CN113329767A - 肠道病毒对vero细胞的适应及其疫苗制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了适应在Vero细胞中增殖至高滴度的肠道病毒D68及其适应方法。本发明还公开了包含灭活的肠道病毒D68抗原的合适的疫苗组合物。

Description

肠道病毒对VERO细胞的适应及其疫苗制剂
相关专利申请
本申请要求于2018年12月29日提交的印度专利申请号201841049814的优先权和权益；其公开内容以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及通过对推荐用于疫苗生产的细胞基质进行适应来创建新病毒毒株并利用新病毒株用于生成疫苗和作为诊断工具。
发明背景
肠道病毒68或肠道病毒D68是新出现的肠道病毒，引起呼吸道疾病，症状轻到严重，常表现为流感样症状和神经系统疾病，如急性弛缓性脊髓炎(AFM)。肠道病毒68是正义单链RNA病毒，属于肠道病毒属和小核糖核酸病毒科(Picobirnaviridae)的D种。虽然第一次分离是在1962年的美国(Schieble等人，Am J Epidemiol 1967，85:297-310)，但直到21世纪初，这种病原体才被频繁报道(Oberste等人，J Gen Virol 2004，85:2577-2584)。此后，全世界都报告了由肠道病毒D68引起的爆发(Eshaghi等人，Front Microbiol 2017，8:257)。2014年，由于肠道病毒D68扩散至美国各地导致大规模爆发，导致1153人感染，14人死亡(CDC.非脊髓灰质炎肠道病毒：肠道病毒D68；Midgley等人，MMWRMorb Vertal Wkly Rep2014，63:798-9)。同一时期，加拿大报告了肠道病毒感染的激增(Skowronski等人，EuroSurveill，2015年，20:1-14；Edwin等人，Can CommuniDis Rep 2015，41Suppl 1:2-8)。随后，不同国家报告了由肠道病毒D68引起的呼吸道感染(Dyrdak等人，Euro Surveill 2016，21；Knoester等人，Emerg Infec Dis 2017，23:140-143；Wang等人，SciRep 2017，7:1242)。
US20160312314A1公开了一种检测肠道病毒D68的方法，通过将从样品中获得的核酸与寡核苷酸引物接触，将接触的样品暴露于DNA扩增过程中，该过程提供肠道病毒D68VP1基因的98核苷酸扩增产物的产生，并且随后检测该98核苷酸扩增产物，其中所述扩增产物的存在表明样品含有肠道病毒D68。
US20160355897A1公开了用于检测样品中肠道病毒D，特别是检测肠道病毒D68的方法和组合物。所述方法包括在足以通过至少一种引物特异性扩增EV-D68 VP1核酸的条件下和/或在足以使探针特异性杂交到EV-D68核酸的条件下，将样品与能够特异性扩增EV-D68病毒蛋白1(VP1)核酸或其部分的至少一种引物(例如正向引物和/或反向引物)和/或能够特异性杂交到EV-D68 VP1核酸的可检测标记的探针接触。检测EV-D68 VP1核酸的扩增和/或探针与EV-D68 VP1核酸的杂交，从而鉴定样品中是否存在EV-D68。
现有技术未能教导已知的肠道病毒D68在Vero细胞中适应和繁殖，Vero细胞是推荐用于疫苗生产的病毒繁殖的细胞基质。此外，现有技术仅限于检测肠道病毒D病毒株的方法，并且未公开可用作疫苗/免疫原性组合物以提供针对病毒的保护的任何组合物。针对这种可怕的新出现的病毒的疫苗是必要的，但到目前为止还没有。本发明公开了使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖的方法。本发明还公开了一种含有突变的核酸序列的肠道病毒株，所述突变的核酸序列翻译成作为适于在疫苗组合物中使用的抗原的蛋白质。本发明还公开了合适的疫苗组合物。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种使肠道病毒D68株(一种或多种)在细胞基质中适应的方法，所述细胞基质是推荐用于疫苗生产的细胞基质(例如Vero细胞)。
本发明的另一个目的是提供新的肠道病毒D68株(一种或多种)，其适应在Vero细胞上繁殖并且能够在Vero细胞上以高滴度产生。
本发明的另一个目的是提供针对肠道病毒D68感染的灭活的疫苗制剂，其包含所述病毒株。
本发明的另一个目的公开了使用适应Vero细胞的肠道病毒D68的重组蛋白或完整肠道病毒D68病毒用于产生针对分别的重组蛋白或完整病毒的抗体，所述抗体可用于诊断分别的抗原。
发明概述
本发明的一个方面是提供使肠道病毒D68在推荐用于疫苗生产的细胞基质中适应的方法。
在一些实施方案中，提供了适应于在Vero细胞中繁殖到高滴度的肠道病毒D68，其由具有SEQ ID No 1的核苷酸序列的cDNA分子编码。在一些其他实施方案中，提供了SEQ IDNo 2中公开的编码适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的核苷酸序列。在另一实施方案中，提供了SEQ ID No 3中公开的适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的氨基酸序列。
本发明的另一方面是提供适应Vero细胞的肠道病毒D68病毒中的氨基酸水平变化(V341L、E647G、M699K、E719K、D1355N、T1406S、H2110Q)。
在一些实施方案中，提供了一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖到高滴度的方法，包括以下步骤：
(a)通过在32-35℃，更准确地在32-33℃吸附约60-120分钟来感染病毒；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃添加维持培养基后繁殖病毒；
(c)以1:3至1:10的稀释度稀释从每次传代获得的病毒原液，以感染接下来的Vero细胞批次用于在32-35℃，更准确地在32-33℃进行病毒的初始传代；
(d)以1:20-1:500的稀释度稀释病毒以在32-35℃，更准确地在32-33℃在随后/后续的传代中感染Vero细胞；和
(e)在每次传代期间达到90％或更高的细胞病变效应时或在感染的6天内收获病毒。
在一些其他实施方案中，提供了一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖到高滴度的方法，其中肠道病毒D68病毒进行空斑测定，包括以下步骤：
(a)每12孔板或6孔板铺板300万至400万个Vero细胞以达到适合空斑测定的汇合度；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃，一式两份、一式三份或一式四份地在不同孔中吸附不同稀释度的病毒1-2小时；
(c)以≤0.6％的羧甲基纤维素或0.8-1.8％的Avicel RC 591作为覆盖介质进行覆盖；
(d)用羧甲基纤维素作为覆盖物在感染后5-7天后或用Avicel RC 591作为覆盖物在感染后3-4天后，用10％福尔马林固定细胞；
(e)在固定后去除固定液并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞；和
(f)将新鲜制备的染色液-结晶紫溶液逐滴加到固定的细胞中，并在室温染色30分钟至1小时或2小时。
在一些其他实施方案中，提供了一种灭活含有SEQ ID No.1编码的cDNA的肠道病毒D68用于免疫的方法，包括以下步骤：
(a)对收获的肠道病毒D68病毒进行无菌过滤；
(b)使用核酸酶处理去除宿主核酸并使用100kDa过滤器通过切向流过滤进行浓缩；
(c)使用1/2000-1/4000福尔马林在从25-37℃变化的温度多至3周或使用BPL在4-25℃多至120小时或使用0.005％到3％的过氧化氢在25±5℃多至6小时进行灭活；和
(d)灭活的抗原的纯化或在灭活病毒抗原之前的纯化如下进行：通过使用Sepharose CL-4B的凝胶过滤继之以使用DEAE树脂的阴离子交换层析，或者通过双步骤/两轮尺寸排阻层析，或者通过纤维素硫酸盐(cellufine sulphate)继之以阴离子交换层析，或者通过混合模式树脂如CHT II型(Biorad)单独地或与其他树脂组合，或者层析方法的组合。
在本发明的又一方面中，提供了用于灭活的肠道病毒D68单价疫苗的制剂，其中肠道病毒D68的灭活剂包括诸如福尔马林、β-丙内酯、过氧化氢(H2O2)的化学剂或诸如UV、X射线和γ射线辐射的各种物理剂。
在一些实施方案中，提供了一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的灭活的肠道病毒D68病毒抗原和任选地一种或多种选自佐剂、稳定剂或防腐剂的药学上可接受的赋形剂。
本发明的另一方面是提供用于包含灭活的肠道病毒D68和其他肠道病毒的组合疫苗的制剂。在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物进一步包含其他肠道病毒，包括EV71、脊髓灰质炎病毒或其组合。
本发明的另一方面涉及能够诱导肠道病毒D68特异性体液免疫应答的灭活的肠道病毒D68疫苗，其中灭活的疫苗可以是加佐剂的或不加佐剂的。
本发明的又一方面涉及能够引发显著中和抗体应答的肠道病毒D68疫苗。
在一些实施方案中，提供了属于肠道病毒D68的氨基酸序列，其具有选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的多蛋白中的氨基酸。在一些实施方案中，提供了一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的灭活的肠道病毒D68病毒抗原，其中肠道病毒D68具有选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的多蛋白中的氨基酸。
在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物在2-8℃稳定至少6个月和在37℃稳定至少1个月。
附图简要说明
图1：肠道病毒68在Vero细胞中的适应。
1A：模拟感染的Vero细胞
1B：感染EV68的Vero细胞在感染后第3天显示细胞病变效应。
图2：不同传代期间在Vero细胞中肠道病毒D68(US/KY/14-18953)的滴度。
图3：通过RT-PCR确认适应Vero细胞的EV68病毒。从来自适应后Vero细胞的两个不同传代的EV68病毒分离出RNA，并用EV68特异性引物对进行逆转录和随后检测(A)(第1道：1Kb标记(NEB)，第2、3道-适应Vero的US-KY/14-18953(US-KY/14-18953-Vero)病毒和使用泛肠道病毒引物)，(B)(第1和2道：适应Vero的US-KY/14-18953/US-KY/14-18953-Vero，第3道：阴性对照，第4道：来自NEB的100bp标记)。
图4：使用两种不同的覆盖介质对适应Vero的EVD68的空斑测定。测试(A)Avicel(0.8％和1.2％)和(B)CMC(0.6％)作为覆盖介质用于不同时间段的肠道病毒D68空斑测定进展。
图5：适应Vero的EVD68蛋白的表达。用对EVD68具有特异性的VP1和VP2抗体通过Western印迹检查EVD68的VP1和VP2蛋白的表达。已经提到了蛋白质阶梯各个条带的位置和分子量。
图6：适应Vero细胞的EVD68抗原的稳定性。适应Vero细胞的EVD68抗原的稳定性以在2-8℃暴露EVD68抗原达1个月、3个月和6个月(A)以及在37℃暴露EVD68抗原达7天、15天和1个月(B)后的稳定性百分比表示。
图7：福尔马林灭活的肠道病毒D68株US/KY/14-18953-Vero诱导的Balb/c小鼠血清中肠道病毒D68特异性IgG滴度。用有或无铝佐剂(alum)配制的福尔马林灭活的肠道病毒D68株US/KY/14-18953-Vero以3周间隔皮下免疫6-8周雌性Balb/c小鼠三次。每次免疫前后采集血液并分离血清。进行ELISA以检测血清中肠道病毒D68特异性IgG滴度。
图8：β-丙内酯灭活的肠道病毒D68株US/KY/14-18953-Vero诱导的Balb/c小鼠血清中肠道病毒D68特异性IgG滴度。用有或无铝佐剂配制的β-丙内酯灭活的肠道病毒D68株US/KY/14-18953-Vero以3周间隔皮下免疫6-8周雌性Balb/c小鼠三次。每次免疫前后采集血液并分离血清。进行ELISA以检测血清中肠道病毒D68特异性IgG滴度。
图9：从用在有或无铝佐剂的情况下配制的β-丙内酯和福尔马林灭活的肠道病毒D68抗原免疫的小鼠收集的血清中IgG1和IgG2a的比率。用有或无铝佐剂配制的福尔马林和β-丙内酯灭活的肠道病毒D68株US/KY/14-18953-Vero以3周间隔皮下免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠三次。第三次免疫后2周，从免疫的小鼠收集的血清中测定IgG1/IgG2a比率。
发明详述
Vero细胞是世界卫生组织(WHO)近年来推荐的用于疫苗生产最常用的细胞基质。Vero细胞的主要优势是无限生命跨度(连续细胞系)，具有已证明的安全性和大规模生产疫苗的适合性(Barrett等人，Expert Rev Vaccines 2009，8:607-618)。因此，Vero细胞对人类疫苗的快速生产具有价值。我们从ATCC(ATCC，VR-1825)获得后将从USA分离的临床肠道病毒D68株(US/KY/14-18953)在Vero细胞中进行了适应。
在一些实施方案中，提供了适应在Vero细胞中繁殖到高滴度的肠道病毒D68，其由具有SEQ ID No 1的核苷酸序列的cDNA分子编码。在一些其他实施方案中，提供了SEQ IDNo 2中公开的编码适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的核苷酸序列。在还另一个实施方案中，提供了SEQ ID No 3中公开的适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖到高滴度的方法，包括以下步骤：
(a)通过在32-35℃，更准确地在32-33℃吸附约60-120分钟来感染病毒；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃添加维持培养基后繁殖病毒；
(c)以1:3至1:10的稀释度稀释从每次传代获得的病毒原液，以感染接下来的Vero细胞批次用于在32-35℃，更准确地在32-33℃进行病毒的初始传代；
(d)以1:20-1:500的稀释度稀释病毒以在32-35℃，更准确地在32-33℃在随后/后续的传代中感染Vero细胞；和
(e)在每次传代期间当达到90％或更高的细胞病变效应时或在感染的6天内收获病毒。
最初，亲本肠道病毒D68株US/KY/14-18953在Vero细胞中不繁殖，也没有表现出以细胞病变效应或任何细胞畸形为形式的任何感染迹象。因此，亲本株没有表现出任何适应的迹象。随后高感染剂量的病毒用于后续的几次传代。整个感染过程的温度保持在32-34℃左右并且绝不允许超过35℃。通过这种策略，毒株开始适应在Vero细胞中并从第3代开始显示出部分细胞病变效应。到第5代，在Vero细胞中观察到完全的细胞病变效应(CPE)。使用逐渐降低的感染剂量进一步将肠道病毒D68株继续传代，以确定毒株是否在Vero细胞中稳定适应。本发明公开的肠道病毒D68毒株确实适应了在Vero细胞中并已被用作疫苗候选毒株，以使用Vero细胞作为病毒繁殖的基质生产疫苗。
本发明在此公开了一种使任何肠道病毒D68株在Vero细胞中适应以使其适用于疫苗生产的方法。特别地，本发明的一个实施方案描述了在新细胞例如Vero细胞中适应肠道病毒D68的方法。
进一步地，本发明还公开了适应Vero的肠道病毒D68株的一个或多个多核苷酸序列，如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2公开的，以及适应Vero的肠道病毒D68株的一个或多个氨基酸序列，如SEQ ID No.3公开的。
本发明进一步公开了如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10公开的EV68的个别结构蛋白的核苷酸序列以及如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11公开的EV68的个别结构蛋白的氨基酸序列，其可用于制备重组蛋白。SEQID No.4的核苷酸序列翻译得到SEQ ID No.5的氨基酸序列，SEQ ID No.6的核苷酸序列翻译得到SEQ ID No.7的氨基酸序列，SEQ ID No.8的核苷酸序列翻译得到SEQ ID No.9的氨基酸序列，并且SEQ ID No.10的核苷酸序列翻译得到SEQ ID No.11的氨基酸序列。重组蛋白可以对适用于各表达系统的核苷酸序列密码子优化后在细菌、酵母或哺乳动物系统中进行表达并克隆到相应的表达载体中。免疫表达的重组蛋白后产生的抗体可用于诊断完整病毒或相应的蛋白抗原。
在另一个实施方案中，本发明公开了在Vero细胞中适应Vero细胞的肠道病毒D68株的空斑测定的标准化方法，其可用于确定以空斑形成单位表示的病毒滴度，尤其是用于确定空斑减少中和滴度(PRNT)用于疫苗功效研究。
在一些其他实施方案中，提供了一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中增殖至高滴度的方法，其中肠道病毒D68病毒进行空斑测定，包括以下步骤：
(a)每12孔板或6孔板铺板300万至400万个Vero细胞以达到适合空斑测定的汇合度；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃，一式两份、一式三份或一式四份在不同孔中吸附不同稀释度的病毒1-2小时；
(c)以≤0.6％的羧甲基纤维素或0.8-1.8％的Avicel RC 591作为覆盖介质进行覆盖；
(d)用羧甲基纤维素作为覆盖物在感染后5-7天后或用Avicel RC 591作为覆盖物在感染后3-4天后，用10％福尔马林固定细胞；
(e)在固定后去除固定液并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞；和
(f)将新鲜制备的染色液-结晶紫溶液逐滴加到固定的细胞中，并在室温染色30分钟至1小时或2小时。
本发明还公开了从适应的病毒中制备抗原及将其配制为疫苗组合物，以引发针对肠道病毒D68的抗体。适应Vero细胞的EV68的疫苗抗原可以通过使用化学方法如福尔马林、β-丙内酯(BPL)、氧化剂如过氧化氢，物理方法包括但不限于UV或X辐射或γ照射的灭活来制备。
在一些其他实施方案中，提供了一种灭活含有从SEQ ID No.1编码的cDNA的肠道病毒D68用于免疫的方法，包括以下步骤：
(a)对收获的肠道病毒D68病毒进行无菌过滤；
(b)使用核酸酶处理去除宿主核酸并使用100kDa过滤器通过切向流过滤进行浓缩；
(c)使用1/2000-1/4000福尔马林在从25-37℃变化的温度多至3周或使用BPL在4-25℃多至120小时或使用0.005％到3％的过氧化氢在25±5℃多至6小时进行灭活；和
(d)灭活的抗原的纯化或在灭活病毒抗原之前的纯化如下进行：通过使用Sepharose CL-4B的凝胶过滤继之以使用DEAE树脂的阴离子交换层析，或者通过双步骤/两轮尺寸排阻层析，或者通过纤维素硫酸盐继之以阴离子交换层析，或者通过混合模式树脂如CHT II型(Biorad)单独地或与上述树脂组合，或者上述层析步骤的任何组合。
在又一个实施方案中，灭活的疫苗抗原可以在佐剂存在或不存在的情况下配制。佐剂包括但不限于铝佐剂(氢氧化铝、磷酸铝)，乳剂如水包油佐剂或油包水佐剂，Toll样受体(TLR)配体如单磷酰脂质A(MPL)，完整或截短的鞭毛蛋白，包括细菌细胞组分的佐剂，基于角鲨烯的佐剂如MF59或AddaVax、montanide等，Ribi佐剂，含CpG和非CpG的寡核苷酸，皂苷如QS-21，免疫刺激复合物(ISCOM)、ISCOMATRIX等，维生素，免疫调节剂包括细胞因子。
在一些实施方案中，提供了一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的灭活的肠道病毒D68病毒抗原和任选的一种或多种选自佐剂、稳定剂或防腐剂的药学上可接受的赋形剂。
在另一个实施方案中，肠道病毒68疫苗可以与其他基于肠道病毒的疫苗(一种或多种)一起配制以制备一种或多种组合疫苗，其中其他肠道病毒包括但不限于肠道病毒71，柯萨奇病毒包括柯萨奇病毒A16、柯萨奇病毒A6、柯萨奇病毒A10，鼻病毒和脊髓灰质炎病毒。疫苗制剂还可包括肠道病毒68疫苗与黄病毒、正粘病毒或可引起呼吸道疾病、脑炎或脑膜炎的任何其他病毒组合。
在一些实施方案中，提供了属于肠道病毒D68的氨基酸序列，具有选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的多蛋白中的氨基酸。在一些实施方案中，提供了一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的灭活的肠病毒D68病毒抗原，其中肠病毒D68具有在多蛋白中的选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的氨基酸。
在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物在2-8℃稳定至少6个月并且在37℃稳定至少1个月。
实施例
实施例1：病毒繁殖
使用高感染剂量的肠道病毒D68株感染Vero细胞。最初，让病毒吸附在T25 cm2烧瓶中，偶尔摇动，持续约60至120分钟，然后加入DMEM作为维持培养基。使用从每次传代获得的病毒原液以约1:3-1:10的稀释度来感染接下来的批次进行初始传代。在随后/后续的传代中，使用来自先前传代的病毒原液以更高稀释度(范围为1:20-1:500)的病毒进行感染。当达到90％或更高的细胞病变效应时或在感染的6天内(以较早者为准)收获病毒。肠道病毒D68的整个繁殖过程在不高于35℃并且理想的32-33℃的温度进行。不同传代中病毒的滴度通过TCID50测定和/或空斑测定确定，并且如图2所示。
在32-35℃(优选地32-33℃)范围内的受控温度，在初始传代期间选择较低稀释度的病毒进行感染(不会对Vero细胞有毒性)接着在后续的传代中使用较高稀释度的病毒进行感染，如上所述的这整个过程已经允许肠道病毒D68病毒在Vero细胞中成功适应。图1示例说明了肠病毒68在Vero细胞中的适应，其中图1A显示了模拟感染的Vero细胞，图1B显示了用EV68感染的Vero细胞在感染后第3天显示出细胞病变效应。成功适应后，在T75 cm2烧瓶、T175 cm2烧瓶并然后在细胞堆(Cell stack)中或在滚瓶中依次进行病毒生产的规模放大。
实施例2：RNA分离和RT-PCR
已经根据标准程序通过Trizol方法从收获后具有感染病毒的无细胞上清液中分离RNA。简而言之，750μl Trizol用于250μl含有病毒的上清液。如果需要获得大量病毒核酸材料，则在Trizol分离方法之前，通过PEG6000或PEG8000(Merck，India)或使用100kDa截留膜(Merck，India)的超滤来浓缩病毒上清液。使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将分离的RNA逆转录为互补cDNA(cDNA)。使用病毒特异性引物确认病毒RNA的存在，如图3所示。引物序列提供如下：
肠道病毒D68特异性引物(Calvo等人，Pediatr Infect Dis J 2016,35:45-49)：
(F)-1:GTTCYTTAATAGGRTTCRTAGCAGC
(R)-1:CTCTATTRCCAATTATGGCATTRAG
泛肠道病毒引物(Thao等人，J.Virol.Methods 2010,170:134-139)
(F):5’-CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’
(R):5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’
实施例3：测序
对于全基因组测序，使用Illumina兼容的
Figure BDA0003170224570000111
UltraTM DirectionalRNALibrary Prep Kit(New England BioLabs,MA,USA)制备RNA测序文库。测序文库最初通过Qubit荧光计(Thermo Fisher Scientific,MA,U.S.A.)进行定量，并在AgilentTapeStation上分析其片段大小分布。最后，使用Kapa Library Quantification Kit(KapaBiosystems,Wilmington,MA,U.S.A.)通过定量PCR对测序文库进行准确定量。qPCR定量的文库以等摩尔量合并，以创建最终的多重文库集合，用于在Illumina NextSeq(150x 2化学)上进行测序。
下表1提供了亲本肠道病毒D68株US/KY/14-18953与适应Vero细胞的病毒株US/KY/14-18953-Vero之间的氨基酸差异和相应核苷酸水平差异：
Figure BDA0003170224570000112
Figure BDA0003170224570000121
表1：测序总结
实施例4:肠道病毒D68的空斑测定
目前没有全面的文献支持肠道病毒D68空斑测定。本发明公开了肠道病毒D68的标准化空斑测定程序。每12孔板或6孔板(Greiner bio-one)铺板约3百万至4百万个Vero细胞，以达到适合空斑测定的汇合度。将不同稀释度的病毒以一式两份、一式三份或一式四份吸附在不同孔中1-2小时。随后添加0.8％羧甲基纤维素(CMC)(Merck，India)半固体覆盖物。0.6-0.5％浓度的羧甲基纤维素也备选地用作覆盖介质。或者，使用0.8-1.8％浓度的Avicel RC591(FMC Corporation，USA)作为覆盖物。为方便起见，以下将Avicel RC 591称为Avicel。
当CMC用作覆盖物时在感染后4至6天后或当Avicel用作覆盖物时在感染后2至4天后，用10％甲醛固定细胞1小时。固定后，去除固定液并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。洗涤后，将新鲜制备的结晶紫溶液逐滴加到固定的细胞中，并在室温染色30分钟至1小时。当使用CMC作为覆盖物时在感染的第5天或当使用Avicel时在48小时内，可以看到空斑。结果如图4所示。当Avicel用作覆盖介质时，感染3天后空斑更加明显，如图4所示。
实施例5：肠道病毒D68的表达
使用肠道病毒D68-VP1和VP2特异性抗体通过Western印迹对适应Vero细胞的肠道病毒D68抗原检查肠道病毒D68 VP1、VP2蛋白的表达，如图5所示。特异性抗原通过12％SDS-PAGE凝胶分离，然后转移到PVDF膜上。印迹用1％BSA封闭，随后与肠道病毒D68-VP1和VP2特异性一抗(GeneTex)孵育90分钟。不久之后，将印迹用含有吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤四次，然后与缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗孵育。使用显色底物-金属增强的DAB(Thermo Scientific)检测表达信号。
实施例6：用于免疫的疫苗的制备和配制
将繁殖和收获的编码SEQ ID No.1中cDNA的EVD68病毒进行无菌过滤；使用核酸酶处理去除宿主核酸并使用100kDa过滤器通过切向流过滤进行浓缩。随后，使用1/2000-1/4000福尔马林在从25-37℃变化的温度达多至3周，或使用BPL在4-25℃达多至120小时灭活浓缩的病毒。通过使用硫代硫酸盐中和福尔马林。可替代地，使用0.005％到3％过氧化氢在25±5℃达多至6小时灭活病毒。通过加入10U/ml的过氧化氢酶来水解残留的过氧化氢以停止反应。在灭活实验结束时，通过使灭活的病毒在Vero细胞中连续传代多至三次并且没有细胞病变效应来证实灭活。使用肠病毒68抗原特异性VP1抗体对灭活的病毒抗原测试和确认体外抗原性。随后使用Sepharose CL-4B凝胶过滤然后使用DEAE树脂或通过Capto Core700树脂(GE Healthcare Life Sciences)进行阴离子交换层析来纯化灭活的病毒。纯化也通过双步骤/两轮尺寸排阻层析法进行。也可以使用纤维素硫酸盐然后根据需要进行阴离子交换层析来纯化灭活的病毒。也通过混合模式树脂-CHT II型(Biorad)单独或与前面提到的树脂组合进行纯化。
或者，在病毒纯化后进行如上所述的灭活。用于灭活的疫苗的缓冲液是10-30mM磷酸盐缓冲液。可替换地，将Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、蔗糖磷酸谷氨酸盐或任何药学上可接受的缓冲剂用于配制。
用于灭活的疫苗的合适赋形剂包括但不限于选自糖醇如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇(高至20％)的稳定剂。制剂还包含稳定剂如蔗糖和/或海藻糖和/或聚山梨醇酯40或聚山梨醇酯80。疫苗制剂包含选自甘氨酸、谷氨酸、精氨酸的氨基酸或精氨酸盐酸盐(高至2％)。疫苗制剂还包含人或动物血清白蛋白。
疫苗制剂包含选自硫柳汞和2-苯氧乙醇的防腐剂。对于无汞疫苗制剂，将使用2-苯氧乙醇(2.5-20mg/ml)。在另一个实施方案中，制剂不含任何防腐剂。
将灭活的抗原在含或不含铝佐剂佐剂(浓度范围为100μg至1mg)的情况下配制；更准确地与200-500μg的铝佐剂一起配制用于免疫。灭活的肠道病毒68疫苗可以使用其他佐剂配制，其他佐剂例如水包油佐剂或油包水佐剂等乳剂，Toll样受体(TLR)配体如单磷酰脂质A(MPL)，完整或截短的鞭毛蛋白，包括细菌细胞组分的佐剂，基于角鲨烯的佐剂如MF59或AddaVax、montanide等，Ribi佐剂，含CpG和非CpG的寡核苷酸，皂苷如QS-21，免疫刺激复合物(ISCOM)、ISCOMATRIX等，维生素，免疫调节剂包括细胞因子。
实施例7：组合疫苗
EVD68、EV71和脊髓灰质炎病毒导致神经系统症状并且通常与急性弛缓性脊髓炎—与脊髓相关的无力导致肌肉和身体反射的无力。因此，针对EVD68、EV71和脊髓灰质炎病毒的组合疫苗将减少与这些病毒相关的神经系统并发症。
在一个实施方案中，将福尔马林灭活的EVD68抗原(多至5微克)与福尔马林灭活的EV71灭活抗原(多至5微克)在磷酸盐缓冲液(10-30mM)(1:1的抗原比)中配制。制剂的其他组分包括佐剂(包括但不限于多至0.9mg/ml的铝佐剂或MPLA或者组合的铝佐剂和MPLA)、糖和/或糖醇。制剂可包括氨基酸，如甘氨酸和/或谷氨酸盐和/或精氨酸(多至2％)。制剂可以包含或不包含防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。
在另一个实施方案中，福尔马林灭活的EVD68抗原(多至5微克抗原)与福尔马林灭活的sabin 1型脊髓灰质炎(多至40D抗原单位)和sabin 3型脊髓灰质炎疫苗(多至32D抗原单位)一起配制。组合疫苗可以包含或不包含福尔马林灭活的EV71抗原(多至5微克抗原)。
EV71病毒灭活以及1型和3型脊髓灰质炎病毒灭活使用福尔马林在36℃±1℃进行多至4天来完成。在另一个实施方案中，灭活的EVD68、EV71和1型和3型脊髓灰质炎病毒在室温在铝佐剂中分别吸附2-3小时或多至6小时或在搅拌条件下在4℃吸附16小时。随后，在搅拌条件下将吸附的抗原混合在一起。
或者，EVD68抗原或EV71或脊髓灰质炎抗原首先吸附在铝佐剂中，然后是其他抗原。
还通过混合抗原在没有佐剂的情况下制备制剂。
下面提供的表格仅用于示例说明。单价灭活的EVD68疫苗和具有灭活的EVD68、灭活的EV71、灭活的sabin 1型脊髓灰质炎疫苗和灭活的sabin 3型脊髓灰质炎疫苗的组合疫苗的可能制剂范围不限于表中提到的制剂。疫苗制剂的pH值保持在6.5至7.5的范围内。
Figure BDA0003170224570000151
表2：EVD68单价疫苗的制剂
Figure BDA0003170224570000152
Figure BDA0003170224570000161
表3：组合疫苗的制剂
实施例8：疫苗稳定性
通过将灭活的EVD68抗原暴露在2-8℃多至6个月来测试EVD68抗原的稳定性。或者，在37℃达1个月进行加速的稳定性研究。发现灭活的抗原在没有任何稳定剂的情况下在37℃达1个月保持>75％的稳定性。在存在10％蔗糖或10％蔗糖和10％山梨糖醇组合的情况下，在37℃达1个月的稳定性≥90％。在没有稳定剂的情况下在2-8℃储存6个月时的稳定性超过85％，在有10％蔗糖或10％蔗糖和10％山梨糖醇组合的情况下超过95％(图6)。
Figure BDA0003170224570000162
表4：灭活的肠道病毒D68抗原的稳定性研究
实施例9：疫苗抗原的免疫原性
含有灭活的抗原的疫苗用于以三周间隔免疫6-8周的小鼠三次。在每次免疫之前和之后收集血清。如下进行ELISA：在用肠道病毒D68特异性抗原包被后，然后在1％BSA中封闭，随后用免疫的小鼠血清和抗小鼠二抗处理ELISA板。
发现福尔马林灭活的抗原诱导非常高的肠道病毒D68特异性抗体滴度(高至200,000)，并如图7所示。BPL灭活的抗原诱导相对较少但显著量的肠道病毒D68特异性抗体滴度(高至20,000)，如图8所示。
此外，从第三次免疫后两周收集的小鼠血清中确定肠道病毒D68特异性IgG1/IG2a比率，以通过ELISA检测免疫应答的模式是Th1型还是Th2型(图9)。如果IgG1高于IgG2a，则认为Balb/C小鼠中的免疫应答主要与Th2淋巴细胞相关联，而当IgG2a高于IgG1时，则主要与Th1淋巴细胞相关联。当IgG1/IgG2a接近1时，一般认为是平衡的Th1和Th2免疫应答。已经发现，与IgG2a相比，不加佐剂的β-丙内酯(BPL)灭活的EVD68抗原引发了高IgG1型病毒特异性抗体(IgG1/IgG2a＝3)，表明Th2型免疫应答。与IgG2a相比，加铝佐剂的BPL灭活的EVD68抗原引发了甚至更高的IgG1型病毒特异性抗体(IgG1/IgG2a＝9.8)，表明向Th2型免疫应答的进一步极化。相反，已发现未加佐剂的福尔马林灭活的EVD68抗原引发平衡的IgG1和IgG2a抗体应答(IgG2a/IgG1＝1.22)，表明更平衡的Th1和Th2型免疫应答，这在铝佐剂作为佐剂存在的情况下稍微更加倾向Th2型免疫应答(IgG1/IgG2a＝1.67)。
为了中和滴度检测，将来自EVD68灭活的抗原疫苗(使用或不使用佐剂配制)免疫小鼠的血清连续稀释，并与肠道病毒D68病毒以1:1的比例孵育2小时。将血清-病毒混合物加入到Vero细胞中并孵育2小时。随后，在DMEM培养基中用1.2％Avicel覆盖细胞。感染后四天将细胞固定在10％福尔马林中，并用0.8％结晶紫溶液染色以观察空斑。PRNT50计算为显示空斑数量减少50％或更多的最高血清稀释度。
或者，以96孔形式进行微量中和测定。在微量中和法中，每96孔板接种250万个细胞。将来自EVD68灭活的抗原疫苗(使用或不使用佐剂配制)免疫小鼠的血清连续稀释，并与肠道病毒D68病毒以1:1的比率孵育2小时。随后，将血清-病毒混合物加入到Vero细胞中并等待长达4天以观察具有血清-病毒混合物的孔中对Vero细胞的细胞病变效应的抑制。中和滴度被认为是与具有对照病毒或阴性对照血清-病毒混合物的孔相比抑制50％的细胞病变效应的血清的最后稀释度。
福尔马林和BPL灭活的肠道病毒D68抗原均在Balb/c小鼠中诱导显著中和抗体滴度。
抗原制剂 中和滴度
福尔马林灭活的EVD68抗原 64
福尔马林灭活的EVD68抗原+铝佐剂 64
BPL灭活的EVD68抗原 16
BPL灭活的EVD68抗原+铝佐剂 16
表5：由福尔马林和BPL灭活的适应Vero细胞的肠道病毒D68抗原诱导的中和滴度。
序列表
<110> Bharat Biotech International Limited
<120> 肠道病毒对VERO细胞的适应及其疫苗制剂
<130> P-18-753-IN
<140> 201841049814
<141> 2018-12-29
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7348
<212> DNA
<213> 适应Vero的肠道病毒68/肠道病毒D68株US/KY-18953(称为US/KY/14-18953-Vero)的全基因组的互补DNA序列
<400> 1
ataaaacagc cttggggttg ttcccacccc aagggcccac gtggcggcta gtactctggt 60
atttcggtac ctttgtacgc ctgttttatc tccctcccca atgtaactta gaagctttca 120
aatcaaagct caataggtgg agcgcaagcc agcgcttccg tgagcaagca ctcctgtttc 180
cccggtgcgg ttgtatagac tgttcccacg gttgaaaaca acctatccgt tatccgctat 240
agtacttcga gaaacctagt atcacctttg gattgttgat gcgttgcgct cagcacacta 300
acccgtgtgt agcttgggtc gatgagtctg gacatacccc actggtgaca gtggtccagg 360
ctgcgttggc ggcctactca tggtgaaaac catgagacgc taaacatgaa caaggtgtga 420
agagtctatt gagctactat agagtcctcc ggcccctgaa tgcggctaat cttaaccatg 480
gagcaagtgc tcacaaacca gtgagttgct tgtcgtaatg cgcaagtccg tggcggaacc 540
gactactttg ggtgtccgtg tttcactttt tacttttatg actgcttatg gtgacaattt 600
aatattgtta ccatttagct agtcaaatta atcatataaa actttaaatc ctatctaaca 660
attcacattt ggatagcttc attttgagga ctttatacct acttacaaag atgggggctc 720
aagttactag acagcaaacc ggaacccatg agaacgccaa cattgccaca aatggatccc 780
atatcacata caaccagata aatttttaca aagatagtta tgcggcttca gctagtaaac 840
aagatttttc tcaggaccca tcaaaattta ctgaaccagt ggtagaaggc ttaaaagcag 900
gggctccagt tttgaaatcc cctagtgctg aggcatgtgg ctacagtgat agagtattac 960
aactcaaatt aggtaattcg gctattgtca ctcaggaagc agcgaactat tgttgcgctt 1020
atggtgaatg gcccaattat ttaccagatc acgaggcagt agctattgac aaacccacac 1080
aaccagaaac tgctacggac agattctata ccttgaaatc ggtcaaatgg gaaactgaaa 1140
gtacaggatg gtggtggaaa ttacctgatg cactaaacaa cataggtatg tttggacaaa 1200
atgtacagca tcactactta tataggtctg gtttcttaat tcatgtgcag tgtaacgcca 1260
caaaattcca tcaaggtgcc ctattagtgg tagcaatccc agaacaccaa aggggggcgc 1320
acaacaccac tactagccca ggttttgatg atatcatgaa gggtgaagaa ggagggacat 1380
ttaaccaccc atatgtcctt gatgatggga cgtcactagc ctgcgcaaca atatttccac 1440
accagtggat aaatttgaga accaataatt cagcaacaat agttcttccc tggatgaatg 1500
ccgctccaat ggacttccca ctcaggcaca atcagtggac actagcaata attccagtag 1560
taccactagg tacgcgcaca gtgtcaagta tggttccaat aacagtttct attgctccaa 1620
tgtgttgtga gtttaatgga ctcagacacg ccattactca aggtgtccca acataccttc 1680
taccaggctc aggacaattt ctaactactg atgatcacag ctctgcgccg cttcttccat 1740
gcttcaaccc aactccagaa atgcacattc cagggcaagt ccgcaacatg ctagaagtga 1800
ttcaggtgga atcaatgatg gagattaata acacagaaaa tgcagttggc atgcagcgtc 1860
tcaaagttga tatatcagta ctaacagacg ttgatcaatt gttattcaac atcccactag 1920
acatacagtt agatgggcca cttagaaaca ctctagtagg aaacatatct agatattata 1980
ctcactggtc tggatctcta gaaatgacat ttatgttttg tgggagcttc atggcaacag 2040
gaaaattaat tctgtgttac actcctccag gcgggtcatg cccaacaacc agagaaactg 2100
ctatgttagg tacacatatt gtttgggatt ttggattaca atccagtgtc actctggtaa 2160
taccttggat cagtggatcc cactacagga tgttcaacaa tgatgctaag tcaaccaatg 2220
ccaatgttgg ctatgttacc tgttttatgc aaaccaattt aatagttccc agtgagtctt 2280
ctaacacatg ttccttaata gggttcgtag cagcaaaaga tgacttttcc ctcaggctaa 2340
tgagagatag ccctgacatt ggacaactag aacatttaca tgaggcagag gcagcctacc 2400
agattgagag catcatcaag acagcaactg acaccgtgaa aagtgagatt aacgctgaac 2460
ttggcgtggt ccctagtttg aatgcagttg aaacaggtgc aagttctaac actgaaccag 2520
aggaagccat acaaactcgc acggtgataa atcagcatgg tgtatctgaa acattagtgg 2580
agaattttct tagcagggca gccttagtat caaagagaag tttcgaatac aaaaatcaca 2640
cctcatctgg agcacgaaca gacaagaact tttataaatg gacaattaac accaagtcct 2700
ttgtccagtt gaggagaaag ctggaactgt tcacgtacct tagatttgat gctgaaatta 2760
ccatacttac aactgtggca gtaggtagca acaacagcac atacaagggc cttcctgact 2820
tgacacttca agcaatgttt gtacctactg gtgcccttac tccaaaaaaa caggattcat 2880
tccattggca gtccggtagt aatgctagtg tattcttcaa agtttctgac cccccagcca 2940
gaatgactat accttttatg tgtatcaact cagcatactc agttttctat gatggttttg 3000
ctggatttga aaagaatggt ctttatggga taaatccagc tgataccatc ggcaacttat 3060
gtgtcagaat agtgaatgag caccagccaa ttggtttcac agtgaccgtc agggtttaca 3120
tgaagcctaa acacataaaa gcgtgggcac ccagaccacc acgaaccctg ccatatatga 3180
gcattgcaaa tgcaaactat aagggtaaag aaagggcacc aaatgcgctc aatgccataa 3240
ttggcaatag agagagtgtc aaaaccatgc ctcatgatat ccggttagtg aatactggtc 3300
caggcttcgg aggggtcttt gtaggatctt ttaaaataat taactaccac ttagccacta 3360
tagaggaaag acagtcagct atctatgtag actggcaatc agatgttctg gttactccca 3420
ttgctgccca tggaagacac caaatagcaa gatgtaagtg caatacaggg gtttattatt 3480
gcagacacag agataagagc tacccagttt gttttgaagg cccagggatt caatggattg 3540
aacaaaatga atattaccca gcaaggtacc agactaatgt gcttctagca gctggtcctg 3600
cagaagcagg agattgtggt ggtttactgg tctgtccaca tggggtaatt ggtcttctca 3660
cagcaggggg gggtggaatt gtagctttca ctgatatcag gaatttacta tggttagata 3720
ctgatgctat ggaacaaggc attactgatt acattcaaaa tctcggtaat gcctttggag 3780
cggggtttac agaaacaatc tctagtaaag ctaaggaagt gcaagacatg ttgattggag 3840
agagttcact attagagaaa ttgttaaaag ctctaatcaa aattatctca gcattggtga 3900
ttgtaattag aaattcagaa gatttaatta cagtcacagc cacactagca ttgctaggtt 3960
gccatgattc accatggagc tatttgaaac ataaagtgtg ctcatattta ggtattcctt 4020
atgtacctag acagagtgaa tcatggctca agaagttcac agaagcatgc aatgctctca 4080
ggggtttaga ttggttatca cagaagatag ataaattcat caactggctt aaaaacaaaa 4140
tattaccaga ggctagggag aaatatgaat ttgtacaaag actcaaacag ttaccagtca 4200
tagagaacca agttagcact attgaacata gctgcccaac aacagaacaa caacaggcct 4260
tgtttaacaa tgttcaatat tactcacact attgtagaaa gtatgcacca ctttacgcag 4320
tggaggcaaa gagagtgaca gctcttgaaa agaaaataaa taactacatc cagttcaagt 4380
ccaaatctcg cattgaaccg gtttgtttaa taatacatgg ttccccaggg actggcaaat 4440
cagtagcttc aaatctgatt gccagggcta tcacagaaaa gttaggaggg gatgtttatt 4500
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atgatttaat gcaaaatcca gatggaaacg acatatctat gttttgccaa atggtttcca 4620
ccgtggactt tatacctcca atggccagtt tagaagaaaa gggaactcta tacaccagtc 4680
catttttgat agccactact aatgctggct caatacatgc accaaccgtc tcagactcca 4740
aggctttgtc acgcagattt aaatttgatg tgaacattga ggtcacagat tcatacaaag 4800
actcaaataa attggacatg tcaagagcag tggagatgtg taaaccagat gactgtgctc 4860
ccattaatta taaaagatgc tgcccattga tttgtggaaa ggccattcaa tttagagatc 4920
gtagatctaa tgcaagatcc actatagata tgttagtaac tgacattatt aaggagtata 4980
gaatcagaaa cagtacacaa gataaactgg aggctctgtt ccagggacct ccacagttta 5040
aagagatcaa aatttcagtt actccagaca caccagctcc tgatgctata aacgatcttc 5100
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aggccgttgc tacctttgta tcaatagcag gtgtagttta tgttatatat aaactttttg 5280
ctggtatcca aggcccttac acaggaattc ccaatcctaa acctaaggta ccctctctta 5340
gaacagctaa agtgcagggg ccagggtttg attttgcaca agctataatg aagaaaaaca 5400
ccgtcattgc caggactgaa aagggtgagt tcaccatgtt gggtatacat gatagagtgg 5460
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aagttttaga tgcatgtgct ctcagagact tgactgacac aaatttagag attaccatag 5580
tcaaactgga tcgtaaccaa aagtttagag atatcagaca ttttctgccc agatatgagg 5640
atgattataa tgatgctgtg cttagcgtgc atacatcaaa atttccaaat atgtatatcc 5700
cagtcgggca agtcaccaat tatggtttcc taaacctagg tggcacacca actcaccgca 5760
ttttgatgta taactttcca acaagagctg gtcagtgtgg tggtgtggtg acaaccacag 5820
gtaaagtgat agggatacat gtaggtggaa atggagctca agggtttgca gcaatgctac 5880
tccattctta ctttattgat acacaaggtg aaatagttag caatgagaaa agtggggtgt 5940
gtattaacgc accggcaaag accaaacttc aacccagtgt cttccatcaa gtttttgaag 6000
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cccttgaaag tgccatgtat gggatggatg gtctcgaggc attagactta accaccagtg 6240
cagggttccc ctacttgctg caagggaaga agaaaaggga tatattcaac agacaaacca 6300
gggacaccac tgaaatgaca aggatgttag aaaaatatgg agttgatcta ccttttgtaa 6360
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gttatgatgc cagcttatca ccagtatggt ttgcctgttt aaagaaagtt ttaattaaat 6660
taggttacac ccatcagaca tctttcatag attatctgtg tcactcggta catttgtaca 6720
aggacagaaa atatatagtc aatggtggaa tgccctctgg ttcttcaggc accagcatat 6780
tcaatactat gatcaataat ataatcatga ggactttgtt gattagggtt tataaaggca 6840
tagacttaga ccaattcaag atgatagcat atggagatga tgttattgct agttatccac 6900
acaagattga tccaggttta ctagcagaag caggcaaaca ttatggatta ctaatgacac 6960
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ctttgtgtta tctcgcatgg cataacgggg aggaggctta caatgaattt tgtagaaaaa 7200
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agaggtaaat tttggtcact tgggggcc 7348
<210> 2
<211> 6570
<212> DNA
<213> 编码US/KY/14-18953-Vero的多蛋白的核苷酸序列
<400> 2
atgggggctc aagttactag acagcaaacc ggaacccatg agaacgccaa cattgccaca 60
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gtttattatt gcagacacag agataagagc tacccagttt gttttgaagg cccagggatt 2820
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cagttcaagt ccaaatctcg cattgaaccg gtttgtttaa taatacatgg ttccccaggg 3720
actggcaaat cagtagcttc aaatctgatt gccagggcta tcacagaaaa gttaggaggg 3780
gatgtttatt ctctaccccc agacccaaaa tattttgatg ggtataaaca gcaaacagta 3840
gtccttatgg atgatttaat gcaaaatcca gatggaaacg acatatctat gttttgccaa 3900
atggtttcca ccgtggactt tatacctcca atggccagtt tagaagaaaa gggaactcta 3960
tacaccagtc catttttgat agccactact aatgctggct caatacatgc accaaccgtc 4020
tcagactcca aggctttgtc acgcagattt aaatttgatg tgaacattga ggtcacagat 4080
tcatacaaag actcaaataa attggacatg tcaagagcag tggagatgtg taaaccagat 4140
gactgtgctc ccattaatta taaaagatgc tgcccattga tttgtggaaa ggccattcaa 4200
tttagagatc gtagatctaa tgcaagatcc actatagata tgttagtaac tgacattatt 4260
aaggagtata gaatcagaaa cagtacacaa gataaactgg aggctctgtt ccagggacct 4320
ccacagttta aagagatcaa aatttcagtt actccagaca caccagctcc tgatgctata 4380
aacgatcttc tcaggtcagt ggattctcaa gaagttaggg actattgcca aaagaaaggg 4440
tggattgtaa tacacccatc aaatgaatta ttagtggaaa aacacattag cagggctttt 4500
atcactctac aggccgttgc tacctttgta tcaatagcag gtgtagttta tgttatatat 4560
aaactttttg ctggtatcca aggcccttac acaggaattc ccaatcctaa acctaaggta 4620
ccctctctta gaacagctaa agtgcagggg ccagggtttg attttgcaca agctataatg 4680
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gatagagtgg cagttatccc cacacatgca tctgttggag aaaccattta catcaacgat 4800
gtagagacta aagttttaga tgcatgtgct ctcagagact tgactgacac aaatttagag 4860
attaccatag tcaaactgga tcgtaaccaa aagtttagag atatcagaca ttttctgccc 4920
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atgtatatcc cagtcgggca agtcaccaat tatggtttcc taaacctagg tggcacacca 5040
actcaccgca ttttgatgta taactttcca acaagagctg gtcagtgtgg tggtgtggtg 5100
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gcaatgctac tccattctta ctttattgat acacaaggtg aaatagttag caatgagaaa 5220
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gtttttgaag gttcaaagga accagcagtt ctcaattcaa aagatcctag gcttaagaca 5340
gattttgagg aagctatctt ttcaaaatat acaggtaata aaattatgtt aatggatgaa 5400
tacatggaag aagcagtgga tcattatgta ggatgtttag aaccattaga tattagtata 5460
gatcctatac cccttgaaag tgccatgtat gggatggatg gtctcgaggc attagactta 5520
accaccagtg cagggttccc ctacttgctg caagggaaga agaaaaggga tatattcaac 5580
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gatccagata tattctggtc aaaaatccct attttgctag atggagaaat ctttgctttt 5880
gattacactg gttatgatgc cagcttatca ccagtatggt ttgcctgttt aaagaaagtt 5940
ttaattaaat taggttacac ccatcagaca tctttcatag attatctgtg tcactcggta 6000
catttgtaca aggacagaaa atatatagtc aatggtggaa tgccctctgg ttcttcaggc 6060
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ccaatgaagg agatacatga gtccattaga tggactaaag accccagaaa tacacaggat 6420
catgttagat ctttgtgtta tctcgcatgg cataacgggg aggaggctta caatgaattt 6480
tgtagaaaaa ttagaagtgt gcctgtggga agggcattga cactacctgc atactctagt 6540
cttagacgaa aatggttaga ttcgttctag 6570
<210> 3
<211> 2189
<212> PRT
<213> US/KY/14-18953-Vero的多蛋白的氨基酸序列
<400> 3
Met Gly Ala Gln Val Thr Arg Gln Gln Thr Gly Thr His Glu Asn Ala
1 5 10 15
Asn Ile Ala Thr Asn Gly Ser His Ile Thr Tyr Asn Gln Ile Asn Phe
20 25 30
Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Lys Gln Asp Phe Ser Gln
35 40 45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Val Glu Gly Leu Lys Ala Gly
50 55 60
Ala Pro Val Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Arg Val Leu Gln Leu Lys Leu Gly Asn Ser Ala Ile Val Thr Gln Glu
85 90 95
Ala Ala Asn Tyr Cys Cys Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Asn Tyr Leu Pro
100 105 110
Asp His Glu Ala Val Ala Ile Asp Lys Pro Thr Gln Pro Glu Thr Ala
115 120 125
Thr Asp Arg Phe Tyr Thr Leu Lys Ser Val Lys Trp Glu Thr Glu Ser
130 135 140
Thr Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn Ile Gly Met
145 150 155 160
Phe Gly Gln Asn Val Gln His His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Leu
165 170 175
Ile His Val Gln Cys Asn Ala Thr Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu
180 185 190
Val Val Ala Ile Pro Glu His Gln Arg Gly Ala His Asn Thr Thr Thr
195 200 205
Ser Pro Gly Phe Asp Asp Ile Met Lys Gly Glu Glu Gly Gly Thr Phe
210 215 220
Asn His Pro Tyr Val Leu Asp Asp Gly Thr Ser Leu Ala Cys Ala Thr
225 230 235 240
Ile Phe Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr
245 250 255
Ile Val Leu Pro Trp Met Asn Ala Ala Pro Met Asp Phe Pro Leu Arg
260 265 270
His Asn Gln Trp Thr Leu Ala Ile Ile Pro Val Val Pro Leu Gly Thr
275 280 285
Arg Thr Val Ser Ser Met Val Pro Ile Thr Val Ser Ile Ala Pro Met
290 295 300
Cys Cys Glu Phe Asn Gly Leu Arg His Ala Ile Thr Gln Gly Val Pro
305 310 315 320
Thr Tyr Leu Leu Pro Gly Ser Gly Gln Phe Leu Thr Thr Asp Asp His
325 330 335
Ser Ser Ala Pro Leu Leu Pro Cys Phe Asn Pro Thr Pro Glu Met His
340 345 350
Ile Pro Gly Gln Val Arg Asn Met Leu Glu Val Ile Gln Val Glu Ser
355 360 365
Met Met Glu Ile Asn Asn Thr Glu Asn Ala Val Gly Met Gln Arg Leu
370 375 380
Lys Val Asp Ile Ser Val Leu Thr Asp Val Asp Gln Leu Leu Phe Asn
385 390 395 400
Ile Pro Leu Asp Ile Gln Leu Asp Gly Pro Leu Arg Asn Thr Leu Val
405 410 415
Gly Asn Ile Ser Arg Tyr Tyr Thr His Trp Ser Gly Ser Leu Glu Met
420 425 430
Thr Phe Met Phe Cys Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys Leu Ile Leu
435 440 445
Cys Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Ser Cys Pro Thr Thr Arg Glu Thr Ala
450 455 460
Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val
465 470 475 480
Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Gly Ser His Tyr Arg Met Phe Asn
485 490 495
Asn Asp Ala Lys Ser Thr Asn Ala Asn Val Gly Tyr Val Thr Cys Phe
500 505 510
Met Gln Thr Asn Leu Ile Val Pro Ser Glu Ser Ser Asn Thr Cys Ser
515 520 525
Leu Ile Gly Phe Val Ala Ala Lys Asp Asp Phe Ser Leu Arg Leu Met
530 535 540
Arg Asp Ser Pro Asp Ile Gly Gln Leu Glu His Leu His Glu Ala Glu
545 550 555 560
Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Ser Ile Ile Lys Thr Ala Thr Asp Thr Val
565 570 575
Lys Ser Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Val Val Pro Ser Leu Asn Ala
580 585 590
Val Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Thr Glu Pro Glu Glu Ala Ile Gln
595 600 605
Thr Arg Thr Val Ile Asn Gln His Gly Val Ser Glu Thr Leu Val Glu
610 615 620
Asn Phe Leu Ser Arg Ala Ala Leu Val Ser Lys Arg Ser Phe Glu Tyr
625 630 635 640
Lys Asn His Thr Ser Ser Gly Ala Arg Thr Asp Lys Asn Phe Tyr Lys
645 650 655
Trp Thr Ile Asn Thr Lys Ser Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu
660 665 670
Leu Phe Thr Tyr Leu Arg Phe Asp Ala Glu Ile Thr Ile Leu Thr Thr
675 680 685
Val Ala Val Gly Ser Asn Asn Ser Thr Tyr Lys Gly Leu Pro Asp Leu
690 695 700
Thr Leu Gln Ala Met Phe Val Pro Thr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Lys
705 710 715 720
Gln Asp Ser Phe His Trp Gln Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Phe Phe
725 730 735
Lys Val Ser Asp Pro Pro Ala Arg Met Thr Ile Pro Phe Met Cys Ile
740 745 750
Asn Ser Ala Tyr Ser Val Phe Tyr Asp Gly Phe Ala Gly Phe Glu Lys
755 760 765
Asn Gly Leu Tyr Gly Ile Asn Pro Ala Asp Thr Ile Gly Asn Leu Cys
770 775 780
Val Arg Ile Val Asn Glu His Gln Pro Ile Gly Phe Thr Val Thr Val
785 790 795 800
Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Lys Ala Trp Ala Pro Arg Pro
805 810 815
Pro Arg Thr Leu Pro Tyr Met Ser Ile Ala Asn Ala Asn Tyr Lys Gly
820 825 830
Lys Glu Arg Ala Pro Asn Ala Leu Asn Ala Ile Ile Gly Asn Arg Glu
835 840 845
Ser Val Lys Thr Met Pro His Asp Ile Arg Leu Val Asn Thr Gly Pro
850 855 860
Gly Phe Gly Gly Val Phe Val Gly Ser Phe Lys Ile Ile Asn Tyr His
865 870 875 880
Leu Ala Thr Ile Glu Glu Arg Gln Ser Ala Ile Tyr Val Asp Trp Gln
885 890 895
Ser Asp Val Leu Val Thr Pro Ile Ala Ala His Gly Arg His Gln Ile
900 905 910
Ala Arg Cys Lys Cys Asn Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Arg His Arg Asp
915 920 925
Lys Ser Tyr Pro Val Cys Phe Glu Gly Pro Gly Ile Gln Trp Ile Glu
930 935 940
Gln Asn Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Thr Asn Val Leu Leu Ala
945 950 955 960
Ala Gly Pro Ala Glu Ala Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Val Cys Pro
965 970 975
His Gly Val Ile Gly Leu Leu Thr Ala Gly Gly Gly Gly Ile Val Ala
980 985 990
Phe Thr Asp Ile Arg Asn Leu Leu Trp Leu Asp Thr Asp Ala Met Glu
995 1000 1005
Gln Gly Ile Thr Asp Tyr Ile Gln Asn Leu Gly Asn Ala Phe Gly
1010 1015 1020
Ala Gly Phe Thr Glu Thr Ile Ser Ser Lys Ala Lys Glu Val Gln
1025 1030 1035
Asp Met Leu Ile Gly Glu Ser Ser Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys
1040 1045 1050
Ala Leu Ile Lys Ile Ile Ser Ala Leu Val Ile Val Ile Arg Asn
1055 1060 1065
Ser Glu Asp Leu Ile Thr Val Thr Ala Thr Leu Ala Leu Leu Gly
1070 1075 1080
Cys His Asp Ser Pro Trp Ser Tyr Leu Lys His Lys Val Cys Ser
1085 1090 1095
Tyr Leu Gly Ile Pro Tyr Val Pro Arg Gln Ser Glu Ser Trp Leu
1100 1105 1110
Lys Lys Phe Thr Glu Ala Cys Asn Ala Leu Arg Gly Leu Asp Trp
1115 1120 1125
Leu Ser Gln Lys Ile Asp Lys Phe Ile Asn Trp Leu Lys Asn Lys
1130 1135 1140
Ile Leu Pro Glu Ala Arg Glu Lys Tyr Glu Phe Val Gln Arg Leu
1145 1150 1155
Lys Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Gln Val Ser Thr Ile Glu His
1160 1165 1170
Ser Cys Pro Thr Thr Glu Gln Gln Gln Ala Leu Phe Asn Asn Val
1175 1180 1185
Gln Tyr Tyr Ser His Tyr Cys Arg Lys Tyr Ala Pro Leu Tyr Ala
1190 1195 1200
Val Glu Ala Lys Arg Val Thr Ala Leu Glu Lys Lys Ile Asn Asn
1205 1210 1215
Tyr Ile Gln Phe Lys Ser Lys Ser Arg Ile Glu Pro Val Cys Leu
1220 1225 1230
Ile Ile His Gly Ser Pro Gly Thr Gly Lys Ser Val Ala Ser Asn
1235 1240 1245
Leu Ile Ala Arg Ala Ile Thr Glu Lys Leu Gly Gly Asp Val Tyr
1250 1255 1260
Ser Leu Pro Pro Asp Pro Lys Tyr Phe Asp Gly Tyr Lys Gln Gln
1265 1270 1275
Thr Val Val Leu Met Asp Asp Leu Met Gln Asn Pro Asp Gly Asn
1280 1285 1290
Asp Ile Ser Met Phe Cys Gln Met Val Ser Thr Val Asp Phe Ile
1295 1300 1305
Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu Glu Lys Gly Thr Leu Tyr Thr Ser
1310 1315 1320
Pro Phe Leu Ile Ala Thr Thr Asn Ala Gly Ser Ile His Ala Pro
1325 1330 1335
Thr Val Ser Asp Ser Lys Ala Leu Ser Arg Arg Phe Lys Phe Asp
1340 1345 1350
Val Asn Ile Glu Val Thr Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Asn Lys Leu
1355 1360 1365
Asp Met Ser Arg Ala Val Glu Met Cys Lys Pro Asp Asp Cys Ala
1370 1375 1380
Pro Ile Asn Tyr Lys Arg Cys Cys Pro Leu Ile Cys Gly Lys Ala
1385 1390 1395
Ile Gln Phe Arg Asp Arg Arg Ser Asn Ala Arg Ser Thr Ile Asp
1400 1405 1410
Met Leu Val Thr Asp Ile Ile Lys Glu Tyr Arg Ile Arg Asn Ser
1415 1420 1425
Thr Gln Asp Lys Leu Glu Ala Leu Phe Gln Gly Pro Pro Gln Phe
1430 1435 1440
Lys Glu Ile Lys Ile Ser Val Thr Pro Asp Thr Pro Ala Pro Asp
1445 1450 1455
Ala Ile Asn Asp Leu Leu Arg Ser Val Asp Ser Gln Glu Val Arg
1460 1465 1470
Asp Tyr Cys Gln Lys Lys Gly Trp Ile Val Ile His Pro Ser Asn
1475 1480 1485
Glu Leu Leu Val Glu Lys His Ile Ser Arg Ala Phe Ile Thr Leu
1490 1495 1500
Gln Ala Val Ala Thr Phe Val Ser Ile Ala Gly Val Val Tyr Val
1505 1510 1515
Ile Tyr Lys Leu Phe Ala Gly Ile Gln Gly Pro Tyr Thr Gly Ile
1520 1525 1530
Pro Asn Pro Lys Pro Lys Val Pro Ser Leu Arg Thr Ala Lys Val
1535 1540 1545
Gln Gly Pro Gly Phe Asp Phe Ala Gln Ala Ile Met Lys Lys Asn
1550 1555 1560
Thr Val Ile Ala Arg Thr Glu Lys Gly Glu Phe Thr Met Leu Gly
1565 1570 1575
Ile His Asp Arg Val Ala Val Ile Pro Thr His Ala Ser Val Gly
1580 1585 1590
Glu Thr Ile Tyr Ile Asn Asp Val Glu Thr Lys Val Leu Asp Ala
1595 1600 1605
Cys Ala Leu Arg Asp Leu Thr Asp Thr Asn Leu Glu Ile Thr Ile
1610 1615 1620
Val Lys Leu Asp Arg Asn Gln Lys Phe Arg Asp Ile Arg His Phe
1625 1630 1635
Leu Pro Arg Tyr Glu Asp Asp Tyr Asn Asp Ala Val Leu Ser Val
1640 1645 1650
His Thr Ser Lys Phe Pro Asn Met Tyr Ile Pro Val Gly Gln Val
1655 1660 1665
Thr Asn Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gly Thr Pro Thr His Arg
1670 1675 1680
Ile Leu Met Tyr Asn Phe Pro Thr Arg Ala Gly Gln Cys Gly Gly
1685 1690 1695
Val Val Thr Thr Thr Gly Lys Val Ile Gly Ile His Val Gly Gly
1700 1705 1710
Asn Gly Ala Gln Gly Phe Ala Ala Met Leu Leu His Ser Tyr Phe
1715 1720 1725
Ile Asp Thr Gln Gly Glu Ile Val Ser Asn Glu Lys Ser Gly Val
1730 1735 1740
Cys Ile Asn Ala Pro Ala Lys Thr Lys Leu Gln Pro Ser Val Phe
1745 1750 1755
His Gln Val Phe Glu Gly Ser Lys Glu Pro Ala Val Leu Asn Ser
1760 1765 1770
Lys Asp Pro Arg Leu Lys Thr Asp Phe Glu Glu Ala Ile Phe Ser
1775 1780 1785
Lys Tyr Thr Gly Asn Lys Ile Met Leu Met Asp Glu Tyr Met Glu
1790 1795 1800
Glu Ala Val Asp His Tyr Val Gly Cys Leu Glu Pro Leu Asp Ile
1805 1810 1815
Ser Ile Asp Pro Ile Pro Leu Glu Ser Ala Met Tyr Gly Met Asp
1820 1825 1830
Gly Leu Glu Ala Leu Asp Leu Thr Thr Ser Ala Gly Phe Pro Tyr
1835 1840 1845
Leu Leu Gln Gly Lys Lys Lys Arg Asp Ile Phe Asn Arg Gln Thr
1850 1855 1860
Arg Asp Thr Thr Glu Met Thr Arg Met Leu Glu Lys Tyr Gly Val
1865 1870 1875
Asp Leu Pro Phe Val Thr Phe Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Arg
1880 1885 1890
Glu Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser
1895 1900 1905
Leu Asn Asp Ser Val Ala Met Arg Val Ala Phe Gly Asn Leu Tyr
1910 1915 1920
Ala Thr Phe His Asn Asn Pro Gly Thr Ala Thr Gly Ser Ala Val
1925 1930 1935
Gly Cys Asp Pro Asp Ile Phe Trp Ser Lys Ile Pro Ile Leu Leu
1940 1945 1950
Asp Gly Glu Ile Phe Ala Phe Asp Tyr Thr Gly Tyr Asp Ala Ser
1955 1960 1965
Leu Ser Pro Val Trp Phe Ala Cys Leu Lys Lys Val Leu Ile Lys
1970 1975 1980
Leu Gly Tyr Thr His Gln Thr Ser Phe Ile Asp Tyr Leu Cys His
1985 1990 1995
Ser Val His Leu Tyr Lys Asp Arg Lys Tyr Ile Val Asn Gly Gly
2000 2005 2010
Met Pro Ser Gly Ser Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn Thr Met Ile
2015 2020 2025
Asn Asn Ile Ile Met Arg Thr Leu Leu Ile Arg Val Tyr Lys Gly
2030 2035 2040
Ile Asp Leu Asp Gln Phe Lys Met Ile Ala Tyr Gly Asp Asp Val
2045 2050 2055
Ile Ala Ser Tyr Pro His Lys Ile Asp Pro Gly Leu Leu Ala Glu
2060 2065 2070
Ala Gly Lys His Tyr Gly Leu Leu Met Thr Pro Ala Asp Lys Gly
2075 2080 2085
Thr Ser Phe Val Asp Thr Asn Trp Glu Asn Val Thr Phe Leu Lys
2090 2095 2100
Arg Tyr Phe Arg Ala Asp Gln Gln Tyr Pro Phe Leu Ile His Pro
2105 2110 2115
Val Met Pro Met Lys Glu Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys
2120 2125 2130
Asp Pro Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Tyr Leu
2135 2140 2145
Ala Trp His Asn Gly Glu Glu Ala Tyr Asn Glu Phe Cys Arg Lys
2150 2155 2160
Ile Arg Ser Val Pro Val Gly Arg Ala Leu Thr Leu Pro Ala Tyr
2165 2170 2175
Ser Ser Leu Arg Arg Lys Trp Leu Asp Ser Phe
2180 2185
<210> 4
<211> 207
<212> DNA
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP4蛋白的互补DNA序列
<400> 4
atgggggctc aagttactag acagcaaacc ggaacccatg agaacgccaa cattgccaca 60
aatggatccc atatcacata caaccagata aatttttaca aagatagtta tgcggcttca 120
gctagtaaac aagatttttc tcaggaccca tcaaaattta ctgaaccagt ggtagaaggc 180
ttaaaagcag gggctccagt tttgaaa 207
<210> 5
<211> 69
<212> PRT
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP4蛋白的氨基酸序列
<400> 5
Met Gly Ala Gln Val Thr Arg Gln Gln Thr Gly Thr His Glu Asn Ala
1 5 10 15
Asn Ile Ala Thr Asn Gly Ser His Ile Thr Tyr Asn Gln Ile Asn Phe
20 25 30
Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Lys Gln Asp Phe Ser Gln
35 40 45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Val Glu Gly Leu Lys Ala Gly
50 55 60
Ala Pro Val Leu Lys
65
<210> 6
<211> 744
<212> DNA
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP2蛋白的互补DNA序列
<400> 6
tcccctagtg ctgaggcatg tggctacagt gatagagtat tacaactcaa attaggtaat 60
tcggctattg tcactcagga agcagcgaac tattgttgcg cttatggtga atggcccaat 120
tatttaccag atcacgaggc agtagctatt gacaaaccca cacaaccaga aactgctacg 180
gacagattct ataccttgaa atcggtcaaa tgggaaactg aaagtacagg atggtggtgg 240
aaattacctg atgcactaaa caacataggt atgtttggac aaaatgtaca gcatcactac 300
ttatataggt ctggtttctt aattcatgtg cagtgtaacg ccacaaaatt ccatcaaggt 360
gccctattag tggtagcaat cccagaacac caaagggggg cgcacaacac cactactagc 420
ccaggttttg atgatatcat gaagggtgaa gaaggaggga catttaacca cccatatgtc 480
cttgatgatg ggacgtcact agcctgcgca acaatatttc cacaccagtg gataaatttg 540
agaaccaata attcagcaac aatagttctt ccctggatga atgccgctcc aatggacttc 600
ccactcaggc acaatcagtg gacactagca ataattccag tagtaccact aggtacgcgc 660
acagtgtcaa gtatggttcc aataacagtt tctattgctc caatgtgttg tgagtttaat 720
ggactcagac acgccattac tcaa 744
<210> 7
<211> 248
<212> PRT
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP2蛋白的氨基酸序列
<400> 7
Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Leu Gln Leu
1 5 10 15
Lys Leu Gly Asn Ser Ala Ile Val Thr Gln Glu Ala Ala Asn Tyr Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Asn Tyr Leu Pro Asp His Glu Ala Val
35 40 45
Ala Ile Asp Lys Pro Thr Gln Pro Glu Thr Ala Thr Asp Arg Phe Tyr
50 55 60
Thr Leu Lys Ser Val Lys Trp Glu Thr Glu Ser Thr Gly Trp Trp Trp
65 70 75 80
Lys Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn Ile Gly Met Phe Gly Gln Asn Val
85 90 95
Gln His His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Leu Ile His Val Gln Cys
100 105 110
Asn Ala Thr Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Val Ala Ile Pro
115 120 125
Glu His Gln Arg Gly Ala His Asn Thr Thr Thr Ser Pro Gly Phe Asp
130 135 140
Asp Ile Met Lys Gly Glu Glu Gly Gly Thr Phe Asn His Pro Tyr Val
145 150 155 160
Leu Asp Asp Gly Thr Ser Leu Ala Cys Ala Thr Ile Phe Pro His Gln
165 170 175
Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile Val Leu Pro Trp
180 185 190
Met Asn Ala Ala Pro Met Asp Phe Pro Leu Arg His Asn Gln Trp Thr
195 200 205
Leu Ala Ile Ile Pro Val Val Pro Leu Gly Thr Arg Thr Val Ser Ser
210 215 220
Met Val Pro Ile Thr Val Ser Ile Ala Pro Met Cys Cys Glu Phe Asn
225 230 235 240
Gly Leu Arg His Ala Ile Thr Gln
245
<210> 8
<211> 705
<212> DNA
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP3蛋白的互补DNA序列
<400> 8
ggtgtcccaa cataccttct accaggctca ggacaatttc taactactga tgatcacagc 60
tctgcgccgc ttcttccatg cttcaaccca actccagaaa tgcacattcc agggcaagtc 120
cgcaacatgc tagaagtgat tcaggtggaa tcaatgatgg agattaataa cacagaaaat 180
gcagttggca tgcagcgtct caaagttgat atatcagtac taacagacgt tgatcaattg 240
ttattcaaca tcccactaga catacagtta gatgggccac ttagaaacac tctagtagga 300
aacatatcta gatattatac tcactggtct ggatctctag aaatgacatt tatgttttgt 360
gggagcttca tggcaacagg aaaattaatt ctgtgttaca ctcctccagg cgggtcatgc 420
ccaacaacca gagaaactgc tatgttaggt acacatattg tttgggattt tggattacaa 480
tccagtgtca ctctggtaat accttggatc agtggatccc actacaggat gttcaacaat 540
gatgctaagt caaccaatgc caatgttggc tatgttacct gttttatgca aaccaattta 600
atagttccca gtgagtcttc taacacatgt tccttaatag ggttcgtagc agcaaaagat 660
gacttttccc tcaggctaat gagagatagc cctgacattg gacaa 705
<210> 9
<211> 235
<212> PRT
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP3蛋白的氨基酸序列
<400> 9
Gly Val Pro Thr Tyr Leu Leu Pro Gly Ser Gly Gln Phe Leu Thr Thr
1 5 10 15
Asp Asp His Ser Ser Ala Pro Leu Leu Pro Cys Phe Asn Pro Thr Pro
20 25 30
Glu Met His Ile Pro Gly Gln Val Arg Asn Met Leu Glu Val Ile Gln
35 40 45
Val Glu Ser Met Met Glu Ile Asn Asn Thr Glu Asn Ala Val Gly Met
50 55 60
Gln Arg Leu Lys Val Asp Ile Ser Val Leu Thr Asp Val Asp Gln Leu
65 70 75 80
Leu Phe Asn Ile Pro Leu Asp Ile Gln Leu Asp Gly Pro Leu Arg Asn
85 90 95
Thr Leu Val Gly Asn Ile Ser Arg Tyr Tyr Thr His Trp Ser Gly Ser
100 105 110
Leu Glu Met Thr Phe Met Phe Cys Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys
115 120 125
Leu Ile Leu Cys Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Ser Cys Pro Thr Thr Arg
130 135 140
Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp Asp Phe Gly Leu Gln
145 150 155 160
Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Gly Ser His Tyr Arg
165 170 175
Met Phe Asn Asn Asp Ala Lys Ser Thr Asn Ala Asn Val Gly Tyr Val
180 185 190
Thr Cys Phe Met Gln Thr Asn Leu Ile Val Pro Ser Glu Ser Ser Asn
195 200 205
Thr Cys Ser Leu Ile Gly Phe Val Ala Ala Lys Asp Asp Phe Ser Leu
210 215 220
Arg Leu Met Arg Asp Ser Pro Asp Ile Gly Gln
225 230 235
<210> 10
<211> 930
<212> DNA
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP1蛋白的互补DNA序列
<400> 10
ctagaacatt tacatgaggc agaggcagcc taccagattg agagcatcat caagacagca 60
actgacaccg tgaaaagtga gattaacgct gaacttggcg tggtccctag tttgaatgca 120
gttgaaacag gtgcaagttc taacactgaa ccagaggaag ccatacaaac tcgcacggtg 180
ataaatcagc atggtgtatc tgaaacatta gtggagaatt ttcttagcag ggcagcctta 240
gtatcaaaga gaagtttcga atacaaaaat cacacctcat ctggagcacg aacagacaag 300
aacttttata aatggacaat taacaccaag tcctttgtcc agttgaggag aaagctggaa 360
ctgttcacgt accttagatt tgatgctgaa attaccatac ttacaactgt ggcagtaggt 420
agcaacaaca gcacatacaa gggccttcct gacttgacac ttcaagcaat gtttgtacct 480
actggtgccc ttactccaaa aaaacaggat tcattccatt ggcagtccgg tagtaatgct 540
agtgtattct tcaaagtttc tgacccccca gccagaatga ctataccttt tatgtgtatc 600
aactcagcat actcagtttt ctatgatggt tttgctggat ttgaaaagaa tggtctttat 660
gggataaatc cagctgatac catcggcaac ttatgtgtca gaatagtgaa tgagcaccag 720
ccaattggtt tcacagtgac cgtcagggtt tacatgaagc ctaaacacat aaaagcgtgg 780
gcacccagac caccacgaac cctgccatat atgagcattg caaatgcaaa ctataagggt 840
aaagaaaggg caccaaatgc gctcaatgcc ataattggca atagagagag tgtcaaaacc 900
atgcctcatg atatccggtt agtgaatact 930
<210> 11
<211> 310
<212> PRT
<213> US/KY/14-18953-Vero的VP1蛋白的氨基酸序列
<400> 11
Leu Glu His Leu His Glu Ala Glu Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Ser Ile
1 5 10 15
Ile Lys Thr Ala Thr Asp Thr Val Lys Ser Glu Ile Asn Ala Glu Leu
20 25 30
Gly Val Val Pro Ser Leu Asn Ala Val Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn
35 40 45
Thr Glu Pro Glu Glu Ala Ile Gln Thr Arg Thr Val Ile Asn Gln His
50 55 60
Gly Val Ser Glu Thr Leu Val Glu Asn Phe Leu Ser Arg Ala Ala Leu
65 70 75 80
Val Ser Lys Arg Ser Phe Glu Tyr Lys Asn His Thr Ser Ser Gly Ala
85 90 95
Arg Thr Asp Lys Asn Phe Tyr Lys Trp Thr Ile Asn Thr Lys Ser Phe
100 105 110
Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Leu Phe Thr Tyr Leu Arg Phe Asp
115 120 125
Ala Glu Ile Thr Ile Leu Thr Thr Val Ala Val Gly Ser Asn Asn Ser
130 135 140
Thr Tyr Lys Gly Leu Pro Asp Leu Thr Leu Gln Ala Met Phe Val Pro
145 150 155 160
Thr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Lys Gln Asp Ser Phe His Trp Gln Ser
165 170 175
Gly Ser Asn Ala Ser Val Phe Phe Lys Val Ser Asp Pro Pro Ala Arg
180 185 190
Met Thr Ile Pro Phe Met Cys Ile Asn Ser Ala Tyr Ser Val Phe Tyr
195 200 205
Asp Gly Phe Ala Gly Phe Glu Lys Asn Gly Leu Tyr Gly Ile Asn Pro
210 215 220
Ala Asp Thr Ile Gly Asn Leu Cys Val Arg Ile Val Asn Glu His Gln
225 230 235 240
Pro Ile Gly Phe Thr Val Thr Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His
245 250 255
Ile Lys Ala Trp Ala Pro Arg Pro Pro Arg Thr Leu Pro Tyr Met Ser
260 265 270
Ile Ala Asn Ala Asn Tyr Lys Gly Lys Glu Arg Ala Pro Asn Ala Leu
275 280 285
Asn Ala Ile Ile Gly Asn Arg Glu Ser Val Lys Thr Met Pro His Asp
290 295 300
Ile Arg Leu Val Asn Thr
305 310

Claims (11)

1.一种肠道病毒D68，其适应于在Vero细胞中繁殖至高滴度，由具有SEQ ID No 1的核苷酸序列的cDNA分子编码。
2.一种核苷酸序列，其编码适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白，所述核苷酸序列在SEQ ID No 2中公开。
3.一种适应Vero细胞的肠道病毒D68多蛋白的氨基酸序列，在SEQ ID No3中公开。
4.一种使肠道病毒D68适应在Vero细胞中繁殖至高滴度的方法，包括以下步骤：
(a)通过在32-35℃，更准确地在32-33℃吸附约60-120分钟来感染病毒；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃添加维持培养基后繁殖病毒；
(c)以1:3至1:10的稀释度稀释从每次传代获得的病毒原液以感染接下来的Vero细胞批次，用于在32-35℃，更准确地在32-33℃进行病毒的初始传代；
(d)以1:20-1:500的稀释度稀释病毒以在32-35℃，更准确地在32-33℃在随后/后续的传代中感染Vero细胞；和
(e)在每次传代期间达到90％或更高的细胞病变效应时或在感染的6天内收获病毒。
5.权利要求4所述的方法，其中肠道病毒D68病毒进行空斑测定，包括以下步骤：
(a)每12孔板或6孔板铺板300万至400万个Vero细胞以达到适合空斑测定的汇合度；
(b)在32-35℃，更准确地在32-33℃，一式两份、一式三份或一式四份在不同孔中吸附不同稀释度的病毒1-2小时；
(c)以≤0.6％的羧甲基纤维素或0.8-1.8％的Avicel RC 591作为覆盖介质进行覆盖；
(d)用羧甲基纤维素作为覆盖物在感染后5-7天后或用Avicel RC 591作为覆盖物在感染后3-4天后，用10％福尔马林固定细胞；
(e)在固定后去除固定液并用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞；和
(f)将新鲜制备的染色液-结晶紫溶液逐滴加到固定的细胞中，并在室温染色30分钟至1小时或2小时。
6.一种灭活含有从SEQ ID No.1编码的cDNA的肠道病毒D68用于免疫的方法，包括以下步骤：
(a)对收获的肠道病毒D68病毒进行无菌过滤；
(b)使用核酸酶处理去除宿主核酸并使用100kDa过滤器通过切向流过滤进行浓缩；
(c)使用1/2000-1/4000福尔马林在从25-37℃变化的温度多至3周或使用BPL在4-25℃多至120小时或使用0.005％到3％的过氧化氢在25±5℃多至6小时来进行灭活；和
(d)灭活的抗原的纯化或在灭活病毒抗原之前的纯化如下进行：通过使用SepharoseCL-4B的凝胶过滤继之以使用DEAE树脂的阴离子交换层析，或者通过双步骤/两轮尺寸排阻层析，或者通过纤维素硫酸盐继之以阴离子交换层析，或者通过混合模式树脂如CHT II型(Biorad)单独地或与其他树脂组合，或者层析方法的组合。
7.一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的权利要求6中获得的灭活的肠道病毒D68病毒抗原和任选地一种或多种选自佐剂、稳定剂或防腐剂的药学上可接受的赋形剂。
8.权利要求7所述的免疫原性组合物，其中组合物在2-8℃稳定至少6个月并且在37℃稳定至少1个月。
9.权利要求7所述的免疫原性组合物，其中组合物还包含其他肠道病毒，包括EV71、脊髓灰质炎病毒或其组合。
10.一种属于肠道病毒D68的氨基酸序列，其在多蛋白中具有选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的氨基酸。
11.一种免疫原性组合物，其包含在生理学上可接受的媒介物中的灭活的肠道病毒D68病毒抗原，其中肠道病毒D68在多蛋白中具有选自L341、G647、K699、K719、N1355、S1406、Q2110或其组合的氨基酸。
CN201980089603.4A 2018-12-29 2019-12-27 肠道病毒对vero细胞的适应及其疫苗制剂 Pending CN113329767A (zh)

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