ES2287954T3

ES2287954T3 - Vacuna que contiene una peroxirredoxina.

Info

Publication number: ES2287954T3
Application number: ES97925196T
Authority: ES
Inventors: John Pius Dalton; Stuart John Andrews
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: EP0953047B1; EP0953047A2; US6676944B2; AU732807B2; GB9612214D0; DE69737691D1; CN1221451A; BR9710849A; WO1997047740A2; ATE361363T1; US20030124137A1; NZ333265A; AU3042497A; DE69737691T2; CA2256710A1; WO1997047740A3

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES PARA VACUNAS QUE COMPRENDEN PEROXIREDOXINA Y/O UN MATERIAL ANTIGENICO DE BE TUBULINA, PREFERIBLEMENTE DE ORIGEN FASCIOLA O DICROCOELIUM, PARA SU USO EN LA LUCHA CONTRA INFECCIONES PARASITICAS DE HELMINTOS EN UN MAMIFERO. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN MOLECULAS DE PEROXIREDOXINA Y/O BE -TUBULINA Y A SECUENCIAS DE AMINOACIDO DE LAS MISMAS, A VECTORES QUE COMPRENDEN LAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO Y A LAS CELULAS TRANSFORMADAS POR LOS VECTORES.

Description

Vacuna que contiene una peroxirredoxina.

La invención se refiere al uso de una peroxirredoxina (antioxidante específico de tiol) como antígeno protector frente a helmintos parásitos.

Cada especie de animal doméstico puede ser parasitada por una serie de diferentes especies de helminto, un proceso que habitualmente provoca enfermedades. Por ejemplo, se sabe que el trematodo parasitario Fasciola hepatica es un causa de la económicamente importante enfermedad de la fascioliasis en rumiantes, tales como el ganado vacuno y ovino. El parásito entra en el mamífero hospedante penetrando a través de la pared del intestino y pasa aproximadamente siete semanas alimentándose y excavando a través de la masa del hígado antes de migrar hacia el conducto biliar. Después de la infección, el desarrollo de inmunidad en el hospedante puede ser pobre y la resistencia frente a una nueva infección en los hospedantes ya infectados puede ser sólo parcial o incluso inexistente. Otros parásitos incluyen Fasciola gigantica y Dicrocoelium spp., Paramphistomum spp. y también Schistosoma spp., por ejemplo S. bovis y S. mansoni.

También causan problemas nematodos tales como los anquilostomas (por ejemplo, Necator, Ancylostoma, Uncinaria y Bunostomum spp.).

De los nematodos que se alimentan de sangre, el género Haemonchus provoca anemia y pérdida de peso, y si no se trata frecuentemente resulta en la muerte. Los animales infectados con otro nematodo relacionado, que no se alimenta de sangre, el Ostertagia, también presentan problemas y pueden morir si no son tratados.

Otros gusanos parasitarios de importancia económica incluyen las diversas especies de los siguientes géneros de helmintos: Tri-chostrongylus, Nematodirus, Dictyocalus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris y Strongylus. Además del ganado, también se pueden infectar los animales de compañía y los humanos, habitualmente con resultados fatales, y por tanto las infecciones y plagas de helmintos suponen un problema de considerable relevancia a nivel mundial.

El control de los helmintos parásitos en el ganado de pastoreo recae en la actualidad principalmente en el uso de fármacos antihelmínticos combinados con gestión de los pastos. Dichas técnicas a menudo resultan insatisfactorias, en primer lugar debido a que puede que los fármacos antihelmínticos tengan que administrarse frecuentemente, en segundo lugar debido a que está extendiendo la resistencia a los fármacos antihelmínticos, y en tercer lugar debido a que a menudo no es posible la gestión apropiada de los pastos en determinadas granjas, e incluso cuando lo es, puede suponer la imposición de restricciones al uso del pasto disponible.

Se han llevado a cabo numerosos intentos para controlar los helmintos parásitos de animales domésticos empleando medios inmunológicos. Con escasas excepciones (por ejemplo, el nematodo pulmonar, Dictyocaulus viviparus), se ha demostrado que esta estrategia no es posible.

En el documento WO90/08819 se ha propuesto una vacuna contra F. hepatica, que comprende una glutationa-S-transferasa de F. hepatica como material antigénico. También se han propuesto otras vacunas contra F. hepatica en los documentos WO94/09142, WO94/28925 y WO96/10583, que comprenden como material antigénico, respectivamente, una catepsina L, una dipeptidil peptidasa y una clase de hematoproteínas de F. hepatica.

Bennett (Patente del R.U. Nº 2169606B) extrajo varios antígenos de organismos Fasciola mediante un proceso que separa antígenos específicos de la etapa juvenil de los antígenos presentes en las etapas juveniles y adultas.

Adicionalmente, los productos excretores/secretores (E/S) crudos in vitro pueden conferir, en determinadas circunstancias, inmunidad en ratas (Rajasekariah y col., Parasitol. 79 (1979), pág. 393-400).

Ahora se ha descubierto que los animales vacunados contra F. hepatica usando una preparación de hemoproteína relativamente impura, cuya contrapartida pura se describe en el documento WO96/10583, producen anticuerpos contra moléculas de peroxirredoxina de origen parasitario. Este descubrimiento abre la posibilidad de obtener vacunas contra F. hepatica y otros helmintos en base al uso de moléculas de peroxirredoxina como antígenos.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona una composición de vacuna como la reivindicada en la reivindicación 1.

De forma alternativa, la invención proporciona el uso de moléculas como las definidas en la reivindicación 1 en la preparación de una composición de vacuna para combatir una plaga parasitaria de helmintos en un mamífero.

Preferiblemente, el mamífero es un rumiante, por ejemplo ganado bovino u ovino, pero la vacuna de la invención también puede encontrar utilidad en humanos, animales de compañía tales como perros y gatos, o en otros animales domésticos.

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Se prefieren particularmente las moléculas de peroxirredoxina de F. hepatica que poseen secuencias de cADN y secuencias de aminoácidos predichas como las mostradas en la Figura 4, respectivamente, para su uso en la vacuna de la invención.

Las moléculas de peroxirredoxina incorporadas en la vacuna de acuerdo con la invención se encuentran, al menos parcialmente, en forma purificada. Preferiblemente, las moléculas de la presente invención son puras al menos en un 75% y más preferiblemente en al menos un 95%. Cabe destacar que una vez que se han obtenido las moléculas de peroxirredoxina con una pureza de al menos el 95%, se pueden mezclar con una o más proteínas antigénicas purificadas adicionales, para formar una vacuna polivalente.

Una forma preferida de vacuna polivalente de acuerdo con la invención contendrá polipéptidos de peroxirredoxina como los mencionados anteriormente en combinación con un antígeno de tipo catepsina L, como se describe más detalladamente en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/09142, o un antígeno de dipeptidil peptidasa como se describe más detalladamente en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO94/28925, o una clase de moléculas de hemoproteína como se describe más detalladamente en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO96/10583, o un antígeno de \beta-tubulina como se describe más adelante en la presente memoria. Por tanto, la catepsina L y/o la dipeptidil peptidasa y/o las hemoproteínas se derivan preferiblemente de parásitos tales como Fasciola o Dicrocoelium, en particular del parásito del hígado F. hepatica. Dicha vacuna polivalente aumentará significativamente la probabilidad de protección contra helmintos mediante la inducción y de inmunidad en la especie hospedante contra dos o más aspectos separados del parásito helminto invasor, y reducirá significativamente la probabilidad de que se produzca una plaga.

Las vacunas monovalentes de acuerdo con la invención también pueden tener un efecto anti-fecundidad sobre los helmintos parásitos, y dicho efecto debería ser más marcado en las vacunas polivalentes.

En un aspecto preferido, la vacuna polivalente comprende polipéptidos de peroxirredoxina de acuerdo con la presente invención junto con una catepsina L1 que tiene un peso molecular de 27 kDa mediante electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sódico, tal como se describe en WO94/09142, y/o una catepsina L2 que tiene un peso molecular de 29,5 kDa mediante la misma técnica, tal como se describe en WO94/09142, y/o una dipeptidil peptidasa que tiene un peso molecular de 200 kDa mediante la misma técnica, tal como se describe en WO94/28925 o una o más de una clase de hemoproteínas de al menos 200 kDa mediante cromatografía de filtración de gel tal como se describe en WO96/10583.

Las vacunas de acuerdo con la invención se pueden formular con vehículos y/o adyuvantes convencionales y la invención también proporciona un proceso para la preparación de las vacunas que comprende reunir peroxirredoxina purificada, y/o moléculas de \beta-tubulina como las descritas anteriormente, y uno o más adyuvantes o vehículos. Los adyuvantes adecuados incluyen hidróxido de aluminio, saponina (ISCOMs), quil A y más formas purificadas del mismo, dipéptido de muramilo, aceites minerales y vegetales, dextrano DEAE, copolímeros-bloque no iónicos o liposomas tales como Novasomes (Marca Comercial de Micro Vesicular Systems Inc.), en presencia de uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los vehículos para las secuencias de péptidos que corresponden a epítopos de moléculas de peroxirredoxina o de \beta-tubulina de acuerdo con la invención pueden ser proteínas tales como el péptido de antígeno múltiple de antígeno de núcleo de Hepatitis B o lipopéptidos tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinilserilserina (P_{3}CSS). Los diluyentes adecuados incluyen medios líquidos tales como disolución salina adecuada para su uso como vehículo. Se pueden incluir otros componentes tales como conservantes.

La administración de la vacuna a la especie hospedante se puede realizar empleando cualquier ruta convencional, por ejemplo, oralmente o parenteralmente, tal como mediante inyección intramuscular, opcionalmente a intervalos, por ejemplo dos inyecciones con un intervalo de 7-35 días. Una dosis adecuada cuando se administra mediante inyección puede ser aquella que proporcione una cantidad de proteína en el intervalo de 10-500 \mug.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona la molécula de peroxirredoxina de F. hepatica que se caracteriza por:

(a): tener una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la Figura 4;

(b): estar codificada por una secuencia de nucleótidos, de la cual al menos una porción corresponde sustancialmente a la secuencia mostrada en la Figura 4;

Aunque las moléculas de peroxirredoxina para uso en la vacuna de acuerdo con la invención se pueden preparar aislándolas de los helmintos, también puede ser conveniente prepararlas mediante técnicas de ADN recombinante con las ventajas ya conocidas que presentan dichas técnicas en términos de escalado de producción y reproducibilidad. Por tanto, la invención también proporciona moléculas de peroxirredoxina como las descritas aquí anteriormente, producidas por medio de técnicas de ADN recombinante.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas de peroxirredoxina de la invención que corresponden a todas o a una porción de las secuencias de nucleótidos mostradas en la Figura 4.

Por tanto, un ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser un ADN, un cADN o un ARN de cadena sencilla o doble.

Se pueden dar variaciones de secuencias de nucleótidos que codifican peroxirredoxina entre diferentes cepas o helmintos dentro de una especie, entre las diferentes etapas del ciclo vital del helminto (por ejemplo, entre las etapas larvaria y adulta), entre cepas similares de origen geográfico distinto, y también dentro del mismo helminto. Dichas variaciones se incluyen en el alcance de esta invención.

Por tanto, la provisión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención permite obtener peroxirredoxina recombinante en cantidades no disponibles hasta el momento, permitiendo con ello el desarrollo de vacunas anti-helmínticas.

Otros aspectos de la invención relacionados con lo anterior incluyen vectores que contienen una o más secuencias de nucleótidos tal como se han definido anteriormente; células hospedantes, por ejemplo bacterias tales como E. coli o células de levadura tales como Saccharomyces spp., o más preferiblemente células eucarióticas, transformadas por dichos vectores, por ejemplo mediante un vector baculovirus; y procesos para preparar polipéptidos de peroxirredoxina recombinante que comprenden cultivar dichas células hospedantes transformadas y aislar dichos polipéptidos de peroxirredoxina de las células cultivadas.

Una formulación alternativa de vacuna viva o desactivada puede comprender un virus atenuado o virulento o una célula hospedante, por ejemplo, un microorganismo tal como una bacteria, que tenga insertado una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ADN) de acuerdo con la invención para la estimulación de una respuesta inmune dirigida contra polipéptidos codificados por la molécula de ácido nucleico insertada. Se prefiere particularmente un vector bacteriano que provoca inmunidad mucosal local de intestino frente a un antígeno parasitario, y que a continuación bloquea la migración de parásitos juveniles, notablemente especies invasivas tales como las especies de Salmonella.

También puede haber presentes materiales antigénicos en la vacuna, proporcionando de este modo un efecto protector potenciado frente al helminto parásito en cuestión, o un efector protector combinado frente a una o más plagas parasitarias adicionales.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Injertos amplificados mediante PCR de clones \lambda gt11 inmuno-seleccionados. Los clones positivos fueron amplificados con PCR usando cebadores directos e inversos \lambda universales. Las muestras de cada reacción PCR se analizaron mediante electroforesis de gel de agarosa.

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Figura 2

Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida de \beta-tubulina (clon D6).

Figura 3

Alineamiento de la secuencia de aminoácidos predicha de clon D6 para \beta-tubulina de Toxoplasma. La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia parcial D6 se alineó con la de \beta-tubulina de Toxoplasma gondii (número de acceso de GenBank P10878, Nagel y Boothroyd, 1988). Las cajas recuadran regiones homólogas y se han introducido huecos para proporcionar un alineamiento máximo.

Z = sin determinar.

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Figura 4

Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos predicha de (peroxirredoxina) (clon B1).

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Figura 5

Alineamiento de secuencia de aminoácidos predicha del clon B1. La secuencia de aminoácidos deducida del clon B1 se alineó con la del antioxidante específico de tiol de rata (TSA, número de acceso de GenBank P35704), factor B de potenciamiento de célula asesinas naturales humanas (NKEF B, número de acceso P31945), gen asociado a proliferación humano (PAG, número de acceso X67951), TSA humano (Lim y col., 1994, número de acceso P35701) y TSA de Onchocerca volvulus (número de acceso U09385). Los recuadros denotan residuos conservados y se han introducido huecos para maximizar el alineamiento. Los residuos de cisteína de centros activos se indican con flechas.

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Figura 6

Expresión de proteína de fusión de clon B1.

A.: Se sometió a los sobrenadantes de lavado de placa de fago natural (banda 1) y de fago de clon B (banda 2) a SDS PAGE reductora y a tinción de plata.

B.: Tras llevar a cabo una electroforesis, los geles de SDS fueron coagulados en nitrocelulosa y fueron evaluados con anticuerpos anti-\beta-galactosidasa. La banda 1 contiene sobrenadante de fago natural y la banda 2 contiene sobrenadante de clon B1. Las flechas grandes indican la posición de \beta-galactosidasa. Las flechas pequeñas indican la posición de proteína de fusión recombinante B1.

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Figura 7

Análisis Northern blot de ARN total de F. hepatica y de hígado de bovino.

Se sometió a electroforesis ARN total de F. hepatica (banda 1) y de hígado de bovino (banda 2) en un gel de agarosa de formaldehído, se transfirió a un filtro de nitrocelulosa y se probó con un fragmento de 400 pb marcado con ^{32}P. Se indican los marcadores de tamaño de ARN.

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Figura 8

Protección de glutamina sintetasa mediante homogenato de parásito de hígado contra el sistema DTT/Fe^{3+}.

Se incubaron 0,5 U de glutamina sintetasa (GS) en presencia de la disolución desactivante (IS): FeCl_{3} 15 \muM y DTT 5 mM, con 0,3 mg, 0,6 mg y 0,9 mg de homogenato de parásito de hígado (LHF), durante 10 minutos a 37ºC. Las reacciones se evaluaron para determinar la actividad remanente de glutamina sintetasa.

Descripción detallada de la invención 1. Materiales

El Alpha ^{32}P dATP se obtuvo en Amersham, el RNAzol^{TM} B en AMS Biotechnology Ltd., y la película rayos-X X-Omat, el Fijador de líquido FX 40 y el desarrollador LX 24 de película Polaroid 667 fueron adquiridos en Kodak. La agarosa, el anticuerpo anti-\beta-galactosidasa marcado con fosfatasa alcalina (ratón), el Apa I, la 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosidasa (X-Gal), los dNTP's, el EcoRI, el Hind III, el isopropiltio-\beta-D-galactósido (IPTG), los marcadores de ADN pGem, el sistema de vector pGem®, el sistema Prime-a-Gene®, el Sac I, la Polimerasa de ADN Taq, las preparaciones WizarD ^{TM} \lambda, y el sistema de limpieza de ADN Wizard^{TM} fueron adquiridos en Promega. El difosfato de adenina (ADP), el IgG anti-bovino conjugado con fosfatasa alcalina (de conejo), el dietilpirocarbonato (DEPC), el ditiotreitol (DTT), la glutamina, la glutamina sintetasa, la lisozima, la proteinasa K y el ADN de esperma de salmón procedían de Sigma Chemical Company.

2. Inmunoescrutinio de biblioteca de expresión de cADN de \lambda gt11 de F. hepatica Preparación de biblioteca de cADN de \lambda gt11

Se preparó una biblioteca de cADN de \lambda gt11 mediante el siguiente método estándar (Promega Handbook). Se aisló el ARN total de parásitos adultos maduros usando RNAzol ^{TM}. A partir de éste, se aisló mARN mediante unión a una columna oligo dT. Se generó cADN de doble cadena a partir del mARN usando el kit de síntesis de cADN Riboclone®. Se añadieron brazos de ligadura EcoR I al cADN, que fue ligado a continuación a brazos de gt11 y empaquetado en cabezas \lambda usando el sistema Packagene®. El fago empaquetado se valoró y a continuación se amplificó infectando células competentes de fago Y1090 de E. coli (cultivo durante una noche en medio LB con un 0,2% de maltosa y MgSO_{4} 10 mM) con diluciones del fago, incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos y a continuación llevando las bacterias a placa en top agar sobre placas de agar LB con 100 \mug ml^{-1} de ampicilina.

Preparación de fracción de hemoglobina

Se eliminaron los parásitos de F. hepatica de los conductos biliares de hígados infectados de ganado condenado en un matadero local de Irlanda. Los parásitos fueron lavados seis veces en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,3, y a continuación se mantuvieron en RPMI-1640, pH 7,3, que contenía un 2% de glucosa, HEPES 30 mM y 25 mg ml^{-1} de gentamicina a 37ºC durante 18 horas. Tras este periodo de incubación se retiró el medio de cultivo, se centrifugó a 12000 x g durante 30 minutos y se recuperó el sobrenadante (productos ES) y se almacenó a -20ºC.

Se concentraron quinientos mL de productos ES hasta 15 mL en una unidad de Ultrafiltración Amicon 8400 (Danvers, MA, EE.UU.) con una membrana YM3 (corte en 3.000 mw). La muestra concentrada se centrifugó a 12.000 x g durante 30 minutos y se aplicó a una columna Sepharyl S-200 de 340 mL equilibrada en Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0, a 4ºC. Una vez que había pasado el volumen vacío (110 mL) se tomaron fracciones (5 mL). Se monitorizó la absorbancia del eluato a 280 nm usando un Monitor UV Atto. Las fracciones que contenían hemoproteína (de color amarillo) fueron reunidas y concentradas en una unidad de Ultrafiltración Amicon 8050 hasta 5 mL. Dicho concentrado se denominó fracción de hemoglobina (Hf).

Preparación de sueros de inmunoescrutinio

Se escrutó inmunológicamente la biblioteca de cADN usando un conjunto de sueros procedentes de animales vacunados con fracción de hemoglobina (Hf) tal como se ha descrito antes. Los sueros se tomaron después de tres vacunaciones con Hf y antes de la exposición al parásito. Antes de usarse, los sueros fueron pre-adsorbidos para eliminar todos los anticuerpos reactivos con proteínas de E. coli. Esto se logró incubando los sueros con discos de nitrocelulosa que contenían proteínas de E. coli ligadas a temperatura ambiente durante 6 h. Este procedimiento de adsorción se repitió tres veces. Los discos se prepararon incubando los discos en un extracto sonicado de células de E. coli (10 ciclos de 30 segundos, descansos de 0,7 segundos) durante 24 h a 4ºC, y bloqueando a continuación las posiciones de exceso con BSA/T-PBS al 1%. Los sueros se incubaron con discos, se retiraron, se centrifugaron y se almacenaron a 4ºC hasta su uso.

Inmunoescrutinio de biblioteca \lambda

Se infectaron células competentes Y1090 de E. coli con una dilución 1:50 de fago. Tras una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, las células fueron llevadas a placa en top agar sobre placas de ampicilina LB e incubadas a 42ºC hasta que se observaron plaquetas (aproximadamente 3 h). Se tomaron discos de nitrocelulosa que habían sido empapados en IPTG 10 mM y secados al aire, y se colocaron con cuidado en las placas señalando su orientación con tres marcas de aguja. Las placas fueron incubadas durante 4 h a 37ºC, a continuación los discos se retiraron con cuidado y se bloquearon durante una noche en BSA/T-PBS al 1%, antes de probar con los antisueros bovinos pre-absorbidos (dilución 1:500). Tras lavar en T-PBS se detectó anticuerpo ligado usando IgG anti-bovina marcada con fosfatasa alcalina, con NBT y BCIP como sustrato. Las plaquetas positivas aparecían en forma de anillos púrpura. Dichas plaquetas fueron extraídas en como un pistón de agar usando una pipeta pasteur esterilizada, fueron transferidas a 1 mL de tampón de fago (MgSO_{4} 10 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,4) y se permitió que difundieran a 4ºC toda la noche. Se volvieron a colocar en placa los fagos individuales y se repitió el escrutinio de anticuerpos dos veces más o hasta que se obtuvieron plaquetas puras, es decir, cuando todas las plaquetas de una placa reaccionaron con el anticuerpo.

3. Preparación de lisatos \lambda y aislamiento de ADN

Las plaquetas aisladas se recogieron en 200 \muL de tampón SM 0,1X (gelatina al 0,01%, MgSO_{4} 8 mM, NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) y se incubaron durante una noche a 4ºC. Se usaron cien \muL para infectar células Y1090 competentes, que fueron colocadas en placa como se ha indicado antes, y se incubaron a 42ºC hasta que se observó una lisis confluente (aproximadamente 5 h). Se añadieron cuatro mL de tampón 0,1X SM a la placa y después de una noche de incubación a 4ºC se retiró el tampón. Se añadió cloroformo (concentración final del 0,5%) y se almacenó el lisato a 4ºC hasta su uso.

4. Análisis PCR de ADN \lambda

Se empleó Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) para aislar y estimar el tamaño de los injertos procedentes de la biblioteca de fagos, usando cebadores \lambda universales. Dichos cebadores derivan de la secuencia que rodea la posición de clonación EcoR I del vector \lambda gt11. Se añadieron veinte \muL de lisato \lambda a 180 \muL de agua y se llevaron a ebullición durante 10 minutos, y a continuación se usó 1 \muL por cada 50 \muL de PCR. Cada vial de PCR consistió en la siguiente mezcla:

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Cada mezcla se recubrió con 70 \muL de aceite mineral, se colocó en el Hybaid Omnigene Thermal Cycler, y la PCR se realizó como se indica a continuación:

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Se analizaron 25 \muL de reacciones PCR mediante electroforesis de gel de agarosa, tal como se detalla en Sambrook y col. (1989).

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5. Sub-clonación de fragmentos PCR

Los fragmentos de genes amplificados mediante PCR fueron separados del gel. Se descompuso la agarosa usando partículas de vidrio, y el ADN recuperado se purificó usando el sistema de limpieza de ADN Wizard ^{TM} (Promega). A continuación los fragmentos fueron sub-clonados directamente en plásmido pGem®-T, tal como se indica a continuación:

1 \muL (25 ng) de vector pGem®-T, 8 \muL de tampón de ligasa (ATP 10 mM, MgCl_{2} 100 mM, DTT 100 mM, tris-HCl 300 mM, pH 7,8), 1 U de ligasa de ADN T4 y 100 ng de injerto de ADN fueron mezclados suavemente y se permitió que se produjera la reacción de unión durante una noche a 4ºC.

Las células competentes se prepararon usando uno de los siguientes métodos:

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(a) transformación de cloruro de calcio

Se tomaron alícuotas de un cultivo de fase logarítmica de células JM109 de E. coli, se colocaron en hielo durante 5 minutos, se centrifugaron a 12.000 x g durante 2 minutos y se eliminó el sobrenadante. Las células fueron resuspendidas suavemente con 1 mL de CaCl_{2} frío y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células volvieron a ser agitadas y resuspendidas en 0,5 mL de CaCl_{2} frío. Se añadieron cuidadosamente 10 \muL de mezcla de ligadura a alícuotas de 50 \muL de células, y se llevaron a hielo durante otros 30 minutos. A continuación las células fueron sometidas a un golpe de calor a 42ºC durante 90 segundos y se devolvieron al hielo durante 2-5 minutos. Inmediatamente después de la transformación se añadieron 950 \muL de medio LB precalentado y las células fueron incubadas a 37ºC durante 1 h. Las células se concentraron mediante centrifugación y fueron extendidas en placas LB que contenían 100 \mug mL^{-1} de ampicilina, IPTG 0,5 mM y 40 \mug mL^{-1} de X-Gal (para selección azul/blanco).

(b) electroporación

Se concentró un cultivo de fase logarítmica de células electrocompetentes de E. coli XL1-blue mediante centrifugación y se dividió en alícuotas. Se añadieron 2,5 \muL de reacción de ligación a 300 \muL de células, se mezcló suavemente y se llevó a cubetas de electroporación de 0,2 \mum. A continuación las células se transformaron mediante electroporación en las siguientes condiciones: el generador de pulsos se fijo a 25 \muF, 2,48 kV y 200 \Omega. En estas condiciones un pulso da lugar a un pulso de 12,5 kV cm^{-1} con una constante de tiempo de aproximadamente 4 segundos. Se añadió inmediatamente 1 mL de medio SOC precalentado (que contenía glucosa 20 mM) y las células se incubaron durante 1 h a 37ºC, antes de concentrar y llevar a placa como se ha indicado anteriormente. Las placas cubiertas con células transformadas se cultivaron durante una noche a 37ºC.

6. Escrutinio de plásmidos recombinantes

Con el escrutinio de color de X-Gal y de IPTG, las colonias recombinantes deberían ser blancas y las colonias sin injerto de ADN azules. Las colonias blancas se recogieron en 2 mL de LB con 100 \mug mL^{-1} de ampicilina (y 15 \mug mL^{-1} de tetraciclina para las células azules XL), y se incubaron una noche a 37ºC. El ADN de plásmido de 1 mL de dicha minipreparación de cultivo se aisló alcanzando ebullición o mediante el método de lisis alcalina descrito por Sambrook y col. (1989). El ADN se digirió doblemente con las enzimas de restricción Sac I y Apa I y los injertos fueron observados mediante electroforesis de gel de agarosa.

7. Secuenciamiento de ADN de Plásmido

Se limpió aún más el ADN de plásmido purificado de los clones positivos usando preparaciones Wizard ^{TM} \lambda. El ADN se envió para analizar la secuencia al Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Dirham o a BioResearch Ireland, Trinity College de Dublín.

8. Preparación de proteína de fusión

El análisis de la secuencia reveló que el clon B1 era una nueva proteína antioxidante de parásito (peroxirredoxina) que, por tanto, fue caracterizada con mayor profundidad. La proteína de fusión del clon \lambda B1 se preparó mediante el método de sobrenadante de lavado de placa. Se infectaron células Y1090 competentes de E. coli con 10.000 pfu de fagos recombinantes y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente, antes de ser vertidos en placas de ampicilina LB en top agar. Las placas fueron incubadas a 42ºC durante 3 h (lisis casi confluente), y a continuación se añadieron a las placas 5 mL de tampón de fago que contenía EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, iodoacetamida 1 mM e IPTG 10 mM, y se cultivaron a 37ºC una noche. Se recuperó el tampón y también se rascó el top agar en un tubo de centrífuga. Éste fue sometido a vórtice durante 20 segundos antes de centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se llevó el sobrenadante a tubos de microfuga que se giraron de nuevo a 12.000 x g. Los sobrenadantes se almacenaron a -20ºC hasta su uso.

La proteína de fusión se analizó mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS reductor seguido de tinción de plata, y mediante inmunotinción usando un anticuerpo primario anti-\beta-galactosidasa.

9. Preparación de sonda de ADN radiomarcada

Se amplificó mediante PCR un fragmento de 400 pb a partir de ADN de clon B1 usando los siguientes cebadores de consenso, diseñados a partir de la comparación de secuencias de proteínas de la familia de antioxidantes de peroxirredoxina. Dichos cebadores cruzaron las regiones que codifican las regiones de centros activos, cys 47 (VCP 47) y cys 168 (VCP 168).

Cebador delantero VCP 47 (Shem F)

: 5' GAT TTY ACW TTY GTN TGT CCW ACW GAR -3'

Cebador inverso VCP 168 (SmTSAR)

: 5' GGW CAN ACY TCW CCA TGY TC -3'

en donde Y = T ó C, W = A ó G y N = T, C, A ó G

\newpage

El producto PCR fue separado de un gel de agarosa y lavado como se ha indicado antes. El fragmento se marcó con Alpha ^{32}P mediante imprimación aleatoria usando el sistema Promega Prime-a-Gene®. La mezcla de reacción fue la siguiente:

4

El tubo de reacción se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Se añadieron 200 \muL de EDTA 0,5 M y la reacción acabó con una ebullición durante 2 minutos. En ese momento la sonda estaba preparada para su uso en las reacciones de hibridación.

10. Aislamiento de ARN y análisis de Northern blot a. Aislamiento de ARN de parásito adulto

Se cultivaron parásitos maduros durante una noche en RPMI-1640, pH 7,3, que contenía un 2% de glucosa, HEPES 30 mM y 25 mg/L de gentamicina, para permitir la eliminación del contenido intestinal que pudieran contener las células hospedantes. Se tomaron aproximadamente 10 parásitos (1 gramo de tejido) y se llevaron a un tubo de centrífuga, se añadieron 5 mL de RNAzol^{TM} y los parásitos fueron homogeneizados a máxima velocidad durante 30 segundos usando un homogeneizador Thyristor Regler TR50. Se añadió un mL de cloroformo y se agitó la disolución vigorosamente durante 15 segundos y se llevó a hielo durante 5 minutos. Tras dividir en alícuotas y ponerlas en tubos de microfuga, la disolución se centrifugó a 13.000 x g durante 15 minutos a 4ºC y se formaron dos capas. La fase acuosa superior se trasladó a un nuevo tubo, se añadió un volumen igual de isopropanol y las muestras se incubaron a 4ºC durante 15 minutos (o se dividieron en alícuotas para ser almacenadas a largo plazo a -80ºC). Se volvieron a centrifugar durante 15 minutos, se retiró el sobrenadante y se lavó la partícula de ARN con etanol al 75% antes de secar y reconstituir con 200 \muL de agua tratada con DEPC al 0,1%. Se aisló ARN de bovino usando el mismo procedimiento con 1 gramo de hígado fresco de bovino como material de partida. Se analizó el ARN mediante electroforesis sobre geles de agarosa que contenían formaldehído como se detalla en Sambrook y col. (1989).

b. Análisis de Northern blot

Después de la electroforesis se enjuagó el gel con agua tratada con DEPC para eliminar el formaldehído y el ARN se transfirió a una membrana de nitrocelulosa empleando el método de transferencia capilar descrito por Sambrook y col., (1989). Los fragmentos de ARN fueron extraídos del gel con un flujo de tampón, y se depositaron sobre la superficie de la nitrocelulosa. Después de la transferencia, el ARN se fijó sobre la membrana mediante cocción a 80ºC durante 2 h en un horno.

c. Hibridación con la sonda radiomarcada

El filtro de nitrocelulosa se empapó en 6X SSC (NaCl 0,9 M, citrato sódico 90 mM, pH 7,0) hasta que quedó completamente humedecido y se colocó en una bolsa que se sella térmicamente. A continuación, se añadieron a la bolsa 200 mL de disolución de prehibridación (6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, 100 \mug mL^{-1} de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado). Se extrajo la máxima cantidad posible de aire de la bolsa, que fue sellada e incubada durante la noche a 68ºC. Tras la incubación se abrió la bolsa rompiendo una esquina y se añadió cuidadosamente la sonda radiomarcada. Se volvió a sellar la bolsa, se metió en una segunda bolsa sellada y se volvió a incubar a 68ºC durante 24 h. Se vertió cuidadosamente la disolución de hibridación en un recipiente adecuado, y los filtros fueron retirados y sumergidos inmediatamente en 300 mL de 2X SSC y SDS al 0,1%. Los filtros se incubaron con una agitación suave a temperatura ambiente durante 15 minutos. La disolución de lavado se sustituyó dos veces y se repitió la incubación. Entonces se añadió 0,1X SSC y SDS al 0,5% a los filtros que volvieron a incubarse a 68ºC durante 1 h. Se aclaró los filtros con 0,1X SSC para eliminar el SDS, se mancharon brevemente sobre toallas de papel y se envolvieron en papel adhesivo, y a continuación se expusieron a una película de rayos-X a -80ºC para obtener una imagen autorradiográfica. Se necesitó una exposición durante 24 h a 80ºC con una pantalla intensificadora para obtener una imagen.

11. Ensayo de extracto de parásito maduro para determinar nuevas actividades antioxidantes

Se midió la actividad antioxidante de extracto de parásito de hígado monitorizando su capacidad para inhibir la desactivación de glutamina sintetasa mediada por tiol/hierro/oxígeno. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de microtitulación con un volumen de reacción de 100 \muL que contenía 0,5 U de glutamina sintetasa (E. coli), en presencia o en ausencia de disoluciones de desactivación y de proteína protectora (homogenato de parásito de hígado). Las disoluciones de desactivación consistieron en FeCl_{3} 15 \muM y DTT 5 mM o 2-mercaptoetanol 14 mM (concentraciones finales). Tras una incubación de 10 minutos a 37ºC se midió la actividad remanente de glutamina sintetasa añadiendo 100 \muL de mezcla de ensayo de \gamma glutamil transferasa. Ésta contenía ADP 0,4 mM, glutamina 150 mM, arsenato potásico 10 mM, cloruro de manganeso 0,4 mM, cloruro de hidroxilamonio 20 mM en imidazol-HCl 50 mM, pH 7,0. La reacción se incubó a 37ºC durante 30 minutos y finalizó con la adición de 50 \muL de mezcla de parada, que consistía en 55 g de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 20 g de ácido tricloroacético y 21 mL de HCl concentrado por litro. La absorbancia resultante del complejo \gamma glutamil hidroxamato-Fe^{3+} se midió a 540 nm. En ausencia de "proteína protectora" en dichas condiciones se perdió entre el 70 y el 100% de la actividad de glutamina sintetasa.

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12. Inmunoescrutinio de biblioteca de cADN de F. Hepatica y análisis de clones aislados mediante PCR y digestión de restricción

Se usaron sueros de las pruebas de vacuna para escrutar una biblioteca de cADN de F. hepatica construida en fago \lambda gt11. El conjunto de sueros usados se obtuvo el día de la exposición al parásito (semana 11) de animales inmunizados con fracción de hemoglobina (Hf). Dichos animales mostraron un nivel medio de protección frente a la exposición a parásito del 43,8%.

Estos sueros debían contener anticuerpos reactivos con hemoglobina y cualquier otro antígeno presente en la fracción de inmunización.

Se usaron diez placas con aproximadamente 2.000 pfu cada una en el escrutinio primario con una dilución 1:500 de sueros pre-adsorbidos. Se eligieron treinta plaquetas positivas y éstas se sometieron a otras tres o cuatro rondas de escrutinio hasta que todas las plaquetas de las placas fueron positivas, indicando la presencia de clones puros. A continuación se prepararon lisatos de las plaquetas positivas y se analizó el ADN mediante PCR usando cebadores \lambda delanteros e inversos. De los treinta positivos seleccionados sólo veinte produjeron productos de PCR; por tanto los otros diez fueron desechados. Los clones se clasificaron en grupos en base al tamaño del fragmento de PCR
(Figura 1).

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5

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13. Subclonación de injertos de fago

La subclonación se llevó a cabo con D6 del Grupo 1 de clones (1700 pb) y con B1 del Grupo 3 (1400 pb). Los productos \lambda de PCR de estos dos clones fueron subclonados directamente en el plásmido pGem®-T. Se seleccionaron las colonias blancas y se escrutaron mediante digestión doble con las enzimas de restricción Sac I y Apa I. Se aisló un clon con un injerto de 1600-1700 pb de D6 y del clon B1 se obtuvo un injerto de 1400-1500 pb.

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14. Análisis de secuencia del clon D6

Se secuenció comercialmente el ADN de plásmidos recombinantes después de una purificación con preparaciones Wizard ^{TM} \lambda. Del clon D6 se obtuvo una secuencia parcial de aproximadamente 420 bases. La secuencia deducida de 141 aminoácidos se comparó con secuencias disponibles en bases de datos, y se descubrió que presentaba una homología significativa con el extremo C-terminal de las \beta-tubulinas de varios organismos. Las \beta-tubulinas son proteínas de 440-450 aminoácidos de longitud, que corresponden a aproximadamente 1320 bases, por tanto el clon D6 de aproximadamente 1700 bases puede contener el gen de \beta tubulina de F. hepatica entero. La Figura 2 muestra el alineamiento de la secuencia parcial de D6 con \beta-tubulina de Toxoplasma gondii. En la región de solapamiento, la secuencia de D6 muestra un 64% de identidad y un 73% de similitud con el extremo C de la tubulina de protozoo.

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15. Análisis de secuencia del clon B1

Se estimó que el injerto del clon B tenía aproximadamente 1400 pb de longitud mediante amplificación PCR usando cebadores \lambda. Se secuenciaron aproximadamente 1200 bases del injerto en la dirección 5' a 3'. Esto reveló un codón ATG de inicio y un marco de lectura abierto de aproximadamente 20 residuos de adenina (cola Poli A), precedidos de dos secuencias de poliadenilación, AAAATAAA y AATA, lo que indica que el clon estaba completo en su extremo 3'. El ADN tiene una región 5' sin traducir de aproximadamente 200 bases y una región 3' sin traducir de aproximadamente 700 bases.

Se predice que el clon B1 codifica una proteína de 194 aminoácidos con una masa molecular calculada de 21.646 Da. Cuando se usa para escrutar bases de datos de secuencias de proteínas, la secuencia de aminoácidos predicha muestra una identidad altamente significativa con una nueva familia de proteínas antioxidantes, la familia peroxirredoxina. En la Figura 3 se muestra el alineamiento del clon B1 con antioxidante específico de tiol de rata (TSA, número de acceso de GenBank P35704), factor B de potenciamiento de células asesinas naturales humanas (NKEF B, número de acceso P31945), gen asociado a la proliferación humano (PAG, número de acceso X67951), TSA humana (Lim y col., 1994, número de acceso P35701), y TSA de Onchocerca volvulus (número de acceso 009385).

La proteína con la mayor identidad es la TSA de rata; 57,0% y con un 74,6% de similitud. Las demás identidades son las siguientes: NKEF B humana, 56,9% (similitud del 71,5%), PAG humana, 53,8% (similitud del 73,0%), TSA humana, 53,7% (similitud del 71,0%), TSA de Onchocerca volvulus, 2,0% (similitud del 33,7%).

La similitud se observó en la longitud completa de las secuencias, y se observaron dos dominios altamente conservados. El primero de ellos es una tira de dieciséis aminoácidos de posiciones aproximadas 40-60, - F Y P L D F T F V C P T E I I A -. El segundo dominio, más corto, - H G F V C P A -, se encuentra en las posiciones aproximadas 165-175.

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16. Expresión de proteína de fusión mediante clon B1

Se usó el método de sobrenadante de lavado de placa para fabricar proteínas de fusión a partir de fago de clon B1. Se analizó el sobrenadante resultante y el sobrenadante procedente de E. coli infectado con fago natural mediante reducción de SDS PAGE (Figura 4A). En la preparación natural se observó una proteína con la misma masa molecular que la \beta-galactosidasa (banda 1). En los sobrenadantes de B1 dicha proteína no se encontraba presente, pero se observó una proteína más grande de aproximadamente 160 kDa, no observada en el tipo natural (banda 2). Para determinar si ésta era la proteína de fusión, se coaguló el gel en papel de nitrocelulosa y se evaluó con anticuerpos anti-\beta-galactosidasa (Figura 4B). La unión del anticuerpo a la proteína grande confirmó su identidad como proteína de fusión de \beta-galactosidasa (banda 2). El anticuerpo también se unió a la molécula de \beta-galactosidasa natural (banda 1) y a otras proteínas comunes a ambos sobrenadantes.

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17. Análisis Northern

Se usaron cebadores diseñados a partir de dominios conservados de las proteínas antioxidantes (alrededor de las estructuras VCP en las posiciones aproximadas 50 y 170), para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 400 pb de longitud. Éste fue marcado con ^{32}P y se usó como sonda para ARN de F. hepatica y de bovino, que fueron analizados sobre gel de agarosa antes de coagular. Se encontró un único tránscrito de aproximadamente 750 kb en el ARN de F. hepatica (Figura 5, banda 1). No se observó una unión similar a peroxirredoxina en el ARN de bovino (Figura 5, banda 2).

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18. Actividad antioxidante de extracto de parásito maduro

Se midió la actividad antioxidante como la capacidad de un extracto de parásito de hígado para prevenir la desactivación de glutamina sintetasa por un sistema de desactivación de mezcla de tiol y hierro. La Figura 6 muestra la desactivación de glutamina sintetasa por hierro y DTT en presencia de varios niveles de homogenato de parásito de hígado (LFH). La incubación de glutamina sintetasa con hierro y DTT da como resultado una pérdida del 70% de la actividad enzimática. La presencia de LFH proporciona una protección dependiente de la dosis, obteniendo con valores de dosis de 0,3 mg, 0,6 mg y 0,9 mg de LFH una restauración de la actividad de glutamina sintetasa del 50%, 61% y 75%, respectivamente.

Bibliografía

Lim., Y. S., Cha, M. K., Kim, H. K. Y Kim, I. H. 1994. The thiol-specific antioxidant protein from human brain: gene cloning and analysis of conserved cysteine regions. Gene 140, 279-284.

Nagel, S. D. y Boothroy, J. C. 1988. The a and b tubulins of Toxoplasma gondii are encoded by single copy genes containing multiple copy introns. Molecular and Biochemical Parasitology 29, 261-273.

Rajasekariah y col. (1979), Parasitology 79, 393-400.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. 1989. En Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Patente del R.U. Nº 2169606B

WO94/09142

WO94/28925

WO96/10583

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: John Pius Dalton

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(B): CALLE: 22 Orpen Rise, Orpen Grove

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(C): CIUDAD: Blackrock

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(D): ESTADO: Condado de Dublín

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(E): PAÍS: República de Irlanda

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): *

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna que contiene una peroxirredoxina y/o una B-tubulina.

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: PC compatible IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30 (EPO)

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(vi): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9612214.8

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-JUN-1996

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 700 pares base

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 2..700

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 1:

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6

60

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 141 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 2:

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7

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 449 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 3:

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8

9

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1163 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 179..763

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 4:

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10

100

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 194 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 5:

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11

111

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 198 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 6:

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12

112

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 198 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 7:

13

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 8:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 198 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 8:

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14

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 9:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 198 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 9:

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15

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(2) INFORMACIÓN CORRESPONDIENTE A LA SEQ ID NO 10:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 161 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 10:

16

Claims

1. Una composición de vacuna para su uso para combatir una plaga parasitaria de helmintos en un mamífero, en la que el material antigénico comprende una molécula de peroxirredoxina de Fasciola hepatica, sustancialmente correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4, en forma al menos parcialmente purificada, junto con un vehículo y/o adyuvante.

2. Una vacuna como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que dichas moléculas antigénicas incorporadas en dicha vacuna son puras al menos en un 75%.

3. Una vacuna como la reivindicada en la reivindicación 2, en la que dichas moléculas antigénicas incorporadas en dicha vacuna son puras al menos en un 95%.

4. Una vacuna como la reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende uno o más determinantes antigénicos adicionales para formar una vacuna polivalente.

5. Una vacuna como la reivindicada en la reivindicación 4, en la que dichos determinantes antigénicos adicionales son antígeno de Catepsina de tipo L y/o antígeno de dipeptidil peptidasa y/o un antígeno de hemoproteína y/o un antígeno de \beta-tubulina.

6. El uso de moléculas de peroxirredoxina como las definidas en la reivindicación 1, en la preparación de una composición de vacuna para combatir una plaga parasitaria de helmintos en un mamífero.

7. Un proceso para la preparación de una vacuna como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende asociar dicha peroxirredoxina purificada y uno o más adyuvantes o vehículos.

8. Una molécula de ADN que codifica una molécula de peroxirredoxina de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 4.

9. Una proteína de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4.

10. Un vector que comprende una o más secuencias de nucleótidos como las definidas en la reivindicación 8.

11. Una célula hospedante transformada que comprende el vector de la reivindicación 10.

12. Un proceso para la preparación de polipéptidos de peroxirredoxina recombinante que comprende cultivar células hospedantes transformadas de acuerdo con la reivindicación 11, y aislar dichos polipéptidos de peroxirredoxina a partir de células cultivadas.

13. Una formulación de vacuna activa o desactivada, que comprende un virus atenuado o virulento, o una célula hospedante, que lleva insertada una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 8, capaz de estimular una respuesta inmune contra polipéptidos codificados por la molécula de ácido nucleico insertada.