ES2864950T3 - Compuestos de 1-ciano-pirrolidina como inhibidores de USP30 - Google Patents

Compuestos de 1-ciano-pirrolidina como inhibidores de USP30 Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula (II) **(Ver fórmula)** un tautómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto o tautómero, en donde: m es 0 o 1; cuando m es 1, Z es -C(R6)(R7)-; R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-C6, o alcoxi C1-C6 opcionalmente sustituidos; R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-C3, o alcoxi C1-C3 opcionalmente sustituidos; R1, R6, R7 y R8 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, ciano, hidroxilo, un grupo alquilo C1-C3, o alcoxi C1-C3 opcionalmente sustituidos; R9 representa un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, ciano, hidroxilo, alquilo C1-C6, un grupo alcoxi C1-C3, o un anillo de cicloalquilo de 3 a 8 miembros, o forma un anillo heterocíclico con R10; R10 representa un átomo de hidrógeno, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, o forma un anillo heterocíclico con R9, o forma un anillo monocíclico con R11; Y representa un enlace covalente, -alquileno(C0-C3)-N(R11)-alquileno C0-C3 o alquileno C1-C3; R11 representa un átomo de hidrógeno, alquilo C1-C6, o forma un anillo monocíclico con R10; R11 representa un anillo de heteroarilo, heterociclilo o cicloalquilo de 3 a 14 miembros monocíclico sustituido, bicíclico opcionalmente sustituido o tricíclico opcionalmente sustituido; donde R12, cuando está sustituido, está sustituido con uno o más de -Q1-(R13)p, en donde: p es 0 o 1; Q1 representa un átomo de halógeno, ciano, oxo, hidroxilo, un enlace covalente, -alquilen(C0-C3)-NR14-, -alquilen(C0- C3)-NR14R15, -alquilen(C0-C3)-CONR14-, -alquilen(C0-C3)-NR14CO-, -alquilen(C0-C3)-NR14SO2-, un átomo de oxígeno, - alquilen(C0-C3)-CO-, -alquilen(C0-C3)-S(O)q-, -alquilen(C0-C3)-SO2NR14, -alquilen(C0-C3)-SO2NR14R15, -alcoxi C1-C6, haloalcoxi C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, -alquilen(C0-C3)-SO2R14, -alquilen(C0-C3)-NR14COR15, -alquilen(C0-C3)- NR14CONR15R16, -alquilen(C0-C3)-NR14SO2NR15R16, -alquilen(C0-C3)-CONR14R15, -alquilen(C0-C3)-CO2R14, - alquilen(C0-C3)-NR14CO2R15, -alquilen(C0-C3)-SO2NR14R15, -alquilen(C0-C3)-C(O)R14 y alquilen(C1-C6)-NR14SO2R15, NO2, alquileno C1-C6, -alquenileno C2-C6, o un -grupo alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; q es 0, 1 o 2; R14, R15 y R16 representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, alquilo C1-C6, o un grupo alquileno C1-C6; cuando p es 1, R13 representa un anillo de heteroarilo, heterociclilo, arilo de 4 a 10 miembros o cicloalquilo de 3 a 8 miembros; en donde R13 puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre halógeno, haloalquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalcoxi C1-C6, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, hidroxialquilo C1-C6, oxo, ciano, -Q2-R17, -Q2-NR17CONR18R19, -Q2-NR17R18, -Q2-COR17, -Q2-NR17COR18, -Q2- NR17CO2R18, -Q2-SO2R17, Q2-CONR17R18, -Q2-CO2R17, -Q2-SO2NR17R18, -Q2-NR17SO2R18, heterociclilo, cicloalquilo, heteroarilo y arilo; en donde dichos anillos de heterociclilo, cicloalquilo, heteroarilo y arilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, que pueden ser iguales o diferentes, seleccionados entre Cl, F, OMe, Me, COCH3, CONH2, NHC(O)CH(CH3)2, y CO2CH2CH3; Q2 representa un enlace covalente, un átomo de oxígeno, -CO- o un grupo alquileno C1-C6 o alquenileno C2-C6; R16, R17, R18 representan cada uno independientemente hidrógeno, alquilo C1-C6, heterociclilo, heteroarilo, arilo o cicloalquilo; y en donde los sustituyentes opcionales de alquilo de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10 y Q1, que pueden ser iguales o diferentes, se seleccionan entre alcoxi C1-C3, halógeno, hidroxilo, tiol, ciano, amino, amido, nitro y SF5.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas inmunoprotectoras de Leptospira y procedimientos de identificación y uso de las mismas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere en general a proteínas de Leptospira spp. inmunogénicas (incluyendo inmunoprotectoras), que son capaces de provocar amplias respuestas inmunitarias protectoras en animales, particularmente en animales caninos. La presente invención se refiere además a una composición para su uso en procedimientos para proporcionar a animales, especialmente animales caninos que necesitan protección de los mismos, con amplias respuestas inmunitarias protectoras contra múltiples Leptospira spp.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0002] La presente invención proporciona una composición para su uso en un procedimiento de proporcionar a un animal en necesidad de la inmunidad protectora contra Leptospira spp. con dicha inmunidad protectora, que comprende administrar a un animal una vacuna que comprende una cantidad inmunoprotectora eficaz de una composición que comprende al menos un polipéptido de Leptospira que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6.
[0003] La presente invención también proporciona un vector para su uso en un procedimiento de proporcionar a un animal en necesidad de la inmunidad protectora contra Leptospira spp. con dicha inmunidad protectora, que comprende un ADN recombinante, en el que el ADN recombinante comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5.
[0004] La presente invención proporciona además una vacuna de ADN recombinante para su uso en un procedimiento de proporcionar a un animal en necesidad de la inmunidad protectora contra Leptospira spp. con dicha inmunidad protectora, que comprende:
a. un ADN recombinante en el que el ADN recombinante comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5; y b. un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector, en el que el ADN recombinante se inserta en el vector de manera que se expresa una proteína recombinante cuando el vector se proporciona en un huésped apropiado.
[0005] La presente invención también proporciona un procedimiento para producir una vacuna contra un trastorno relacionado con Leptospira que comprende:
a. proporcionar un ADN recombinante, en el que el ADN recombinante comprende la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5;
B. proporcionar un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector; y
c. insertar el ADN recombinante en el vector, en el que el ADN recombinante se inserta en el vector de manera que se exprese una proteína recombinante cuando el vector se proporciona en un huésped apropiado, produciendo así la vacuna.
[0006] La presente invención proporciona además un procedimiento para producir un péptido inmunoprotector para su uso en una vacuna contra un trastorno relacionad con Leptospira que comprende:
a. proporcionar un ADN recombinante, en el que el ADN recombinante se selecciona de
i. un ADN recombinante que codifica la secuencia de ácido nucleico tal como se establece en SEQ ID NO: 5; o ii. un ADN recombinante que codifica la secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID NO: 6; b. proporcionar un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector; c. insertar el ADN recombinante en el vector;
d. proporcionar una cepa bacteriana;
e. transformar el vector en la cepa bacteriana de modo que se exprese una proteína recombinante cuando el vector se transforme en la cepa bacteriana; y
f. recolectar la proteína recombinante de la cepa bacteriana, produciendo así la proteína inmunoprotectora.
[0007] Las Leptospira son bacterias espiroquetas clasificadas en especies saprofitas intermediarias o patógenas que habitan en suelos y reservorios de agua dulce, predominantemente en regiones del mundo con climas tropicales (1). Las especies patógenas se pueden transmitir a los animales salvajes y domésticos y a los seres humanos a través del contacto directo o indirecto con un revestimiento epidérmico desgastado. La enfermedad se manifiesta como leptospirosis en huéspedes susceptibles con síntomas que van desde una enfermedad febril leve hasta insuficiencia renal, hepática o respiratoria mortal. Los huéspedes asintomáticos incluyen ratones, ratas, mapaches y otros, y en estos animales las bacterias colonizan los túbulos renales dando como resultado la expulsión de las bacterias de nuevo al medio ambiente, en la orina. La Leptospira patógena puede sobrevivir durante largos períodos en el agua (2, 3), lo que brinda una oportunidad para que la bacteria infecte a un nuevo huésped.
[0008] La Leptospira se asemeja a las características distintivas de las bacterias Gram negativas en que contienen una membrana interna, un espacio periplásmico con peptidoglicano y una membrana externa donde se ancla el lipopolisacárido. Sin embargo, las bacterias se denominan "similares a Gram negativas" porque, a diferencia de otras bacterias Gram negativas, el peptidoglicano está asociado con la membrana citoplasmática (4) y no con la membrana externa. Los componentes de la envoltura de Leptospira se han caracterizado ampliamente en estudios previos, incluidas las composiciones de proteínas de las membranas citoplasmática y externa. Sin embargo, el transporte de proteínas desde el citoplasma al espacio extracelular y, por lo tanto, los sistemas de secreción no se han caracterizado experimentalmente en Leptospira.
[0009] Las Leptospira tienen la capacidad de diseminarse rápidamente en los órganos diana (riñones e hígado) donde generalmente se observan en el espacio intersticial (8, 9), pero también se ha demostrado que existen transitoriamente de forma intracelular en los macrófagos (10-12). Durante la supervivencia tanto extracelular como intracelular, las Leptospira probablemente utilizan varias proteínas de la membrana externa y extracelulares para permanecer viables durante la infección. De ello se desprende que numerosos estudios se han centrado en la identificación (13-18) y caracterización (19-32) de las proteínas de la membrana externa y algunos estudios han comenzado a caracterizar las proteínas extracelulares en Leptospira. Estudios previos centrados en proteínas extracelulares de LeptospiraI se han combinado para identificar una hemolisina (33), una proteína similar a inmunoglobulina (LigA) (34) y una esfingomielinasa (Sph2) (23). En una escala global, un estudio proteómico ha identificado proteínas de Leptospira interrogaos en sobrenadantes de cultivo (35) mientras que otro estudio utilizó un enfoque bioinformático para identificar posibles proteínas extracelulares y de la membrana externa (15). También se ha demostrado que los sobrenadantes de cultivo de Leptospira contienen proteasas que pueden interferir con la defensa del complemento del huésped contra Leptospira (36), que una enolasa extracelular interactúa con el plasminógeno del huésped (37) y que una colagenasa extracelular puede degradar el colágeno del huésped (38). Por último, la comparación de los transcriptomas de un mutante de Leptospira inactivado en un locus regulador putativo (lb139) frente a la cepa parental de tipo salvaje (wt) reveló, entre otros, niveles reducidos de transcripción de 20 genes que codificaban proteínas extracelulares, en la cepa mutante (39) y este mutante mostró atenuación de virulencia en hámsters. Combinados, estos estudios implicaron a proteínas extracelulares en el proceso de infección por Leptospiral.
[0010] Las vacunas actuales contra Leptospira consisten principalmente en preparaciones de bacterinas inactivadas, que inducen una respuesta inmune en gran parte humoral y son principalmente específicas de serovares ("Leptospirosis Fact Sheet", OMS, Oficina Regional para Asia Sudoriental, 2009). Además, la declaración de la etiqueta de Novibac (Merck Animal Health) indica que hay poca o ninguna evidencia de protección cruzada. La falta de protección cruzada observada no es sorprendente, particularmente en vista de las significativas diferencias genéticas/genómicas entre, por ejemplo, la organización de genes en el locus biosintético de lipopolisacáridos (rfb) (Pena-Moctezuma, A. et al, 2001 Fe MS Immunology and Medical Microbiology 31 (2001) 73-81). Los lipopolisacáridos de Leptospira son, por tanto, específicos de serovar y, como epítopos antigénicos, tienden a provocar respuestas inmunitarias independientes de las células T. Como tal, la estrategia actual para lograr una amplia protección contra diferentes serovares de Leptospira ha sido incluir muchos serovares de Leptospira inactivados diferentes en una formulación de vacuna. Este enfoque tiene inconvenientes importantes, incluida la necesidad de cultivar múltiples serovares diferentes para lograr una protección completa y un potencial creciente de interferencia con otros serovares de Leptospira u otros componentes de la vacuna.
[0011] Por consiguiente, sería útil proporcionar composiciones simplificadas, que quizás contengan sólo una o más proteínas inmunogénicas conservadas, para provocar amplias respuestas inmunoprotectoras contra múltiples serovares de Leptospira. Sería además útil proporcionar composiciones de vacuna contra Leptospira que activen respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares, para proporcionar a los vacunados una protección más amplia y duradera contra la exposición posterior a Leptospira. Hasta la presente divulgación, no se conocían procedimientos para proporcionar tal protección contra múltiples serovares de Leptospira usando una o más proteínas inmunoprotectoras conservadas.
Secuencia de referencia NCBI: WP_000849189.1 describe una proteína hipotética de Leptospira interrogans.
Nascimento et al., 2004, Brazilian Journal of Medical and Biological Research, vol. 37, no. 4, páginas 459-477, describe características del genoma de Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Nascimento et al., 2004, Journal of Bacteriology, American Society for Microbiology, vol. 186, no. 7, páginas 2164-2172, informaron que la genómica comparativa de dos serovares de Leptospira interrogans revela nuevos conocimientos sobre fisiología y patogénesis. Klaasen et al., 2013, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 158, no. 1, páginas 26-29, informó que una nueva vacuna tetravalente contra leptospirosis canina proporciona al menos 12 meses de inmunidad contra la infección.
Klaasen et al., 2012, Veterinary Record, vol. 172, no. 7, páginas 181-181, describe una nueva bacterina tetravalente de Leptospira que protege contra la infección y la diseminación después de la estimulación en perros.
Dong et al., 2008, BMC Microbiology, vol. 8, no. 1, página 223, describe la caracterización del gen de ompLI de especies patógenas de Leptospira en China y la inmunogenicidad cruzada de la proteína OmpL 1.
Dellagostin et al., 2011, Human Vaccines, vol. 7, no. 11, páginas 1215-1224, describe vacunas recombinantes contra la leptospirosis.
El documento CN 101874898 se refiere a una vacuna recombinante de genes trivalentes para prevenir la leptospirosis y un procedimiento de preparación de la misma.
El documento WO 2009/042538 describe proteínas inmunogénicas de la membrana externa derivada del genoma de Leptospira y composiciones y procedimientos basados en las mismas.
Chang et al., 2007, Vaccine, vol. 25, no. 48, páginas 8190-8197, informa sobre la inmunogenicidad de las supuestas proteínas recombinantes de la membrana externa de Leptospiras como candidatas a vacuna.
Magudeswaran et al., 2014, Indian Journal of Biotechnology, vol. 13, no. 1, páginas 57-61, informa sobre la evidencia del potencial de reacción cruzada de la proteína LipL41 de Leptospira recombinante.
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[0013] Por lo tanto, un objeto de esta descripción es proporcionar un procedimiento racional de alto rendimiento para la identificación de proteínas de Leptospira spp. inmunoprotectoras, que sean ampliamente protectoras contra al menos dos serovares virulentos de Leptospira. En una realización particular, se proporciona una amplia protección mediante proteínas de superficie conservadas de serovar cruzado, que pueden no expresarse durante las condiciones normales de cultivo presentes durante la fabricación típica de una vacuna leptobacterina. En otra realización particular, la protección amplia incluye una respuesta inmunitaria tanto humoral como celular.
[0014] En este documento se describe el procedimiento para la identificación de proteínas de Leptospira spp. inmunoprotectoras que comprende las etapas de:
(a) identificar posibles genes de localización de membrana, que se conservan entre serovares patógenos de Leptospira;
(b) identificar proteínas de membrana de Leptospira conservadas que se expresan in vivo o en condiciones similares a in vivo; y
(c) correlacionar los resultados de los estudios genéticos (a) y de proteínas (b) para identificar las proteínas panprotectoras de Leptospira; identificando así proteínas de Leptospira spp. inmunoprotectoras, que pueden usarse en la formulación de vacunas de Leptospira ampliamente inmunoprotectoras.
[0015] En el procedimiento de identificación descrito en este documento, los análisis se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de los siguientes o equivalentes o superiores de los mismos: CLC Genomics Workbench y Genostar Suite 4.0 (para la anotación del ensamblaje); Wallgene gneostar 1.3.1.2 (para genómica comparativa); y SignalP, LipoP, SpLip, TMHMM y MCMBB (para la predicción de la localización de la membrana).
[0016] En este documento se describe una visión general del procedimiento y los resultados se presentan en las Figs. 1 y 2.
[0017] En el procedimiento de identificación descrito en este documento, las proteínas de membrana externa se pueden extraer (por ejemplo, mediante los procedimientos de rutina Triton o proteinasa K) y a continuación identificarse mediante LC-MS-MS. A continuación, las secuencias de péptidos pueden alinearse con cualquier base de datos de proteínas de Leptospira (o más general) adecuada.
[0018] Un objeto adicional de la presente divulgación es proporcionar proteínas de Leptospira spp. ampliamente inmunoprotectoras, que son adecuadas para su uso en formulaciones de vacunas monovalentes y multivalentes.
[0019] Otro objeto de esta descripción es proporcionar composiciones que comprenden proteínas de Leptospira spp. inmunoprotectoras.
[0020] Aún otro objeto de la presente descripción es proporcionar procedimientos para inducir respuesta inmunitaria segura y protectora en un animal en necesidad de los mismos, contra múltiples Leptospira spp., que comprende la etapa de administrar al menos un proteína de Leptospira spp. Inmunoprotectora de acuerdo con la presente divulgación a animales que necesitan protección contra múltiples Leptospira spp.
[0021] En una realización, las proteínas o composiciones inmunoprotectoras que comprenden o consisten esencialmente en, o consiste en al menos una o más proteínas de Leptospira spp. inmunogénicas (incluyendo inmunoprotectoras) inducen protección contra la exposición experimental o natural subsiguiente de Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira bratislava y cualquier otro serovar de Leptospira conocido ahora o determinado en el futuro causante de enfermedades en animales, incluidos los humanos.
[0022] En este documento se describe la composición inmunogénica ampliamente protectora que puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en al menos una Leptospira spp atenuada viva, al menos una subunidad (por ejemplo, un péptido, proteína, o porción inmunoprotectora de los mismos), al menos una bacterina enriquecida en antígenos de superficie, o cualquier combinación de los anteriores.
[0023] En otra realización, las proteínas inmunoprotectores son antígenos de superficie que son relativamente más altamente expresadas in vivo, pero relativamente menos expresadas in vitro. Tal como se usa en este documento, "in vivo" significa que la Leptospira spp., por ejemplo, la Leptospira spp. patógena, está creciendo y/o infectando a un huésped animal. Tal como se usa en este documento, "in vitro" significa que la Leptospira spp. está creciendo en el contexto de las condiciones de cultivo de rutina, por ejemplo, las utilizadas para fabricar Leptospira spp. para uso en vacunas a base de bacterina.
[0024] Hasta la presente divulgación, nadie había apreciado esta posibilidad, ni concebido los procedimientos descritos para la explotación de este fenómeno para generar una vacuna contra Leptospira ampliamente eficaz.
[0025] Por consiguiente, en el presente documento se describen procedimientos para cultivar Leptospira spp. que imita las condiciones in vivo. Este procedimiento puede facilitar la identificación de proteínas de Leptospira spp.ampliamente protectoras porque permite una expresión relativamente más alta de tales proteínas en relación con cuando Leptospira spp. se cultivan en condiciones de fabricación tradicional o in vitro.
[0026] En el procedimiento de cultivo in vivo que se describe en el presente documento, la Leptospira spp. se puede cultivar en condiciones que imitan las condiciones in vivo, incluyendo una osmolaridad relativamente más alta, una temperatura relativamente más alta y niveles relativamente más bajos de hierro (por ejemplo, por quelación). En el presente documento se describe que la cepa 700 de L. interrogans australis puede cultivarse en tres condiciones: 1) EMJH a 29°C (cultivo de control in vitro); 2) añadir a # 1 bipiridilo 40 pM y NaCl 120 mM (condiciones similares a las in vivo); y 3) dos o más pases en hígado y bazo de hámster (condiciones reales in vivo).
[0027] Sorprendentemente, cuando se aumentaron la osmolaridad y la temperatura, tal como se describe en el presente documento, la expresión de proteínas inmunoprotectoras cruzadas aumentó significativamente en relación con sus niveles de expresión en condiciones de cultivo estándar (véase la Tabla 1 a continuación). El desarrollo y la explotación de este procedimiento de la invención ha permitido a los solicitantes producir composiciones de vacunas desconocidas hasta ahora, que son altamente seguras y eficaces para provocar en un animal que lo necesite inmunidad protectora contra al menos dos Leptospira spp. patógenas.
T l 1. An í n L ir in i r m n l m l ri l i n hi rr
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Tabla 2. Antígenos de Leptospira spp. adicionales que se ha determinado que tienen una buena viabilidad técnica LI 1 27 LI 11 n ri l rm n v n
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T l . Pr ín L ir . m n m ri ri n l E m l 1 2
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[0028] Estas y otras realizaciones se describen o son evidentes a partir de, y están abarcadas por, la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0029] Una divulgación completa y práctica de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, para un experto en la técnica, se expone más particularmente en el resto de la memoria descriptiva, incluyendo la referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La figura 1 es un esquema del proceso de cribado de proteínas de Leptospira spp.;
La figura 2 representa la determinación del "genoma central", que significa el conjunto de genes comunes a todos los genomas estudiados del género Leptospira menos los genes presentes en las especies no patógenas (es decir, L. biflexa);
La figura 3 es un diagrama de flujo que muestra cómo el enfoque de cribado genómico y proteómico paralelo produjo las cinco proteínas de Leptospira spp. candidatas a vacuna de alto interés enumeradas en la Tabla 1 anterior;
La figura 4 muestra transferencias Western que demuestran la localización diferencial de proteínas y la expresión en sobrenadantes de cultivo de Leptospiral;
La figura 5 muestra la clasificación de exoproteínas de L. interrogaos, lo que indica que la mayoría de las proteínas están involucradas en los procesos metabólicos;
La figura 6 muestra que la regulación de exoproteínas en respuesta a la sal es independiente de la categoría funcional, mientras que la temperatura afecta a las exoproteínas en la traducción, la estructura ribosómica y la biogénesis; La figura 7 muestra sueros positivos para Leptospira que muestran predominantemente reactividad de IgM frente a exoproteínas de LeptospiraI;
La figura 8 muestra que se requieren genes selectos que codifican exoproteínas para el crecimiento in vitro y para una virulencia completa;
La figura 9 es un gráfico que presenta los resultados del estudio de desafío de hámster (Ejemplo 3).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0030] En este documento se describe el procedimiento para la identificación de proteínas de Leptospira spp. inmunoprotectoras que comprende las etapas de:
(a) identificar posibles genes de localización de membrana, que se conservan entre serovares patógenos de Leptospira;
(b) identificar proteínas de membrana de Leptospira conservadas que se expresan in vivo o en condiciones similares a in vivo; y
(c) correlacionar los resultados de los estudios genéticos (a) y de proteínas (b) para identificar las proteínas panprotectoras de Leptospira; identificando así proteínas de Leptospira spp. inmunoprotectoras, que pueden usarse en la formulación de vacunas de Leptospira ampliamente inmunoprotectoras.
[0031] En el procedimiento de identificación descrito en este documento, los análisis se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de los siguientes o equivalentes o superiores de los mismos: CLC Genomics Workbench y Genostar Suite 4.0 (para la anotación del ensamblaje); Wallgene gneostar 1.3.1.2 (para genómica comparativa); y SignalP, LipoP, SpLip, TMHMM y MCMBB (para la predicción de la localización de la membrana).
[0032] En este documento se describe una visión general del procedimiento y los resultados se presentan en las Figs. 1 y 2.
[0033] En el presente documento se describe una composición para proporcionar a un animal que la necesita inmunidad protectora contra al menos una Leptospira spp., que comprende al menos un polipéptido de Leptospira que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % de identidad con LIC13074p, LIC13050p, LIC13314p, LIC10117p, LIC10879p, LIC10879p, LIC13050p, LIC10411 p, LIC13314p, LIC10117p, LIC11088p, LIC11089p, LIC13074p, LIC20229p, LIC11181p, LIC13059p, LIC10959p, LIC11289p, LIC12349p, LIC13250p, LIC20146p, LIC10321 p, LIC10662p, LIC11183p, LIC11489p, LIC12258p, LIC12731 p, LIC12332p, LIC10793p, LIC11884p, LIC20197p, LIC11224p, LIC11693p, LIC12285p, LIC10672p, LIC10509p, LIC10596p, LIC11028p, LIC11874p, LIC13090p, LIC10318p, LIC10655p, LIC11553p, LIC11637p, LIC12100p, LIC12784p, LIC13002p, LIC13023p, LIC13017p, LIC11711 p, LIC10380p, LIC10551 p, LIC10740p, LIC11580p, LIC11990p, LIC12339p, LIC12691p, LIC12805p, LIC13195p, LIC13313p, LIC13386p, LIC13491 p, LIC20165p, LIC10314p, LIC10326p, LIC10927p, LIC10968p, LIC11003p, LIC12576p, LIC13434p, LIC13071 p, LIC11224p, LIC10027p, LIC10474p, LIC10411p, LIC20035p, LIC20197p, LIC11088p, LIC11687p, LIC11711 p, LIC10115p, LIC12433p, LIC10868p, LIC10898p, LIC11299p, LIC11693p, LIC12030p, LIC20153p, LIC10672p, LIC11966p, LIC10973p, Lp1118p, MceIIp, Lsa21p o combinaciones de los mismos o partes inmunológicas equivalentes eficaces de los mismos. Por "partes inmunológicas equivalentes" se entiende que la parte sea capaz de provocar una respuesta inmunitaria estadísticamente similar o más segura y eficaz, en relación con la secuencia polipeptídica más grande de la que se tomó la parte. Por tanto, si una composición que comprende LIC13074p protege el 80 % de animales vacunados con protección de la estimulación virulenta posterior, y un truncamiento determinado de LIC13074p protege el 82 % de animales vacunados, entonces el truncamineto es una “parte inmunológica equivalente” de LIC13074p.
[0034] En el presente documento se describe que la composición para proporcionar inmunidad protectora contra Leptospira, o enfermedades causadas por Leptospira, comprende al menos un polipéptido de Leptospira que tiene al menos 80 % de identidad con LIC11089p, LIC10973p, LIC10318p, combinaciones de los mismos o partes inmunológicas equivalentes de los mismos. También se describe en el presente documento que el polipéptido de Leptospira tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con LIC11089p, LIC10973p o LIC10318p.
[0035] Se describe además en el presente documento que la composición comprende un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una de las secuencias como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 o 163.
[0036] En este documento se describe la secuencia de ácido nucleico tiene al menos un 98 % de identidad a una de las secuencias como se establece en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 o 163.
[0037] También se describe en el presente dcumento que la secuencia de ácido nucleico tiene 100 % de identidad con una de las secuencias como se establece en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 ,71 , 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 o 163.
[0038] En este documento se describe que la secuencia de ácido nucleico es como se establece en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 o 163.
[0039] En el presente documento se describe un procedimiento para proporcionar a un animal que lo necesite inmunidad protectora contra una o más Leptospira spp. patógenas o virulentas, que comprende administrar a un animal una vacuna que comprende una cantidad inmunoprotectora eficaz de polipéptido de Leptospira spp. seleccionado de, o que tiene al menos un 80 % de identidad con un polipéptido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ,28 , 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 ,78 , 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 , 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 o 164.
[0040] En el presente documento se describe el procedimiento de proporcionar inmunidad protectora que comprende las etapas de administrar a un animal una vacuna que comprende una cantidad eficaz inmunoprotectora de un polipéptido seleccionado de, o que tiene al menos un 80 % de identidad con, un polipéptido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 o 164.
[0041] También se describe en el presente documento un vector capaz de expresar un ADN recombinante, en el que el Ad N recombinante se selecciona de cualquiera de las SEQ ID n O: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23. , 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 , 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 , 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; o en el que el ADN recombinante es al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % homólogo a las secuencias tal como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 , 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163.
[0042] También se describe aquí una vacuna de ADN recombinante que comprende:
(a) un ADN recombinante en el que el ADN recombinante comprende una o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ,27 , 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125 , 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y
(b) un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector, en el que el ADN recombinante se inserta en el vector de manera que se expresa una proteína recombinante cuando el vector se proporciona en un huésped apropiado.
[0043] También se describe en el presente documento un procedimiento para producir una vacuna contra un trastorno relacionado con Leptospira que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un ADN recombinante, en el que el ADN recombinante comprende alguna o más de las secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47,
49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107,
109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153,
155, 157, 159, 161 y 163;
(b) proporcionar un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector; y
(c) insertar el ADN recombinante en el vector, en el que el ADN recombinante se inserta en el vector de manera que
se exprese una proteína recombinante cuando el vector se proporciona en un huésped apropiado, produciendo así la vacuna.
[0044] También se describe en el presente documento un procedimiento para producir un péptido inmunoprotector para su uso en una vacuna contra un trastorno relacionado con Leptospira que comprende:
(a) proporcionar un ADN recombinante, en el que el ADN recombinante se selecciona de:
(i) un ADN recombinante que codifica un epítopo inmunogénico o un fragmento inmunológicamente activo de una cualquiera o más de las secuencias de ácido nucleico como se establece en SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,
19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151 153, 155, 157, 159, 161 y 163; o
(ii) un ADN recombinante que codifica un fragmento de proteína de al menos 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o
95 % de la longitud de la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 2 ,4 , 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,
20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 ,54 , 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 , 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130,
132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 , 154, 156, 158, 160, 162 o 164;
(b) proporcionar un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector;
(c) insertar el ADN recombinante en el vector;
(d) proporcionar una cepa bacteriana;
(e) transformar el vector en la cepa bacteriana de modo que se exprese una proteína recombinante cuando el vector se transforme en la cepa bacteriana; y
(f) recolectar la proteína recombinante de la cepa bacteriana, produciendo así la proteína inmunoprotectora.
[0045] En una realización, el animal está protegido contra Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira australis, Leptospira bratislava y Leptospira pomona. En una realización, al animal se le puede administrar aproximadamente 1 ml de vacuna. La vacuna también se puede administrar en dos
dosis subcutáneas, por ejemplo, a intervalos de 21 días. En un ejemplo, el animal es un canino y la vacuna puede comprender antígenos adicionales que proporcionan inmunidad contra patógenos caninos adicionales. Los antígenos adicionales pueden seleccionarse de parvovirus canino (CPV), virus de la parainfluenza canina (CPi2), virus del moquillo canino (CDV), adenovirus, virus del herpes, rabia, coronavirus canino y combinaciones de los mismos.
[0046] En el presente documento se describe una vacuna de epítopo de células T que comprende una proteína recombinante, en la que la proteína recombinante comprende un epítopo de células T, y en la que el epítopo de células
T comprende al menos una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 80 % de identidad con al menos un polipéptido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,
34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142,
144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 o 164.
[0047] En la vacuna de epítopo de células T descrita en el presente documento, la secuencia del polipéptido comprende una o más de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ,22 , 24,
26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 , 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120 , 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 o 164. En el presente documento se describe la
vacuna que comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 42 (LIC11089),
68 (LIC10973) o 122 (LIC10318).
[0048] También se describe en este documento el polipéptido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ 42, 68 o
122.
Descripciones/Definiciones
[0049] Por "antígeno" o "inmunógeno" se entiende una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; un trozo o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune al presentarse a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.
[0050] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un marcaje o componente bioactivo.
[0051] El término "polipéptido inmunogénico o antigénico", tal como se usa en el presente documento, incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez que se administra al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína tal como se describe en el presente documento comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", tal como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier técnica de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente gran cantidad de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el sector y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No.
4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales son fácilmente identificados mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Los procedimientos especialmente aplicables a las proteínas de T. parva se describen completamente en el documento PCT/US2004/022605.
[0052] En el presente documento se describen fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "polipéptido inmunogénico o antigénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
[0053] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicas. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
[0054] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará tanto una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, tal que la resistencia a una nueva infección se verá aumentada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas y/o signos de enfermedad clínica normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.
[0055] Por "animal" se entienden mamíferos, aves, y similares. Animal o huésped tal como se usa en el presente documento incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, cerdo), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, simio), hurones, focas, y pescado. El término “animal” también incluye un animal individual en todas sus fases de desarrollo, que incluyen fase embrionaria y fetal.
[0056] A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
[0057] Cabe señalar que en esta divulgación y, en particular, en las reivindicaciones y/o párrafos, términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE. UU., por ejemplo, permiten elementos que no se mencionan explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en el estado de la técnica o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.
[0058] La invención se describirá a continuación adicionalmente a modo de los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - identificación de proteínas de Leptospira ssp. Ampliamente protectoras a través de un nuevo procedimiento de alto rendimiento
[0059] Leptospira spp. se sometieron a condiciones de cultivo que imitan las condiciones in vivo, incluida una osmolaridad relativamente más alta, una temperatura relativamente más alta y niveles relativamente más bajos de hierro (por ejemplo, por quelación). Brevemente, la cepa 700 de L. interrogaos australis se cultivó en tres condiciones: 1) EMJH a 29 °C (cultivo de control in vitro); 2) añadir a #1 bipiridilo 40 pM y NaCl 120 mM (condiciones similares a las in vivo); y 3) dos o más pases en hígado y bazo de hámster (condiciones reales in vivo).
[0060] Cuando se aumentaron la osmolaridad y la temperatura, tal como se describe en el presente documento, la expresión de proteínas inmunoprotectoras cruzadas aumentó significativamente en relación con sus niveles de expresión en condiciones de cultivo estándar (véase la Tabla 1 a continuación). El desarrollo y la explotación de este procedimiento de la invención ha permitido a los solicitantes producir composiciones de vacunas desconocidas hasta ahora, que son altamente seguras y eficaces para provocar en un animal que lo necesite inmunidad protectora contra al menos dos Leptospira spp. patógenas.
Ejemplo 2 - Examen del exoproteoma Leptospiral
[0061] Leptospira son bacterias espiroquetas capaces de estilos de vida saprofitos y patógenos. Estas bacterias zoonóticas tienen una prevalencia mundial y la patogenia se manifiesta en la enfermedad conocida como leptospirosis. El objetivo de este estudio fue obtener una comprensión global de la composición del exoproteoma de Leptospira y dilucidar cómo estas proteínas contribuyen al ciclo de vida saprofito y patógeno de estas bacterias. Las exoproteínas de Leptospira se cuantificaron en diversas condiciones de cultivo de Leptospira in vitro que imitan la infección utilizando proteómica cuantitativa de índice espectral normalizado. Se identificaron aproximadamente 208 exoproteínas, que tenían cantidades iguales o mayores en los sobrenadantes de cultivo en comparación con las cantidades celulares. Las condiciones de cultivo demostraron que 52 de estas proteínas estaban reguladas en respuesta a la temperatura, mientras que 69 estaban reguladas en respuesta a cambios osmóticos, y la mayoría mostraba una menor abundancia. Las exoproteínas se clasificaron principalmente en conjuntos de grupos ortólogos que abarcan el metabolismo y la producción de energía, lo que sugiere que las exoproteínas probablemente cumplen funciones esenciales para la viabilidad de Leptospira. Las proteínas asociadas con la virulencia (factores que causan daño tisular y citotoxicidad) estaban subrepresentadas.
[0062] Por consiguiente, la alteración de dos genes que codifican exoproteínas dio lugar a defectos de crecimiento significativos en vitro, mientras que la alteración de otros seis genes que codifican exoproteínas no afectaron en las tasas de crecimiento in vitro ni en la manifestación de la enfermedad en el modelo de infección animal. Estas observaciones sugieren que los genomas de Leptospira contienen genes que codifican exoproteínas con funciones redundantes, la mayoría de las cuales parecen estar dedicadas a procesos heterotróficos con potencial funcionamiento secundario en la patogénesis de la enfermedad.
[0063] Se cultivó la cepa L495 de Leptospira interrogaos serovar Manilae mantenido en medio EMJH (44, 45) a 30 °C. La mutagénesis del transposón de Leptospira se ha descrito previamente (46-48) y los mutantes del transposón L495 usados en este estudio se obtuvieron de una biblioteca de mutantes mantenida internamente. Las cepas mutantes se mantuvieron en cultivo como se describió anteriormente para la cepa parental. Para realizar el análisis proteómico en sobrenadantes de cultivo, EMJH se constituyó con las siguientes modificaciones. Se omitió la albúmina de la receta y se añadieron Tween 80 y glicerol al 0,01 % (v/v). Se preparó un lote separado de EMJH modificado para contener 120 mM de NaCl. Antes de cambiar a medio EMJH modificado, se cultivaron Leptospira en EMJH a 30 °C hasta una densidad de 10A9 bacterias por ml, y posteriormente se sedimentaron mediante centrifugación a 3200 xg durante 15 min, utilizando un rotor de cubeta oscilante. Las bacterias sedimentadas se lavaron 3 veces con EMJH modificado usando 20 ml de medio para cada etapa de lavado. A continuación, las bacterias se resuspendieron en EMJH modificado y se enumeraron mediante microscopía de campo oscuro. Las bacterias se diluyeron a continuación en EMJH modificado a una concentración de 10A8 bacterias por ml en un volumen total de 100 ml para cada condición (para incubación a 30 °C, 37 °C y en EMJH modificado con 120 mM de NaCl a 30 °C), en dos réplicas biológicas para cada condición. Después de 18 horas de incubación, se enumeraron las bacterias mediante microscopía de campo oscuro para validar la viabilidad bacteriana.
Análisis iniciales de proteínas
[0064] Las Leptospira se centrifugaron a 3.200 xg durante 10 minutos y las bacterias sedimentadas se separaron de los sobrenadantes del cultivo mediante sifonación de los sobrenadantes. Los sedimentos se almacenaron a -20 °C y los sobrenadantes del cultivo se transfirieron a dispositivos de ultrafiltración Vivaspin 20 1.000.000 MWCO PES (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Alemania). El último paso aseguró la eliminación de cualquier resto de células de Leptospira completas de los sobrenadantes del cultivo. La centrifugación posterior se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y todas las manipulaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente. El flujo continuo se concentró a continuación usando filtros ultra centrífugos de Amicon Ultra Ultracel-3K (Merck Millipore Ltd., Cork, Irlanda) y posteriormente con Amicon Ultra de bajo volumen - 0,5 ml 3k (Merck Millipore Ltd.). Cada sobrenadante de cultivo de 100 ml se concentró hasta un volumen final de 20 pl.
[0065] Para obtener proteína de las células de Leptospira completas sedimentadas, se resuspendieron sedimentos bacterianos en los respectivos medios de EMJH modificado para un volumen final de 200 pl y se sonicó para lisar las bacterias. La concentración de proteínas se midió mediante espectrometría UV a 280 nm. Las muestras se diluyeron 3:1 en tampón de carga de muestras Laemmli (4x) y se utilizaron concentraciones iguales de proteína en SDS PAGE.
[0066] Se produjo proteína AAS70781.1 (LIC12209) recombinante (en adelante, Leptospira Beta hélice 52 o LbP52) se produjo esencialmente como se describió anteriormente. Los antisueros de conejo generados contra FlaA-2 (49), GroL (50) y LigA (50) fueron generosamente proporcionados por el Dr. David Haake. Se generó antisuero de conejo contra la proteína LbP52 recombinante (rLbP52) usando procedimientos de rutina.
[0067] Para obtener sueros positivos de Leptospira, se obtuvieron cobayas Hartley macho (Charles River Laboratories) a las 6 semanas de edad y pesaban entre 450-500 g. Se anestesiaron las cobayas (N = 6) mediante inyección intramuscular con 40 mg de ketamina y 4 mg de xilazina (por kg de peso corporal) y se recogió sangre (~1 ml) en tubos de plástico Venosafe de 10 ml (Terumo, Guyancourt, Francia) mediante punción del corazón por vía cardíaca. Los animales se mantuvieron entonces en condiciones de cuidados normales durante 7 días y, a continuación, se inyectaron por vía intraperitoneal con 105 de L. interrogaos cepa L495 en 1 ml de EMJH sin albúmina. Se recogieron muestras de sangre de animales infectados mediante punción cardíaca terminal de animales anestesiados. El suero se recogió mediante incubación de muestras de sangre en tubos de plástico Venosafe (Terumo) a temperatura ambiente durante 30 min, seguido de centrifugación a 1.500 xg durante 10 min. El sobrenadante se recogió para su uso en experimentos de ELISA e inmunotransferencia. Los protocolos para experimentos con animales estaban conformes a las directrices de los Comités de Uso y Cuidado de Animales del Institut Pasteur (París, Francia).
[0068] Las inmunotransferencias de SDS-PAGE y de proteínas se realizaron como se describió previamente (32, 51) con las siguientes modificaciones. Los experimentos de SDS-PAGE e inmunotransferencia se realizaron usando 10 pg de proteína total de lisados de células completas y sobrenadantes de cultivo. Se utilizó antisuero para FlaA-2, GroL, LigA y LbP52 a 1:2.000, 1:8.000, 1:750 y 1:1.000, respectivamente. Se utilizaron sueros positivos y preinmunes a Leptospira de cobaya a 1:100 y se utilizaron anticuerpos secundarios policlonales de cabra contra IgG-Fc (HRP) (Abcam) e IgM-Fc (Hr P) (Acris) de cobaya a una dilución de 1:20.000.
Análisis de proteínas por espectrometría de masas
[0069] Para los experimentos de espectrometría de masas, se dejaron separar 10 pg de proteína en 10 mm en un gel TGX en gradiente 4-12 %, sin la adición de ningún colorante. A continuación, se extrajeron núcleos de las muestras y se cortaron en cubitos en secciones de 1 mm. Las muestras de proteína se analizaron en un sistema Ultimate 3000 RSLCnano HPLC (Dionex, Camberley, Reino Unido) ejecutado en modo de inyección directa acoplado a un espectrómetro de masas QExactive Orbitrap (Thermo Electron, Hemel Hempstead, Reino Unido). Las muestras se resolvieron en una columna analítica picotip de 25 cm por 75 pm de diámetro interno (New Objective, Woburn, MA, EE. UU.) que se empaquetó internamente con la fase ProntoSIL 120-3 C18 Ace-EPS, perlas de 3 pm de diámetro (cromatografía de Bischoff, Alemania). El sistema se hizo funcionar a un caudal de 300 nl min_1 y se utilizó un gradiente de 120 min para separar los péptidos. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en un modo de adquisición dependiente de datos "Top 10". Se realizaron rastreos precursores en el orbitrap con un poder de resolución de 70.000, de los cuales los diez iones precursores más intensos fueron seleccionados por el cuadrupolo y fragmentados por HCD a una energía de colisión normalizada del 28 %. La ventana de aislamiento del cuadrupolo se fijó en 3 m/z. Los iones de estado de carga 1 y los iones de estado de carga indeterminado se rechazaron de la selección por fragmentación. La exclusión dinámica se habilitó durante 40 s. Los datos se convirtieron de .RAW a .MGF utilizando ProteoWizard (52).
Ejemplo 4: Análisis de datos
Manipulación de datos después de la identificación y cuantificación
[0070] Las proteínas identificadas y los índices espectrales relativos correspondientes se exportaron a Microsoft Excel para análisis adicionales. Se hicieron las siguientes comparaciones de abundancias proteicas relativas: proteína de sobrenadante a 30 °C frenet a proteína de célula completa a 30 °C (S vs P 30 °C), proteína de sobrenadante a 37 °C frente a proteína de célula completa a 37 °C (S vs P 37 °C), proteína de sobrenadante a 30 °C expuesta a NaCl 120 mM frente a proteína de célula completa a 30 °C expuesta a NaCl 120 mM (S vs P NaCl), proteína de sobrenadante a 37 °C frente a proteína de sobrenadante a 30 °C (37 °C frente a 30 °C) y proteína de sobrenadante a 30 °C expuesta a NaCl 120 mM frente a proteína de sobrenadante a 30 °C (NaCl frente a 30 °C). Para ser considerada como una exoproteína exportada activamente, las proteínas debían ser detectadas en las 6 muestras de sobrenadante y debían haber mostrado una cantidad igual o mayor en el sobrenadante que la Leptospira de células enteras (para S vs P 30 °C). Para comparar las cantidades de exoproteínas en los sobrenadantes de cultivos (37 °C frente a 30 °C S y NaCl frente a 30 °C S), se compararon las abundancias espectrales de proteínas y solo aquellas exoproteínas que mostraban una expresión alterada de al menos 2 veces (promedio entre experimentos repetidos), se consideraron como alteradas en la expresión en respuesta a los cambios de temperatura y osmóticos (Tablas 4 y 5).
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Asignación de proteínas a conjuntos de grupos ortólogos
[0071] Los productos proteicos de los genomas de Leptospira se han clasificado automáticamente en conjuntos de grupos ortólogos (COG) por la plataforma MicroScope (53). Estos datos se utilizaron para clasificar las exoproteínas detectadas en COG y las frecuencias resultantes se compararon con las predichas en todo el genoma. Las estadísticas se realizaron asumiendo una distribución binomial en la que la asignación de exoproteínas en un COG se consideraría un "éxito" y la ausencia un "fracaso". El porcentaje de secuencias codificantes clasificadas en un COG (calculado en MicroScope para todo el genoma) se utilizó como la probabilidad de observar un "éxito" y el número total de exoproteínas detectadas (208 que estaban presentes en los 6 sobrenadantes y que también mostraban cantidades iguales o mayores en el sobrenadante que los sedimentos celulares) se utilizó como tamaño de muestreo para generar distribuciones de probabilidad binomial específicas de COG. Se utilizó un valor de p de p < 0,01 como punto de corte de significación. Para la comparación de exoproteínas reguladas por el cambio de temperatura y desplazamiento osmótico, se realizó un análisis similar con las siguientes modificaciones. Las probabilidades específicas de COG utilizadas fueron las calculadas para las exoproteínas (no las que se observarían en todo el genoma) y el tamaño de la muestra se ajustó para reflejar el número de exoproteínas que se regulan (51 y 69 para cambios de temperatura y osmóticos, respectivamente).
Cepas bacterianas, tasas de crecimiento y experimentos de infección
[0072] La mutagénesis de transposones se realizó previamente en la cepa parental (Manilae L495) y los sitios de inserción se identificaron inicialmente mediante PCR semi-aleatoria (46-48). Los sitios de inserción para los mutantes de exoproteína se validaron mediante PCR y los cebadores, los sitios de inserción y los mutantes de transposón se enumeran en la Tabla 6.
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[0073] Se compararon las exoproteínas imitantes LIC13006' (lenC-), LIC12208-, LIC13060' (lipL36-), LIC10373-, LIC10898' (lipL48-), LIC11977-, LIC11852-, LIC10713- (IruB-) y Manilae L495 para las tasas de crecimiento in vitro en medios EMJH a 30 °C. El crecimiento bacteriano se midió a diario midiendo las densidades ópticas mediante espectroscopia a 420 nm. Se utilizaron exoproteínas que demostraron tasas de crecimiento similares a las de Manilae L495 en experimentos posteriores de medición de virulencia en jerbos de Mongolia (Janvier). Para medir la virulencia, se inyectaron intraperitoneal mentegrupos de 4 jerbos con 10A4 bacterias por animal. A los animales se les administró Manilae L495 o mutantes LIC13006" (lenC-), LIC12208", LIC13060" (lipL36-), LIC10373", LIC 10898 (IipL48-) y LIC11977-. Los animales se controlaron diariamente durante 23 días y se sacrificaron cuando estaban moribundos. Los protocolos para experimentos con animales estaban conforme a las directrices de los Comités de Uso y Cuidado de Animales del Institut Pasteur (París, Francia).
RESULTADOS
Descripción general de células completas y exoproteomas
[0074] Para estudiar los tipos de proteínas que se encuentran en los sobrenadantes de cultivo, las proteínas de células completas (WCP) y las proteínas de sobrenadante de cultivo (CSP) de cada condición de cultivo se sometieron a análisis de inmunotransferencia y SDS-PAGE (Figura 4). Se cultivaron Leptospira a 30 °C, 37 °C o en un medio que contenía NaCl 120 mM. Las proteínas de células completas y sobrenadantes de cultivo se utilizaron posteriormente en experimentos de inmunotransferencia con los antisueros indicados. Figura 4A, una SDS-PAGe teñida con Coomassie representativa que demuestra una composición de proteína dispar cuando se comparan proteínas de lisado de células completas con las obtenidas del sobrenadante de cultivo; Figura 4B, inmunotransferencia de proteínas que demuestra la localización de la proteína flagelar FlaA-2 en células completas, pero no en el sobrenadante; Figura 4C, inmunotransferencia de proteínas que sugiere un aumento de la expresión de la proteína chaperona GroL a 37°C; Figura 4D, inmunotransferencia de proteínas que indica la expresión de la proteína inmunoglobulina LigA en CSP y una mayor expresión en CSP de Leptospira expuesta a NaCl 120 mM. E, inmunotransferencia de proteínas que confirma la expresión de la proteína LbP52 en sobrenadantes de cultivo y aumento de la expresión en CSP de Leptospira expuesta a NaCl 120 mM. El gel SDS-PAGE teñido con Coomassie (Figura 4A) reveló 2 diferencias observables entre WCP y CSP. La primera diferencia fue en los patrones de bandas de proteínas y la segunda fue un sesgo en el tamaño de las proteínas donde la mayoría de CSP migró entre 25-90 kDa, a diferencia de WCP donde se observaron bandas de proteínas tan grandes como 260 kDa. No hubo diferencia visual en las bandas de proteínas en respuesta a cambios osmóticos o de temperatura en WCP o CSP.
[0075] Las inmunotransferencias de proteínas utilizando antisuero contra la proteína flagelar periplásmica de 27,2 kDa (FlaA-2) revelaron bandas de proteínas que migran entre 25-35 kDa en WCP pero sin reactividad con CSP (Figura 4B). Se ha demostrado que la chaperonina de 60 kDa de Leptospira (GroL) se regula por incremento en respuesta a temperaturas de crecimiento elevadas (54) y se ha demostrado que la proteína A similar a la inmunoglobulina (LigA) se regula por incremento y se libera en los sobrenadantes del cultivo tras la exposición de Leptospira a NaCl 120 mM (23, 34). Para evaluar si se observó una respuesta similar a 37°C, se utilizó antisuero contra GroL en experimentos de inmunotransferencia (Figura 4C). Las WCP de Leptospira expuestas a 37 °C mostraron un ligero aumento en la reactividad de GroL (Figura 4C). Inesperadamente, hubo niveles detectables de GroL en todas las muestras de CSP, aunque a niveles significativamente más bajos en comparación con WCP. Usando un razonamiento similar, WCP y CSP se sometieron a análisis de inmunotransferencia usando antisuero reactivo de forma cruzado con proteínas de inmunoglobulina A de Leptospira (LigA con un PM de 128 kDa) y B (LigB con un PM de 201 kDa) (Figura 4D). No se observaron ni LigA ni LigB en muestras de WCP, mientras que LigA se detectó en muestras de CSP, observándose una reactividad pronunciada en muestras de CSP de Leptospira expuestas a NaCl 120 mM (Figura 4D). Las muestras de CSP de Leptospira expuestas a NaCl 120 mM también mostraron 2 bandas únicas que migraron entre 100-140 kDa y una banda única que migró por debajo de 100 kDa (Figura 4D). Tal como será evidente en las secciones de resultados posteriores, observamos una mayor abundancia de numerosas proteínas en los sobrenadantes de los cultivos. Una de esas proteínas fue codificada por el locus LIC12209 y está anotada como una lipoproteína, a la que nos referimos como LbP52 para la proteína del propulsor beta de Leptospira (debido a la presencia de dominios del propulsor beta N-terminal) de 52 kDa. El análisis de inmunotransferencia de WCP y CSP dio como resultado la detección de LbP52 en muestras de CSP solamente, observándose una expresión elevada en muestras de NaCl 120 mM (Figura 4E).
[0076] Los experimentos de inmunotransferencia descritos anteriormente demostraron que las preparaciones de CSP y los experimentos de cambio de temperatura y cambio osmótico se realizaron de manera aceptable para los análisis cuantitativos globales del proteoma posteriores mediante espectrometría de masas. Por lo tanto, WCP y CSP (en réplicas) se sometieron a espectrometría de masas orbitrap-LC para la identificación de proteínas y para la cuantificación relativa de proteínas, utilizando una cuantificación normalizada libre de marcadores de espectros de masas de péptidos. Estos análisis conducen a la detección de 982-1,139 proteínas en WCP y proteínas 613-766 en CSP (Tabla 8 y Anexo_Tabla S1 y Anexo_Tabla S2). Otras diferencias notables entre las muestras incluyeron la detección de proteínas relativamente grandes (300 kDa) en WCP que estaban ausentes en CSP, y la detección de proteínas FlaA-2 y AAS68995.1/LIC10371 en WCP y CSP, respectivamente, pero no al revés (Tabla 7). La última proteína consiste en múltiples dominios de propulsor beta repetidos que encontramos que también están presentes en otras 4 exoproteínas y muestran una gran abundancia en todos los sobrenadantes de cultivo. Se ha descrito (41) el índice espectral normalizado (SIn) y este procedimiento de cuantificación de proteínas reveló un rango dinámico cercano a 5 órdenes de magnitud en cantidades de proteínas (Tabla 7).
Tabla 7. Resumen de los resultados proteómicos. El índice espectral se muestra para la proteína de la vaina flagelar periplásmica FlaA-2 y para una exoproteína (AAS68995.1/LIC10371) que se detectó en gran abundancia en sobrenadantes de cultivo.
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identificación de proteínas exportadas a través de cantidades relativas de proteínas
[0077] En paralelo a la identificación de proteínas, la comparación de proteínas individuales SIn en CSP a WCP permitió la asignación de proteínas que probablemente eran extracelulares localizadas activamente, en lugar de ser detectadas como resultado de la lisis celular y/o la liberación de la membrana externa debido a la manipulación experimental. Específicamente, se consideró que las proteínas que presentaban abundancias al menos iguales o mayores en el sobrenadante en comparación con las células completas y que se detectaron en los 6 sobrenadantes eran exoproteínas transportadas activamente. Este enfoque identificó 208 exoproteínas únicas (Anexo _Tabla S3). Cabe destacar que esta suposición solo era válida en condiciones específicas, ya que las condiciones de cultivo probablemente alteren la exportación de proteínas (como se verá más adelante). Por lo tanto, la cuantificación de proteína relativa utilizada para generar la lista de 208 proteínas fue a partir de la comparación de cantidades de proteína en CSP con WCP a 30 ° C, únicamente. La abundancia relativa de estas exoproteínas en sobrenadantes varió de una abundancia igual a solo detectada en sobrenadantes (Anexo _Tabla S3 y Tabla 8).
T l . L 2 r ín m n n n l r n n liv L. in rr n ° .
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[0078] Para evaluar adicionalmente la asignación de exoproteinas, se usaron las secuencias primarias correspondientes en los análisis bioinformáticos para predecir péptidos señal N-terminales utilizando Phobius (55) y exportación de proteínas no clásicas usando el servidor SecretomeP 2.0 (56). De las 208 proteínas consideradas exportadas, se calculó que 46 contenían un péptido señal N-terminal y se predijo que 38 se exportarían a través de una vía no clásica, definida como una vía que exporta proteínas que carecen de un péptido señal clásico (Tabla S3).
Sobrerrepresentación de exoproteínas en COG relacionados con la producción de energía y el metabolismo
[0079] Las exoproteínas se asignaron a conjuntos de grupos ortólogos (COG) según la clasificación automática de los genomas de Leptospira en la plataforma MicroScope (53). En comparación con las frecuencias esperadas del genoma completo, las exoproteínas en los COG; la motilidad celular (N), los mecanismos de transducción de señales (T), la recombinación y reparación de la replicación (L), la función general (R), la función desconocida (S) y no clasificada (-) estaban subrepresentadas (Figura 5). Los genes de la cepa Fiocruz L1-130 de L. interrogans serovar Copenhageni se han clasificado automáticamente en conjuntos de grupos ortólogos (COG) en el sitio web de GenoScope. Las categorías del COG y los porcentajes previstos de genes de la cepa L1-130 en el COG respectivo son las siguientes: D: control del ciclo celular, división celular, reparto de cromosomas (0,9 %); M: biogénesis de pared celular/membrana/envoltura (5,3 %); N: motilidad celular (2,4 %); O: Modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas (3,2 %); T: Mecanismos de transducción de señales (5,9 %); U: tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular (1,7 %); V: Mecanismos de defensa (1,6 %); Z: Citoesqueleto (0,06 %); B: estructura y dinámica de la cromatina (0,04 %); J: traducción, estructura ribosómica y biogénesis (3,5 %); K: transcripción (3,1 %); L: replicación, recombinación y reparación (4,6 %); C: producción y conversión de energía (3,2 %); E: transporte y metabolismo de aminoácidos (7,0 %); F: transporte y metabolismo de nucleótidos (1,6 %); G: transporte y metabolismo de carbohidratos (3,6 %); H: transporte y metabolismo de coenzimas (2,8 %); I: transporte y metabolismo de lípidos (2,9 %); P: transporte y metabolismo de iones inorgánicos (4,5 %); Q: Biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios (1,8 %); R: predicción de función general solamente (11,0 %); S: Función desconocida (5,0 %); -: Sin clasificar (39,0 %). Esta información se utilizó para clasificar las exoproteínas detectadas en este estudio. Los análisis estadísticos se realizaron asumiendo una distribución binomial utilizando un valor de p de corte de p < 0,01. El símbolo * representa una diferencia significativa entre el número observado de exoproteínas y las probabilidades esperadas del genoma completo para el COG dado, en un tamaño de muestra de 208 proteínas.
[0080] En cambio, hubo una sobrerrepresentación de 2 a 4 veces de exoproteínas clasificadas en los COG; producción y conversión de energía (C), transporte y metabolismo de aminoácidos (E), transporte y metabolismo de nucleótidos (F), transporte y metabolismo de carbohidratos (G) y transporte y metabolismo de lípidos (Figura 5).
Regulación de la expresión de exoproteínas en respuesta a cambios osmóticos y de temperatura
[0081] La comparación de la abundancia de proteínas en CSP de Leptospira cambió a 37 ° C o a EMJH modificado que contiene 120 mM de NaCl a CSP de Leptospira a 30 °C (37 °C frente a 30 °C S y NaCl frente a 30 °C S, respectivamente) reveló una expresión alterada de 52 proteínas en 37 °C frente a 30 °C S y 69 proteínas en NaCl frente a 30 °C S. Tanto los cambios de temperatura como los cambios osmóticos dieron como resultado una expresión reducida de la mayoría de las exoproteínas, 45 de las 52 exoproteínas mostraron una abundancia reducida de -2 a -10 veces a 37 °C y 57 de 69 exoproteínas mostraron cantidades reducidas de -2 a -20 veces en muestras de NaCl 120 mM. Se detectaron seis proteínas entre 2,1 y 6,8 veces más a 37 °C, mientras que 12 proteínas mostraron una abundancia de 2,2 a 6,9 veces más alta a 120 mM de NaCl. En el último caso, las proteínas LigA y LbP52 se observaron en una abundancia 2,9 y 5,5 veces mayor, respectivamente, a NaCl 120 mM consistente con lo que se observó en experimentos de inmunotransferencia (figura 4D y E).
[0082] Las exoproteínas que muestran una expresión alterada en respuesta a la temperatura y el cambio osmótico se clasificaron posteriormente en COG utilizando la plataforma MicroScope (53) para determinar si un cambio de temperatura y/o cambio osmótico tenía un efecto o efectos sobre la expresión/exportación de exoproteínas específicas de COG (FIG. 6A y B). Las exoproteínas que mostraban expresión alterada en sobrenadantes de cultivo de Leptospira desplazado a 37 °C o EMJH modificado que contenía NaCI 120 mM, se clasificaron en COG como se describe para la FIG. 5. A continuación, se compararon las frecuencias de estas exoproteínas con las observadas para las 208 exoproteínas detectadas. El porcentaje de exoproteínas para cada COG se calculó dividiendo el número de exoproteínas reguladas en un COG dado por el número total de exoproteínas reguladas en esa condición (51 y 69 exoproteínas totales mostraron expresión alterada después de un cambio a 37 °C y 120 mM de NaCl, respectivamente). A. El porcentaje de exoproteínas que mostraron expresión aumentada o reducida frente al porcentaje observado para todas las exoproteínas identificadas (208 en total), para cada COG, a 37 °C. B, Análisis similares a los descritos para el panel A pero usando los datos de NaCl 120 mM. Las categorías del COG y los porcentajes previstos de genes de la cepa L1-130 en el COG respectivo se enumeran anteriormente. Los análisis estadísticos se realizaron con la siguiente modificación: el tamaño de la muestra se estableció en 51 y 69 para calcular las probabilidades de frecuencia para conjuntos de datos de NaCl a 37 °C y 120 mM, respectivamente.
[0083] Estas comparaciones no mostraron diferencias significativas en la distribución de frecuencias con la excepción de los COG; traducción, estructura ribosómica y biogénesis (J) (Figura 6A). Para COG J, hubo una sobrerrepresentación significativa de exoproteínas que se clasificaron en este grupo que mostraban expresión reducida a 37 °C (Figura 6A).
Exoproteínas con potenciales funciones “moonlighting"
[0084] Las proteínas “moonlighting” son una clase de proteínas en las que una sola cadena polipeptídica realiza más de una función bioquímica (57). La clasificación de exoproteínas en COG reveló una sobrerrepresentación de proteínas implicadas en la absorción y metabolismo de nutrientes, comprendiendo este último numerosas proteínas implicadas en la vía glucolítica (Figura 5 y Anexo 3_Tabla S3). Las enzimas de la vía glucolítica se han relacionado con las propiedades “moonlighting” en otras bacterias (58-61) y en Leptospira (37). Para buscar proteínas en sobrenadantes de cultivo para potenciales funciones “moonlighting”, se recolectaron proteínas “moonlighting” que se han caracterizado experimentalmente en otros organismos de MoonProt (57). La secuencia primaria de estas proteínas se utilizó a continuación en búsquedas básicas de alineación local (BLAST) utilizando el genoma de L. interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. A continuación, los resultados de la búsqueda se compararon con los datos proteómicos de la Tabla S3, Tabla S1 y Tabla S2 para identificar proteínas ortólogas en los datos proteómicos. Este enfoque identificó 19 proteínas detectadas en el sobrenadante que podrían clasificarse como proteínas “moonlighting” (Tabla 5). Curiosamente, se identificaron 41 proteínas ortólogas a las proteínas “moonlighting” en Leptospira, 19 de estas eran exoproteínas y otras 18 se detectaron en los sobrenadantes.
Tabla 9. Proteínas “moonlighting” potenciales y confirmadas en Leptospira.
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Las exoproteínas son inmunogénicas pero muestran una participación limitada en la manifestación de la enfermedad en jerbos
[0085] Para comenzar a caracterizar las exoproteínas en el contexto de la patogénesis, se utilizaron WCP y CSP en experimentos de inmunotransferencia con sueros de cobaya positivos para Leptospira (S+) para observar la respuesta de anticuerpos a exoproteínas, lo que también sería sugestivo de expresión de exoproteínas durante el proceso de infección (Figura 7). Se utilizaron sueros de cobaya obtenidos antes y después de la infección por Leptospira en experimentos de inmunotransferencia de proteínas para probar la reactividad de inmunoglobulinas con lisados de Leptospira completos o sobrenadantes de cultivo. A. Inmunotransferencia de proteínas que compara la reactividad de IgG con proteínas de células completas y exoproteínas cuando se utilizan sueros positivos para Leptospira . B. Inmunotransferencia de proteínas que demuestra una falta de reactividad de IgG a células completas y proteínas extracelulares cuando se utilizan sueros previos a la infección. C. Inmunotransferencia de proteínas que compara la reactividad de IgM con proteínas de células completas y exoproteínas cuando se utilizan sueros positivos para Leptospira . D. Inmunotransferencia de proteínas que demuestra una falta de reactividad de IgM a células completas y proteínas extracelulares cuando se utilizan sueros previos a la infección.
[0086] Estos análisis revelaron la reactividad de IgG e IgM contra exoproteínas de Leptospira en sueros S+ (Figuras 7A y C) y ninguna reactividad en los sueros de control previos a la infección (Figuras 7B y D). La reactividad de exoproteína con IgG fue significativamente menos prominente en comparación con WCP y se observó una tendencia similar con la reactividad de IgM (Figuras 7A y C). La comparación de la reactividad de IgG e IgM con exoproteínas se distinguió en que las proteínas que mostraban reactividad con IgG no mostraban reactividad con IgM y viceversa (Figuras 7A y C). Además, la CSP de la exposición a NaCl 120 mM también condujo a la reactividad alterada de las exoproteínas IgG e IgM en comparación con la CSP de 30 °C y 37 °C (Figuras 7A y C). Específicamente, se observó una reactividad reducida de IgG e IgM para las bandas de proteínas que migraban entre 70-100 kDa (Figuras 7A y 7C) y se observó una mayor reactividad de IgG para dos proteínas a 35 kDa y 15 kDa (figura 7A).
[0087] A fin de evaluar la necesidad de exoproteínas en la viabilidad de Leptospira in vitro y dentro del huésped, mutantes de Leptospira seleccionados que habían sido inactivados en un gen que codifica exoproteína se ensayaron para determinar in vitro tasas de crecimiento y para la manifestación de la enfermedad en jerbos. Se ensayó la viabilidad in vitro de los mutantes de Leptospira en exoproteínas y se midió su capacidad para establecer la infección en el modelo de infección en jerbos como el tiempo hasta la muerte de los animales. A. Se inocularon bacterias a 104 por ml en medio EMJH, se cultivaron a 30 °C y se controló el crecimiento a través de la medición de la densidad óptica a 420 nm. Los mutantes lruB- y lid11852- mostraron tasas de crecimiento in vitro retardadas en comparación con la cepa parental wt, mientras que todos los demás mutantes de exoproteína ensayados mostraron tasas de crecimiento comparables a wt (no mostrado). B. Los mutantes que muestran tasas de crecimiento in vitro comparables a wt se utilizaron para estimular jerbos a 104 bacterias por animal para el propósito de probar la virulencia. El producto proteico del gen marcado con el símbolo * no cumplió con todos los criterios utilizados para generar la lista de exoproteínas presentada en el Anexo 3_Tabla S3, pero se detectó en sobrenadantes de cultivo. Las tasas de crecimiento in vitro de mutantes identificaron dos genes que cuando se inactivan dan como resultado un crecimiento in vitro significativamente reducido; IruB (LIC10713) y O-acetilhomoserina (tiol) liasa (LIC11852) (Figura 8A).
[0088] Los otros mutantes de Leptospira probados (en genes que codifican exoproteínas) no muestran un defecto de crecimiento in vitro (datos no mostrados) y se utilizaron posteriormente para infectar grupos de cuatro jerbos mediante inyección intraperitoneal con 104 bacterias por animal (Fig. 8B). Los mutantes probados tuvieron muy poco efecto sobre la manifestación de la enfermedad en jerbos porque los animales estimulados con cepas mutantes mostraron tasas de mortalidad similares en comparación con wt L495 (Figura 8B). Los mutantes en los genes LIC13086 y LIC10373 mostraron tasas de mortalidad retardadas y reducidas, respectivamente (Figura 8B), pero estas diferencias no fueron estadísticamente significativas cuando se compararon con las tasas de mortalidad atribuidas a la estimulación a wt L495.
DISCUSIÓN
[0089] La caracterización global de las exoproteínas de Leptospira ha revelado que la mayoría de las exoproteínas contienen funciones metabólicas y de generación de energía, que probablemente son esenciales para la supervivencia en los diversos entornos encontrados por estas bacterias. Leptospira interrogaos evolucionó de L. biflexa y probablemente ha retenido la mayoría de estos genes que codifican exoproteínas del saprófito (62). La clasificación de exoproteínas en COG indicó que la mayoría de las exoproteínas están involucradas en la adquisición y metabolismo de nutrientes, incluida la captación de aminoácidos, carbohidratos y lípidos. La captación de lípidos es esencial para Leptospira ya que la beta-oxidación es el procedimiento principal de generación de energía en estas bacterias. La evidencia de esta última afirmación se proporciona en el medio de cultivo en el que la única fuente de energía es el polisorbato 80; un derivado de sorbitán polietoxilado y ácido oleico. La capacidad de Leptospira para utilizar polisorbato 80 como fuente de energía es en sí misma evidencia de la plasticidad de la función de las exoproteínas, ya que el polisorbato 80 es un compuesto sintético al que las bacterias probablemente no han estado expuestas en su historia evolutiva. Queda por dilucidar si Leptospira también utiliza la beta-oxidación durante el proceso de infección y, de ser así, si habría implicaciones para el tropismo tisular.
[0090] Además de sus actividades metabólicas, 19 exoproteínas también mostraron ortología a las proteínas “moonlighting” en otros microorganismos. Las propiedades “moonlighting” de dos de estas proteínas ya se han demostrado en Leptospira (37, 63). Una de estas proteínas, la fosfopiruvato hidratasa (Eno/LIC11954), se ha caracterizado como enolasa, se detecta en sobrenadantes de cultivo y muestra actividad de unión al plasminógeno (37). La otra proteína, el factor de elongación Tu (Tuf/LIC12875) se detecta en la superficie de Leptospira y muestra unión a plasminógeno y al factor H (63). Otra proteína “moonlighting” potencial, una catalasa (KatE/LIC12032), se ha caracterizado previamente como necesaria para la resistencia al estrés oxidativo y virulencia de la Leptospira (51) pero la capacidad de unión al plasminógeno de esta proteína (como se demostró para la catalasa de Candida albicans (64)) queda por dilucidar en Leptospira. En consonancia con un papel potencial en las interacciones huésped-patógeno, se ha demostrado que cinco posibles proteínas “moonlighting” de Leptospira son inmunorreactivas (65); sugerente de su expresión durante el proceso de infección. Una exoproteína (no detectada en los sobrenadantes de cultivos en el presente estudio) directamente asociada con la patogénesis se ha caracterizado como una colagenasa necesaria para la invasividad tisular y la virulencia en animales (38) mientras que otra proteína (Lsa32/LIC11089), detectada en los sobrenadantes de cultivos en el presente estudio, se ha caracterizado y demuestra la capacidad de unión a laminina y plasminógeno (66). Además, se detectó una proteína G de alta temperatura (HtpG) conocida del factor de virulencia de Leptospira (67) en alta abundancia en todos los sobrenadantes de cultivo. La inactivación de este gen da como resultado la atenuación de la patogénesis, mientras que la cepa complementada, que muestra un aumento de la transcripción de htpG, muestra un aumento de la virulencia, lo que se manifiesta en un aumento de la hemorragia y lesiones en los órganos (67). Además, el mutante htpG no muestra defectos de crecimiento in vitro, lo que sugiere la presencia extracelular de esta proteína como la causa de la patogénesis de la enfermedad en animales, ya sea a través de propiedades “moonlighting” no identificadas o de la respuesta inflamatoria del huésped a esta proteína. En conjunto, estas observaciones constituyen un caso convincente para las interacciones huésped-patógeno mediadas por exoproteínas y la patogénesis de la enfermedad.
[0091] Si bien la patogenia de la enfermedad se puede asociar con la función de exoproteínas, los mutantes de Leptospira alterados en genes que codifican exoproteínas probados en este estudio mostraron una manifestación de enfermedad similar en animales a la observada para la cepa parental. Cabe destacar que uno de los genes inactivados codificaba LipL48 (LIC10898) que fue la segunda proteína más abundante en sobrenadantes de cultivo y se detectó a niveles 11,3 veces superiores a los encontrados dentro de la bacteria. De manera similar, otro gen inactivado (LIC11977) que codifica una proteína de unión de nucleótidos cíclicos también se detectó en alta abundancia en los sobrenadantes y mostró una abundancia 5,8 veces mayor en los sobrenadantes de cultivo en comparación con la que se encuentra dentro de las bacterias. Otras proteínas destacadas incluyeron la proteína similar a la endostatina LenC, que se ha demostrado que se une a la fibronectina (24) y era exclusiva de los sobrenadantes y un antígeno de Leptospira LipL36. Los otros 2 mutantes se inactivaron en genes anotados como lipoproteínas. Nuestra curiosidad por estos genes (LIC12208 y LIC10373) se derivó de la observación de que estas exoproteínas, entre otras 3, contenían múltiples dominios de propulsor beta repetidos, eran exclusivos de los sobrenadantes de cultivo y mostraban una mayor abundancia de 5,5 (LpP52) y 3,5 (AAS71615.1/LIC13066) veces, en condiciones de cultivo que imitan la concentración fisiológica de NaCl. A diferencia de la falta de impacto en la patogénesis de la enfermedad, la inactivación de dos genes que codifican exoproteínas, anotados como una lipoproteína (que contiene un dominio peptidasa de imelisina) (/ruB/LIC10713) y una O-acetilhomoserina (tiol) liasa (AAS70438.1/LIC11852), procesó las bacterias con defectos de crecimiento in vitro. La proteína LruB se ha asociado con uveítis (68-70), indicativa de la expresión durante la patogénesis. Sin embargo, LruB también parece ser esencial para la viabilidad de la Leptospiral fuera del huésped, está en la clase P del COG: el transporte de iones inorgánicos y el metabolismo y el análisis estructural de proteínas similares a la imelisina implica un papel en la captación de hierro (71). La otra exoproteína vital O-acetilhomoserina (tiol) liasa vital se encuentra en la clase E del COG: transporte y metabolismo de aminoácidos y probablemente participa en la regulación de la metionina y la cisteína (72). De ello se deduce que 43 de las 208 exoproteínas se clasificaron en la clase E del COG que implican la función exoproteína en los procesos heterotróficos.
Ejemplo 3 - Experimentos de vacunación y estimulación - ejemplo profético
[0092] Experimentos de inmunización y estimulación. El cribado preliminar de proteínas inmunoprotectoras putativas recombinantes se realizó en un grupo de hámsteres Golden Syrian de 4 semanas de edad, de 5 a 10 hámsteres por grupo. Los hámsteres pueden inmunizarse dos veces mediante inyección subcutánea con proteínas recombinantes (50 pg) en un intervalo de tres semanas (día 0 y día 21). Los hámsteres que reciben solo el adyuvante de Freund representan el grupo de control. Antes de la inmunización, las proteínas recombinantes se mezclaron con un volumen igual de adyuvante de Freund.
[0093] Los hámsteres inmunizados se estimularon por vía intraperitoneal con 10 a 10e3 Leptospiras/dosis, dependiendo del serovar. Para cada serovar se ha determinado la dosis más pequeña que induce al menos 80 muertes después del día 10 después de la estimulación. Los animales se controlaron dos veces al día, se sacrificaron el día 71. Los tejidos de los animales infectados se recogieron asépticamente para análisis histopatológico y cultivo.
[0094] Se analizaron de nuevo antígenos protectores recombinantes (LIC10879, LIC13050, LIC10411, LIC13314, LIC10117, LIC11088, LIC11089, LIC13074, LIC20229, LIC11181, LIC13059, LIC10959, LIC11289, LIC12349, LIC13250, LIC20146, LIC10321, LIC10662, LIC11183, LIC11489, LIC12258, LIC12731, LIC12332, LIC10793, LIC11884, LIC20197, LIC11224, LIC11693, LIC12285, LIC10672, LIC10509, LIC10596, LIC11028, LIC11874, LIC13090, LIC10318, LIC10655, LIC11553, LIC11637, LIC12100, LIC12784, LIC13002, LIC13023, LIC13017, LIC11711, LIC10380, LIC10551, LIC10740, LIC11580, LIC11990, LIC12339, LIC12691, LIC12805, LIC13195, LIC13313, LIC13386, LIC13491, LIC20165, LIC10314, LIC10326, LIC 10927, LIC10968, LIC11003, LIC12576, LIC13434, LIC13071, LIC11224, LIC10027, LIC 10474, LIC10411, LIC20035, LIC20197, LIC11088, LIC11687, LIC11711, LIC10115, LIC12433, LIC10868, LIC10898, LIC11299, LIC11693, LIC12030, LIC20153, LIC10672, LIC11966, LIC10973, Lp1118, MceII y Lsa21) tal como se discutió anteriormente en un grupo de hámsteres (5 a 10 animales por grupo). Los animales inmunizados con Freund se consideraron controles negativos. Se evaluó la eficacia protectora de los antígenos recombinantes en combinación (50 pg de cada antígeno) en un grupo de hámsteres (5 a 10 hámsteres por grupo).
[0095] Protección para hámster. Se inmunizaron grupos de 10 animales dos veces separados por 14 días mediante la ruta SQ con 100 pG (o 50 pG*) de proteínas recombinantes purificadas de E. coli o PBS combinada 1: 1 con adyuvante completo (VI) o incompleto (V2) de Freund. Los hámsteres se estimularon por vía intraperitoneal 14 días después de V2 como se indica y se observaron diariamente durante 21 días para detectar signos clínicos y mortalidad. Tal como se indica en la FIG. 9, se demostró que LIC13314 confería un 60 % de protección contra la estimulación letal de Austra/is.
Procedimiento del modelo de hámster.
[0096] Abreviaciones. BSA - Albúmina de suero bovino; CM - Procedimiento controlado; CMD - Desarrollo del modelo de estimulación; DMSO - dimetilsulfóxido; EMJH: Ellinghausen, McCullough, Johnson y Harris; IO - Operaciones industriales; LGM - Medio de crecimiento de Leptospira; MR - Registro de fabricación; PoC - Prueba de concepto; QC - Control de calidad; I D: investigación y desarrollo; SAM - Procedimiento de ensayo suplementario; USDA -Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
[0097] Hámsteres. Para los estudios se utilizaron hámsteres Golden Syrian, de aproximadamente 3 semanas de edad a su llegada. Los hámsteres no tenían más de 4 semanas de edad, después de un período de aclimatación, que normalmente era de 3-5 días. Los hámsteres se vacunaron aproximadamente a las 4 semanas de edad y a continuación se reforzaron con una segunda vacunación (según fuera necesario) a las 6 semanas de edad. A continuación, los hámsteres se expusieron aproximadamente a las 6 u 8 semanas de edad, dependiendo de si se requería una segunda vacunación. Durante los estudios del Desarrollo del modelo de estimulación (CDM) se utilizaron de 6 a 8 semanas.
[0098] Medios. Se utilizaron tres tipos de medios: EMJH (Difco); Medio de crecimiento de Leptospira (probúmina -Celliance/Millipore); y M26C (receta Merial) - utilizado por IO. El protocolo para la preparación de cada medio se puede encontrar en la literatura del producto correspondiente. El medio de cultivo de Leptospira y LGM-SemiSólido (LGM) es una forma diluida de probúmina, que es un producto de albúmina de suero bovino (BSA) proporcionado por Celliance/Millipore. También debe tenerse en cuenta que las concentraciones de Tween y BSA dentro del Suplemento 10X BSA M26A varían según el serovar que se esté cultivando. Las siguientes son las concentraciones de Tween y BSA en el Suplemento 10X BSA utilizado para cada uno de los 4 serovares: 1) L. canicola: Tween - 375 g/L, BSA - 60 g/L; 2) L. grippo: Tween - 125 g/L, BSA - 100 g/L; 3) L. ictero: Tween - 375 g/L, BSA - 60 g/L; y 4) L. pomona: Tween - 150 g/L, BSA - 100 g/L.
[0099] También hay dos tipos de preparaciones para cada uno de estos medios: un caldo y un semisólido. La versión semisólida de estos medios se puede preparar agregando agar a una concentración final de 1,5 g/L a las porciones basales de cada uno de estos medios antes de esterilizarlos en autoclave y la posterior adición del suplemento de BSA. La temperatura de almacenamiento de cada medio es de 4 °C. Si los medios se almacenan a temperaturas más altas durante períodos prolongados de tiempo, se ha observado una tasa de crecimiento de Leptospiral reducida. El medio utilizado para la propagación de Leptospira debe ser relativamente reciente y debe respetarse una fecha de caducidad de 3 meses desde el momento en que se produce. A medida que cada uno de estos medios envejece, se cree que algunas de las proteínas esenciales dentro del medio podrían comenzar a descomponerse y, por lo tanto, conducir a una tasa de crecimiento, así como una disminución en la actividad o vitalidad del cultivo.
[0100] Leptospira. Las serovares para estos estudios incluyen las siguientes: L. ictero - cepa CFI (NVSL ID 11403, lote 14 de febrero de 2002); L. canicola - cepa de Moulton (Prot 02096/11 de junio de 2002); L. pomona - MLS, NVSL No. 11000 (22 de mayo de 2009); L. grippo - Oregon Shrew Isolate NVSL No. 11808 (01 de abril de 2010); L. copenhageni - cepa Fiocruz L130 (6 de noviembre de 2007); L. australis cepa 1150016700. Se cultivaron Leptospira en tubos Falcon de 15 y 50 ml sin ventilación (n° de catálogo de VWR 21008-929 y 21008-938 respectivamente), a 30 °C, en condiciones estáticas (sin agitación) y expuestas a tan poco luz como sea posible. Es preferente Leptospira en un estado de crecimiento logarítmico para la mayoría de las aplicaciones en lugar de Leptospira que se encuentran en las fases de retraso o estacionarias de crecimiento. Una vez que la cantidad de Leptospira llega a 108 organismos por ml determinado por enumeración de Petroff-Hausser, normalmente se realiza un pase de medio. Durante el pase del medio, el cultivo en crecimiento se diluye usando medio fresco a 1:10 y/o 1:100 dependiendo de la logística del estudio y cuándo se necesitará el cultivo. Sin embargo, es importante minimizar los pases por los medios, ya que esto finalmente dará como resultado la atenuación de la virulencia. Después de 9 pases in vitro (medios), es importante realizar una serie de pases in vivo (pases de hámster) para restaurar la virulencia.
[0101] Pase del hámster. Utilizando un cultivo de Leptospira en la fase logarítmica de crecimiento, se determinó la cantidad/concentración mediante enumeración de Petroff-Hausser. Basado en la cantidad, el cultivo se diluyó usando medio de crecimiento fresco hasta una concentración de 3000 organismos por ml que sirvió como material de estimulación para los hámsteres donantes/de pase. Se administraron a cinco (5) hámsters los siguientes volúmenes del material de estimulación mediante inoculación IP: hámster n° 1 - 1 ml; Hámster n. ° 2: 0,75 ml; Hámster n. ° 3: 0,5 ml; Hámster n. ° 4: 0,5 ml; Hámster n.° 5 - 0,25 ml.
[0102] Cuando se realiza este procedimiento, si la concentración de Leptospira a 3.000 organismos por ml resulta ser ineficaz para causar la muerte en tiempo, la concentración debe aumentarse a 6.000 org./ml y a continuación a 9.000 org./mL si la dosis de 6.000 es ineficaz. El inicio de la enfermedad/muerte debe tener lugar entre 7 y 10 días después de la estimulación para Lc, Li, Lp y Lg. El inicio de la enfermedad/muerte de L. copenhageni es entre 10 y 14 días después de la estimulación. Si el inicio de la enfermedad/muerte tiene lugar después de 10 días después de la estimulación, o 14 días en el caso de copenhageni, se deben realizar pases de hámster adicionales y un posible aumento de la dosis de estimulación hasta que la aparición de la enfermedad/muerte tenga lugar en este intervalo.
[0103] Re-aislamiento de hámster. Una vez que aparece la enfermedad/muerte, el hígado y el riñón del hámster infectado deben extraerse, homogeneizarse y: diluirse en medio (u otros diluyentes aceptables que respaldarán la viabilidad de Leptospira), cuantificarse mediante enumeración de Petroff-Hausser, diluirse adicionalmente (si es necesario) a 3000 org./mL, y usarse para estimularse 5 hámsters más como se describe anteriormente; diluirse en medio y filtrarse (siempre que se observe un número suficiente de Leptospira en el homogeneizado), tal como se especifica a continuación para eliminar la mayor cantidad de contaminantes del homogeneizado de hígado antes de su posterior propagación y posterior almacenamiento; o diluirse 1:10, 1:100 y 1:1.000 en medio semisólido suplementado con 0,1 g/L de 5-fluorouracilo (siempre que no se observe Leptospira en el homogeneizado) y permitir crecer durante 7-14 días hasta que se observa el crecimiento de Leptospira. Este procedimiento es necesario para la serovar L. copenhageni, ya que habitualmente no hay Leptospira observable inmediatamente después de la homogeneización del hígado y el riñón.
[0104] Filtración del homogeneizado de hígado y riñón. Después de homogeneizar de forma independiente aproximadamente 1 g de hígado y/o riñón infectados en 9 ml de medio de crecimiento, el homogeneizado infectado se diluyó adicionalmente en 1:100 en 30 ml de medio de crecimiento (0,3 ml de homogeneizado en 29,7 ml de medio) y, a continuación, se pasó lentamente a través de una serie de filtros de la siguiente manera utilizando una jeringa de 60ml: 1° - tela de queso (no se necesita jeringa); 2° - filtro de jeringa de 5 pm (PALL Acrodisc, Versapor Membrane, no pirogénico, Parte # 4199); 3° - filtro de jeringa de 1,2 pm (PALL Acrodisc, Versapor Membrane, no pirogénico, Parte # 4190); 4° - filtro de jeringa de 0,45 pm (PALL Acrodisc, HT Tuffryn Membrane, no pirogénico, Parte # 4184); 5°- Filtro de jeringa de 0,2 pm (PALL Acrodisc, membrana GHP, Parte # AP-4564T). Después de la filtración, se observó el

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Composición para usar en un procedimiento para proporcionar a un animal que necesita inmunidad protectora contra Leptospira spp. dicha inmunidad protectora, que comprende administrar a un animal una vacuna que comprende una cantidad inmunoprotectora eficaz de una composición que comprende al menos un polipéptido de Leptospira que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 6.
2. Composición para su uso de la reivindicación 1, en la que el polipéptido está codificado por la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 5.
3. Composición para su uso de la reivindicación 1, en la que el animal está protegido contra Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa y Leptospira pomona , opcionalmente en la que: a. al animal se le administra aproximadamente 1 ml de vacuna, o
b. al animal se le administran 2 dosis subcutáneas, en las que opcionalmente las 2 dosis se administran en un intervalo de 21 días.
4. Vector para su uso en un procedimiento para proporcionar a un animal que necesita inmunidad protectora contra Leptospira spp. dicha inmunidad protectora, que comprende un ADN recombinante, en el que el a Dn recombinante comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 5.
5. Vacuna de ADN recombinante para su uso en un procedimiento de proporcionar a un animal que necesita inmunidad protectora contra Leptospira spp. dicha inmunidad protectora, que comprende:
a. un ADN recombinante en el que el ADN recombinante comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 5; y b. un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector, en el que el ADN recombinante se inserta en el vector, de manera que se expresa una proteína recombinante cuando el vector se proporciona en un huésped apropiado.
6. Procedimiento para producir una vacuna contra un trastorno relacionado con Leptospira que comprende:
a. proporcionar un ADN recombinante, en el que el ADN recombinante comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 5;
b. proporcionar un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector; y
c. insertar el ADN recombinante en el vector, en el que el ADN recombinante se inserta en el vector de manera que se exprese una proteína recombinante cuando el vector se proporciona en un huésped apropiado, produciendo así la vacuna.
7. Procedimiento de la reivindicación 6, en el que la vacuna comprende antígenos adicionales que proporcionan inmunidad contra patógenos caninos adicionales.
8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el que los antígenos adicionales se seleccionan de parvovirus canino (CPV), virus de la parainfluenza canina (CPi2), virus del moquillo canino (CDV), adenovirus, virus del herpes, rabia, coronavirus canino y combinaciones de los mismos.
9. Procedimiento para producir un péptido inmunoprotector para usar en una vacuna contra un trastorno relacionado con Leptospira que comprende:
a. proporcionar un ADN recombinante, en el que el ADN recombinante se selecciona de
i. un ADN recombinante que codifica la secuencia de ácido nucleico como se establece en SEQ ID NO: 5; o ii. un ADN recombinante que codifica la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 6;
b. proporcionar un vector capaz de expresar el ADN recombinante cuando el ADN recombinante se inserta en el vector; c. insertar el ADN recombinante en el vector;
d. proporcionar una cepa bacteriana;
e. transformar el vector en la cepa bacteriana de modo que se exprese una proteína recombinante cuando el vector se transforme en la cepa bacteriana; y
f. recolectar la proteína recombinante de la cepa bacteriana, produciendo así la proteína inmunoprotectora.
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