ES2575156T3

ES2575156T3 - Vacunas recombinantes contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas

Info

Publication number: ES2575156T3
Application number: ES11171461.4T
Authority: ES
Inventors: Neil W Ross; Stewart C Johnson; Mark D Fast; Kathryn Vanya Ewart
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2004-07-28
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2016-06-24
Anticipated expiration: 2025-07-28
Also published as: DK2405003T3; CA2575218C; CL2011002334A1; EP2397553A1; DK2397553T3; EP2405003B1; PL2397553T3; EP2397553B1; EP2397552A1; EP2407542A1; EP2402445A1; EP2410055A1; US8207132B2; ES2548677T3; PT2397553E; NO20071143L; EP1789554B1; EP2405003A1; US20080003233A1; WO2006010265A1

Abstract

Un ADN que codifica un antígeno proteínico para uso en el tratamiento de infección de copépodos caligidae en peces, en donde el ADN consiste en la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 9.

Description

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DESCRIPCIÓN

Vacunas recombinantes contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas

Campo técnico

La presente invención se refiere de forma general a vacunas para salmones. Más particularmente, la presente invención se refiere a vacunas contra copépodos caligidae (piojo de mar) y sus secuencias antigénicas.

Antecedentes de la invención

Una serie de especies estrechamente relacionadas entre sí de copépodos parasitarios de la familia Caligidae (copépodos caligidae) infectan y producen enfermedades en la cría de peces. Colectivamente, dichas especies se denominan piojos de mar. Existen tres géneros principales de piojos de mar: Pseudocaligus, Caligus y Lepeophtheirus. En relación a la producción de salmones por todo el hemisferio norte, una especie, el piojo del salmón (Lepeophtheirus salmonis), es responsable de la mayoría de los brotes de enfermedad en granjas de salmónidos. Este parásito es responsable de pérdidas directas e indirectas en acuicultivos por más de 100 millones de dólares de EE.UU. cada año (Johnson, S.C., et al., Zool. Studies 43: 8-19, 2004). Todas las etapas de desarrollo de los piojos de mar, unidos al hospedante, se alimentan del mucus, la piel y la sangre del hospedante. La unión y las actividades de alimentación de los piojos de mar dan como resultado lesiones que varían en naturaleza y gravedad dependiendo de: la especie de piojo de mar, su abundancia, las etapas de desarrollo presentes y la especie del hospedante (Johnson, S.C., et al., “Interactions between sea lice and their hosts”. En Host-Parasite Interactions. Editores: G. Wiegertjes y G. Flick, Garland Science/Bios Science Publications, 2004, pág. 131-160). En el hemisferio sur, el Caligus rogercresseyi es el caligidae que más afecta a la industria de cría de salmón en Chile (González, L. y Carvajal, J. Aquaculture 220: 101-117, 2003).

Los copépodos caligidae presentan ciclos vitales directos que consisten en dos etapas de nauplius planctónicas de vida libre, una etapa de copepodito infeccioso de natación libre, de cuatro a seis etapas de fijación chalimus, una o dos etapas preadultas, y una etapa adulta (Kabata, Z., Libro 1: Crustacea as enemies of fishes. En: Diseases of Fishes, Editores: Snieszko, S.F. y Axelrod, H.R.; Nueva York, T.F.H. Publications, 1970, pág. 171). Cada una de estas etapas de desarrollo viene separada por una muda. Una vez alcanzada la etapa adulta, los copépodos caligidae no sufren mudas adicionales. En el caso del L. salmonis, los huevos eclosionan en la primera etapa de nauplius de natación libre, que viene seguida por una segunda etapa de nauplius, y después por la etapa de copepodito infeccioso. Una vez que el copepodito se localiza en un pez hospedante adecuado, continúa su desarrollo a través de cuatro etapas de chalimus, la primera y segunda etapas de pre-adulto y después una etapa final de adulto (Schram, T.A. “Supplemental descriptions of the developmental stages of Lepeophtheirus salmonis (Krøyer, 1837) (Copepoda: Caligidae)”. En: Pathogens of Wild and Farmed Fish: Sea Lice. Editores: Boxshall, G.A. y Defaye, D., 1993, pág. 30-50). Las mudas se caracterizan por cambios graduales según va creciendo el animal y se ve sometido a modificaciones físicas que le permiten vivir como parásito de movimiento libre, alimentarse y reproducirse sobre la superficie del pez.

Los copépodos caligidae (piojos de mar) se alimentan del mucus, la piel y la sangre de sus hospedantes, lo que produce lesiones que varían en gravedad en función de la(s) etapa(s) de desarrollo de los copépodos presentes, del número de copépodos presentes, de su(s) sitio(s) de fijación y de la especie del hospedante. En situaciones de enfermedad grave, tal como las observadas en el salmón atlántico (Salmo salar) cuando es infectado por un número elevado de L. salmonis, se pueden observar grandes áreas de erosión cutánea y hemorragias sobre la cabeza y el cuello, y un área distintiva de erosión y hemorragia sub-epidérmica en el región perianal (Grimnes, A. et al. J. Fish Biol. 48: 1179-1194, 1996). Los piojos de mar pueden producir cambios fisiológicos en sus hospedantes que incluyen el desarrollo de una respuesta de estrés, una función inmunitaria reducida, un fallo osmorregulador y la muerte, si no son tratados (Johnson et al., ver anterior).

Existen varias estrategias de manejo que han sido usadas para reducir la intensidad de las plagas de copépodos caligidae (piojos de mar). Éstas incluyen: barbecho de los sitios antes de la reposición, separación de clase anual y selección de sitios de granja para evitar áreas en las que hay densidades elevadas de hospedantes silvestres u otras condiciones ambientales adecuadas para el establecimiento del piojo de agua (Pike, A.W. et al., Adv Parasitol

44: 233-337, 1999). Aunque el uso de estas estrategias puede reducir en algunos casos las tasas de infección de piojos de mar, su uso de forma individual o colectiva no ha sido efectivo para eliminar la infección.

Se han usado una variedad de productos químicos y fármacos para controlar los piojos de mar. Dichos productos químicos fueron diseñados para el control de plagas y parásitos terrestres de plantas y animales domésticos. Incluyen compuestos tales como peróxido de hidrógeno, organofosfatos (p.ej., diclorvos y azametifos), ivermectina (y compuestos relacionados, tales como benzoato de emamectina), reguladores de la muda de insectos y piretrinas (MacKinnon, B.M., World Aquaculture 28: 5-10, 1997; Stone J., et al., J. Fish Dis. 22: 261-270, 1999). Los tratamientos de piojos de mar se pueden clasificar en aquellos administrados mediante el baño (p.ej., organofosfatos, piretrinas) y aquellos administrados oralmente (p.ej., ivermectina). Los tratamientos de baño para el control de piojo de mar son dificultosos, caros de aplicar y pueden tener efectos significativos sobre el crecimiento de los peces después de los tratamientos (MacKinnon, ver anterior). Los productos químicos usados en los tratamientos

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de baño no son necesariamente efectivos contra todas las etapas de piojo de mar que se dan en los peces. Actualmente, el uso de tratamientos orales tales como SLICE® (benzoato de emamectina) es el predominante en la industria de los salmónidos. Al contrario que los productos químicos administrados en los tratamientos de baño, SLICE® proporciona una protección a corto plazo contra la re-infección. Este tratamiento, aunque más sencillo de 5 aplicar que los tratamientos de baño, sigue siendo caro y, como los tratamientos de baño, requiere de un periodo de retirada antes de que los animales puedan ser sacrificados para consumo humano (Stone, ver anterior). Como se ha visto en plagas y parásitos terrestres, no hay evidencia del desarrollo de resistencia en L. salmonis frente a estos tratamientos, especialmente en poblaciones tratadas frecuentemente (Denholm, I., Pest Manag Sci 58: 528-536, 2002). Para reducir los costes asociados a los tratamientos de piojos de mar, y para eliminar los riesgos ambientales

10 asociados a dichos tratamientos, se necesitan nuevos métodos de control del piojo de mar, tales como vacunas.

Un rasgo característico de los sitios de unión y alimentación de los copépodos caligidae sobre muchos de sus hospedantes es la falta de respuesta inmune del hospedante (Johnson et al., ver anterior; Jones, M.W., et al., J Fish Dis 13: 303-310, 1990; Jónsdóttir, H., et al., J Fish Dis 15: 521-527, 1992). Esta carencia de respuesta inmune es similar a la reportada para otros parásitos artrópodos tales como las garrapatas en animales terrestres. En esos 15 casos, la supresión de la respuesta inmune del hospedante se debe a la producción de sustancias inmunomoduladoras por parte del parásito (Wikel, S. K., et al., “Arthropod modulation of host immune responses”. En The Immunology of Host-Ectoparasitic Arthropod Relationships. Editores: Wikel, S. K., CAB Int., 1996, pág. 107130). Estas sustancias están siendo investigadas para uso como antígenos de vacuna para el control de dichos parásitos. Los piojos de mar, tal como el L. salmonis, como otros ectoparásitos artrópodos, producen sustancias

20 activas biológicamente en el sitio de unión y alimentación que limitan la respuesta inmune del hospedante. Ya que estas sustancias tienen potencial para ser usadas en una vacuna contra piojos de mar, hemos identificado una serie de dichas sustancias de L. salmonis y hemos examinado sus efectos sobre la función inmune del hospedante in vitro.

Se han identificado antígenos potenciales usando una combinación de técnicas de biología molecular, proteómica,

25 técnicas bioquímicas e inmunológicas. Por ejemplo, se ha observado un aumento en la actividad de proteasa en el mucus de salmón atlántico infectado con L. salmonis, en comparación con peces no infectados (Ross, N.W., et al., Dis Aquat Org 41: 43-51, 2000; Fast, M.D., et al., Dis Aquat Org 52: 57-68, 2002). Este aumento de actividad es debido principalmente a la aparición de una serie de proteínas de bajo peso molecular (18-24 kDa), que son producidas por L. salmonis y que fueron identificadas como tripsinas en base a la actividad, estudios de inhibición y

30 el tamaño. Se identificó actividad de tripsina en mucus de salmón infectado usando absorción por afinidad de aminobenzamidina y zimografía de proteasa (Firth, K.L., et al., J Parasitol 86: 1199-1205, 2000). Se han caracterizado varios genes que codifican para tripsina en L. salmonis y se ha determinado el sitio de expresión de tripsina (Johnson, S.C., et al., Parasitol Res 88: 789-796, 2002; Kvamme, B.O., et al., Int. J. Parasitol. 34, 823-832, 2004; Kvamme, B.O. et al., Gene 352: 63-72, 2005).

35 Se han desarrollado varias bibliotecas de ADNc a partir de las etapas de copepodito, pre-adulto y adulto de L. salmonis. Un estudio de etiqueta de secuencia expresada (EST, del inglés “expressed sequence tag”) de la biblioteca de pre-adulto dio como resultado la identificación de una serie de genes que codifican tripsina y proteasas relacionadas (que incluyen quimotripsina y otras de la familia de peptidasas S1), proteínas de choque térmico, proteínas de cutícula y enzimas metabólicas. Algunos de estos genes, tal como se describen en la presente

40 memoria, tienen utilidad como antígenos en una vacuna del piojo de mar.

La actividad de tipo tripsina es secretada por L. salmonis sobre la piel del salmón y se cree que es usada por el piojo de mar para alimentarse del mucus, la piel y la sangre del salmón, así como para proteger al piojo de mar frente a la respuesta inmune del salmón (Firth, et al., ver anterior). Se descubrió tripsina en los productos de secreción (SPs) de los piojos de mar, tras estimulación con dopamina, mediante secuenciamiento de aminoácidos usando

45 espectrometría de masas. La Tabla 1 muestra las secuencias de péptidos de tripsina secretada por L. salmonis. La protección contra tripsina de piojo de mar puede reducir el sustento del piojo, así como reducir la supresión de la respuesta inmune.

Tabla 1: Resumen de tripsina secretada por L. salmonis identificada mediante LC/MS/MS

Coincidencias de Fracción de

Ion de partida Error Secuencia de péptido

proteína de Piojo de asociac. (grupo Mr (Da) Puntuación b

(m/z) (ppm) a (Inicio-final) c

Mar nº-fracción nº)

Tripsina de Piojo de Mar 215FIDWIAEHQ223

1-2 579,80 1157,77 27 46

(tipos 1-4) (SEQ ID NO: 25) 71IAVSDITYHEK81

1-1 638,35 1274,69 38 72

(SEQ ID NO: 26) 115DQEFIGDVVVSGWGTI 3-6 920,18 1840,28 13 25 SSSGPPSPVLK141 (SEQ ID NO: 27)

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Coincidencias de Fracción de

Ion de partida Error Secuencia de péptido

proteína de Piojo de asociac. (grupo Mr (Da) Puntuación b

(m/z) (ppm) a (Inicio-final) c

Mar nº-fracción nº)

SL-0903 NQYDEFESK

1-1 580,28 1158,48 46 27

de tipo vitelogenina (SEQ ID NO: 28) SL-1469 LSFEHETTEEAR

1-1 724,85 1447,66 17 24

proteína SEP 3 (SEQ ID NO: 29) IILGHEFTPGYIENR

1-2 879,98 1757,91 29 72

(SEQ ID NO: 30) IVILKELSSGM

SL-0547

1-1 604,31 1204,67 19 25 (SEQ ID NO: 31)

proteína SEP 1

+ oxidación M d AGQYGGEISGIVLPNIP

SL-0858

1-2 1248,71 2495,33 65 35 PSISNLAK

proteína SEP 2

(SEQ ID NO: 32)

a Diferencia (en partes por millón) entre la masa medida y la masa predicha a partir de la secuencia de ADN. b Puntuación de investigación MASCOTTM, las puntuaciones por encima de 21 indican identidad u homología extendida (p<0,05) c Secuencia peptídica de bromuro de cianógeno/tríptico predicha a partir de la secuencia de ADN. d + oxidación M significa que la coincidencia MASCOT se dio para un péptido que contenía un residuo de metionina oxidado.

5

La proteína de tipo vitelogenina se descubrió en los productos de secreción (SPs) de piojos de mar tras estimulación con dopamina. La vitelogenina ha sido reportada previamente como antígeno efectivo en una vacuna contra garrapatas (Tellam, R.I., et al., Vet Parasitol 103: 141-156, 2002). La inclusión de vitelogenina en una vacuna contra piojos de mar puede interferir con la fecundidad de los piojos de mar y reducir el número de nacimientos y por tanto

10 el número futuro de piojos de mar. Adicionalmente, las proteínas de tipo vitelogenina han sido implicadas en la síntesis de melanina en invertebrados (Lee, K.M. et al., Eur J Biochem 267: 3695-3703, 2000). La melanina es una molécula de defensa importante de los invertebrados.

Los genes de tipo adhesión de mejillón expresan proteínas similares a las encontradas en los filamentos bisales de mejillón usados por los mejillones para anclarse a superficies sólidas. El cómo se relacionan estos genes con la

15 infestaciones de piojos de mar es algo que aún no se comprende, pero pueden estar implicados en la producción de filamentos frontales. El filamento frontal es usado por las etapas de chalimus para unirse físicamente al hospedante (Gonzalez-Alanis, P., et al., J Parasitol 87: 561-574, 2001).

Los genes BCS-1 son expresados por los percebes cuando cambian de forma planctónica a forma pegada (Okazaki, Y., et al., Gene 250 (1-2): 127-135, 2000). Actualmente existen evidencias que sugieren que éstos son proteínas de

20 unión de cutícula. La alteración de estas proteínas mediante anticuerpos puede interferir en la muda, la integridad de la cutícula del piojo de mar y el crecimiento normal del piojo.

Las proteínas secretoras producidas por los piojos de mar pueden actuar como agentes inmunomoduladores o pueden ayudar en las actividades de alimentación sobre el hospedante (Fast, M.D., et al., Exp Parasitol. 107: 5-13, 2004; Fast, M.D., et al., J Parasitol 89: 7-13, 2003). La neutralización de estas actividades mediante anticuerpos

25 derivados de hospedantes puede afectar al crecimiento del piojo de mar y a su supervivencia sobre el salmón.

Generalmente las vacunas son más seguras que los tratamientos químicos, tanto para el pez como para el medio ambiente. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado vacunas comerciales contra el piojo de mar. El desarrollo de una vacuna ha estado dificultado por una carencia de conocimiento de las interacciones hospedantepatógeno entre el piojo de mar y sus hospedantes. Parece que existe una respuesta de anticuerpos muy limitada en 30 los hospedantes infectados de forma natural. Se han producido vacunas experimentales contra L. salmonis, particularmente a través de extractos de animal completo. Las investigaciones en el desarrollo de vacunas contra piojo de mar han estado dirigidas a proteínas inmunogénicas del piojo de mar y, en particular, a antígenos de intestino. Estas vacunas, basadas en extractos de animal completo, no han demostrado ser protectoras, aunque su administración dio como resultado cambios menores en la fecundidad del L. salmonis (Grayson T.H., et al., J Fish

35 Biol 47: 85-94, 1995). Sin embargo, este estudio particular fue un único ensayo y no se han presentado resultados adicionales de este primer grupo. También se han explorado vacunas de peces basadas en liposomas en determinadas especies de pez de aleta (Keough, Solicitud PCT WO 03/101482) pero no en combinación con antígenos de piojo de mar.

Una discusión más reciente de posibles dianas de vacunas en el intestino fue publicada por Raynard et al.; sin 40 embargo, sus estudios han tenido un éxito limitado (Raynard, R.S., et al., Pest Manag Sci 58: 569-575, 2002).

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Epítopos de células T promiscuas

Los epítopos de células T promiscuas (o “epítopos PTC”) son péptidos altamente inmunogénicos que pueden caracterizarse en parte por su capacidad para unirse a varias formas isotípicas y alotípicas de moléculas de MHC humanas de clase II. Al ayudar a superar la restricción de MHC, pueden inducir respuestas de células T y anticuerpos en miembros de una población genéticamente diversa que expresa diversos haplotipos de MHC. Los epítopos de PTC pueden, por tanto, combinarse con antígenos que en sí mismos son poco inmunogénicos, para generar inmunógenos de péptido potentes. En la presente invención, dichos epítopos se incorporan a la composición para potenciar la inmunogenicidad del antígeno, y la composición general, en un amplio rango de especies.

Los epítopos de células T promiscuas pueden ser derivados de inmunógenos naturales de origen vírico y bacteriano. Los epítopos PTC naturales también pueden ser modificados conservativamente mediante adiciones, eliminaciones

o sustituciones de aminoácidos únicos o múltiples (p.ej., dentro de las clases de aminoácidos cargados, hidrofílicos/hidrofóbicos, estéricos) para obtener secuencias candidatas que pueden ser escrutadas en función de su capacidad para potenciar la inmunogenicidad.

Se pueden sintetizar epítopos PTC no naturales de forma artificial para obtener secuencias que tengan un inmunogenicidad comparable o mejor. Los epítopos PTC artificiales pueden oscilar en tamaño entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 residuos de aminoácido de longitud y pueden presentar características estructurales tales como hélices anfipáticas, que son estructuras alfa-helicoidales con residuos de aminoácido hidrofóbicos que dominan una cara de la hélice y residuos cargados o polares dominando las caras circundantes. Los epítopos PTC también pueden contener estructuras de aminoácido primarias adicionales, tales como una Gly o un residuo cargado seguido de entre dos y tres residuos hidrofóbicos, seguidos a su vez de un residuo cargado o polar (una secuencia de Rothbard). Adicionalmente, los epítopos PTC a menudo obedecen la regla 1, 4, 5, 8, donde un residuo cargado positivamente viene seguido de residuos hidrofóbicos en las posiciones cuarta, quinta y octava después del residuo cargado.

Estas características pueden incorporarse en los diseños de epítopos PTC artificiales. Las posiciones variables y los aminoácidos preferidos están disponibles para estructuras de unión a MHC (Meister et al., Vaccine, 1995; 13: 581591). Por ejemplo, el epítopo PTC degenerado descrito en WO 95/11998 como SSAL1TH1 tiene la secuencia degenerada (Asp/Glu)-(Leu/Ile/Val/Phe)-Ser-(Asp/Gly)-(Leu/Ile/Val/Phe)-(Lys/Arg)-Gly-(Leu/Ile/Val/Phe)(Leu/Ile/Val/Phe)-(Leu/Ile/Val/Phe)-His-(Lys/Arg)-Leu/Ile/Val/Phe)-(Asp/Glu)-Gly-(Leu/Ile/Val/Phe)-.

Ejemplos específicos de epítopos PTC

Los epítopos de células T promiscuas particularmente útiles son la proteína F de virus de sarampión LSEIKGVIVHRLEGV (SEQ ID NO: 33); o la secuencia del tétanos QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 34).

Los ejemplos de epítopos de células T promiscuas particularmente útiles se enumeran en la Tabla 2:

Tabla 2: Ejemplos de epítopos de células T promiscuas

Descripción: Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:

Sarampión 289-302: LSEIKGVIVHRLEGV 33

Toxina del tétanos 830-844: QYIKANSKFIGITEL 34

Debido a una falta de comprensión de los mecanismos y la patología sobre las infestaciones de piojos de mar en salmones, la identificación de dianas adecuadas para tratar la enfermedad no ha tenido éxito. Esto ha dificultado el progreso de la investigación en vacunas y, como tal, a pesar de la promesa y el éxito de las terapias basadas en vacunas en otras áreas de infección, aún no se ha desarrollado una vacuna contra piojo de mar adecuada. Por consiguiente, existe una necesidad de proporcionar dianas moleculares (antígenos) adecuadas efectivas, así como una vacuna contra la infección de piojos de mar.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es obviar o mitigar al menos una desventaja de los tratamientos previos contra la infección de piojo de mar en peces.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una vacuna contra la infección de copépodos caligidae en peces, comprendiendo la vacuna una cantidad inmunológicamente efectiva de antígeno. Particularmente, el copépodo caligidae es Lepeophtheirus salmonis, aunque se puede tratar la infección de cualquier copépodo. En una realización, la vacuna comprende un nucleótido o fragmento peptídico de tripsina de L. salmonis y un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

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En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan secuencias de ADN y de aminoácidos que codifican antígenos para uso en la preparación de formulaciones de vacuna para el tratamiento de la infección de copépodos caligidae en peces. Las realizaciones de dichas secuencias incluyen proteínas de adhesión.

Otros aspectos de la invención incluyen un ADN que codifica proteína de adhesión 2.

Otros aspectos adicionales de la invención incluyen una secuencia de aminoácidos que codifica proteína de adhesión 2.

También se incluye una vacuna de ADN que comprende un ADN que codifica una proteína de adhesión 2 y un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto adicional es una vacuna de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica proteína de adhesión 2, y un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otros aspectos y características de la presente invención serán evidentes para los especialistas en la técnica tras revisar la siguiente descripción de realizaciones específicas de la invención, en combinación con las figuras acompañantes.

Breve descripción de las figuras

Las realizaciones de la presente invención se describen a continuación, únicamente a modo de ejemplo, haciendo referencia a las Figuras acompañantes, en donde:

Figura 1: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de tipo vitelogenina (SEQ ID NO: 1, 2).

Figura 2: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína SEP 1 (SEQ ID NO: 3, 4).

Figura 3: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína SEP 2 (SEQ ID NO: 5, 6).

Figura 4: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína SEP 3 (SEQ ID NO: 7, 8).

Figura 5: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de adhesión 2, homóloga al precursor de proteína 2 de matriz de placa adhesiva de mejillón (SEQ ID NO: 9, 10).

Figura 6: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de adhesión 1, homóloga al precursor de proteína de matriz de placa adhesiva de mejillón (proteína de pie 1) (SEQ ID NO: 11, 12).

Figura 7: muestra a) la secuencia de ácido nucleico y b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a cutícula 1, homóloga a la proteína de tipo BSC-1 (moran 9-15) (SEQ ID NO: 13, 14).

Figura 8: es un gráfico de piojos por cm de pez a lo largo de la duración del tiempo post-infección, usando vacunas (A/B = gen de tripsina de piojo de mar expresado con epítopo de células T; Y/Z = gen de tripsina de piojo de mar expresado; C = control) de la presente invención.

Figura 9: es un gráfico de piojos por gramo de pez a lo largo de la duración del tiempo post-infección, usando vacunas (A/B = gen de tripsina de piojo de mar expresado con epítopo de células T; Y/Z = gen de tripsina de piojo de mar expresado; C = control) de la presente invención.

Figura 10: muestra un gráfico de datos apilados que muestran los porcentajes de las diferentes etapas de piojo de mar presentes en peces inmunizados con la vacuna de tripsina de L. salmonis, en comparación con peces de control, para cada tiempo de muestreo.

Figura 11: muestra una secuencia parcial de ácido nucleico (SEQ ID NO: 15) de proteína de tipo vitelogenina SL-903 similar pero de mayor longitud que la de la Figura 1. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.

Figura 12: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa de la proteína SEP 1 SL-0547 (SEQ ID NO: 16). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.

Figura 13: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa putativa de la proteína SEP 2 SL-0858 (SEQ ID NO: 17). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos para la proteína. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.

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Figura 14: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa putativa de la proteína SEP 3 SL-1469 (SEQ ID NO: 18). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos para la proteína. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.

Figura 15: muestra la secuencia de ácido nucleico de longitud completa putativa de la proteína adhesiva de mejillón SL-0927 (SEQ ID NO: 19). En negrita y subrayado ATG son los codones de inicio supuestos para la proteína. En negrita, subrayado y en cursiva TGA, TAA ó TAG son los codones de parada predichos.

Figura 16: muestra una secuencia de aminoácidos parcial de proteína de tipo vitelogenina SL-903 (SEQ ID NO: 20), junto con coincidencias BLASTTM de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.

Figura 17: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína SEP 1 SL-0547 (SEQ ID NO: 21), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.

Figura 18: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína SEP 2 SL-0858 (SEQ ID NO: 22), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.

Figura 19: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína SEP 3 SL-1469 (SEQ ID NO: 23), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.

Figura 20: muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa putativa de la proteína adhesiva de mejillón SL-0927 (SEQ ID NO: 24), junto a las coincidencias BLAST de la secuencia. Los aminoácidos subrayados son los fragmentos de péptido procedentes de los datos de Espectrometría de Masas de Proteómica.

Figura 21: muestra la expresión media (±SEM) del gen de interleuquina-1β, respecto a β-actina, en células SHK-1 incubadas con y sin lipopolisacárido (LPS), fracción agrupada 1 de producto secretor/excretor de L. salmonis, fracción agrupada 2 de producto secretor/excretor de L. salmonis, y fracción agrupada 3 de producto secretor/excretor de L. salmonis. * indica diferencias significativas respecto al control; † indica diferencias significativas respecto a LPS + control.

Figura 22: muestra la expresión media (±SEM) de gen de interleuquina-1β, respecto a β-actina, en células SHK-1 incubadas con y sin lipopolisacárido (LPS), LPS y disolvente de cromatografía líquida liofilizada (LC), fracción 1 de producto secretor/excretor de L. salmonis, fracción 2 de producto secretor/excretor de L. salmonis, y productos secretores/excretores de L. salmonis no fraccionados; † indica diferencias significativas respecto a LPS + control.

Descripción detallada

De forma general, la presente invención proporciona una vacuna para tratar la infección de piojo de mar en peces, particularmente la infección de L. salmonis. También se refiere a la secuencia de ADN y de aminoácidos de dianas moleculares para uso en la preparación de dicha vacuna.

Las vacunas de la presente invención han sido generadas en base a estudios llevados a cabo por nuestro grupo y otros sobre la expresión génica en piojos de mar. Varios genes del piojo de mar presentan potencial como productores de antígenos en formulaciones de vacuna diseñadas para proteger al salmón frente al piojo de mar, especialmente L. salmonis. Los genes incluyen: 1) un gen para tripsina de piojo de mar; 2) un gen que tiene una alta similitud con una proteína de tipo vitelogenina encontrada en productos de secreción; 3) un gen que tiene una alta similitud de secuencia con el gen de proteína 1 de adhesión de mejillón; 4) un gen que tiene una alta similitud de secuencia con el gen de proteína 2 de adhesión de mejillón; 5) una serie de genes que tienen una alta similitud de secuencia con el gen que codifica para la proteína BCS-1 específica de la etapa de Balanus amphrite; y 6) genes que codifican para tres productos de secreción (SP) proteínicos en el piojo de mar que, a fecha actual, no tienen una similitud significativa con ninguna proteína conocida en las bases de datos públicos.

Tal como se usa en la presente memoria, un “antígeno” se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos que estimulan un sistema inmune del hospedante para producir una respuesta humoral y/o celular específica de antígeno. El término también se usa en la presente memoria de forma intercambiable con “inmunógeno”.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “epítopo” se refiere al sitio sobre un antígeno o hapteno al cual se une una molécula de anticuerpo específica. El término también se usa en la presente memoria de forma intercambiable con “determinante antigénico” o “sitio determinante antigénico”.

Las Figuras 1 a 6 muestran las secuencias de los genes de la presente invención descritas anteriormente y secuenciadas en nuestro laboratorio, con la excepción de la tripsina, de la cual se ha publicado la secuencia de ácido nucleico (Johnson, 2002, ver anterior). Nosotros hemos identificado el producto génico de la tripsina en las

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secreciones del piojo de mar mediante secuenciamiento de aminoácidos usando espectrometría de masas. Dichos genes fueron seleccionados e investigados en base a una comprensión previa de su función putativa.

Las Figuras 11 a 20 muestran secuencias de nucleótidos y aminoácidos de longitud completa putativas o de mayor longitud de los genes y proteínas descritos en la presente memoria.

Los antígenos derivados de L. salmonis deberían proporcionar protección para el pez frente a otras especies de piojo de mar, ya que probablemente usen métodos altamente conservados para fijarse y que les permitan alimentarse con éxito del hospedante.

Los adyuvantes que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen adyuvantes MontanideTM ISA e IMS (Seppic, París, Francia), otros adyuvantes de aceite-en-agua, agua-en-aceite y agua-en-aceite-en-agua, adyuvantes de Ribi (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), TiterMax de Hunter (CytRx Corp., Norcross, GA), adyuvantes de sales de aluminio, proteínas adsorbidas en nitrocelulosa, antígenos encapsulados, adyuvantes que contienen nanopartículas. Los adyuvantes preferidos incluyen Seppic Montanide 720, Montanide IMS111x, Montanide IMS131x, Montanide IMS221x, Montanide IMS301x, Montanide ISA206, Montanide ISA207, Montanide ISA25, Montanide ISA27, Montanide ISA28, Montanide ISA35, Montanide ISA50A, Montanide ISA563, Montanide ISA70, Montanide ISA51, Montanide ISA720, Montanide ISA264. Los adyuvantes particularmente preferidos incluyen Montanide ISA740, Montanide ISA773, Montanide ISA708, Montanide ISA266. El adyuvante recomendado es Montanide ISA763.

Los datos procedentes de estudios que usan las vacunas de la presente invención para el tratamiento de la infección de piojos de mar se proporcionan en la presente memoria a través de los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1

Se expuso salmones a tripsina de L. salmonis como antígeno. Los peces fueron inmunizados con dos grupos de formulación de vacuna de tripsina: A/B (tripsina de piojo de mar recombinante con un epítopo de célula T) e Y/Z (solo tripsina de piojo de mar recombinante). A determinados peces se les administró una vacuna de control, C, que contenía solamente adyuvante. La protección del pez es evidente en los días 6, 11 y 20 (Figuras 8 y 9). El número de piojos de mar por cm y por gramo de pez se reduce en los peces vacunados en comparación a los controles. La formulación de vacuna A/B dio como resultado un menor número de piojos que la formulación Y/Z, lo que demuestra que la inclusión de epítopos de células T con antígenos de piojos de mar proporciona una protección adicional frente a los piojos de mar.

La Figura 10 muestra los resultados de datos apilados de los experimentos de exposición y vacunación. La formulación de vacuna A/B (tripsina de piojo de mar recombinante con un epítopo de célula T) parece que frenó el desarrollo de L. salmonis, ya que en los días 6, 11 y 20 había menores porcentajes de piojos que habían mudado a una etapa más avanzada en comparación con los peces de control.

EJEMPLO 2

Cromatografía de exclusión de tamaño y determinación de proteínas

Los productos secretores excretores liofilizados (SEPs) fueron reconstituidos con acetato de amonio (AMA) 1,0 M (pH 6,0). Se usó un HPLC Agilent 1100 equipado con un detector de diodos (monitorizando a 230 y 256 nm) y una columna Taso Haas (G3000PWX2, 6 μm dp (7,8 mm x 300 mm)) para separar las proteínas/péptidos de las secreciones. A continuación dichas muestras fueron fraccionadas usando un colector de fracciones Waters según los intervalos de tiempo. Las fracciones mostradas en la Tabla 1 fueron recogidas durante 6 experimentos separados de HPLC y se agruparon para cada intervalo de tiempo. A continuación estas muestras fueron secadas por congelación (-80ºC) antes de realizar la determinación de proteínas. La columna se mantuvo a temperatura ambiente y se eluyó isocráticamente con AMA:acetonitrilo (ACN) 98:2 durante 30 minutos a 0,2 mL·min-1 . Se analizaron disoluciones patrón de albúmina de suero bovino (BSA) (20 μg, 2,0 μg y 0,2 μg), SW + DA y tripsina bovina (40 μg) como controles para la comparación de picos con SEPs.

Las concentraciones de proteína de fracciones secretoras de L. salmonis fueron determinadas usando un método de unión a colorante (Bradford, M.M. Anal Biochem 72: 248-254, 1976). Todos los ensayos fueron analizados en un lector de microplacas ThermomaxTM (Molecular Devices). Las muestras fueron reconstituidas en ddH2O y a continuación, tras la determinación de proteínas, fueron separadas por igual entre ensayos funcionales basados en células y análisis proteómico.

Cultivo de células SHK

Se cultivaron células SHK-1 a 18ºC en matraces tratados con cultivo de tejido de 75 cm2 (Costar), en medio L-15 (con 300 mg/L de L-glutamina) suplementados con 500 μL de sulfato de gentamicina (50 mg/mL destilado en agua), 365 μL de 2-mercaptoetanol (55 mM en D-PBS) y 5% de suero fetal bovino (FBS), tal como se describe en Fast et al., 2004, ver anterior. Todos los componentes del medio fueron adquiridos en Gibco. Los matraces confluentes fueron sometidos a pasaje semanalmente dividiendo las células y el medio uniformemente entre dos matraces y

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añadiendo un volumen igual de medio nuevo a cada matraz. Las células usadas en este estudio fueron sometidas a pasaje entre 64 y 68 veces.

Las células SHK-1 fueron sembradas a aproximadamente 4 x 106 células/matraz en medio L-15 suplementado como se ha indicado anteriormente. La estimulación celular siguió el mismo procedimiento indicado por Fast, M.D. et al. Dev. Comp. Immunol. 29: 951-963, 2005. Resumidamente, después de un periodo de 48 h para permitir que cualquier expresión génica inducida por la manipulación volviera a niveles constitutivos, se eliminó el medio y se añadieron 20 mL de medio nuevo. Se añadió lipopolisacárido (LPS) a todos los matraces, excepto a los controles, para obtener una concentración final de 5 μg/mL.

En el primer ensayo, las fracciones SEP fueron reunidas en 3 grupos (Tabla 1), cada una con iguales intervalos de tiempo (10 minutos) y volúmenes procedentes de la cromatografía de exclusión de tamaño. Esto dio como resultado que se añadieran a cada matraz 13 μg de proteína (fracción agrupada 1), 8,0 μg de proteína (fracción agrupada 2) y <0,1 μg de proteína (fracción agrupada 3). Estas incubaciones fueron llevadas a cabo durante 4 h a 18ºC antes de retirar el medio y almacenar las células en ARN, después a -80ºC hasta la extracción de ARN. Este ensayo se repitió dos veces con matraces triplicados para cada condición.

En el segundo ensayo, se añadieron las fracciones SEP 1 y 2 procedentes de la fracción agrupada 1 (Tabla 1) a 1,0 y 1,4 μg por matraz, respectivamente. Estas concentraciones se obtuvieron tras concentrar 4 experimentos de exclusión de tamaño para cada fracción. Para evaluar cualquier efecto de disolvente residual sobre el ensayo basado en células, en el experimento se incluyeron como controles 4 blancos de AMA sometidos al mismo tratamiento. Finalmente, los SEPs no fraccionados usados en las incubaciones de macrófagos fueron incubados aquí a la misma concentración (660 ng). Estas incubaciones se llevaron a cabo por triplicado y siguieron el mismo procedimiento que en el primer ensayo.

PCR en tiempo real de genes de salmón atlántico

Se aisló ARN total de células SHK-1 almacenadas en RNAlaterTM con el kit NucleospinTM RNA II (Clontech) y se midió la concentración en un espectrofotómetro. Las muestras de ARN fueron sometidas a PCR para verificar la ausencia de contaminación de ADN. Se diseñaron las secuencias para cebadores de PCR en tiempo real, se evaluaron y los productos fueron secuenciados como se ha descrito previamente en Fast et al., ver anterior (2004; 2005). Se llevó a cabo la PCR cuantitativa en tiempo real usando un sistema de detección en tiempo real iCycler iQTM y kits SYBR verdes (Bio-Rad) también descritos previamente por Fast et al., ver anterior (2004; 2005). Para asegurar que no se había añadido contaminación de ADN genómico al ADNc cuantificado, se realizaron controles no en tiempo real para cada elemento aislado de ARN con PCR y se observó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5%.

El perfil de PCR fue como se indica a continuación: una etapa inicial de desnaturalización de 3 minutos a 95ºC, seguida de 40 ciclos de desnaturalización (30 s a 95ºC), maduración (30 s a 58ºC) y extensión (30 s a 72ºC), y finalizar con una etapa de extensión final de 72ºC durante 5 minutos. La sensibilidad de las reacciones y la amplificación de productos contaminantes tales como dímeros cebadores, detectados indiscriminadamente mediante SYBR verde (es decir, el SYBR verde se une a todos los ADN de doble hélice), fueron evaluados amplificando diluciones 1 a 10 de los clones (10-2 a 10-8 ng) y muestras duplicadas, así como llevando a cabo un blanco sin ADNc con cada experimento. La relación entre el ciclo umbral (Ct) y el log (ARN) fue lineal (-3,5<pendiente<-3,2) para todas las reacciones. Los números de copias fueron estimados en base al peso molecular de los clones y la DO 260.

Actividad inmunomoduladora de proteínas SEP

Las SEPs fueron fraccionadas en función del tamaño y las fracciones fueron agrupadas. En el primer ensayo (Figura 21), las fracciones agrupadas (PF1, PF2, PF3) fueron incubadas con células SHK-1 (una línea celular de tipo macrófago de salmón) en combinación con lipopolisacáridos (LPS) y se monitorizó la expresión del gen de interleuquina 1β con el objetivo de determinar el efecto inmunomodulador de las proteínas SEP fraccionadas sobre la expresión génica inmune. El gen de interleuquina 1β fue reducido en expresión por las tres fracciones agrupadas en comparación con células estimuladas solo con LPS (Figura 21). Cuando se evaluaron las fracciones individuales que contenían proteínas, la expresión de gen de interleuquina 1β fue reducida por la fracción 2. El análisis LC-MS mostró que la Fracción 2 del grupo 1 contenía la proteína SEP 1, la proteína SEP 2 y tripsina. En la Figura 22 se muestran evidencias de la actividad inmunomoduladora de SEP, que contiene todas las proteínas descritas, en donde se observa un descenso significativo de la expresión inducida por LPS de interleuquina 1β en presencia de SEPs totales.

Las realizaciones descritas anteriormente de la presente invención pretenden ser meramente ejemplos. Los especialistas en la técnica pueden efectuar alteraciones, modificaciones y variaciones de las realizaciones particulares sin separarse del alcance de la invención, que queda definido exclusivamente por las reivindicaciones anexas al presente documento.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un ADN que codifica un antígeno proteínico para uso en el tratamiento de infección de copépodos caligidae en peces, en donde el ADN consiste en la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 9.

5 2. El ADN según la reivindicación 1, en donde el copépodo caligidae es Lepeophtheirus salmonis.
3.

Un ADN que codifica un antígeno proteínico, comprendiendo el ADN una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 9.
4.

El ADN según la reivindicación 3 para uso en la prevención de infección de copépodo caligidae en peces.
5. Una proteína recombinante purificada para uso en la prevención de infección de copépodo caligidae en peces, 10 proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
6.

Una proteína recombinante purificada para uso según la reivindicación 5, en donde el copépodo caligidae es Lepeophtheirus salmonis.
7.

Una proteína recombinante purificada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.

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