ES2575156T3 - Vacunas recombinantes contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas - Google Patents
Vacunas recombinantes contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2575156T3 ES2575156T3 ES11171461.4T ES11171461T ES2575156T3 ES 2575156 T3 ES2575156 T3 ES 2575156T3 ES 11171461 T ES11171461 T ES 11171461T ES 2575156 T3 ES2575156 T3 ES 2575156T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- sea lice
- caligidae
- seq
- fish
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001247232 Caligidae Species 0.000 title claims abstract description 21
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 title description 60
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title description 5
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 title description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 72
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 49
- 241001247234 Lepeophtheirus salmonis Species 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 18
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 37
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 25
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 25
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 13
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 13
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 7
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 7
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 description 7
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100287724 Caenorhabditis elegans shk-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 241000239250 Copepoda Species 0.000 description 6
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 101100421200 Caenorhabditis elegans sep-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 5
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 4
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 241000133262 Nauplius Species 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 3
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 22,23-dihydroavermectin B1a Natural products C1CC(C)C(C(C)CC)OC21OC(CC=C(C)C(OC1OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C1)C(C)C=CC=C1C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(O)C3OC1)O)CC4C2 AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241001611011 Caligus Species 0.000 description 2
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 2
- OYRVWOGRRQDEQH-MLVLNPCWSA-N Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O)C(C)CC)C1=CC=CC=C1 OYRVWOGRRQDEQH-MLVLNPCWSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 2
- VXSIXFKKSNGRRO-MXOVTSAMSA-N [(1s)-2-methyl-4-oxo-3-[(2z)-penta-2,4-dienyl]cyclopent-2-en-1-yl] (1r,3r)-2,2-dimethyl-3-(2-methylprop-1-enyl)cyclopropane-1-carboxylate;[(1s)-2-methyl-4-oxo-3-[(2z)-penta-2,4-dienyl]cyclopent-2-en-1-yl] (1r,3r)-3-[(e)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl Chemical class CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)O[C@@H]1C(C)=C(C\C=C/C=C)C(=O)C1.CC1(C)[C@H](/C=C(\C)C(=O)OC)[C@H]1C(=O)O[C@@H]1C(C)=C(C\C=C/C=C)C(=O)C1 VXSIXFKKSNGRRO-MXOVTSAMSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 2
- GCKZANITAMOIAR-XWVCPFKXSA-N dsstox_cid_14566 Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1.C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H]([NH2+]C)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 GCKZANITAMOIAR-XWVCPFKXSA-N 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000003031 feeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229960002418 ivermectin Drugs 0.000 description 2
- 208000028454 lice infestation Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108010004563 mussel adhesive protein Proteins 0.000 description 2
- 239000003988 mussel adhesive protein Substances 0.000 description 2
- -1 organophosphates (eg Chemical compound 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- HYJYGLGUBUDSLJ-UHFFFAOYSA-N pyrethrin Natural products CCC(=O)OC1CC(=C)C2CC3OC3(C)C2C2OC(=O)C(=C)C12 HYJYGLGUBUDSLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940070846 pyrethrins Drugs 0.000 description 2
- 239000002728 pyrethroid Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- LGKDEBYYRWXEDL-UHFFFAOYSA-N 2-aminobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1N LGKDEBYYRWXEDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 101710186403 Adhesive plaque matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 241000238588 Balanus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001611004 Caligus rogercresseyi Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000238586 Cirripedia Species 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 101710196022 Cuticle protein Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001247233 Lepeophtheirus Species 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 101710199769 Matrix protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000277289 Salmo salar Species 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010040840 Skin erosion Diseases 0.000 description 1
- 206010040860 Skin haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- OEBRKCOSUFCWJD-UHFFFAOYSA-N dichlorvos Chemical compound COP(=O)(OC)OC=C(Cl)Cl OEBRKCOSUFCWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001327 dichlorvos Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000003370 dye binding method Methods 0.000 description 1
- 244000078703 ectoparasite Species 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007938 immune gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000426 osmoregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007110 pathogen host interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43509—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from crustaceans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0003—Invertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un ADN que codifica un antígeno proteínico para uso en el tratamiento de infección de copépodos caligidae en peces, en donde el ADN consiste en la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 9.
Description
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCIÓN
Vacunas recombinantes contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas
Campo técnico
La presente invención se refiere de forma general a vacunas para salmones. Más particularmente, la presente invención se refiere a vacunas contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas.
Antecedentes de la invención
Una serie de especies estrechamente relacionadas entre sí de copépodos parasitarios de la familia Caligidae (copépodos caligidae) infectan y producen enfermedades en la cría de peces. Colectivamente, dichas especies se denominan piojos de mar. Existen tres géneros principales de piojos de mar: Pseudocaligus, Caligus y Lepeophtheirus. En relación a la producción de salmones por todo el hemisferio norte, una especie, el piojo del salmón (Lepeophtheirus salmonis), es responsable de la mayoría de los brotes de enfermedad en granjas de salmónidos. Este parásito es responsable de pérdidas directas e indirectas en acuicultivos por más de 100 millones de dólares de EE.UU. cada año (Johnson, S.C., et al., Zool. Studies 43: 8-19, 2004). Todas las etapas de desarrollo de los piojos de mar, unidos al hospedante, se alimentan del mucus, la piel y la sangre del hospedante. La unión y las actividades de alimentación de los piojos de mar dan como resultado lesiones que varían en naturaleza y gravedad dependiendo de: la especie de piojo de mar, su abundancia, las etapas de desarrollo presentes y la especie del hospedante (Johnson, S.C., et al., “Interactions between sea lice and their hosts”. En Host-Parasite Interactions. Editores: G. Wiegertjes y G. Flick, Garland Science/Bios Science Publications, 2004, pág. 131-160). En el hemisferio sur, el Caligus rogercresseyi es el caligidae que más afecta a la industria de cría de salmón en Chile (González, L. y Carvajal, J. Aquaculture 220: 101-117, 2003).
Los copépodos caligidae presentan ciclos vitales directos que consisten en dos etapas de nauplius planctónicas de vida libre, una etapa de copepodito infeccioso de natación libre, de cuatro a seis etapas de fijación chalimus, una o dos etapas preadultas, y una etapa adulta (Kabata, Z., Libro 1: Crustacea as enemies of fishes. En: Diseases of Fishes, Editores: Snieszko, S.F. y Axelrod, H.R.; Nueva York, T.F.H. Publications, 1970, pág. 171). Cada una de estas etapas de desarrollo viene separada por una muda. Una vez alcanzada la etapa adulta, los copépodos caligidae no sufren mudas adicionales. En el caso del L. salmonis, los huevos eclosionan en la primera etapa de nauplius de natación libre, que viene seguida por una segunda etapa de nauplius, y después por la etapa de copepodito infeccioso. Una vez que el copepodito se localiza en un pez hospedante adecuado, continúa su desarrollo a través de cuatro etapas de chalimus, la primera y segunda etapas de pre-adulto y después una etapa final de adulto (Schram, T.A. “Supplemental descriptions of the developmental stages of Lepeophtheirus salmonis (Krøyer, 1837) (Copepoda: Caligidae)”. En: Pathogens of Wild and Farmed Fish: Sea Lice. Editores: Boxshall, G.A. y Defaye, D., 1993, pág. 30-50). Las mudas se caracterizan por cambios graduales según va creciendo el animal y se ve sometido a modificaciones físicas que le permiten vivir como parásito de movimiento libre, alimentarse y reproducirse sobre la superficie del pez.
Los copépodos caligidae (piojos de mar) se alimentan del mucus, la piel y la sangre de sus hospedantes, lo que produce lesiones que varían en gravedad en función de la(s) etapa(s) de desarrollo de los copépodos presentes, del número de copépodos presentes, de su(s) sitio(s) de fijación y de la especie del hospedante. En situaciones de enfermedad grave, tal como las observadas en el salmón atlántico (Salmo salar) cuando es infectado por un número elevado de L. salmonis, se pueden observar grandes áreas de erosión cutánea y hemorragias sobre la cabeza y el cuello, y un área distintiva de erosión y hemorragia sub-epidérmica en el región perianal (Grimnes, A. et al. J. Fish Biol. 48: 1179-1194, 1996). Los piojos de mar pueden producir cambios fisiológicos en sus hospedantes que incluyen el desarrollo de una respuesta de estrés, una función inmunitaria reducida, un fallo osmorregulador y la muerte, si no son tratados (Johnson et al., ver anterior).
Existen varias estrategias de manejo que han sido usadas para reducir la intensidad de las plagas de copépodos caligidae (piojos de mar). Éstas incluyen: barbecho de los sitios antes de la reposición, separación de clase anual y selección de sitios de granja para evitar áreas en las que hay densidades elevadas de hospedantes silvestres u otras condiciones ambientales adecuadas para el establecimiento del piojo de agua (Pike, A.W. et al., Adv Parasitol
44: 233-337, 1999). Aunque el uso de estas estrategias puede reducir en algunos casos las tasas de infección de piojos de mar, su uso de forma individual o colectiva no ha sido efectivo para eliminar la infección.
Se han usado una variedad de productos químicos y fármacos para controlar los piojos de mar. Dichos productos químicos fueron diseñados para el control de plagas y parásitos terrestres de plantas y animales domésticos. Incluyen compuestos tales como peróxido de hidrógeno, organofosfatos (p.ej., diclorvos y azametifos), ivermectina (y compuestos relacionados, tales como benzoato de emamectina), reguladores de la muda de insectos y piretrinas (MacKinnon, B.M., World Aquaculture 28: 5-10, 1997; Stone J., et al., J. Fish Dis. 22: 261-270, 1999). Los tratamientos de piojos de mar se pueden clasificar en aquellos administrados mediante el baño (p.ej., organofosfatos, piretrinas) y aquellos administrados oralmente (p.ej., ivermectina). Los tratamientos de baño para el control de piojo de mar son dificultosos, caros de aplicar y pueden tener efectos significativos sobre el crecimiento de los peces después de los tratamientos (MacKinnon, ver anterior). Los productos químicos usados en los tratamientos
de baño no son necesariamente efectivos contra todas las etapas de piojo de mar que se dan en los peces. Actualmente, el uso de tratamientos orales tales como SLICE® (benzoato de emamectina) es el predominante en la industria de los salmónidos. Al contrario que los productos químicos administrados en los tratamientos de baño, SLICE® proporciona una protección a corto plazo contra la re-infección. Este tratamiento, aunque más sencillo de 5 aplicar que los tratamientos de baño, sigue siendo caro y, como los tratamientos de baño, requiere de un periodo de retirada antes de que los animales puedan ser sacrificados para consumo humano (Stone, ver anterior). Como se ha visto en plagas y parásitos terrestres, no hay evidencia del desarrollo de resistencia en L. salmonis frente a estos tratamientos, especialmente en poblaciones tratadas frecuentemente (Denholm, I., Pest Manag Sci 58: 528-536, 2002). Para reducir los costes asociados a los tratamientos de piojos de mar, y para eliminar los riesgos ambientales
10 asociados a dichos tratamientos, se necesitan nuevos métodos de control del piojo de mar, tales como vacunas.
Un rasgo característico de los sitios de unión y alimentación de los copépodos caligidae sobre muchos de sus hospedantes es la falta de respuesta inmune del hospedante (Johnson et al., ver anterior; Jones, M.W., et al., J Fish Dis 13: 303-310, 1990; Jónsdóttir, H., et al., J Fish Dis 15: 521-527, 1992). Esta carencia de respuesta inmune es similar a la reportada para otros parásitos artrópodos tales como las garrapatas en animales terrestres. En esos 15 casos, la supresión de la respuesta inmune del hospedante se debe a la producción de sustancias inmunomoduladoras por parte del parásito (Wikel, S. K., et al., “Arthropod modulation of host immune responses”. En The Immunology of Host-Ectoparasitic Arthropod Relationships. Editores: Wikel, S. K., CAB Int., 1996, pág. 107130). Estas sustancias están siendo investigadas para uso como antígenos de vacuna para el control de dichos parásitos. Los piojos de mar, tal como el L. salmonis, como otros ectoparásitos artrópodos, producen sustancias
20 activas biológicamente en el sitio de unión y alimentación que limitan la respuesta inmune del hospedante. Ya que estas sustancias tienen potencial para ser usadas en una vacuna contra piojos de mar, hemos identificado una serie de dichas sustancias de L. salmonis y hemos examinado sus efectos sobre la función inmune del hospedante in vitro.
Se han identificado antígenos potenciales usando una combinación de técnicas de biología molecular, proteómica,
25 técnicas bioquímicas e inmunológicas. Por ejemplo, se ha observado un aumento en la actividad de proteasa en el mucus de salmón atlántico infectado con L. salmonis, en comparación con peces no infectados (Ross, N.W., et al., Dis Aquat Org 41: 43-51, 2000; Fast, M.D., et al., Dis Aquat Org 52: 57-68, 2002). Este aumento de actividad es debido principalmente a la aparición de una serie de proteínas de bajo peso molecular (18-24 kDa), que son producidas por L. salmonis y que fueron identificadas como tripsinas en base a la actividad, estudios de inhibición y
30 el tamaño. Se identificó actividad de tripsina en mucus de salmón infectado usando absorción por afinidad de aminobenzamidina y zimografía de proteasa (Firth, K.L., et al., J Parasitol 86: 1199-1205, 2000). Se han caracterizado varios genes que codifican para tripsina en L. salmonis y se ha determinado el sitio de expresión de tripsina (Johnson, S.C., et al., Parasitol Res 88: 789-796, 2002; Kvamme, B.O., et al., Int. J. Parasitol. 34, 823-832, 2004; Kvamme, B.O. et al., Gene 352: 63-72, 2005).
35 Se han desarrollado varias bibliotecas de ADNc a partir de las etapas de copepodito, pre-adulto y adulto de L. salmonis. Un estudio de etiqueta de secuencia expresada (EST, del inglés “expressed sequence tag”) de la biblioteca de pre-adulto dio como resultado la identificación de una serie de genes que codifican tripsina y proteasas relacionadas (que incluyen quimotripsina y otras de la familia de peptidasas S1), proteínas de choque térmico, proteínas de cutícula y enzimas metabólicas. Algunos de estos genes, tal como se describen en la presente
40 memoria, tienen utilidad como antígenos en una vacuna del piojo de mar.
La actividad de tipo tripsina es secretada por L. salmonis sobre la piel del salmón y se cree que es usada por el piojo de mar para alimentarse del mucus, la piel y la sangre del salmón, así como para proteger al piojo de mar frente a la respuesta inmune del salmón (Firth, et al., ver anterior). Se descubrió tripsina en los productos de secreción (SPs) de los piojos de mar, tras estimulación con dopamina, mediante secuenciamiento de aminoácidos usando
45 espectrometría de masas. La Tabla 1 muestra las secuencias de péptidos de tripsina secretada por L. salmonis. La protección contra tripsina de piojo de mar puede reducir el sustento del piojo, así como reducir la supresión de la respuesta inmune.
Tabla 1: Resumen de tripsina secretada por L. salmonis identificada mediante LC/MS/MS
Coincidencias de Fracción de
Ion de partida Error Secuencia de péptido
proteína de Piojo de asociac. (grupo Mr (Da) Puntuación b
(m/z) (ppm) a (Inicio-final) c
Mar nº-fracción nº)
Tripsina de Piojo de Mar 215FIDWIAEHQ223
1-2 579,80 1157,77 27 46
(tipos 1-4) (SEQ ID NO: 25) 71IAVSDITYHEK81
1-1 638,35 1274,69 38 72
(SEQ ID NO: 26) 115DQEFIGDVVVSGWGTI 3-6 920,18 1840,28 13 25 SSSGPPSPVLK141 (SEQ ID NO: 27)
Coincidencias de Fracción de
Ion de partida Error Secuencia de péptido
proteína de Piojo de asociac. (grupo Mr (Da) Puntuación b
(m/z) (ppm) a (Inicio-final) c
Mar nº-fracción nº)
SL-0903 NQYDEFESK
1-1 580,28 1158,48 46 27
de tipo vitelogenina (SEQ ID NO: 28) SL-1469 LSFEHETTEEAR
1-1 724,85 1447,66 17 24
proteína SEP 3 (SEQ ID NO: 29) IILGHEFTPGYIENR
1-2 879,98 1757,91 29 72
(SEQ ID NO: 30) IVILKELSSGM
SL-0547
1-1 604,31 1204,67 19 25 (SEQ ID NO: 31)
proteína SEP 1
+ oxidación M d AGQYGGEISGIVLPNIP
SL-0858
1-2 1248,71 2495,33 65 35 PSISNLAK
proteína SEP 2
(SEQ ID NO: 32)
a Diferencia (en partes por millón) entre la masa medida y la masa predicha a partir de la secuencia de ADN. b Puntuación de investigación MASCOTTM, las puntuaciones por encima de 21 indican identidad u homología extendida (p<0,05) c Secuencia peptídica de bromuro de cianógeno/tríptico predicha a partir de la secuencia de ADN. d + oxidación M significa que la coincidencia MASCOT se dio para un péptido que contenía un residuo de metionina oxidado.
5
La proteína de tipo vitelogenina se descubrió en los productos de secreción (SPs) de piojos de mar tras estimulación con dopamina. La vitelogenina ha sido reportada previamente como antígeno efectivo en una vacuna contra garrapatas (Tellam, R.I., et al., Vet Parasitol 103: 141-156, 2002). La inclusión de vitelogenina en una vacuna contra piojos de mar puede interferir con la fecundidad de los piojos de mar y reducir el número de nacimientos y por tanto
10 el número futuro de piojos de mar. Adicionalmente, las proteínas de tipo vitelogenina han sido implicadas en la síntesis de melanina en invertebrados (Lee, K.M. et al., Eur J Biochem 267: 3695-3703, 2000). La melanina es una molécula de defensa importante de los invertebrados.
Los genes de tipo adhesión de mejillón expresan proteínas similares a las encontradas en los filamentos bisales de mejillón usados por los mejillones para anclarse a superficies sólidas. El cómo se relacionan estos genes con la
15 infestaciones de piojos de mar es algo que aún no se comprende, pero pueden estar implicados en la producción de filamentos frontales. El filamento frontal es usado por las etapas de chalimus para unirse físicamente al hospedante (Gonzalez-Alanis, P., et al., J Parasitol 87: 561-574, 2001).
Los genes BCS-1 son expresados por los percebes cuando cambian de forma planctónica a forma pegada (Okazaki, Y., et al., Gene 250 (1-2): 127-135, 2000). Actualmente existen evidencias que sugieren que éstos son proteínas de
20 unión de cutícula. La alteración de estas proteínas mediante anticuerpos puede interferir en la muda, la integridad de la cutícula del piojo de mar y el crecimiento normal del piojo.
Las proteínas secretoras producidas por los piojos de mar pueden actuar como agentes inmunomoduladores o pueden ayudar en las actividades de alimentación sobre el hospedante (Fast, M.D., et al., Exp Parasitol. 107: 5-13, 2004; Fast, M.D., et al., J Parasitol 89: 7-13, 2003). La neutralización de estas actividades mediante anticuerpos
25 derivados de hospedantes puede afectar al crecimiento del piojo de mar y a su supervivencia sobre el salmón.
Generalmente las vacunas son más seguras que los tratamientos químicos, tanto para el pez como para el medio ambiente. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado vacunas comerciales contra el piojo de mar. El desarrollo de una vacuna ha estado dificultado por una carencia de conocimiento de las interacciones hospedantepatógeno entre el piojo de mar y sus hospedantes. Parece que existe una respuesta de anticuerpos muy limitada en 30 los hospedantes infectados de forma natural. Se han producido vacunas experimentales contra L. salmonis, particularmente a través de extractos de animal completo. Las investigaciones en el desarrollo de vacunas contra piojo de mar han estado dirigidas a proteínas inmunogénicas del piojo de mar y, en particular, a antígenos de intestino. Estas vacunas, basadas en extractos de animal completo, no han demostrado ser protectoras, aunque su administración dio como resultado cambios menores en la fecundidad del L. salmonis (Grayson T.H., et al., J Fish
35 Biol 47: 85-94, 1995). Sin embargo, este estudio particular fue un único ensayo y no se han presentado resultados adicionales de este primer grupo. También se han explorado vacunas de peces basadas en liposomas en determinadas especies de pez de aleta (Keough, Solicitud PCT WO 03/101482) pero no en combinación con antígenos de piojo de mar.
Una discusión más reciente de posibles dianas de vacunas en el intestino fue publicada por Raynard et al.; sin 40 embargo, sus estudios han tenido un éxito limitado (Raynard, R.S., et al., Pest Manag Sci 58: 569-575, 2002).
10
15
20
25
30
35
40
45
Epítopos de células T promiscuas
Los epítopos de células T promiscuas (o “epítopos PTC”) son péptidos altamente inmunogénicos que pueden caracterizarse en parte por su capacidad para unirse a varias formas isotípicas y alotípicas de moléculas de MHC humanas de clase II. Al ayudar a superar la restricción de MHC, pueden inducir respuestas de células T y anticuerpos en miembros de una población genéticamente diversa que expresa diversos haplotipos de MHC. Los epítopos de PTC pueden, por tanto, combinarse con antígenos que en sí mismos son poco inmunogénicos, para generar inmunógenos de péptido potentes. En la presente invención, dichos epítopos se incorporan a la composición para potenciar la inmunogenicidad del antígeno, y la composición general, en un amplio rango de especies.
Los epítopos de células T promiscuas pueden ser derivados de inmunógenos naturales de origen vírico y bacteriano. Los epítopos PTC naturales también pueden ser modificados conservativamente mediante adiciones, eliminaciones
o sustituciones de aminoácidos únicos o múltiples (p.ej., dentro de las clases de aminoácidos cargados, hidrofílicos/hidrofóbicos, estéricos) para obtener secuencias candidatas que pueden ser escrutadas en función de su capacidad para potenciar la inmunogenicidad.
Se pueden sintetizar epítopos PTC no naturales de forma artificial para obtener secuencias que tengan un inmunogenicidad comparable o mejor. Los epítopos PTC artificiales pueden oscilar en tamaño entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 residuos de aminoácido de longitud y pueden presentar características estructurales tales como hélices anfipáticas, que son estructuras alfa-helicoidales con residuos de aminoácido hidrofóbicos que dominan una cara de la hélice y residuos cargados o polares dominando las caras circundantes. Los epítopos PTC también pueden contener estructuras de aminoácido primarias adicionales, tales como una Gly o un residuo cargado seguido de entre dos y tres residuos hidrofóbicos, seguidos a su vez de un residuo cargado o polar (una secuencia de Rothbard). Adicionalmente, los epítopos PTC a menudo obedecen la regla 1, 4, 5, 8, donde un residuo cargado positivamente viene seguido de residuos hidrofóbicos en las posiciones cuarta, quinta y octava después del residuo cargado.
Estas características pueden incorporarse en los diseños de epítopos PTC artificiales. Las posiciones variables y los aminoácidos preferidos están disponibles para estructuras de unión a MHC (Meister et al., Vaccine, 1995; 13: 581591). Por ejemplo, el epítopo PTC degenerado descrito en WO 95/11998 como SSAL1TH1 tiene la secuencia degenerada (Asp/Glu)-(Leu/Ile/Val/Phe)-Ser-(Asp/Gly)-(Leu/Ile/Val/Phe)-(Lys/Arg)-Gly-(Leu/Ile/Val/Phe)(Leu/Ile/Val/Phe)-(Leu/Ile/Val/Phe)-His-(Lys/Arg)-Leu/Ile/Val/Phe)-(Asp/Glu)-Gly-(Leu/Ile/Val/Phe)-.
Ejemplos específicos de epítopos PTC
Los epítopos de células T promiscuas particularmente útiles son la proteína F de virus de sarampión LSEIKGVIVHRLEGV (SEQ ID NO: 33); o la secuencia del tétanos QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 34).
Los ejemplos de epítopos de células T promiscuas particularmente útiles se enumeran en la Tabla 2:
Tabla 2: Ejemplos de epítopos de células T promiscuas
- Descripción
- Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:
- Sarampión 289-302
- LSEIKGVIVHRLEGV 33
- Toxina del tétanos 830-844
- QYIKANSKFIGITEL 34
Debido a una falta de comprensión de los mecanismos y la patología sobre las infestaciones de piojos de mar en salmones, la identificación de dianas adecuadas para tratar la enfermedad no ha tenido éxito. Esto ha dificultado el progreso de la investigación en vacunas y, como tal, a pesar de la promesa y el éxito de las terapias basadas en vacunas en otras áreas de infección, aún no se ha desarrollado una vacuna contra piojo de mar adecuada. Por consiguiente, existe una necesidad de proporcionar dianas moleculares (antígenos) adecuadas efectivas, así como una vacuna contra la infección de piojos de mar.
Sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención es obviar o mitigar al menos una desventaja de los tratamientos previos contra la infección de piojo de mar en peces.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una vacuna contra la infección de copépodos caligidae en peces, comprendiendo la vacuna una cantidad inmunológicamente efectiva de antígeno. Particularmente, el copépodo caligidae es Lepeophtheirus salmonis, aunque se puede tratar la infección de cualquier copépodo. En una realización, la vacuna comprende un nucleótido o fragmento peptídico de tripsina de L. salmonis y un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
10
15
20
25
30
35
40
45
En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan secuencias de ADN y de aminoácidos que codifican antígenos para uso en la preparación de formulaciones de vacuna para el tratamiento de la infección de copépodos caligidae en peces. Las realizaciones de dichas secuencias incluyen proteínas de adhesión.
Otros aspectos de la invención incluyen un ADN que codifica proteína de adhesión 2.
Otros aspectos adicionales de la invención incluyen una secuencia de aminoácidos que codifica proteína de adhesión 2.
También se incluye una vacuna de ADN que comprende un ADN que codifica una proteína de adhesión 2 y un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto adicional es una vacuna de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica proteína de adhesión 2, y un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otros aspectos y características de la presente invención serán evidentes para los especialistas en la técnica tras revisar la siguiente descripción de realizaciones específicas de la invención, en combinación con las figuras acompañantes.
Breve descripción de las figuras
Las realizaciones de la presente invención se describen a continuación, únicamente a modo de ejemplo, haciendo referencia a las Figuras acompañantes, en donde:
Figura 1: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de tipo vitelogenina (SEQ ID NO: 1, 2).
Figura 2: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína SEP 1 (SEQ ID NO: 3, 4).
Figura 3: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína SEP 2 (SEQ ID NO: 5, 6).
Figura 4: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína SEP 3 (SEQ ID NO: 7, 8).
Figura 5: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de adhesión 2, homóloga al precursor de proteína 2 de matriz de placa adhesiva de mejillón (SEQ ID NO: 9, 10).
Figura 6: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de adhesión 1, homóloga al precursor de proteína de matriz de placa adhesiva de mejillón (proteína de pie 1) (SEQ ID NO: 11, 12).
Figura 7: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a cutícula 1, homóloga a la proteína de tipo BSC-1 (moran 9-15) (SEQ ID NO: 13, 14).
Figura 8: es un gráfico de piojos por cm de pez a lo largo de la duración del tiempo post-infección, usando vacunas (A/B = gen de tripsina de piojo de mar expresado con epítopo de células T; Y/Z = gen de tripsina de piojo de mar expresado; C = control) de la presente invención.
Figura 9: es un gráfico de piojos por gramo de pez a lo largo de la duración del tiempo post-infección, usando vacunas (A/B = gen de tripsina de piojo de mar expresado con epítopo de células T; Y/Z = gen de tripsina de piojo de mar expresado; C = control) de la presente invención.
Figura 10: muestra un gráfico de datos apilados que muestran los porcentajes de las diferentes etapas de piojo de mar presentes en peces inmunizados con la vacuna de tripsina de L. salmonis, en comparación con peces de control, para cada tiempo de muestreo.
Figura 11: muestra una secuencia parcial de ácido nucleico (SEQ ID NO: 15) de proteína de tipo vitelogenina SL-903 similar pero de mayor longitud que la de la Figura 1. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.
Figura 12: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa de la proteína SEP 1 SL-0547 (SEQ ID NO: 16). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.
Figura 13: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa putativa de la proteína SEP 2 SL-0858 (SEQ ID NO: 17). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos para la proteína. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Figura 14: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa putativa de la proteína SEP 3 SL-1469 (SEQ ID NO: 18). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos para la proteína. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.
Figura 15: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa putativa de la proteína adhesiva de mejillón SL-0927 (SEQ ID NO: 19). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos para la proteína. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.
Figura 16: muestra una secuencia de aminoácidos parcial de proteína de tipo vitelogenina SL-903 (SEQ ID NO: 20), junto con coincidencias BLASTTM de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.
Figura 17: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína SEP 1 SL-0547 (SEQ ID NO: 21), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.
Figura 18: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína SEP 2 SL-0858 (SEQ ID NO: 22), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.
Figura 19: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína SEP 3 SL-1469 (SEQ ID NO: 23), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.
Figura 20: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína adhesiva de mejillón SL-0927 (SEQ ID NO: 24), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.
Figura 21: muestra la expresión media (±SEM) del gen de interleuquina-1β, respecto a β-actina, en células SHK-1 incubadas con y sin lipopolisacárido (LPS), fracción agrupada 1 de producto secretor/excretor de L. salmonis, fracción agrupada 2 de producto secretor/excretor de L. salmonis, y fracción agrupada 3 de producto secretor/excretor de L. salmonis. * indica diferencias significativas respecto al control; † indica diferencias significativas respecto a LPS + control.
Figura 22: muestra la expresión media (±SEM) de gen de interleuquina-1β, respecto a β-actina, en células SHK-1 incubadas con y sin lipopolisacárido (LPS), LPS y disolvente de cromatografía líquida liofilizada (LC), fracción 1 de producto secretor/excretor de L. salmonis, fracción 2 de producto secretor/excretor de L. salmonis, y productos secretores/excretores de L. salmonis no fraccionados; † indica diferencias significativas respecto a LPS + control.
Descripción detallada
De forma general, la presente invención proporciona una vacuna para tratar la infección de piojo de mar en peces, particularmente la infección de L. salmonis. También se refiere a la secuencia de ADN y de aminoácidos de dianas moleculares para uso en la preparación de dicha vacuna.
Las vacunas de la presente invención han sido generadas en base a estudios llevados a cabo por nuestro grupo y otros sobre la expresión génica en piojos de mar. Varios genes del piojo de mar presentan potencial como productores de antígenos en formulaciones de vacuna diseñadas para proteger al salmón frente al piojo de mar, especialmente L. salmonis. Los genes incluyen: 1) un gen para tripsina de piojo de mar; 2) un gen que tiene una alta similitud con una proteína de tipo vitelogenina encontrada en productos de secreción; 3) un gen que tiene una alta similitud de secuencia con el gen de proteína 1 de adhesión de mejillón; 4) un gen que tiene una alta similitud de secuencia con el gen de proteína 2 de adhesión de mejillón; 5) una serie de genes que tienen una alta similitud de secuencia con el gen que codifica para la proteína BCS-1 específica de la etapa de Balanus amphrite; y 6) genes que codifican para tres productos de secreción (SP) proteínicos en el piojo de mar que, a fecha actual, no tienen una similitud significativa con ninguna proteína conocida en las bases de datos públicos.
Tal como se usa en la presente memoria, un “antígeno” se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos que estimulan un sistema inmune del hospedante para producir una respuesta humoral y/o celular específica de antígeno. El término también se usa en la presente memoria de forma intercambiable con “inmunógeno”.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “epítopo” se refiere al sitio sobre un antígeno o hapteno al cual se une una molécula de anticuerpo específica. El término también se usa en la presente memoria de forma intercambiable con “determinante antigénico” o “sitio determinante antigénico”.
Las Figuras 1 a 6 muestran las secuencias de los genes de la presente invención descritas anteriormente y secuenciadas en nuestro laboratorio, con la excepción de la tripsina, de la cual se ha publicado la secuencia de ácido nucleico (Johnson, 2002, ver anterior). Nosotros hemos identificado el producto génico de la tripsina en las
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
secreciones del piojo de mar mediante secuenciamiento de aminoácidos usando espectrometría de masas. Dichos genes fueron seleccionados e investigados en base a una comprensión previa de su función putativa.
Las Figuras 11 a 20 muestran secuencias de nucleótidos y aminoácidos de longitud completa putativas o de mayor longitud de los genes y proteínas descritos en la presente memoria.
Los antígenos derivados de L. salmonis deberían proporcionar protección para el pez frente a otras especies de piojo de mar, ya que probablemente usen métodos altamente conservados para fijarse y que les permitan alimentarse con éxito del hospedante.
Los adyuvantes que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen adyuvantes MontanideTM ISA e IMS (Seppic, París, Francia), otros adyuvantes de aceite-en-agua, agua-en-aceite y agua-en-aceite-en-agua, adyuvantes de Ribi (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), TiterMax de Hunter (CytRx Corp., Norcross, GA), adyuvantes de sales de aluminio, proteínas adsorbidas en nitrocelulosa, antígenos encapsulados, adyuvantes que contienen nanopartículas. Los adyuvantes preferidos incluyen Seppic Montanide 720, Montanide IMS111x, Montanide IMS131x, Montanide IMS221x, Montanide IMS301x, Montanide ISA206, Montanide ISA207, Montanide ISA25, Montanide ISA27, Montanide ISA28, Montanide ISA35, Montanide ISA50A, Montanide ISA563, Montanide ISA70, Montanide ISA51, Montanide ISA720, Montanide ISA264. Los adyuvantes particularmente preferidos incluyen Montanide ISA740, Montanide ISA773, Montanide ISA708, Montanide ISA266. El adyuvante recomendado es Montanide ISA763.
Los datos procedentes de estudios que usan las vacunas de la presente invención para el tratamiento de la infección de piojos de mar se proporcionan en la presente memoria a través de los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 1
Se expuso salmones a tripsina de L. salmonis como antígeno. Los peces fueron inmunizados con dos grupos de formulación de vacuna de tripsina: A/B (tripsina de piojo de mar recombinante con un epítopo de célula T) e Y/Z (solo tripsina de piojo de mar recombinante). A determinados peces se les administró una vacuna de control, C, que contenía solamente adyuvante. La protección del pez es evidente en los días 6, 11 y 20 (Figuras 8 y 9). El número de piojos de mar por cm y por gramo de pez se reduce en los peces vacunados en comparación a los controles. La formulación de vacuna A/B dio como resultado un menor número de piojos que la formulación Y/Z, lo que demuestra que la inclusión de epítopos de células T con antígenos de piojos de mar proporciona una protección adicional frente a los piojos de mar.
La Figura 10 muestra los resultados de datos apilados de los experimentos de exposición y vacunación. La formulación de vacuna A/B (tripsina de piojo de mar recombinante con un epítopo de célula T) parece que frenó el desarrollo de L. salmonis, ya que en los días 6, 11 y 20 había menores porcentajes de piojos que habían mudado a una etapa más avanzada en comparación con los peces de control.
EJEMPLO 2
Cromatografía de exclusión de tamaño y determinación de proteínas
Los productos secretores excretores liofilizados (SEPs) fueron reconstituidos con acetato de amonio (AMA) 1,0 M (pH 6,0). Se usó un HPLC Agilent 1100 equipado con un detector de diodos (monitorizando a 230 y 256 nm) y una columna Taso Haas (G3000PWX2, 6 μm dp (7,8 mm x 300 mm)) para separar las proteínas/péptidos de las secreciones. A continuación dichas muestras fueron fraccionadas usando un colector de fracciones Waters según los intervalos de tiempo. Las fracciones mostradas en la Tabla 1 fueron recogidas durante 6 experimentos separados de HPLC y se agruparon para cada intervalo de tiempo. A continuación estas muestras fueron secadas por congelación (-80ºC) antes de realizar la determinación de proteínas. La columna se mantuvo a temperatura ambiente y se eluyó isocráticamente con AMA:acetonitrilo (ACN) 98:2 durante 30 minutos a 0,2 mL·min-1 . Se analizaron disoluciones patrón de albúmina de suero bovino (BSA) (20 μg, 2,0 μg y 0,2 μg), SW + DA y tripsina bovina (40 μg) como controles para la comparación de picos con SEPs.
Las concentraciones de proteína de fracciones secretoras de L. salmonis fueron determinadas usando un método de unión a colorante (Bradford, M.M. Anal Biochem 72: 248-254, 1976). Todos los ensayos fueron analizados en un lector de microplacas ThermomaxTM (Molecular Devices). Las muestras fueron reconstituidas en ddH2O y a continuación, tras la determinación de proteínas, fueron separadas por igual entre ensayos funcionales basados en células y análisis proteómico.
Cultivo de células SHK
Se cultivaron células SHK-1 a 18ºC en matraces tratados con cultivo de tejido de 75 cm2 (Costar), en medio L-15 (con 300 mg/L de L-glutamina) suplementados con 500 μL de sulfato de gentamicina (50 mg/mL destilado en agua), 365 μL de 2-mercaptoetanol (55 mM en D-PBS) y 5% de suero fetal bovino (FBS), tal como se describe en Fast et al., 2004, ver anterior. Todos los componentes del medio fueron adquiridos en Gibco. Los matraces confluentes fueron sometidos a pasaje semanalmente dividiendo las células y el medio uniformemente entre dos matraces y
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
añadiendo un volumen igual de medio nuevo a cada matraz. Las células usadas en este estudio fueron sometidas a pasaje entre 64 y 68 veces.
Las células SHK-1 fueron sembradas a aproximadamente 4 x 106 células/matraz en medio L-15 suplementado como se ha indicado anteriormente. La estimulación celular siguió el mismo procedimiento indicado por Fast, M.D. et al. Dev. Comp. Immunol. 29: 951-963, 2005. Resumidamente, después de un periodo de 48 h para permitir que cualquier expresión génica inducida por la manipulación volviera a niveles constitutivos, se eliminó el medio y se añadieron 20 mL de medio nuevo. Se añadió lipopolisacárido (LPS) a todos los matraces, excepto a los controles, para obtener una concentración final de 5 μg/mL.
En el primer ensayo, las fracciones SEP fueron reunidas en 3 grupos (Tabla 1), cada una con iguales intervalos de tiempo (10 minutos) y volúmenes procedentes de la cromatografía de exclusión de tamaño. Esto dio como resultado que se añadieran a cada matraz 13 μg de proteína (fracción agrupada 1), 8,0 μg de proteína (fracción agrupada 2) y <0,1 μg de proteína (fracción agrupada 3). Estas incubaciones fueron llevadas a cabo durante 4 h a 18ºC antes de retirar el medio y almacenar las células en ARN, después a -80ºC hasta la extracción de ARN. Este ensayo se repitió dos veces con matraces triplicados para cada condición.
En el segundo ensayo, se añadieron las fracciones SEP 1 y 2 procedentes de la fracción agrupada 1 (Tabla 1) a 1,0 y 1,4 μg por matraz, respectivamente. Estas concentraciones se obtuvieron tras concentrar 4 experimentos de exclusión de tamaño para cada fracción. Para evaluar cualquier efecto de disolvente residual sobre el ensayo basado en células, en el experimento se incluyeron como controles 4 blancos de AMA sometidos al mismo tratamiento. Finalmente, los SEPs no fraccionados usados en las incubaciones de macrófagos fueron incubados aquí a la misma concentración (660 ng). Estas incubaciones se llevaron a cabo por triplicado y siguieron el mismo procedimiento que en el primer ensayo.
PCR en tiempo real de genes de salmón atlántico
Se aisló ARN total de células SHK-1 almacenadas en RNAlaterTM con el kit NucleospinTM RNA II (Clontech) y se midió la concentración en un espectrofotómetro. Las muestras de ARN fueron sometidas a PCR para verificar la ausencia de contaminación de ADN. Se diseñaron las secuencias para cebadores de PCR en tiempo real, se evaluaron y los productos fueron secuenciados como se ha descrito previamente en Fast et al., ver anterior (2004; 2005). Se llevó a cabo la PCR cuantitativa en tiempo real usando un sistema de detección en tiempo real iCycler iQTM y kits SYBR verdes (Bio-Rad) también descritos previamente por Fast et al., ver anterior (2004; 2005). Para asegurar que no se había añadido contaminación de ADN genómico al ADNc cuantificado, se realizaron controles no en tiempo real para cada elemento aislado de ARN con PCR y se observó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5%.
El perfil de PCR fue como se indica a continuación: una etapa inicial de desnaturalización de 3 minutos a 95ºC, seguida de 40 ciclos de desnaturalización (30 s a 95ºC), maduración (30 s a 58ºC) y extensión (30 s a 72ºC), y finalizar con una etapa de extensión final de 72ºC durante 5 minutos. La sensibilidad de las reacciones y la amplificación de productos contaminantes tales como dímeros cebadores, detectados indiscriminadamente mediante SYBR verde (es decir, el SYBR verde se une a todos los ADN de doble hélice), fueron evaluados amplificando diluciones 1 a 10 de los clones (10-2 a 10-8 ng) y muestras duplicadas, así como llevando a cabo un blanco sin ADNc con cada experimento. La relación entre el ciclo umbral (Ct) y el log (ARN) fue lineal (-3,5<pendiente<-3,2) para todas las reacciones. Los números de copias fueron estimados en base al peso molecular de los clones y la DO 260.
Actividad inmunomoduladora de proteínas SEP
Las SEPs fueron fraccionadas en función del tamaño y las fracciones fueron agrupadas. En el primer ensayo (Figura 21), las fracciones agrupadas (PF1, PF2, PF3) fueron incubadas con células SHK-1 (una línea celular de tipo macrófago de salmón) en combinación con lipopolisacáridos (LPS) y se monitorizó la expresión del gen de interleuquina 1β con el objetivo de determinar el efecto inmunomodulador de las proteínas SEP fraccionadas sobre la expresión génica inmune. El gen de interleuquina 1β fue reducido en expresión por las tres fracciones agrupadas en comparación con células estimuladas solo con LPS (Figura 21). Cuando se evaluaron las fracciones individuales que contenían proteínas, la expresión de gen de interleuquina 1β fue reducida por la fracción 2. El análisis LC-MS mostró que la Fracción 2 del grupo 1 contenía la proteína SEP 1, la proteína SEP 2 y tripsina. En la Figura 22 se muestran evidencias de la actividad inmunomoduladora de SEP, que contiene todas las proteínas descritas, en donde se observa un descenso significativo de la expresión inducida por LPS de interleuquina 1β en presencia de SEPs totales.
Las realizaciones descritas anteriormente de la presente invención pretenden ser meramente ejemplos. Los especialistas en la técnica pueden efectuar alteraciones, modificaciones y variaciones de las realizaciones particulares sin separarse del alcance de la invención, que queda definido exclusivamente por las reivindicaciones anexas al presente documento.
Claims (6)
-
imagen1 REIVINDICACIONES1. Un ADN que codifica un antígeno proteínico para uso en el tratamiento de infección de copépodos caligidae en peces, en donde el ADN consiste en la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 9.5 2. El ADN según la reivindicación 1, en donde el copépodo caligidae es Lepeophtheirus salmonis. -
- 3.
- Un ADN que codifica un antígeno proteínico, comprendiendo el ADN una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 9.
-
- 4.
- El ADN según la reivindicación 3 para uso en la prevención de infección de copépodo caligidae en peces.
- 5. Una proteína recombinante purificada para uso en la prevención de infección de copépodo caligidae en peces, 10 proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
-
- 6.
- Una proteína recombinante purificada para uso según la reivindicación 5, en donde el copépodo caligidae es Lepeophtheirus salmonis.
-
- 7.
- Una proteína recombinante purificada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
1531
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US59162604P | 2004-07-28 | 2004-07-28 | |
US591626P | 2004-07-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2575156T3 true ES2575156T3 (es) | 2016-06-24 |
Family
ID=35785878
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES11171430.9T Active ES2548677T3 (es) | 2004-07-28 | 2005-07-28 | Vacunas recombinantes contra copépodos caligidos (piojos de mar) y secuencias de antígeno de las mismas |
ES11171461.4T Active ES2575156T3 (es) | 2004-07-28 | 2005-07-28 | Vacunas recombinantes contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES11171430.9T Active ES2548677T3 (es) | 2004-07-28 | 2005-07-28 | Vacunas recombinantes contra copépodos caligidos (piojos de mar) y secuencias de antígeno de las mismas |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8207132B2 (es) |
EP (8) | EP2402445A1 (es) |
CA (1) | CA2575218C (es) |
CL (1) | CL2011002334A1 (es) |
DK (2) | DK2405003T3 (es) |
ES (2) | ES2548677T3 (es) |
NO (1) | NO342565B1 (es) |
PL (1) | PL2397553T3 (es) |
PT (1) | PT2397553E (es) |
WO (1) | WO2006010265A1 (es) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW200801034A (en) * | 2005-10-05 | 2008-01-01 | Intervet Int Bv | Novel sea lice vaccine |
WO2007146359A2 (en) * | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Diversa Corporation | Sea lice antigen vaccines |
CU23634A1 (es) | 2007-05-31 | 2011-02-24 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Secuencias de ácido nucleico y aminoácidos, y vacuna para el control de infestaciones por ectoparásitos en peces |
CA2705544A1 (en) | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Calanus As | Bioactive copepod-compositions, processes for the production thereof, and use thereof to prevent or treat hosts infested by phylogenetically similar ectoparasites |
CA2873599A1 (en) * | 2012-05-17 | 2013-11-21 | Tecnovax Chile S.A. | Peptides inducing an immune response against copepods and/or the development of a mucous shield in fish; vaccines, uses and methods for modulating the fish immune response and/or for inducing development of a mucous shield in fish |
NO343281B1 (en) * | 2016-12-30 | 2019-01-14 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
WO2017213521A1 (en) * | 2016-06-10 | 2017-12-14 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin |
NO343723B1 (en) * | 2016-06-10 | 2019-05-20 | Aqua Health As | Peptides for the inhibition of trypsin and sea lice infestation. |
EP3743100A1 (en) | 2018-01-25 | 2020-12-02 | Benchmark Animal Health Limited | Sea lice antigens and vaccines |
GB201902425D0 (en) | 2019-02-22 | 2019-04-10 | Benchmark Animal Health Ltd | Sea lice antigens and vaccines |
EP3920964A1 (en) * | 2019-02-04 | 2021-12-15 | Benchmark Animal Health Limited | Sea lice vaccines |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0332660A4 (en) | 1986-11-24 | 1990-12-05 | Genex Corporation | Bioadhesives |
EP0725838A4 (en) | 1993-10-26 | 1997-02-26 | United Biomedical Inc | STRUCTURED SYNTHETIC ANTIGAN BANKS AS DIAGNOSTICS, VACCINE AND THERAPEUTIC AGENTS |
JPH07163361A (ja) | 1993-12-14 | 1995-06-27 | Kaiyo Bio Technol Kenkyusho:Kk | ムラサキイガイ接着蛋白質遺伝子 |
US6248329B1 (en) * | 1998-06-01 | 2001-06-19 | Ramaswamy Chandrashekar | Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof |
US20020013955A1 (en) * | 1998-06-10 | 2002-01-31 | Sharon Ogden | Production of recombinant protein in transgenic fish |
AU2003229199A1 (en) | 2002-05-31 | 2003-12-19 | Alpharma As | Liposome vaccine formulations for fin-fish |
GB0513484D0 (en) | 2005-07-01 | 2005-08-10 | Accentus Plc | Producing liquid hydrocarbons |
TW200801034A (en) * | 2005-10-05 | 2008-01-01 | Intervet Int Bv | Novel sea lice vaccine |
-
2005
- 2005-07-28 US US11/572,719 patent/US8207132B2/en active Active
- 2005-07-28 EP EP11171453A patent/EP2402445A1/en not_active Withdrawn
- 2005-07-28 EP EP11171467A patent/EP2405004A1/en not_active Withdrawn
- 2005-07-28 EP EP11171461.4A patent/EP2397553B1/en active Active
- 2005-07-28 ES ES11171430.9T patent/ES2548677T3/es active Active
- 2005-07-28 EP EP11171430.9A patent/EP2405003B1/en active Active
- 2005-07-28 WO PCT/CA2005/001178 patent/WO2006010265A1/en active Application Filing
- 2005-07-28 DK DK11171430.9T patent/DK2405003T3/en active
- 2005-07-28 DK DK11171461.4T patent/DK2397553T3/en active
- 2005-07-28 PT PT111714614T patent/PT2397553E/pt unknown
- 2005-07-28 CA CA2575218A patent/CA2575218C/en active Active
- 2005-07-28 EP EP11171441A patent/EP2397552A1/en not_active Withdrawn
- 2005-07-28 EP EP11171451A patent/EP2410055A1/en not_active Withdrawn
- 2005-07-28 ES ES11171461.4T patent/ES2575156T3/es active Active
- 2005-07-28 PL PL11171461T patent/PL2397553T3/pl unknown
- 2005-07-28 EP EP05770065.0A patent/EP1789554B1/en active Active
- 2005-07-28 EP EP11171518A patent/EP2407542A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-02-28 NO NO20071143A patent/NO342565B1/no not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-09-21 CL CL2011002334A patent/CL2011002334A1/es unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2410055A1 (en) | 2012-01-25 |
EP2405003B1 (en) | 2015-09-02 |
PT2397553E (pt) | 2016-06-08 |
EP2397552A1 (en) | 2011-12-21 |
PL2397553T3 (pl) | 2017-03-31 |
EP1789554A1 (en) | 2007-05-30 |
DK2405003T3 (en) | 2015-09-21 |
NO342565B1 (no) | 2018-06-18 |
NO20071143L (no) | 2007-02-28 |
EP2402445A1 (en) | 2012-01-04 |
US20080003233A1 (en) | 2008-01-03 |
EP2407542A1 (en) | 2012-01-18 |
CA2575218A1 (en) | 2006-02-02 |
EP1789554A4 (en) | 2009-05-06 |
EP2397553A1 (en) | 2011-12-21 |
US8207132B2 (en) | 2012-06-26 |
ES2548677T3 (es) | 2015-10-20 |
CA2575218C (en) | 2013-07-09 |
CL2011002334A1 (es) | 2012-03-30 |
WO2006010265A1 (en) | 2006-02-02 |
EP1789554B1 (en) | 2018-07-04 |
DK2397553T3 (en) | 2016-06-13 |
EP2405004A1 (en) | 2012-01-11 |
EP2405003A1 (en) | 2012-01-11 |
EP2397553B1 (en) | 2016-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2575156T3 (es) | Vacunas recombinantes contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas | |
Dalton et al. | Parasite vaccines—a reality? | |
Smith et al. | Developments and hurdles in generating vaccines for controlling helminth parasites of grazing ruminants | |
Smith | Prospects for vaccines of helminth parasites of grazing ruminants | |
Hewitson et al. | Vaccination against helminth parasite infections | |
Carpio et al. | Novel gene isolated from Caligus rogercresseyi: a promising target for vaccine development against sea lice | |
Hess et al. | Vaccines to combat river blindness: expression, selection and formulation of vaccines against infection with Onchocerca volvulus in a mouse model | |
He et al. | Protection of goldfish against Ichthyophthirius multifiliis by immunization with a recombinant vaccine | |
ES2287954T3 (es) | Vacuna que contiene una peroxirredoxina. | |
US9034339B2 (en) | Nucleic acid and amino acid sequences, and vaccine for the control of ectoparasite infestations in fish | |
DK202170436A1 (en) | Sea Lice Vaccines | |
US20220088160A1 (en) | Sea lice antigens and vaccines | |
US20210061866A1 (en) | Sea lice antigens and vaccines | |
Spithill | Control of tissue parasites. III. Trematodes | |
WO2014020218A1 (es) | Vacuna frente a infestaciones provocadas por artrópodos hematófagos | |
BG99888A (bg) | Приложението на антихелминтни ваксини при лечение на паразитно заболяване,свързано със загуба на естествения имунитет | |
Kumar et al. | Immunoprophylactic Control Strategy for Tropical Fasciolosis: A Possibility | |
BR102019021511A2 (pt) | Método de produção de proteínas recombinantes do toxocara canis, visadas como vacina para controle da toxocaríase canina | |
Gislefoss et al. | Identification and characterization of two salmon louse (Lepeophtheirus salmonis, Krøyer, 1838) heme peroxidases and their potential as vaccine antigens |