CN102558313A

CN102558313A - 肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用

Info

Publication number: CN102558313A
Application number: CN2012100075992A
Authority: CN
Inventors: 孟继鸿; 张建华; 董敏; 江炳福; 徐明杰; 程险峰; 董晨; 戴星
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2012-07-11

Abstract

肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所述；核苷酸序列如SEQIDNO.2所述；该重组蛋白可应用于制备单克隆抗体、多克隆抗体以及肠道病毒71型特异性抗体的检测。本发明为肠道病毒71型感染的血清学检测提供了一种新的诊断抗原，经实验证明本发明提供的肠道病毒71型特异性抗原具有良好的敏感性和特异性，可被肠道病毒71型感染后的人血清以及灭活全病毒动物免疫血清识别，不但可以用于肠道病毒71型感染的血清学诊断，还可以用于疫苗研发以及使用过程中的免疫效果评价。与全病毒颗粒作为诊断抗原相比，本发明提供的特异性蛋白抗原制备简便，降低了试剂盒制备的成本。

Description

肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物医学的病毒免疫学检测技术领域，具体涉及一种可特异性检测肠道病毒71型抗体的重组蛋白及该重组蛋白的应用。

背景技术

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)属小RNA病毒科、肠道病毒属，是手足口病的主要病原体之一。除EV71外，多种肠道病毒包括柯萨奇病毒A组(4、5、9、10、16型)、柯萨奇病毒B组(2、5型)和埃可病毒等也能引起手足口病，其中以柯萨奇病毒A16(Coxsackie A16，CA16)最为常见。通常情况下，EV71感染引起的手足口病在临床症状和体征方面与CA16等其它肠道病毒所致的手足口病难以区别，但部分患儿也可出现无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹和神经源性肺水肿等多种神经系统并发症，有较高的病死率和致残率，严重危害婴幼儿的生命健康。

自1974年Schmidt等人首次报道EV71以来，EV71已在世界范围内引起多次暴发与流行。近年来，EV71感染疫情在亚太地区呈上升趋势，如1997年马来西亚、1998年我国台湾地区和1999年新加坡等地均出现暴发流行。2008年4月，我国安徽等较多省份相继出现暴发流行；据卫生部发布的法定传染病疫情报告显示，我国手足口病疫情呈逐年上升趋势。为有效控制EV71的流行，必须努力提高诊断和治疗水平、加强疫情监测与流行病学研究，发展有效的疫苗。其中早期特异性病原学诊断至关重要。早期诊断、早期治疗对于改善EV71型手足口病的预后、降低重症病例的病死率与致残率有重要意义。

目前用于EV71感染的诊断仍以传统的病毒分离技术为主，然后用中和试验鉴定并确定血清型，或利用EV71单克隆抗体进行间接免疫荧光法(IFA)鉴定。这些方法费时费力且敏感性差，不利于早期诊断。利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测EV71 RNA也是常见的方法，但由于其灵敏度很高，对实验室条件及操作人员要求也高，稍有不慎，极易引起交叉污染，出现假阳性，故难以在基层推广应用。而酶联免疫吸附试验(ELISA)由于其快速敏感且操作简单、无需太多的实验设备，适合在广大基层诊疗机构中推广应用。

目前国内外EV71感染的ELISA检测，按所采用的抗原不同可以分为两大类。第一类是采用EV71灭活全病毒颗粒作为抗原来检测EV71特异性抗体。这一方法在实际应用中存在明显的不足：一是利用纯化的EV71病毒颗粒做抗原，即使在纯度得到保证的情况下，病毒颗粒表面仍然存在一些与其他肠道病毒有交叉反应的抗原位点，故其特异性得不到保证。二是病毒培养和纯化过程不仅操作复杂、成本高，而且还易导致活病毒污染。第二类是采用VP1重组蛋白作为抗原来检测EV71特异性抗体。VP1是最主要的表面抗原，直接决定病毒的抗原性，但除了含有EV71型特异性抗原位点以外，也存在其他肠道病毒共同的抗原表位，可被其他肠道病毒感染血清识别，这些表位将在一定程度上降低EV71特异性抗体检测的敏感性和特异性。

鉴于EV71的危害性以及目前血清学检测技术的一些缺陷，有必要开发一种EV71特异性抗原来替代上述诊断用抗原，以进一步提高EV71特异性抗体检测的敏感性和特异性。

发明内容

解决的技术问题：目前在肠道病毒71型感染诊断中，采用病毒分离以及中和抗体检测等方法存在着费时费力又不能快速诊断的弊端，采用RT-PCR等分子生物学方法存在着过程繁琐又需要昂贵的分子生物学试剂及相应的仪器设备等问题，采用全病毒颗粒作为诊断抗原也存在着抗原制备过程复杂、费时费力、生物安全隐患等问题，为了解决上述问题，本发明提供了一种含有肠道病毒71型特异性抗原表位的重组蛋白及其制备方法，可以代替全病毒颗粒作为诊断抗原进行血清学诊断抗原，用于肠道病毒71型特异性抗体的检测。

技术方案：肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原，表达该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

包含上述核苷酸序列的重组质粒。所述核苷酸序列的重组质粒为pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43、pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₂、pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₄和pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₆。

表达肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原的工程菌株，宿主菌为大肠杆菌，它含有上述的重组质粒。

肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原的制备方法，以SEQ ID NO.2所述的核苷酸为模板，设计上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6，然后进行PCR扩增获得目的基因，经EcoRI和BamHI双酶切后克隆至表达质粒pGEX-4T-2，构建重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43；分别利用EcoR I和BamH I双酶切和EcoR I和BglII双酶切重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43产生插入片段和载体，经T4 DNA连接酶连接形成含2个抗原编码基因片段的重组质粒pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₂，同法构建含4个和6个抗原编码基因片段的重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE₃)，获得重组工程菌；利用IPTG诱导表达重组蛋白并纯化获得目的蛋白。

肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原在制备单克隆抗体、多克隆抗体以及在制备肠道病毒71型特异性抗体检测试剂盒中的应用。

有益效果：本发明为肠道病毒71型感染的血清学检测提供了一种新的诊断抗原，经实验证明本发明提供的肠道病毒71型特异性抗原具有良好的敏感性和特异性，可被肠道病毒71型感染后的人血清以及灭活全病毒动物免疫血清识别，不但可以用于肠道病毒71型感染的血清学诊断，还可以用于疫苗研发以及使用过程中的免疫效果评价。与全病毒颗粒作为诊断抗原相比，本发明提供的特异性抗原蛋白制备简便，降低了试剂盒制备的成本。

附图说明

图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中A为EV71-VP1基因扩增，B为EV71-VP1_6-43区段扩增；

图2为表达质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43的构建流程图；

图3为SDS-PAGE分析GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白诱导表达情况，其中M表示蛋白分子量标准，1为诱导前，2-12为各菌落诱导2h；

图4为Western-blot分析GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白的免疫反应性，其中图4A是重组蛋白与EV71等相关病毒兔免疫血清IgG的反应性分析，其中1-3是抗EV71兔血清，4是抗CA16兔免疫血清，5是抗Echo6兔免疫血清；图4B是重组蛋白与手足口病患者血清IgM的反应性分析，1-13为EV71阳性血清(PCR)，14-16为CA16阳性血清(PCR)，17-18为EV71和CA16双阴性血清(PCR)；

图5为EV71-VP1_6-43多拷贝重组蛋白抗原的表达及免疫反应性比较。其中图5A为SDS-PAGE分析串联表达的GST重组蛋白纯化情况，其中M表示蛋白分子量标准，1为GST，2-5分别为含EV71-VP1_6-43不同拷贝数的GST重组蛋白；B和C：Western-blot分析EV71-VP1_6-43不同拷贝数GST-重组蛋白与EV71感染患者血清IgM的免疫反应性比较，图5B为EV71弱阳性血清，图5C为EV71强阳性血清。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1重组EV71特异性抗原蛋白的制备

1.1 EV71病毒流行株VP1基因序列测定

将EV71流行株-MAS0901病毒液接种至单层非洲绿猴肾细胞(Vero)上，36℃、5％CO₂培养，逐日观察细胞病变效应(CPE)，当CPE达80％以上后收获病毒，取140μL病毒培养上清，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒RNA，用One-Step RT-PCR Kit(QIAGEN)扩增VP1基因，上游引物(F1-SEQ ID NO.3)为5’-GCAGCCCAGAAGAACTTCAC-3’，下游引物(R1-SEQ ID NO.4)为5’-ACCACTCTAAAGTTGCCCAC-3’，产物大小为1015bp，扩增体系如下：

H₂O(RNase-free)	13.5μL
		5×One-Step RT-PCR Buffer	2.5μL
dNTP Mix(10mM)	1.0μL
		Primer F1(10μM)	1.0μL

[0025]

Primer R1(10μM)	1.0μL
		One-Step RT-PCR Enzyme Mix	1.0μL
Template RNA	5.0μL
		Total	25.0μL

扩增条件为：42℃逆转录45min；95℃预变性3min；95℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1.5min，35个循环；末次循环后72℃ 10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1A所示，扩增产物送Invitrogen公司测序。

1.2 EV71特异性抗原表位的筛选及目的基因克隆

从Genebank下载EV71和CA16等肠道病毒VP1基因序列，结合上述EV71流行株VP1基因序列，利用生物信息学软件DNAStar进行氨基酸序列同源性分析，结合抗原表位预测分析，筛选出EV71特异性抗原区段，即VP1的N端第6至43个氨基酸区段(38aa)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1：DVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGK，编码肽段的DNA片段起始序列为：GATGTAATTGAAAGTTCCATAGG，终止序列为CGACTGGATACAGGCAAG，以此来设计PCR扩增引物：

上游引物(F2-SEQ ID NO.5)：5′-TTT GGA TCC GGA GGA GGA GAT GTA ATT GAA AGT TCC ATA GG-3′(含BamH I酶切位点)

下游引物(R2-SEQ ID NO.6)：5′-CCC GAA TTC CTA AGA TCT CTT GCC TGT ATC CAG TCG-3′(含EcoRI、BglII酶切位点和TAG终止密码)

利用Expand High Fidelity PCR System(Roche)进行PCR，扩增体系如下：

ddH₂O	36μL
		10×Expand High Fidelity buffer	5μL
dNTP Mix(10mM)	2μL
		Primer F2(10μM)	2μL
Primer R2(10μM)	2μL
		Expand High Fidelity enzyme mix	1μL
Template DNA	2μL
		Total	50μL

反应条件：94℃预变性2min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 45sec，30个循环；末次循环结束后72℃ 10min。取PCR扩增产物5μL用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带，见附图1B。采用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)进行胶回收DNA。

1.3表达载体pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43的构建及鉴定

表达载体为pGEX-4T-2质粒(GE Healthcare)，具有氨苄青霉素(Amp⁺)抗性，并携带BamHI和EcoRI酶切位点。将pGEX-4T-2质粒转化至DH5α感受态细胞，挑单菌落进行细菌培养，并用QIAprep Spin Miniprep Kit抽提质粒，具体操作按说明书进行。

将pGEX-4T-2质粒和1.2中回收的目的基因利用BamHI和EcoRI限制性内切酶(Fermentas公司)进行双酶切，酶切体系如下：

10×buffer	6μL
		pGEX-4T-2质粒或PCR产物	～1μg(质粒)或～0.2μg(PCR产物)
BamHI	2μL
		EcoRI	2μL
ddH₂O	补足至60μL

将上述各成分混匀后置37℃水浴6小时后取出，利用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)分别回收pGEX-4T-2质粒和PCR产物。

然后进行连接反应(TaKaRa公司)，连接体系如下：

酶切纯化后的质粒载体pGEX-4T-2	0.03pmol
		酶切纯化后的PCR产物	0.3pmol
10×T4 DNA Ligase Buffer	2.5μL
		T4 DNA Ligase(350U/μL)	1.0μL
ddH₂O	补足至25μL

将上述成分混匀后置16℃过夜(约15小时)，同时做阴性对照，即用等量ddH₂O代替上述PCR产物。次日将连接反应产物转化DH5α感受态细胞，具体操作过程如下：

从-80℃冰箱中取出1支DH5α感受态细胞，置于冰上融化。取5μL连接产物加入50μL感受态细胞悬液中，轻柔混匀，依次进行如下处理：冰上放置30min，然后放入PCR仪，42℃1.5min，冰上放置2min，然后加入500μL经37℃预热的LB培养基(无抗性)中，混匀后置37℃摇床、100rpm摇1.5～2h，取100μL涂布在LB琼脂平板(含50μg/mL氨苄青霉素)上，置37℃恒温培养箱培养18h，同时做阳性对照(未酶切的pGEX-4T-2)和阴性对照以及感受态细胞对照。次日观察转化结果，挑取若干菌落利用pGEX-4T-2测序引物(参见《GST gene fusion system》附录4)做菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测在290bp处出现目的条带即为疑似阳性菌落，挑取疑似阳性菌落进行摇菌培养，抽提质粒，进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，可见在120bp处出现插入片段，即为阳性重组子。选择其中1个阳性重组子送Invitrogen公司测序，插入片段序列正确，将此重组质粒命名为pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43，表达质粒构建过程如图2所示。

1·4表达融合蛋白的重组工程菌构建

将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，操作方法同1.3，挑单菌落接种于3mLLB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)中，37℃过夜培养，次日以1∶200转种至3mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)中，37℃、200rpm摇菌培养至OD₆₀₀约为0.8时加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养，诱导2h，以诱导前菌体做对照，利用SDS-PAGE分析诱导表达情况，结果如附图3所示，第1泳道为未诱导的大肠杆菌对照，第2至12泳道分别为11个PCR阳性菌落诱导2h，考马斯亮蓝染色后在30kD处可见蛋白条带，即为可诱导表达目的蛋白的阳性重组工程菌，选择表达量最高的工程菌，用10％(V/v)甘油冷冻保存。

1.5重组EV71特异性抗原的制备和纯化

1.5.1GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白的诱导及表达条件优化

取1支冻存的重组BL21(DE3)菌种在冰上融化，用接种环划线接种LB琼脂平板(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜，次日按1∶200转种至25mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)中，37℃、200rpm摇菌培养至OD600约为0.8，将菌液分装至6支15mL灭菌试管，每管3mL，分别加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L和1.0mmol/L，继续培养，37℃诱导3h，离心收集菌体，用SDS-PAGE分析诱导表达情况，结果发现IPTG浓度为1.0mmol/L时表达量最大。

同法培养工程菌20mL，当OD₆₀₀为0.8时加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃继续培养，分别于0h、1h、2h、3h、4h和5h收集菌液，离心收获菌体，用SDS-PAGE分析诱导表达情况，结果发现诱导4h时表达量已达到峰值，此后不再增加，表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的25％。

同法培养工程菌100mL，按上述优化的诱导条件，即IPTG浓度为1.0mmol/L，37℃诱导4h，离心收获菌体，用1mL PBS重悬菌体，于-80℃冻融3次，加入溶菌酶和PMSF至终浓度分别为0.5mg/mL和1mmol/L，4℃放置30min，不断搅拌直至粘稠，加入DNase和RNase至终浓度为5μg/mL，室温振摇15min，至菌液不再粘稠。4℃、12000rpm离心15min，取上清，沉淀用等量PBS重悬，用SDS-PAGE分析重组蛋白的可溶性，结果发现重组蛋白几乎都在上清中，说明GST-EV71-VP1_6-43有很好的可溶性。

1.5.2 GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白的纯化

按1.5.1优化的诱导条件，摇菌培养1L菌液，可得到约6g菌体，重悬于20mL PBS中，按1.5.1所示方法破碎菌体，4℃、12000rpm离心15min，收集破菌上清，过滤后用Glutathione sepharose 4B(GE Healthcare)纯化，具体操作：取1.33mL Glutathione sepharose 4B装柱，柱床体积为1mL，用4℃预冷的PBS平衡层析柱，平衡后将柱介质加入20mL破菌上清中，置于水平摇床室温摇动结合1h，结合后重新装柱，收集穿过液，用4℃预冷的PBS洗柱3次，每次为10个柱体积，用Coomassie Plus(Bradford)Assay Kit检测蛋白含量，直至洗涤液不显色为止，用4℃预冷的洗脱液(含10mM还原型谷胱甘肽的PBS)洗柱，每次加1mL(1个柱体积)，检测蛋白洗脱情况，收集洗脱液，用SDS-PAGE分析重组蛋白纯化效果。结果显示，洗脱液中含有大量重组蛋白，浓度约为2mg/mL且纯度高达95％以上，6g菌体最终可获得约10mg纯化蛋白。

1.6重组EV71特异性抗原的性质检定

1.6.1 Western-blot分析GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白的免疫反应性

采用Western-blot分析GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白的免疫反应活性，具体操作方法：取适量纯化的GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白加等量的2×SDS-PAGE Loading Buffer混匀，煮沸5min后上样，进行SDS-PAGE，120V电泳1.5h后；电泳结束后取下凝胶，电泳转移至硝酸纤维素(NC)膜，250mA电转1.5h；电转完成后将NC膜浸入封闭液(5g脱脂奶粉溶于100mlTBST)中，室温封闭1h；将NC膜平铺于Mini-PROTEAN II(Bio-Rad)上，夹紧盖板后各孔道加入600μL血清样品(1∶100，用封闭液稀释)，室温孵育2h，用TBST洗涤3次，每次5min，各孔道分别加入600μL酶标二抗(1∶1000，用封闭液稀释)，室温孵育2h，用TBST洗涤3次，取下NC膜，立即放入底物液(DAB)中显色，待膜上出现清晰的棕色条带后，立即以蒸馏水冲洗终止反应。共检测5份兔免疫血清，包括3份抗EV71血清、1份抗CA16血清和1份抗Echo6血清，结果显示，3份抗EV71血清均呈阳性，而两份非EV71血清均呈阴性，见附图4A；同时检测了18份手足口病患者血清，包括EV71阳性血清(PCR阳性)13份，CA16阳性血清(PCR阳性)3份，EV71和CA16双阴性血清(PCR阴性)2份。结果显示13份EV71阳性血清均出现不同程度的显色反应，而5份EV71阴性血清无反应，见附图4B。通过Western-blot分析认为，GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白有良好的抗原反应性，且特异性高。

1.6.2间接ELISA分析GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白的免疫反应性

试剂配制：

(1)包被液(pH 7.2、0.01mol/LPBS)

取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.27g，加双蒸水至1L，调pH至7.2，4℃保存；

(2)洗涤液(0.05％PBST)

取Tween-20 0.5mL，溶于1L 0.01mol/L的PBS中；

(3)抗体稀释液(含1％BSA的PBST)

取BSA 5g，溶于500mL PBST中，4℃保存；

(4)底物液(TMB-过氧化氢尿素溶液)

A液：取Na₂HPO₄·12H₂O 9.205g，柠檬酸2.55g，过氧化氢尿素0.3g，加双蒸水至500mL，调pH至7.2，4℃保存；B液：四甲基联苯胺(TMB)0.1溶于10mL无水乙醇中，Na₂-EDTA0.073g，柠檬酸0.525g，溶于90℃双蒸水中，冷却后逐滴加入TMB无水乙醇溶液，4℃保存；

(5)终止液(2mol/LH₂SO₄溶液)

取浓硫酸100mL缓慢滴加到600mL双蒸水中并不断搅拌，加双蒸水至900mL。

操作步骤：

(1)抗原包被：将重组蛋白抗原用0.01mol/LPBS按一定比例稀释后包被聚苯乙烯酶标板，100μL/孔，置4℃冰箱过夜；次日用1×PBST洗涤3次，拍干；

(2)封闭：每孔加入100μL抗体稀释液，置37℃封闭30min，用1×PBST洗涤3次，拍干；

(3)加待检血清：将待检血清用抗体稀释液按1∶100稀释，100μL/孔，置37℃孵育45min，用1×PBST洗涤5次，拍干；

(4)加酶标二抗：将HRP标记的二抗用抗体稀释液按1∶5000稀释，100μL/孔，置37℃孵育45min，用1×PBST洗涤5次，拍干；

(5)显色：每孔加底物A液、B液各50μL，轻拍混匀，置37℃温育10min，

加入终止液50μL，轻拍混匀终止反应；

(6)测定：酶标仪(Bio-Rad 680)以空白对照孔调零，在主波长450nm、参考波长630nm处测定各孔A450值。

以GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白作为抗原，分别检测EV71灭活病毒及相关病毒免疫新西兰兔血清IgG抗体，实验步骤参见实施例1.6.2，实验结果见表1。6份EV71热灭活病毒免疫兔血清均呈阳性，而5份非EV71免疫血清(包括2份CA16、2份HAV以及1份Echo6免疫血清)均呈阴性，说明EV71-VP1_6-43重组蛋白含有EV71特异性抗原表位，可以用于EV71特异性抗体检测。

表1 GST-EV71-VP1_6-43重组蛋白检测抗EV71兔血清效果

实施例2重组EV71特异性抗原多拷贝串联表达及应用

为了进一步提高EV71特异性抗原的免疫反应活性，我们将EV71-VP1_6-43重组蛋白编码基因重复克隆至表达质粒pGEX-4T-2上，以实现EV71-VP1_6-43重组蛋白多拷贝串联表达。

2.1EV71-VP1_6-43重组蛋白多拷贝串联表达质粒构建

在实施例1.3制备的重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43基础上，利用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行双酶切获得目的基因，利用EcoRI和BglII限制性内切酶进行双酶切获得含有单拷贝EV71-VP1_6-43编码基因的载体pGEX-4T-2，酶切体系如下：

10×buffer	6μL
		pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43	～1μg
BamHI或BglII	2μL
		EcoRI	2μL
ddH₂O	补足至60μL

将上述各成分混匀后置37℃水浴6小时后取出，利用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)分别回收pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43重组质粒和EV71-VP1_6-43编码DNA。然后进行连接反应(TaKaRa公司)，连接体系如下：

酶切纯化后的重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43	0.03pmol
		酶切纯化后的EV71-VP1_6-43编码DNA	0.3pmol
10×T4 DNA Ligase Buffer	2.5μL
		T4 DNA Ligase(350U/μL)	1.0μL
ddH₂O	补足至25μL

将上述成分混匀后置16℃过夜(约15小时)，同时做阴性对照，即用等量ddH₂O代替上述PCR产物。次日将连接反应产物转化DH5α感受态细胞，具体操作过程同实施例1.3，获得的重组子经BamHI和EcoRI限制性内切酶双酶切鉴定阳性的，命名为pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₂。以该重组质粒为基础，按照上述策略构建含4拷贝和6拷贝的EV71-VP1_6-43重组pGEX-4T-2质粒，分别命名为pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₄和pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₆。

2.2EV71-VP16-43重组蛋白多拷贝串联表达与纯化

将上述表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，分别构建重组工程菌，操作方法同1.4，IPTG 1mmol/L、37℃诱导4h，离心收集菌体，以诱导前菌体做对照，用SDS-PAGE分析诱导表达情况，考马斯亮蓝染色后在35kD、44kD和53kD处可见目的蛋白条带，实验结果显示各重组工程菌均能表达含相应目的蛋白拷贝数的GST融合蛋白，用10％(V/v)甘油冷冻保存菌种。

将上述工程菌扩大培养，经IPTG 1mmol/L、37℃诱导4h后离心收集菌体，溶菌酶破碎菌体后分离上清与沉淀，采用SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性，发现这三种蛋白均为可溶性表达，即EV71-VP1_6-43目的基因拷贝数的增加并不影响融合蛋白的可溶性。收集破菌上清，分别用Glutathione sepharose 4B(GE Healthcare)纯化重组蛋白，具体操作方法同实施例1.5.2，纯化结果如附图5A所示，第1泳道为GST对照，第2至5泳道分别为含1、2、4和6拷贝EV71-VP1_6-43的GST重组蛋白。

2.3EV71-VP16-43单拷贝与多拷贝重组蛋白抗原反应性比较

2.3.1Western-blot分析比较EV71-VP1_6-43不同拷贝数重组蛋白抗原反应性

采用Western-blot分析比较EV71-VP1_6-43单拷贝与多拷贝GST重组蛋白的免疫反应活性。用PBS稀释实施例1和2制备的1、2、4和6拷贝EV71-VP1_6-43重组蛋白纯化蛋白，调整浓度至约0.5mg/mL，加等量2×SDS-PAGE Loading Buffer上样，进行SDS-PAGE，电转至NC膜进行免疫印迹反应，病人血清用作一抗，用封闭液(5g脱脂奶粉溶于100ml TBST中)作1∶100稀释，二抗为HRP标记的羊抗人IgM，用上述封闭液液作1∶2000稀释。具体操作方法同实施例1.6，实验结果如附图5B和5C所示。结果显示，EV71病人血清1(强阳性)与4种EV71-VP1_6-43不同拷贝数的重组蛋白反应无显著差别(附图5C)，但EV71病人血清2(弱阳性)与4拷贝和6拷贝重组蛋白的反应性明显强于单拷贝和2拷贝重组蛋白(附图5B)，说明多拷贝重组蛋白可以提高检测的敏感性。

2.3.2间接ELISA分析比较EV71-VP1_6-43不同拷贝数重组蛋白抗原反应性

将实施例1和2制备的1、2、4和6拷贝EV71-VP1_6-43重组蛋白作为诊断抗原，包被聚苯乙烯酶标板，利用间接ELISA原理检测病人血清中EV71特异性IgM抗体，比较不同拷贝数EV71-VP1_6-43重组蛋白的免疫反应性差异。按照实施例1.6.2所述的实验步骤，采用方阵滴定法确定4种EV71-VP1_6-43不同拷贝数重组蛋白的最佳包被浓度，同时检测8份人血清IgM抗体水平，包括6份EV71阳性血清和2份阴性血清，评价不同拷贝数重组蛋白的检测效果，结果见表2。

表2比较EV71-VP1_6-43不同拷贝数重组蛋白检测人血清IgM抗体效果

从ELISA分析结果看，含6拷贝EV71-VP1_6-43的重组蛋白作为抗原的检测效果最好，尤其对于弱阳性血清标本，可以显著提高检测的敏感性。

2.4GST-(EV71-VP1_6-43)₆重组蛋白检测病人血清IgM抗体效果评估

将纯化的GST-(EV71-VP1_6-43)₆重组蛋白用包被液作1∶800(方阵滴定)稀释，包被聚苯乙烯酶标板，检测人血清IgM抗体水平，具体操作方法按实施例1.6.2所示进行，共检测130份血清，包括70份手足口病患儿血清和60份非手足口病患儿血清，以患者临床标本RT-PCR检测结果作为参考，评估ELISA的检测效果，检测结果见表3。

表3间接ELISA检测手足口病患者血清IgM抗体效果分析

真实性和可靠性评价指标计算：灵敏度为91.91％，特异度为92.00％，粗一致性为91.54％，表明本法有良好的检测效果，利用本法进行EV71感染临床血清学诊断是切实可行的。

序列表

<110> 东南大学

<120> 肠道病毒71型特异性抗原的重组蛋白及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val Ser Arg Ala Leu Thr

1 5 10 15

His Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr Gln Val Ser Ser His

20 25 30

Arg Leu Asp Thr Gly Lys

35

<210> 2

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgtaattg aaagttccat aggagatagc gtgagcagag ccctcactca cgctctacca 60

gcacccacag gccagaacac acaggtgagc agtcatcgac tggatacagg caag 114

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcagcccaga agaacttcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accactctaa agttgcccac 20

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttggatccg gaggaggaga tgtaattgaa agttccatag g 41

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccgaattcc taagatctct tgcctgtatc cag 33

Claims

1.肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

2.肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原，其特征在于表达该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。

4.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43、pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₂、pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₄和pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₆。

5.表达肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原的工程菌株，其特征在于宿主菌为大肠杆菌，它含有权利要求3或4所述的重组质粒。

6.肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于以SEQ ID NO.2所述的核苷酸为模板，设计上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6，然后进行PCR扩增获得目的基因，经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后克隆至表达质粒pGEX-4T-2，构建重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43；分别利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切和EcoRⅠ和BglⅡ双酶切重组质粒pGEX-4T-2/EV71-VP1_6-43产生插入片段和载体，经T4 DNA连接酶连接形成含2个抗原编码基因片段的重组质粒pGEX-4T-2/(EV71-VP1_6-43)₂，同法构建含4个和6个抗原编码基因片段的重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE₃)，获得重组工程菌；利用IPTG诱导表达重组蛋白并纯化获得目的蛋白。

7.权利要求1所述肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原在制备单克隆抗体、多克隆抗体以及在制备肠道病毒71型特异性抗体检测试剂盒中的应用。