CN107449915A - 一种检测血清中抗ev‑d68病毒抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测血清中抗EV‑D68病毒抗体的方法。提取EV‑D68病毒基因组RNA，通过反转录和PCR扩增反应得到VP1基因的cDNA，将其克隆到克隆载体，再将转入表达载体得到重组表达质粒，转化宿主菌并用IPTG诱导蛋白表达，表达产物通过包涵体的提取、变性、复性、纯化得到可以作为鉴别诊断抗原的VP1融合蛋白。将抗原包被96孔酶标板，用间接Elisa方法检测已用EV‑D68灭活病毒抗原及佐剂制备的EV‑D68灭活疫苗免疫后的新西兰大白兔、恒河猴、小鼠的血清，来确定大肠杆菌表达的VP1融合蛋白作为检测抗原的敏感性和特异性。本发明确定了与EV‑D68VP1蛋白相结合的抗体的亲和力，具有操作简单，特异性高、灵敏度高、耗时短、成本低的特点。

Description

一种检测血清中抗EV-D68病毒抗体的方法

技术领域

本发明属于病毒抗体检测技术领域，具体是涉及一种检测血清中抗EV-D68病毒抗体效价的方法。

背景技术

肠道病毒D组68型(Enterovirus D68，EV-D68)属于小核糖核酸病毒科，最早于1962年在美国加利福利亚州的下呼吸道感染住院病人的咽拭子样本中分离获得。EV-D68病毒感染所导致的临床表现多样，从症状较轻的上呼吸道感染到严重的成人和儿童脑膜炎症状。研究表明，EV-D68在儿童中能够引起急性迟缓性麻痹(acute flaccid paralysis)及脑神经功能障碍(cranial nerve dysfunction)。近年来，EV-D68 病毒在中国及世界范围内均有流行。从2008年～2010年，EV-D68病毒在亚洲、欧洲、美国等地均有小范围流行。2014年12月，在全美 47个洲和哥伦比亚地区，有1152人被确诊为由EV-D68病毒引起的急性呼吸道感染。在我国，2014年8月，北京儿童医院的一个5岁女童被诊断为EV-D68病毒阳性，随后发展为严重的肺部感染。在中国，Xiang等人通过对2006年8月～2010年4月的6942例与急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection，ARTI)相关的成年病人(年龄≥15岁)的鼻拭、咽拭样本检测发现，其中130例样本为肠道病毒感染样本，而感染的肠道病毒以CA21和EV-D68为主，EV-D68感染比例为10％，然而，此报道缺乏儿童ARTI的数据。LU等人对2009年～2012年间的41例儿童肠道病毒感染病例样本检测发现，EV-D68 感染病例为7例，比例达17.1％。Xiao等人的另一项研究对中国2012～ 2014年重庆地区的1876个呼吸道感染的(Respiratory tract infections， RTI)儿童的鼻拭子样本进行检测，发现19例EV-D68感染样本，其中13例样本是在2014年9月到10月检测出，并从样本中分离获得 13株病毒，进化树分析发现这13株病毒与2014年的美国主要流行株具有高度同源性。目前，尚无针对EV-D68的有效抗病毒药物及预防性疫苗，所以对人群抗EV-D68抗体的血清学检测，以及研发有效的EV-D68治疗性药物、预防性疫苗是控制EV-D68病毒感染与流行的关键。

疫苗接种者血清抗体的效价及血清阳性率是预防性疫苗免疫效果评价的重要指标。目前，抗EV-D68抗体的检测主要采用微量中和实验的方法(Neutralization Test)，但该实验方法存在实验周期长 (5～7天)，最后的结果判断需要通过细胞病变效应(Cytopathic Effect， CPE)的计算，实验的影响因素较多(细胞状态、病毒稀释的误差) 等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测血清中抗 EV-D68病毒抗体的方法，以准确鉴别血清中是否含有抗EV-D68病毒抗体，以及抗体的效价。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种检测血清中抗EV-D68病毒抗体的方法，包括以下步骤：

(1)EV-D68病毒VP1蛋白基因的克隆和重组表达载体 pGEX-5X-VP1的构建：

①使用商品化的总RNA提取试剂盒，从感染EV-D68病毒的Vero 细胞中提取病毒总RNA；将病毒总RNA反转录为cDNA；

②PCR扩增：以cDNA为模板，用上游引物5'-gct caa acc act tac atg-3'，斜体划线处为上游酶切位点EcoR I，和下游引物5'-gcc tcaggt ggt tac tatgtt gtg-3'，斜体划线处为下游酶切位点Xho I，进行PCR扩增后使用商品化DNA片段胶回收试剂盒进行片段回收；

③目的片段与pGEX-5X-1载体的酶切回收：胶回收纯化后的VP1 片段和pGEX-5X-1分别用EcoR I和Xho I双酶切，用商品化胶回收试剂盒纯化目的片段和载体片段，电泳观察回收情况；

④目的片段VP1与表达载体连接：连接反应总体系为20μl，具体连接反应体系按照试剂盒说明书要求配制；

⑤DH5α感受态细胞的转化：以10-20μl连接反应物在100μl DH5α感受态细胞中进行转化后，涂布于预热至37℃的LB琼脂平板上，37℃培养16-18h；

⑥pGEX-5X-VP1质粒鉴定：在超净工作台里用灭菌枪头从平板上挑取单个白色菌落，接种于3-5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃温度下，摇床速度为200-220rpm/min，振荡培养16-18h；使用商品化质粒提取试剂盒提取质粒pGEX-5X-VP1并进行测序确证；

(2)融合蛋白VP1的表达和纯化：

①将含有质粒pGEX-5X-VP1的阳性克隆转化到感受态细胞中，并涂布到LB固体平板上，37℃培养过夜，挑取单个克隆培养扩增后进行蛋白表达；以1:100比例接种到30ml-100ml LB液体培养基中， 37℃培养2.5-3小时，A600值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5-1mmol/L IPTG，诱导表达4-6小时后进行SDS-PAGE分析及Western-blot分析；

②SDS-PAGE电泳检测：将收集的菌液12000rpm/min离心1min，用80μl PBS重悬，加入20μl 5×上样缓冲液，混匀，75-100℃，煮5min，用上样针进样20μl，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到100V，继续电泳达到胶的底部；取下整块凝胶用考马斯亮蓝染液染色/脱色；

③Western-blot印迹分析：取出SDS-PAGE凝胶，按照滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸的顺序叠放转膜10-30min；取出PVDF膜，放入玻璃平皿中，经过封闭，一抗孵育，二抗孵育后，进行ECL化学发光显色并观察结果；

④VP1融合蛋白大量诱导表达：条件和小量的相同，将体积扩大到1L LB的液体培养基；诱导结束后，8000-12000rpm/min离心30min，收集菌体，使用0.01mmol/L PBS，pH＝8.0缓冲液洗涤两次后重悬，冰浴中超声破碎；收集菌体沉淀；

⑤包涵体溶解和复性：按照包涵体溶解液(ml):大肠杆菌菌体湿重(g)＝10:1的比例混匀，45℃水浴2h，期间每隔30min，轻轻搅拌一次，8000rpm/min，离心15min，取上清液加入透析袋中，并将透析袋置于包涵体复性液中，4℃透析复性48h；

⑥包涵体纯化：包涵体复性后，通过亲和层析纯化蛋白，用 Western-blot检测纯化后的重组蛋白；

⑦纯化后蛋白浓度测定：按照Bradford法蛋白定量试剂盒步骤进行；根据标准曲线计算样品中VP1融合蛋白的蛋白浓度；

(3)VP1融合蛋白与不同种属特异性抗体结合能力的Elisa检测：

①抗原包被：以纯化的VP1融合蛋白包被高亲和力的酶标板，包被液为PBS，pH＝7.4，每孔蛋白含量为0.5μg，4℃过夜，设3个复孔；

②一抗稀释：以EV-D68灭活病毒免疫的不同种属的动物血清作为一抗，以2倍梯度稀释法稀释成以下不同的梯度：1:40、1:80、1:160、 1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240；在酶标板中加入稀释好的不同浓度梯度的一抗，室温孵育2h；

③洗涤后加入不同种属动物对应的带有HRP标记的二抗，二抗稀释比例为1:5000，每孔加入100μl，室温1h；

④显色：洗涤后在酶标板中加入单组份TMB显色液，100μl/孔，轻轻震荡混匀，37℃5分钟，按照50μl/孔加入2mol/L的硫酸终止反应；

⑤测定：以空白孔调零，450nm波长依次测定各孔的吸光度值即 OD值，OD_阳性血清/OD_阴性血清大于2.1时判断为阳性；以OD_阳性血清/OD_阴性血清值大于2.1时的最大血清稀释度即为血清效价。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明的检测方法是以 EV-D68VP1融合蛋白为基础的间接Elisa方法。EV-D68VP1结构蛋白是刺激机体产生抗体的主要免疫原，能与抗EV-D68抗体特异性结合。本发明选取了EV-D68Fermon株结构蛋白VP1基因，通过克隆表达，以纯化的VP1融合蛋白作为鉴别诊断的抗原，采用间接Elisa 模式，研发出EV-D68特异性抗体检测方法。该法操作简单，特异性高、灵敏度高、耗时短、成本低。

附图说明

图1为EV-D68 VP1蛋白基因PCR扩增产物电泳图；

图2为重组表达质粒pGEX-5X-1-VP1的双酶切(EcoR I/Xho I) 鉴定；

图3为重组蛋白的表达；

图4为纯化产物的Western-blot分析；

图5为不同种属的血清与重组蛋白结合能力的Elisa检测；

图6为不同种属免疫血清与纯化蛋白亲和力测定。

具体实施方案

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化和等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例1：

VP1蛋白基因的克隆：

1)EV-D68病毒总RNA的提取

使用天根生化科技公司的总RNA提取试剂盒，从感染EV-D68 的Vero细胞中提取RNA。按照试剂盒说明书进行，具体步骤如下：

①取病毒感染的细胞悬液250μl加入到eppendorf管中，再加入750μl TRNzol-A⁺试剂，用振荡器旋涡振荡混匀；

②将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白质复合物完全分离；

③每使用1ml TRNzol-A⁺加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3min；

④4℃，12000rpm离心10min。样品分为三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把约500μl水相转移到新管中；

⑤在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30min；

⑥4℃，12000rpm，离心10min，去上清；

⑦加入1ml 75％乙醇(用RNase-Free ddH₂O配制)洗涤沉淀；

⑧4℃，5000rpm，离心3min，倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀；

⑨室温放置2-3min左右，加入30μl RNase-Free ddH₂O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA；

2)反转录

使用TAKARA公司的反转录试剂盒，反转录体系为20μl，即： Random 6mers 1μl，dNTP Mixture(10mM)1μl，模板RNA 2μl，RNase free ddH₂O 6μl，混匀离心后，65℃保温5min后，冰上迅速冷却。随后，在含有上述反应液的Microtube管中加入5×PrimeScriptⅡbuffer 4μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScriptⅡRTase(200U/μl)1μl， RNasefree ddH₂O 4.5μl，混匀离心后，按照30℃10min，42℃60min， 70℃15min反应体系进行逆转录，冰上冷却。

3)PCR扩增

以反转录的cDNA为模板，用上游引物5'-gct caa acc act tac atg-3'(斜体划线处为上游酶切位点EcoR I)，和下游引物5'-gcc tca ggt ggt tac tatgtt gtg-3'(斜体划线处为下游酶切位点Xho I)进行PCR扩增。

反应体系为20μl，即：2×上样缓冲液10μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，模板1.0μl，RNase Free ddH₂O:7.0μl。离心混匀后置于 PCR自动扩增仪中，进行如下循环：98℃10s，57℃15s，72℃1min， 35个循环。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳(100V)，扩增产物片段大小若与预期的目的片段(931bp)大小一致，进行后续实验(图1)。

4)目的DNA片段的纯化回收

先将PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳(100V)30min左右，在长波紫外光下观察电泳情况，当目的DNA片段与杂带完全分开后，用清洁手术刀(经火焰消毒)切下含有目的片段的凝胶块置于 1.5ml EP管中；

并按照TAKARA公司的Agrose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0 说明书进行：

①切碎凝胶。每300mg琼脂糖凝胶中加入1.2ml溶胶液；

②均匀混匀后室温25℃溶解胶块，此时应间断震荡混合10min，使胶块充分溶解；

③待胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube上；

④将上述操作步骤③的溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心 1min，弃滤液，将滤液再加入Spin Column中离心一次，以提高DNA 的回收率；

⑤将700μl的buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心 30s，弃滤液；

⑥重复操作步骤⑤；

⑦将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000rpm，离心 1min；

⑧将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min，洗脱前将Elution Buffer加热至60℃；

⑨室温12000rpm离心1min洗脱DNA；

重组表达载体构建：

1)目的片段与pGEX-5X-1载体的酶切回收：

①胶回收纯化后的VP1片段和pGEX-5X-1分别用EcoR I和Xho I 双酶切。目的基因酶切体系为表1，载体酶切为表2；

表1：目的基因片段VP1酶切反应体系

反应条件为：37℃水浴3h；

表2：载体pGEX-5X-1酶切反应体系

反应条件为：37℃水浴2h；

②酶切产物的回收：用1.2％的琼脂糖凝胶电泳目的基因片段和载体酶切产物，切下所需要的目的条带，用Agarose Gel DNA Extraction Kit 4.0回收纯化目的片段和载体片段，方法同步骤4)，电泳观察回收情况；

2)目的片段VP1与表达载体连接：

连接反应总体体系为20μl，反应体系见-表3；

表3：目的片段VP1与表达载体pGEX-5X-1连接反应体系

反应条件为：16℃水浴，连接过夜；

3)DH5α感受态细胞的转化：

①在100μl DH5a感受态细胞中进行转化，加入10μl连接反应物，用枪头轻轻混匀，冰浴45min；

②将离心管小心转移至42℃水浴中，热激45s；

③迅速置于冰浴中冷却2min，然后每管中加入预热的37℃LB 900μl/管，37℃180rpm/min震荡培养1h使细胞复苏；

④取上述200μl细胞悬液，用枪头轻轻混匀，涂布于预热至37℃的LB琼脂平板上，37℃过夜培养16-18h；

4)摇菌：

在超净工作台里用灭菌枪头从平板上挑取单个白色菌落，接种于含3ml LB液体培养基中，含50μg/ml氨苄青霉素，37度220rpm/min 振荡培养16h；

5)质粒提取与鉴定：

小量提取质粒按照天根生物科技有限公司的质粒小提试剂盒说明书进行：

①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

②取3ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机， 12000rpm离心1min，尽量吸除上清；

③向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已经加入RNaseA)，使用移液器和涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；

④向离心管中加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

⑤向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；

⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm/min离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

⑦向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已经加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管；

⑧重复操作步骤⑦；

⑨将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm/min离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；

⑩将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中央滴加30μl 左右洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm/min离心2min将质粒溶液收集到离心管中；

阳性克隆的鉴定：

1)电泳鉴定：将所提取的质粒进行电泳，与阴性对照做比较，筛选出可能为阳性的质粒；

2)酶切鉴定：用EcoR I/Xho I进行双酶切，反应体系为20μl，即重组质粒5μl，10×酶切通用缓冲液2μl，EcoR I 1μl，Xho 1μl，H₂O 11μl，置于37℃水浴中，2h后取出，将酶切产物分子量与Marker进行电泳比较，得到与预期大小一致的目的片段和载体片段(图2)；

3)重组质粒的测序确证：把电泳鉴定、酶切鉴定均为阳性的克隆，送大连宝生物公司测序。鉴定正确的质粒命名为pGEX-5X-1-VP1，所得编码VP1蛋白的核苷酸序列的测序结果如下：

CAGGTGAGGAGTTCATCAAAACAGCAACTGATACTGTGAAGAGTGAGATTAACGCCGAACTTGGTGTGGTCCCTAGTCTAAATGCAGTTGAAACTGGTGCAACTTCCAACACTGAACCAGAAGAAGCCATACAAACTCGCACAGTAATAAATCAGCATGGTGTGTCGGAGACGTTAGTGGAGAATTTTCTTGGTAGGGCAGCCCTAGTGTCAAAGAAAAGTTTTGAATACAAGAATCATGCCTCATCCAGCGCAGGGGCACACAAAAACTTTTTTAAATGGACAATTAATACTAAGTCTTTTGTCCAGTTAAGAAGAAAGCTGGAATTATTCACATACCTTAGGTTTGATGCTGAAATCACCATACTCACAACTGTGGCAGTAAATGGTAATAATGACAGCACATACATGGGTCTCCCTGACTTGACACTCCAAGCAATGTTTGTACCAACTGGTGCTCTTACTCCAAAGGAGCAGGATTCATTTCATTGGCAATCAGGCAGTAATGCTAGTGTGTTCTTTAAAATTTCTGATCCCCCAGCTAGAATGACTATACCTTTTATGTGCATCAACTCAGCATATTCAGTTTTTTATGATGGCTTTGCTGGATTTGAGAAAAATGGTCTATATGGAATAAACCCAGCTGACACTATTGGCAACTTGTGTGTCAGAATAGTGAATGAACATCAACCAGTTGGTTTTACAGTGACCGTTAGGGTTTACATGAAGCCTAAACATATAAAAGCATGGGCTCCACGACCACCGCGAACCATGCCATACATGAGCATTGCTAATGCAAATTACAAAGGTAGAGATACAGCACCAAACACACTTAAT G

重组表达质粒的诱导表达：

①将阳性克隆质粒转化到表达菌株Rosseta(DE3)感受态细胞中，并涂布到LB固体平板上，37℃培养过夜。挑取单个克隆，命名为 Rosseta(DE3)/pGEX-5X-1-VP1；

②将Rosseta(DE3)/pGEX-5X-1-VP1接种到3ml LB液体培养基中37℃过夜培养。次日，按照体积比1:100比例接种到30ml LB液体培养基中，37℃培养2.5-3h，A600值达到0.6，加入终浓度为1mmol/L IPTG，诱导表达4h.取1ml菌液，12000rpm/min，离心1min，用0.01mol/LPBS(PH＝8.0)重悬，进行SDS-PAGE分析及Western-blot分析，检测表达产物，同时用转化的空载体作为对照；

表达产物检测：

1)SDS-PAGE电泳检测：

①洗净玻璃板(1.00mm)厚，固定在电泳槽上面，配制12％的分离胶5ml，迅速注入两玻璃板中，使用1ml蒸馏水封胶。待胶凝固后 (40min-1h)，倾倒上层水，加入1-2ml浓缩胶，插上梳子，垂直放置电泳槽，使其凝固；

②小心移去梳子，在电泳装置槽内装入1×电泳缓冲液(10×电泳缓冲液的配制：Tris 30.3g，Glycine 187.7g，SDS 10.0g，加水定容至1L)；

③将收集的菌液12000rpm/min离心1min，用80μl菌液重悬，加入 20μl 5×上样缓冲液(250mM Tris-HCL(pH 6.8)，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，混匀，100℃，煮5min，用上样针进样20μl，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到100V，继续电泳达到胶的底部；

④染色，取下凝胶用双蒸水冲洗，用考马斯亮蓝染液(proteintech B300030)染色液，在摇床上摇动染色1h；

⑤脱色，使用20ml左右脱色液(10％醋酸，5％乙醇，85％双蒸水)，更换脱色液3-4次，在脱色摇床上脱色直到背景变白，条带清晰为止；

⑥结果观察电泳显示重组质粒产生了约61KD的蛋白带，与预期的融合蛋白分子量大小一致，见(图3)；

2)Western印迹分析：

①溶液的配制：10×液转膜缓冲液：Tris 58.0g/L，甘氨酸29g/L，SDS 1.85g，定容至1L(使用时稀释成为1×转膜缓冲液，并且按照体积比加入20％甲醇)。TBS缓冲液：1mol/L的Tris-HCl(PH＝7.5)10ml， NaCl 9g，定容至1L，4℃贮存。TBST洗液：1L TBS溶液中加入1ml Tween-20溶液。封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mlTBST缓冲液中，现配现用；

②蛋白样品VP1的SDS-PAGE，参见实施例SDS-PAGE电泳检测；

③电泳结束后取出凝胶，切去浓缩胶，将分离胶浸泡于转移缓冲液中；准备与胶相同大小的PVDF膜一张，滤纸2张，浸泡于转移缓冲液中；在正极电板上按照滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序叠放整齐，叠放过程中尽量赶走气泡，盖上负极板，25V，1.3A转膜20min；

④封闭：转膜完成后，取出PVDF膜，放入玻璃平皿中，加入40ml 新鲜配制的封闭液，4℃，平摇过夜；

⑤一抗孵育：倒掉封闭液，PBST洗涤两次，每次5min；按照1:200 浓度加入一抗，室温2h；

⑥二抗孵育：PBST洗涤6次，每次15min，按照1:10000浓度加入羊抗兔二抗，室温1h；

⑦ECL化学发光显色：PBST洗涤6次，每次10min；将配制好的 ECL试剂均匀覆盖在PVDF膜上，发光显影，于暗室条件下压片曝光，曝光时间10s，显影，定影；

⑧结果：表达的GST-VP1融合蛋白在PVDF膜上与抗体发生免疫学反应，结果表明，诱导菌出现一条特异性反应条带，未诱导菌未见任何反应。证明表达蛋白能与抗EV-D68阳性多克隆抗体发生特异性的免疫反应；

VP1融合蛋白的大量制备与纯化：

①VP1融合蛋白大量诱导表达：大量诱导蛋白的表达：条件和小量的相同，将体积扩大到1L LB的液体培养基。诱导结束后， 8000rpm/min离心30min，收集菌体，使用0.01mmol/L PBS(PH＝8.0) 缓冲液洗涤2次后重悬，冰浴中超声破碎(超声条件为：4℃，300W，超声8s，停4s，超声40min)，8000rpm/min离心30min，收集菌体沉淀；

②包涵体溶解：然后按照包涵体溶解液(ml):大肠杆菌菌体湿重(g) ＝10:1的比例加入包涵体溶解液(尿素8mol/L，DTT 10mmol/L)内， 45℃水浴2h，期间每隔30min，轻轻搅拌一次，8000rpm/min，离心 15min，取上清液，用于后续的包涵体透析复性；

③包涵体复性：按照25mM/L Tris-HCl(PH＝9.0)，0.1mM/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)，1mM还原型谷胱甘肽(GSH)配制复性液。将上述步骤②中的包涵体溶解液加入透析袋中，置于复性液中，4℃透析复性48h；

注：透析袋的处理：1)将透析管剪成适当长度(10-20cm)的小段，即成透析袋。2)在大体积的2％(m/v)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(PH＝8)中将透析袋煮沸10min。3)将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。

4)将透析袋置1mmol/L EDTA(PH＝8)中煮沸10min；

5)透析袋冷却后存放于4℃，应确保透析袋始终浸没在液体中。6) 在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗；

④包涵体纯化：包涵体复性后，通过GST亲和层析纯化蛋白。用 Western-blot检测纯化后的重组蛋白。纯化后的重组蛋白VP1与特异性的阳性血清相结合，在相对分子量为61KD处可见目的条带，与目的片段理论大小一致；(图4)

纯化后蛋白浓度测定：

按照联科生物Bradford法蛋白定量试剂盒步骤进行：

将所有试剂(G250染色液、BSA溶液、样品)平衡至室温；

①标准品制备：取50μl BSA溶液(2mg/ml)，用溶解蛋白样品的缓冲液稀释至200μl，终浓度为0.5mg/ml；

②标准曲线设置参考如下。标准品的用量分别为0、1、2、4、8、 12、16和20μl，加标准品稀释液补足到20μl。设三个复孔；

③样品孔中加入20μl待测样品，稀释样品，使之落在标准曲线范围内；

④每孔加入200μl G250染色液，室温放置2-5min；

⑤酶标仪测定OD 595的吸光度值；

⑥根据标准曲线计算样品中VP1融合蛋白的蛋白浓度；

不同种属抗EV-D68阳性血清的制备：

①新西兰大白兔阳性血清的制备：以EV-D68灭活的病毒加弗氏完全佐剂免疫新西兰大白兔，采用背部皮下多点注射。免前采集兔全血，分离血清作为阴性血清对照。每只用病毒蛋白含量1mg与等体积弗氏完全佐剂充分混匀成为乳浊剂后进行注射，初次免疫后14天进行加强免疫，并于初次免疫后7、14、28天采集全血分离血清。第二针免疫完成后14天，颈动脉插管收集全血，分离血清，测定免疫血清中和抗体效价。

②恒河猴阳性血清的制备：以EV-D68灭活的病毒加氢氧化铝佐剂免疫恒河猴，采用肌肉注射的方式。免前采集恒河猴全血，分离血清作为阴性血清对照。按照0、14的免疫程序进行免疫，并于第一针免疫后7、14、28天采血并分离血清，测定免疫血清中和抗体效价。

③小鼠阳性血清的制备：以EV-D68灭活的病毒加氢氧化铝佐剂免疫小鼠，采用肌肉注射的方式。免前采集小鼠全血，分离血清作为阴性血清对照。按照0、14的免疫程序进行免疫，并于第一针免疫后7、 14、28天处死小鼠取取全血并分离血清，测定免疫血清中和抗体效价。

VP1融合蛋白与不同种属特异性抗体结合能力的Elisa检测方法建立：

①溶液配制：0.5‰PBST洗涤液配制：1L PBS溶液中加入0.5ml Tween-20；5％封闭液配制：100ml PBS溶液中加入5g BSA；

②抗原包被：以纯化的VP1融合蛋白包被高亲和力的酶标板，包被液为PBS(PH＝7.4)，每孔蛋白含量为0.5μg，4℃过夜，设3个复孔；

③洗涤：丢弃残余包被液，甩干，每孔加满0.5‰PBST洗涤液，静止30s后弃去，如此反复2次，拍干；

④封闭：在步骤③洗涤后的酶标板中，每孔加入100μl 5％封闭液，室温放置2h；

⑤洗涤：丢弃残余液体，甩干，每孔加满0.5‰PBST洗涤液，静置 30s后弃去，如此反复5次，拍干；

⑥一抗稀释：以EV-D68灭活病毒免疫的兔血清作为一抗，进行2 倍梯度稀释，按照1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、 1:5120、1:10240比例稀释；

⑦加入一抗：在步骤⑤洗涤后的酶标板中，加入⑥稀释的不同浓度的一抗，室温孵育2h；

洗涤，重复⑤的步骤；

⑧加入二抗：在步骤⑧洗涤后的酶标板中，加入不同种属动物对应的带有HRP标记的二抗，二抗稀释比例为1:5000，每孔加入100μl 抗体，室温1h；

洗涤，重复⑤的步骤；

⑩显色与测定：在酶标板中加入单组份TMB显色液，100μl/孔，轻轻震荡混匀，37℃，5min；在酶标板按照50μl/孔加入2mol/L的硫酸终止反应；以空白孔调零，450nm波长依次测定各孔的吸光度值即 OD值，OD_阳性血清/OD_阴性血清大于2.1时判断为阳性。以OD_阳性血清/OD_阴性血清值大于2.1时的最大血清稀释度作为血清效价。

结果分析：实验结果显示，免疫兔血清从1：640稀释度开始，OD_阳性血清/OD_阴性血清＞2.1，直到1:5120开始下降，说明该EV-D68VP1 蛋白可以识别EV-D68免疫兔血清，并且免疫兔血清的抗EV-D68血清效价为1：5120。(图5)

VP1融合蛋白与不同种属抗体亲和力的测定Elisa方法建立：

①使用纯化的VP1抗原包被酶标板2块，然后用3％的MPBS室温封闭2h，0.1mol/L的PBS洗涤；

②在一排试管中，建立从0.1nmol/L～1μmol/L浓度梯度的抗原PBS 溶液，加入蛋白含量终浓度为0.5nmol/L的兔阳性血清溶液，使总体积为100μl，室温孵育30min；

③取上述步骤②中反应混合物加至已包被抗原的酶标板中，酶标板微孔中预先加入30％的MPBS 30μl(实验时要重复测定2-3次，以免误差)后孵育，时间不超过10min；

④孵育结束后，将反应混合物转入另一块包被抗原的酶标板中，第二块板子的Elisa操作与第1块相同。第2块的目的是检查在进行第1 块板的Elisa时，是否只有一小部分游离抗体被捕获，并作为第1块板的平衡校正；

⑤充分洗涤第1块板。加入单组份显色液，用2mol/L的硫酸终止反应，在连续酶标仪上测定其吸光度值(A450)；

结果判断：最强吸光度值的一半时的VP1抗原浓度相当于解离常数K_dis，亲和力常数为解离常数的倒数1/K_dis。通过亲和力常数计算可知，兔血清的亲和力常数K_a为1.6的亲和⁶；(图6)

实施例2：

重复实施例1，有以下不同点；

VP1融合蛋白与不同种属特异性抗体结合能力的Elisa检测方法建立：

与实施例1不相同的步骤如下：

⑥一抗稀释：以EV-D68灭活病毒免疫的恒河猴血清作为一抗，按照 1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、 1:25600、1:51200、1:102400比例稀释；

结果分析：实验结果显示，免疫恒河猴血清从1:100稀释度开始，OD_阳性血清/OD_阴性血清＞2.1，说明该EV-D68VP1蛋白可以识别 EV-D68免疫恒河猴血清，直到1:6400开始降低，并且免疫恒河猴血清的抗EV-D68血清效价为1:6400。(图5)；

VP1融合蛋白与不同种属抗体亲和力的测定Elisa方法建立：

①、③、④步骤与实施例1相同；

②在一排试管中，建立从0.1nmol/L～1umol/L浓度梯度的抗原PBS 溶液，加入蛋白含量终浓度为0.5nmol/L的恒河猴阳性血清溶液，使总体积为100μl，室温孵育30min；

结果判断：最强吸光度值的一半时的VP1抗原浓度相当于解离常数 K_dis，亲和力常数为解离常数的倒数1/K_dis。通过亲和力常数计算可知，恒河猴血清的亲和力常数K_a为3.85×10⁵；(图6)

实施例3：

重复实施例1，有以下不同点；

VP1融合蛋白与不同种属特异性抗体结合能力的Elisa检测方法建立：

与实施例1不相同的步骤如下：

⑥一抗稀释：以EV-D68灭活病毒免疫的小鼠血清作为一抗，按照 1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240、 1:20480比例稀释；

结果分析：实验结果显示，免疫小鼠血清从1:2560稀释度开始，OD _阳性血清/OD_阴性血清＞2.1，说明该EV-D68VP1蛋白可以识别EV-D68免疫小鼠血清，直到1：40960开始降低，并且免疫小鼠血清的抗EV-D68血清效价为1:40960。(图5)

VP1融合蛋白与不同种属抗体亲和力的测定Elisa方法建立：

①、、、③、④步骤与实施例2相同；

②在一排试管中，建立从0.1nmol/L～1umol/L浓度梯度的抗原PBS 溶液，加入蛋白含量终浓度为0.5nmol/L的小鼠阳性血清溶液，使总体积为100μl，室温孵育30min；

结果判断：最强吸光度值的一半时的VP1抗原浓度相当于解离常数 K_dis，亲和力常数为解离常数的倒数1/K_dis。通过亲和力常数计算可知，小鼠血清亲和力常数K_a为3.08×10⁶；(图6)

综上所述：基于EV-D68 VP1融合蛋白为包被抗原，所建立的间接Elisa方法可以快速识别不同种属血清中的特异性EV-D68抗体。所表达的融合抗原与不同种属的免疫血清均具有一定的亲和活性，且不同种属亲和力常数不同。

Claims (1)

1.一种检测血清中抗EV-D68病毒抗体的方法，包括以下步骤：

(1)EV-D68病毒VP1蛋白基因的克隆和重组表达载体pGEX-5X-VP1的构建：

①使用商品化的总RNA提取试剂盒，从感染EV-D68病毒的Vero细胞中提取病毒总RNA；将病毒总RNA反转录为cDNA；

②PCR扩增：以cDNA为模板，用上游引物5'-gct caa acc act tac atg-3'，斜体划线处为上游酶切位点EcoR I，和下游引物5'-gcc tcaggt ggt tac tat gttgtg-3'，斜体划线处为下游酶切位点Xho I，进行PCR扩增后使用商品化DNA片段胶回收试剂盒进行片段回收；

③目的片段与pGEX-5X-1载体的酶切回收：胶回收纯化后的VP1片段和pGEX-5X-1分别用EcoR I和Xho I双酶切，用商品化胶回收试剂盒纯化目的片段和载体片段，电泳观察回收情况；

④目的片段VP1与表达载体连接：连接反应总体系为20μl，具体连接反应体系按照试剂盒说明书要求配制；

⑤DH5α感受态细胞的转化：以10-20μl连接反应物在100μl DH5α感受态细胞中进行转化后，涂布于预热至37℃的LB琼脂平板上，37℃培养16-18h；

⑥pGEX-5X-VP1质粒鉴定：在超净工作台里用灭菌枪头从平板上挑取单个白色菌落，接种于3-5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃温度下，摇床速度为200-220rpm/min，振荡培养16-18h；使用商品化质粒提取试剂盒提取质粒pGEX-5X-VP1并进行测序确证；

(2)融合蛋白VP1的表达和纯化：

①将含有质粒pGEX-5X-VP1的阳性克隆转化到感受态细胞中，并涂布到LB固体平板上，37℃培养过夜，挑取单个克隆培养扩增后进行蛋白表达；以1:100比例接种到30ml-100mlLB液体培养基中，37℃培养2.5-3小时，A600值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5-1mmol/LIPTG，诱导表达4-6小时后进行SDS-PAGE分析及Western-blot分析；

②SDS-PAGE电泳检测：将收集的菌液12000rpm/min离心1min，用80μl PBS重悬，加入20μl 5×上样缓冲液，混匀，75-100℃，煮5min，用上样针进样20μl，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到100V，继续电泳达到胶的底部；取下整块凝胶用考马斯亮蓝染液染色/脱色；

③Western-blot印迹分析：取出SDS-PAGE凝胶，按照滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序叠放转膜10-30min；取出PVDF膜，放入玻璃平皿中，经过封闭，一抗孵育，二抗孵育后，进行ECL化学发光显色并观察结果；

④VP1融合蛋白大量诱导表达：条件和小量的相同，将体积扩大到1L LB的液体培养基；诱导结束后，8000-12000rpm/min离心30min，收集菌体，使用0.01mmol/L PBS，pH＝8.0缓冲液洗涤两次后重悬，冰浴中超声破碎；收集菌体沉淀；

⑤包涵体溶解和复性：按照包涵体溶解液(ml):大肠杆菌菌体湿重(g)＝10:1的比例混匀，45℃水浴2h，期间每隔30min，轻轻搅拌一次，8000rpm/min，离心15min，取上清液加入透析袋中，并将透析袋置于包涵体复性液中，4℃透析复性48h；

⑥包涵体纯化：包涵体复性后，通过亲和层析纯化蛋白，用Western-blot检测纯化后的重组蛋白；

⑦纯化后蛋白浓度测定：按照Bradford法蛋白定量试剂盒步骤进行；根据标准曲线计算样品中VP1融合蛋白的蛋白浓度；

(3)VP1融合蛋白与不同种属特异性抗体结合能力的Elisa检测：

①抗原包被：以纯化的VP1融合蛋白包被高亲和力的酶标板，包被液为PBS，pH＝7.4，每孔蛋白含量为0.5μg，4℃过夜，设3个复孔；

②一抗稀释：以EV-D68灭活病毒免疫的不同种属的动物血清作为一抗，以2倍梯度稀释法稀释成以下不同的梯度：1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240；在酶标板中加入稀释好的不同浓度梯度的一抗，室温孵育2h；

③洗涤后加入不同种属动物对应的带有HRP标记的二抗，二抗稀释比例为1:5000，每孔加入100μl，室温1h；

④显色：洗涤后在酶标板中加入单组份TMB显色液，100μl/孔，轻轻震荡混匀，37℃5分钟，按照50μl/孔加入2mol/L的硫酸终止反应；

⑤测定：以空白孔调零，450nm波长依次测定各孔的吸光度值即OD值，OD_阳性血清/OD_阴性血清大于2.1时判断为阳性；以OD_阳性血清/OD_阴性血清值大于2.1时的最大血清稀释度即为血清效价。