CN101294154B - 一种生产大片吸虫组织蛋白酶l1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，包括一个用PCR从大片吸虫成虫cDNA文库中扩增出大片吸虫组织蛋白酶L1基因的过程，一个构建含有组织蛋白酶L1全长基因的重组质粒的过程，一个将重组质粒转化入大肠杆菌中进行增殖的过程，一个诱导表达含有正确的重组质粒转化的大肠杆菌的过程，然后收集菌液，透析、过滤，最后将样品加入预先用水洗缓冲液处理好的蛋白纯化柱中，用水洗缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液洗脱蛋白，得到大片吸虫组织蛋白酶L1蛋白。本发明的方法是一种低廉且产量高的表达组织蛋白酶L1的方法。本发明中组织蛋白酶L1在大肠杆菌中的表达量可达700mg/L，且易于纯化，便于投入实践应用中。

Description

一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，尤其涉及酶的生产方法，特别是一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法。

背景技术

片吸虫病是由片形科片形属的大片吸虫和肝片吸虫寄生于牛羊等哺乳动物的肝脏和胆管内而引起的一种片形吸虫病。能引起宿主急性或慢性肝炎和胆管炎，并伴有全身性的中毒现象和营养障碍，危害相当严重，特别对幼崽和绵羊，可以引起大批死亡。在慢性病程中，使牛羊消瘦、发育障碍，生产力下降，并成为废物。该病在我国分布极其广泛，给畜牧业带来极大经济损失。该病也可感染人，严重影响人类的身体健康，是一种重要的人畜共患病。

现有技术中，片形吸虫病的诊断分为临床诊断和实验室诊断。实验室诊断又可分病原检查和免疫学检测。病原检查包括：反复沉淀法，硝酸铅漂浮法和尼龙筛集卵法，以上方法的检出率较低，而且易造成漏检，只有当虫体在体内发育成熟时才能从粪便中检出虫卵，这时虫体在移行时对器官已造成损伤，这样就延误了有效治疗时间而影响了对该病的控制。免疫检测方法包括：血凝试验(Indirect Haemagglutination，IHA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶联免疫印渍技术(ELIB)和斑点免疫金渗漏法(DIGFA)等，与病原检查相比，免疫检测方法具有检出率高，特异性强，敏感性高等优点，但诊断用抗原基本上都是虫源的，其获取方法繁琐且无法标准化。这又给片形吸虫病的确诊带来一定困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，所述的这种方法生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法要解决现有技术中用于诊断片形吸虫病的抗原获取困难的技术问题。

本发明一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，包括如下步骤：

步骤1，根据大片吸虫组织蛋白酶L1基因全长mRNA序列去除信号肽序列，设计含BamH I和Sal I酶切位点的特异性引物，用PCR从大片吸虫成虫cDNA文库中扩增出如SEQ ID NO：1所示的大片吸虫组织蛋白酶L1基因；

步骤2，将组织蛋白酶L1全长基因连接到一个载体上，形成重组载体，用BamH I和Sal I分别酶切重组载体和表达载体，对酶切产物进行纯化，然后用连接酶进行连接，形成重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌中进行增殖，PCR鉴定正确后，测序确认；

步骤3，取鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌，于含氨苄的培养基培养，30～44℃摇菌至OD600值0.4~0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.8-1.2mM，诱导表达，收集菌液，离心弃上清，备用；

步骤4，收集沉淀用尿素溶解，透析复性20-30h，滤膜过滤；

步骤5，把样品加入预先用水洗缓冲液处理好的蛋白纯化柱中，反复过柱2-5次，然后继续用水洗缓冲液冲洗，最后用洗脱缓冲液洗脱蛋白，得到大片吸虫组织蛋白酶L1蛋白。

进一步的，所述的含BamHII酶切位点的特异性引物为

5′-CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3′，

所述的含Sal I酶切位点的特异性引物为

5′-ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3′。

进一步的，用PCR从大片吸虫成虫cDNA文库中扩增出大片吸虫组织蛋白酶L1基因时的PCR参数为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、2min，30个循环；72℃、10min。

进一步的，所述的重组载体为pMD18-T/FgCL1，所述的表达载体为pGEX-4T-2。

进一步的，在所述的步骤2中，所述的大肠杆菌为DH5a。

进一步的，在所述的步骤3中，所述的大肠杆菌为BL21。

进一步的，所述的培养基为2×YT培养基。

进一步的，所述的大肠杆菌细胞的诱导温度为30℃。

进一步的，本发明还提供了大肠杆菌作为表达系统用来生产大片吸虫组织蛋白酶L1的用途。

本发明的原理是：半胱氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，广泛地存在于寄生虫体内，该酶涉及虫体的毒力、对组织和细胞的侵袭力和免疫逃避等多个方面。组织蛋白酶L1在片形吸虫的童虫和成虫生长发育阶段都有表达，可作为片形吸虫病早期诊断抗原。为了获得高表达的组织蛋白酶L1(FgCL1)，本发明利用大肠杆菌表达系统生产FgCL1蛋白，为片形吸虫病的早期诊断和防治奠定了基础。由于目前组织蛋白酶L1已被视为重要的诊断抗原候选抗原之一。本发明人在研究过程中，发现选择适当的表达载体，并利用大肠杆菌表达系统进行表达，可以显著提高组织蛋白酶的表达水平，利用IPTG进行诱导蛋白表达，可进一步诱导组织蛋白酶的高表达。

本发明采用的大肠杆菌表达系统由于E.coli易于培养、成本低，表达蛋白可大量生产，又易于纯化，人们对其基因结构及表达调控原理有了较多的了解，所以广泛的被人们采用，通常将外源基因导入到大肠杆菌中主要用于蛋白质的大量表达，在蛋白质的纯化、定位及功能分析方面有一定的价值。

本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明利用大肠杆菌表达系统表达了大片吸虫组织蛋白酶L1，并利用GST亲和层析的方法分离纯化FgCL1，表达产量可达700mg/l，从而为片形吸虫病免疫诊断方法提供了便利，是一种低廉且产量高的表达FgCL1的方法，其原核表达系统快速、简单、低廉，有利于纯化，所得产物可以应用于片形吸虫病的免疫诊断。

附图说明

图1为大片吸虫组织蛋白酶L1全长基因的电泳图，其中1，2为FgCL1扩增产物，3位空白对照，M为DNA Marker。

图2为pGEX/FgCL1重组质粒的双酶切图，其中M为DL2000，1为PCR产物，2为pMD18-T/FgCL1BamH I和Sal I双酶切产物，3为pGEX/FgCL1BamH I和Sal I双酶切的产物。

图3为pGEX/FgCL1重组质粒构建示意图。

图4为FgCL1的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白Marker，1为BL21对照，2为未诱导的空载体，3为空载体诱导，4、5、6、7、8为FgCL1诱导0.5、1、2、3、4h收集菌液。

图5为纯化后的FgCL1的SDS-PAGE电泳图，其中，1为空载体诱导，2为纯化后的FgCL1融合蛋白，3为IPTG诱导pGEX-FgCL1/BL21，M为蛋白Marker。

图6为纯化蛋白Western blot图，其中1，2为纯化蛋白，3为阴性对照，M为蛋白Marker。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的，以下说明不用于限制本发明的保护范围。

实施例1 重组质粒的构建

1.1组织蛋白酶L1全长基因的克隆

根据Gram等在GeneBank发表的大片吸虫组织蛋白酶L1基因全长mRNA序列，序列号是AF125566，设计一对含BamH I和Sal I酶切位点的特异性引物，

CAT1为5′-CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3′

CAT2为5′-ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3′

通过CAT1和CAT2从大片吸虫cDNA文库中扩增FgCL1基因序列。PCR参数为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃.10min。将PCR产物利用通过TA克隆连接到pMD18-T Vector上，PCR鉴定正确后测序(如图1所示)。

1.2pGEX-FgCL1的构建

如图2、图3所示，用BamH I和Sal I分别酶切重组载体pMD18-T/FgCL1和表达载体pGEX-4T-2，37℃水浴过夜后终止反应，用DNA胶回收试剂盒(购自TaKaRa公司)回收FgCL1相应条带和pGEX-4T-2，纯化后的酶切产物用T4连接酶进行连接，16℃连接过夜，形成重组质粒pGEX-FgCL1。

1.3重组质粒的鉴定

将重组产物转化入感受态大肠杆菌DH5α中，挑取氨苄抗性克隆(100ug/ml)，接种于LB培养基，37℃振荡培养过夜，提取重组质粒，经PCR鉴定正确后测序。

结果，测序证明并未发生移码突变。

1.4重组质粒的转化

取鉴定正确的重组质粒1ul转化E.coli BL21(DE3)中表达。

实施例2 细胞培养与蛋白诱导表达

挑取单克隆于含氨苄的2×YT培养基培养，37℃摇菌至OD值约0.4~0.6时，加入IPTG使其终浓度为1mM，继续摇菌4h，每小时收集1mL菌液，12000r/min离心2min。

诱导表达后蛋白电泳表明，在61KD位置有表达，见图4。

实施例3 分离纯化

按上述方法对阳性克隆进行大量诱导表达后用溶菌酶加超声裂解菌体，经8M尿素溶解，离心后将上清转移至透析袋，复性液中4℃透析24h，0.22μm滤膜过滤。然后参照High-Affinity GST Resin说明书进行融合蛋白的纯化。把样品加入预先用Washing buffer处理好的蛋白纯化柱中，反复过柱3次，然后继续用Washing buffer冲洗，后用Elution buffer洗脱蛋白，见图5。

实施例4 表达产物的生物特性鉴定

4.1分子量测定

将收集的细胞沉淀加入1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液振荡至细菌沉淀物完全溶解，100℃水浴5min，12000r/min离心2min，取上清进行SDS-PAGE电泳。分离胶和积层胶的浓度分别为12％和5％，加样20μL、电压条件分别为130V和80V，以低分子量标准蛋白作对照。考马斯亮兰染色1h，脱色液脱色数次拍照。

4.2抗原性检测

将收集的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，100V1h转移至硝酸纤维素膜(NC)上，5％脱脂奶粉封闭液中孵育2h，与1：200自然感染大片吸虫牛血清(畜禽寄生虫病防治技术研究室采集)反应1h，PBST洗脱三次，每次10min，再与羊抗牛IgG-HRP 1:5000室温作用1h。PBST洗涤三次后，置于底物溶液中显色。

Western blot显示61KD的蛋白能与自然感染大片吸虫牛血清结合，证明61KD蛋白的确是组织蛋白酶L1，结果见图6。

本发明组织蛋白酶L1在大肠杆菌中的表达产量可达700mg/ml，并且有融合标签，这就大大简化了纯化过程，给实践应用带来很大便利。

本发明利用大肠杆菌表达大片吸虫组织蛋白酶L1，包涵体经尿素变性，复性后经GST亲和层析分离纯化。这是一种低廉且高产的表达FgCLl的方法，为产业化生产奠定了基础。且大肠杆菌表达系统使用最早也研究最多，并且其遗传背景相对比较清楚，大肠杆菌表达系统操作简便、廉价、使用安全、周期短等优点。由于E.coli易于培养、成本低，表达蛋白可大量生产，又易于纯化，人们对其基因结构及表达调控原理有了较多的了解。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>933

<212>DNA

<213>FgCL1

<400>1

Claims (8)

1.一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：

步骤1，根据大片吸虫组织蛋白酶L1基因全长mRNA序列去除信号肽序列，设计含BamH I和SalI酶切位点的特异性引物，用PCR从大片吸虫成虫cDNA文库中扩增出如SEQ ID NO：1所示的大片吸虫组织蛋白酶L1基因；

步骤2，将组织蛋白酶L1全长基因连接到一个载体上，形成重组载体，用BamH I和Sal I分别酶切重组载体和表达载体，对酶切产物进行纯化，然后用连接酶进行连接，形成重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌(E.coli)中进行增殖，PCR鉴定正确后，测序确认；

步骤3，取鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)，于含氨苄的培养基培养，30～44℃摇菌至OD600值0.4～0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.8-1.2mM，诱导表达，收集菌液，离心弃上清，备用；

步骤4，收集沉淀用尿素溶解，透析复性20-30h，滤膜过滤；

步骤5，把样品加入预先用水洗缓冲液处理好的蛋白纯化柱中，反复过柱2-5次，然后继续用水洗缓冲液冲洗，最后用洗脱缓冲液洗脱蛋白，得到大片吸虫组织蛋白酶L1蛋白。

2.如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：所述的含BamH I酶切位点的特异性引物为

5′-CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3′，

所述的含Sal I酶切位点的特异性引物为

5′-ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3′。

3.如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：

PCR参数为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、2min，30个循环；72℃、10min。

4.如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：所述的重组载体为如图3所示的pMD18-T/FgCL1，所述的表达载体为如图3所示的pGEX-4T-2。

5.如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：在步骤2中，所述的大肠杆菌为DH5α。

6.如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：在步骤3中，所述的大肠杆菌为BL21。

7.如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：所述的培养基为2×YT培养基。

8.如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于：所述的大肠杆菌细胞的诱导温度为30℃。

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