de purificação das proteínas pode ser adaptada a outras metodologias como troca iônica, troca catiônica, exclusão por tamanho. As proteínas rTcCad e rTcVcan purificadas exibem uma única banda num gel SDS-PAGE com um peso molecular de 23.46kDa e 42.55kDa respectivamente.

EXEMPLO 2 - PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DE IMUNIZAÇÃO CONTENDO A PROTEÍNA rTcCad EM ADJUVANTE COMPLETO DE FREUD

[062] Uma amostra de 102,5 μL de rTcCad expressada e purificada de acordo com o exemplo 1 com uma concentração de 244 μg/mL de proteína é dissolvida em 397,5 μL de PBS pH 7.0 mais 500μL de Adjuvante Completo de Freud.

EXEMPLO 3 - PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DE IMUNIZAÇÃO CONTENDO A PROTEÍNA rTcVcan EM ADJUVANTE COMPLETO DE FREUD

[063] Uma amostra de 105,93μL de rTcCad expressada e purificada de acordo com o exemplo 1 com uma concentração de 236 μg/mL de proteína é dissolvida em 394,07 μL de PBS pH 7.0 mais 500μL de Adjuvante Completo de Freud.

EXEMPLO 4 - PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DE IMUNIZAÇÃO CONTENDO A PROTEÍNA rTcCAD EM ADJUVANTE INCOMPLETO DE FREUD

[064] Uma amostra de 102,5 μL de rTcCad expressada e purificada de acordo com o exemplo 1 com uma concentração de 244 μg/mL de proteína é dissolvida em 397,5 μL de PBS pH 7.0 mais 500μL de Adjuvante Incompleto de Freud.

EXEMPLO 5 - PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DE IMUNIZAÇÃO CONTENDO A PROTEÍNA rTcVcan EM ADJUVANTE INCOMPLETO DE FREUD

[065] Uma amostra de 105,93μL de rTcVcan expressada e purificada de acordo com o exemplo 1 com uma concentração de 236 μg/mL de proteína é dissolvida em 394,07 μL de PBS pH 7.0 mais 500μL de Adjuvante Incompleto de Freud.

EXEMPLO 6 - RESPOSTA DE ANTICORPOS ÀS VACINAS CONJUGADAS

[066] Os conjugados preparados pelos procedimentos dos exemplos acima encontram-se de acordo com os protocolos autorizados pelo Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA-ICS) para o teste com segurança em camundongos (n° 137/2018; 14 de abril de 2018). Os conjugados são então testados quanto à sua capacidade de criar anticorpos nos camundongos. Os conjugados são diluídos em PBS estéril (pH 7,0) em adjuvante completo de e incompleto de Freud junto com as proteínas recombinantes de tal modo que uma dose de 0,1 mL contém 25ug de proteína. As vacinas conjugadas são esterilizadas por filtração por membrana através de 0,45μm Filtro Kasvi.

[067] Camundongos fêmeas C57BL/6 (10 semanas de idade) são divididas em 7 grupos de 7 animais, Grupo 1: Controle PBS, Grupo 2: Controle PBS/Adjuvante, Grupo 3: Animais imunizados com a proteína rTcCad, Grupo 4: Animais imunizados com a proteína rTcVcan. No primeiro dia os animais são imunizados via subcutânea com o conjugado contendo 25 μg de proteína recombinante com adjuvante completo de Freud (ACF) (SIGMA-ALDRICH Co, St. Louis, MO, USA) num volume total de 100 μL. Após 5 dias os animais são imunizados com a mesma dose de rTcCad e rTcVcan misturada com adjuvante incompleto de Freud (AIF) (SIGMA-ALDRICH Co, St. Louis, MO, USA). A terceira imunização é realizada 5 dias após a segunda com a mesma solução utilizada na segunda imunização. Os grupos 1 e 2 (controles) seguem o mesmo esquema de vacinação previamente descrito recebendo apenas 100 μL de PBS e PBS/adjuvante respectivamente (Fig. 2).

[068] Após o último reforço os animais são desafiados com 500 ovos infectantes de T. canis administrados via oral. Trinta dias depois do desafio os animais são eutanásiados e amostras de sangue são coletadas por sangramento da veia subclávia. Os soros dos camundongos de cada um dos grupos são ensaiados por ELISA quanto aos títulos de anticorpos de tipo IgG, e suas subclases IgG1 e IgG2a e IgE específica. Nos experimentos realizados, houve tendências de maiores respostas de IgG1 particularmente na proteína rTcCad (p <0.0001) comparada com a rTcVcan (p = 0.002), a proteína rTcCad também apresentou uma forte resposta de IgG2a (p < 0.0001). Da mesma forma a proteína rTcCad teve induz uma maior produção de IgE (p < 0,005). Os resultados do ensaio estão representados nos gráficos 2, 3, 4 e 5.

EXEMPLO 7 - RESPOSTA DE CÉLULAS T ÀOS CONJUGADOS VACINAIS

[069] A resposta imune das células T avalia-se mediante a titulação dos níveis de citocinas IL-5 mediada pelas células T-helper (Th) tipo 2 em culturas de esplenócitos e INFƔ mediada pelas células T-helper (Th) tipo1. Esplenócitos de camundongos sensibilizados com as proteínas obtinas no exemplo 1 são lavados duas vezes em meio RPMI por centrifugação a 200g por 10 min. O sedimento obtido é ressuspenso em meio RPMI suplementado com 200 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100μg/mL de estreptomicina e 10% de soro fetal de bovino inativado (Gibco, Pisley, UK).

[070] As células dos baços são plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano (Costar, Cambridge, MA, EUA) a uma densidade de 5x105 células/poço.

[071] As células são tratadas com concentrações não citotóxicas das proteínas obtivas no exemplo 1 e estimuladas com 5 μg/mL de pokeweed (PWM) (Sigma Aldrich, Saint Louis, MA, EUA). As células são incubadas a 37°C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 durante 48 horas. Os sobrenadantes das culturas de células são coletados e analisados por ensaio imunoenzimático (ELISA) para as concentrações de citocinas IL-5 e INFƔ (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA).

[072] Níveis significativamente elevados de IL-5 são observados para as proteínas recombinantes identificadas in silico (rTcCad [p < 0,0001] e rTcVcan [p= 0,0001]). Para o IFN-γ, as imunizações com as proteínas recombinantes individuais são associadas ao aumento da produção desta citocina (rTcCad e rTcVcan [p<0,0001]). Para a IL-10 as proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan não mostram resultados estatisticamente significantes. Os resultados do ensaio estão representados nos gráficos 6 e 7.

EXEMPLO 9 - PROTEÇÃO CONTRA O DESAFIO COM OVOS DE TOXOCARA CANIS EM CAMUNDONGOS FÊMEAS VACINADOS AS VACINAS CONJUGADAS

[073] Camundongos fêmeas C57BL/6, com 10 semanas de idade, em grupos de sete animais por grupo, são injetados subcutaneamente com 0,1 mL de várias vacinas com intervalos de 7 dias. Estas vacinas incluíram rTcCad e rTcVcan. A grupo de controle, vacinado com PBS e o grupo de controle vacinado só com adjuvante (ACF/AIF), não induz uma resposta de anticorpos nestes camundongos. Cada camundongo é injetado com uma dose de vacina contendo 25μg de proteína. Todas as vacinas também contêm adjuvante completo de Freud (ACF) durante a primeira imunização e adjuvante incompleto de Freud (AIF) durante os seguintes dois reforços. Os soros dos camundongos são recolhidos por são coletadas por sangramento da veia subclávia 30 dias após iniciado o desafio com os ovos férteis de T. canis.

[074] Ovos obtidos de dissecção de vermes fêmeas adultas de T.canis são cultivados durante 28 - 35 dias em placas de Petri mantidos em solução de formaldeído 2,5% a temperatura ambiente com ventilação suficiente, depois do tempo de incubação os ovos são lavados em abundante tampão salino fosfatado (PBS) estéril pH7.0. O número de ovos/mL é determinado pela contagem dos ovos que contém as larvas em estádio L2 em câmara de Neubauer. As doses de ovos administrados via oral são calculadas como sendo aproximadamente 500 ovos/100μL. Os animais são checados periodicamente e caso existir mortes, são registradas. Todos os camundongos que servem como controle negativo recebem PBS pH7,0 ou adjuvante e a mesma dose de ovos de T. canis. Todos os camundongos vacinados com rTcCad e rTcVcan induzem respostas de anticorpos significativas, os grupos vacinados com às proteínas mostram menor quantidade de larvas de T. canis comparados com os controles negativos. As vacinas conjugadas desta invenção, são eficazes na proteção de camundongos contra infecção letal por T. canis. As proteínas de forma individual mostraram reduzir significativamente a quantidades de larvas observadas no músculoo (rTcCad 60,4% [P = 0,001] e rTcVcan 58,1% [P = 0,002]), no fígado, são observadas contagens igualmente significativas para rTcCad e rTcVcan (rTcCad 52,0%, rTcVcan 53,2%, [p <0,005]). A redução larval no cérebro não diferiu significativamente do controle adjuvante de qualquer uma das proteínas recombinantes.

[075] Estas vacinas conjugadas também provocam respostas significativas de anticorpos para as proteínas recombinantes obtidas no exemplo 1 (Figuras 9, 10 e 11).

Análise estatística

[076] Os testes de Kolmogorav Smirnov e Shapiro Wilk são utilizados para avaliar a normalidade dos dados imunológicos. O teste de Wilcoxon é utilizado para comparar grupos pareados. O teste T student é utilizado para comparar grupos de proteínas emparejados. O teste de ANOVA é utilizado para avaliar a heterogeneidade entre os grupos independentes com os testes de comparação múltipla post hoc de Dunn feitos para comparações intergrupos (ou seja, grupos controle vacinados versus adjuvantes) com significância estatística inferida por P <0,05. Utilizando o programa GraphPad Prism 7.0.

Claims (4)

1. MÉTODO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A INFECÇÃO POR TOXOCARA CANIS EM ANIMAIS DOMÉSTICOS, caracterizado por utilizar as proteínas recombinantes rTcCad e rTcVcan obtidas nas seguintes etapas: a) Superexpressão em sistemas heterologos, aproveitando as sequências genicas das proteínas Tcan_06969 (KHN87575.1) e Tcan_14421 (KHN75413.1), otimizadas para expressão proteica em organismo procarioto (Codon usage), sintetizadas e clonadas no vetor de expressão pET-21a(+) e purificadas por cromatografia de afinidade; b) Utilização como vacina, compreendendo um conjugado imunogênico que inclui a proteína rTcCad de T. canis expressa por via recombinante e o Adjuvante Completo de Freud/Adjuvante Incompleto de Freud; assim como outro conjugado imunogênico que compreende a proteína rTcVcan de T. canis expressa por via recombinante e o Adjuvante Completo de Freud/Adjuvante Incompleto de Freud; c) Método de imunização contra a doença causada por T. canis em animais domésticos que envolve a administração dos conjugados imunogênicos das proteínas rTcCad, rTcVcan e o Adjuvante Completo de Freud/Adjuvante Incompleto de Freud ao referido animal, em uma quantidade imunogênica ótima que seja administrada por via subcutânea.
2. MÉTODO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A INFECÇÃO POR TOXOCARA CANIS EM ANIMAIS DOMÉSTICOS, de acordo com a reivindicação 1 etapa “a”, caracterizado por produzir as proteínas recombinantes de Toxocara canis rTcCad e rTcVcan de forma heteróloga em organismos procariotos e em outros sistemas de expressão, como: eucariotos e sistemas free cell. E caracterizada pela purificação por Cromatografia de Afinidade (CA), e outros métodos de purificação, incluindo: Troca Iônica (TI), Exclusão por Tamanho (ET), Interação Hidrofóbica (IH), Fase Reversa (FR) e Cromatografia Multimodal (CM).
3. MÉTODO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A INFECÇÃO POR TOXOCARA CANIS EM ANIMAIS DOMÉSTICOS, de acordo com a reivindicação 1 etapa “b””, caracterizado por utilizar o Adjuvantes Completo e Incompleto de Freud, e outros veículos imunológicos como sais minerais: Hidróxido de alumínio, Fosfato de alumínio, Fosfato de cálcio; partículas lipídicas: Lipossomas; complexos que estimulam a imunidade como Saponinas, Dipéptido muramil (MPD), DNA bacteriano (oligo CpG), Lipopolissacarídeos (LPS), MPL e derivados sintéticos. Lipopeptídeos, micropartículas microesferas de partículas biodegradáveis, partículas semelhantes a vírus, adjuvantes da mucosa como a toxina da cólera, toxina mutante: LTK63 e LTR72, toxina labil de E. coli; Interleucinas IL-2, IL-12, GM-CSF, INF-Ɣ; e genes que codificam moléculas co-estimulatórias, ou emulsões como ASO2: emulsão à base de óleo com MPL e QS21; ASO1: lipossomas, MPL e QS21; IC30: Poli-L-arginina (versão sintética do RNA de cadeia dupla): agonista de TLR3; IC31: péptido KLK (derivado de IC30) e ODNs (oligodesoxinucleótidos sintéticos contendo motivos não metilados CpG). Agonista de TLR3 e TLR9.
4. MÉTODO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A INFECÇÃO POR TOXOCARA CANIS EM ANIMAIS DOMÉSTICOS, de acordo com a reivindicação 1 etapa “c”, caracterizado por administrar os conjugados desta invenção por via subcutânea. E por outras vias de administração convencionais: via oral, intraperitoneal ou intramuscular, para induzir uma resposta imunitária ativa que promove a proteção contra infecção sistémica causada pelo Toxocara canis.

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