WO2013011942A1 - 変異狂犬病ウイルス及びワクチン - Google Patents

変異狂犬病ウイルス及びワクチン Download PDF

Info

Publication number
WO2013011942A1
WO2013011942A1 PCT/JP2012/067927 JP2012067927W WO2013011942A1 WO 2013011942 A1 WO2013011942 A1 WO 2013011942A1 JP 2012067927 W JP2012067927 W JP 2012067927W WO 2013011942 A1 WO2013011942 A1 WO 2013011942A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
virus
amino acid
rabies
madness
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/067927
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直人 伊藤
杉山　誠
Original Assignee
国立大学法人岐阜大学
共立製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人岐阜大学, 共立製薬株式会社 filed Critical 国立大学法人岐阜大学
Priority to CN201280035160.9A priority Critical patent/CN103781902A/zh
Priority to JP2013524703A priority patent/JP5946453B2/ja
Publication of WO2013011942A1 publication Critical patent/WO2013011942A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/20162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering

Definitions

  • the present invention relates to a rabies virus structural protein, wherein at least the 273 position of the N protein is an amino acid other than phenylalanine, the 394 position of the N protein is an amino acid other than tyrosine, and the 333 position of the G protein is an amino acid other than arginine or lysine It relates to rabies virus, rabies vaccine preparation containing this virus, rabies prevention / treatment method, rabies vaccine production method, use for rabies vaccine preparation production, and the like.
  • Rabies is a zoonotic disease caused by infection from a rabies virus bite. Treatment has not yet been established, and when it occurs, almost 100% die with severe neurological symptoms.
  • Rabies virus has a very wide host range and is supposed to infect all mammals including humans. In developing countries, dogs are the main source of infection, and in developed countries, wild animals such as foxes, raccoons, skunks, and bats are the main source of infection. Even today, more than 50,000 people die from rabies each year. ing.
  • Rabies can be prevented by vaccination, and inactivated rabies vaccine is now widely used.
  • inactivated vaccine a large amount of antigen is required to obtain a sufficient effect, and the vaccine is expensive.
  • live attenuated vaccines can be manufactured at a lower cost than inactivated vaccines, but there are safety concerns. For this reason, vaccines are not sufficiently spread, particularly in developing countries.
  • Rabies virus is categorized in the Rissaviridae genus Lissavirus.
  • Viral particles have a bullet-like shape with a width of 60 to 110 nm and a length of 130 to 250 nm, and contain five structural proteins: G protein, M protein, N protein, P protein, and L protein.
  • the viral genome is a single-stranded RNA with a total length of about 12,000 bases and contains genes encoding five structural proteins in the order of N, P, M, G, and L from the upstream (3 'end side). .
  • the virus can be attenuated by substituting the amino acid at position 333 of the G protein with an amino acid other than arginine or lysine (non-patented). Reference 1 etc.).
  • a virus in which the amino acid at position 333 of the G protein is substituted with an attenuated type is actually used as a live attenuated vaccine for oral immunization of wild animals in Europe and the like (see Patent Document 1, etc.).
  • This attenuated mutant virus has been reported to be toxic by mutating position 194 of G protein to lysine even if position 333 of G protein is mutated to attenuated form (Non-patented) Reference 2). For this reason, there is concern about the return of pathogenicity due to mutation at position 194 of the G protein, and the attenuated mutant virus only at position 333 of the G protein is not necessarily sufficiently safe.
  • the present inventors confirmed that the amino acids at positions 273 and 394 of the rabies N protein were mediated by RIG-I (Retinoic acid-inducible gene I) and antiviral response and pathogenicity (See Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5 are documents relating to artificial synthesis of rabies virus mutants by the reverse genetics method described later.
  • an object of the present invention is to provide a safe, effective and inexpensive rabies vaccine.
  • the present inventors for the attenuated rabies virus in which the amino acid at position 333 of the G protein is substituted, in addition to the position at position 333 of the G protein, the amino acids at positions 273 and 394 of the N protein. It was newly found that by introducing mutations, immunogenicity and safety can be improved, and even when position 194 of the G protein is mutated to lysine, it is not toxic.
  • At least 273 of the N protein is an amino acid other than phenylalanine
  • 394 of the N protein is an amino acid other than tyrosine
  • 333 of the G protein is an amino acid other than arginine or lysine.
  • ⁇ ⁇ Rabies virus is attenuated by introducing a mutation into amino acid at position 333 of G protein, and immunogenicity can be improved by introducing mutation into amino acids at positions 273 and 394 of N protein.
  • immunogenicity can be improved by introducing mutation into amino acids at positions 273 and 394 of N protein.
  • a small inoculation amount is sufficient compared to the case where a mutation is added only at the 333th position of the G protein. In order to achieve a safe immune effect, the amount of inoculation can be reduced and the safety can be further increased.
  • the virulence can be restored by mutation. Can be reduced, and safety can be further increased.
  • the present invention is useful as a rabies vaccine preparation containing a mutant rabies virus, and rabies can be effectively prevented and treated by administering this vaccine preparation.
  • this recombinant virus can be artificially synthesized using cultured cells, for example, when used as a live attenuated vaccine, there is an advantage that a rabies vaccine preparation can be produced at a relatively low cost.
  • the immunogenicity can be enhanced by the present invention.
  • the present invention relates to a rabies virus structural protein, wherein at least the 273 position of the N protein is an amino acid other than phenylalanine, the 394 position of the N protein is an amino acid other than tyrosine, and the 333 position of the G protein is an amino acid other than arginine or lysine Includes all rabies viruses. That is, the present invention is not narrowly limited by virus production means and the like. For example, mutant viruses obtained by subculture in chicken embryos and / or cultured cells, mutant viruses artificially synthesized using clone cDNA, etc. And so on.
  • rabies virus At least phenylalanine at position 273 of N protein is other amino acid, tyrosine at position 394 of N protein is other amino acid, and arginine or lysine at position 333 of G protein is other than that
  • the amino acid sequences of portions other than the 273th position of the N protein, the 394th position of the N protein, and the 333th position of the G protein are not particularly limited as long as they are substantially the same as the sequences in known rabies virus strains.
  • rabies virus strains with known amino acid sequences include CVS strain, ERA strain, Nishigahara strain, HEP-Flury strain, LEP-Flury strain, SAD Bern strain, and SAD B19 strain.
  • the “substantially identical” means that the amino acid sequences in the corresponding region have 80 to 100% identity, more preferably 90 to 100% identity.
  • the amino acid at position 273 of the N protein is not particularly limited as long as it is an amino acid other than phenylalanine.
  • glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, glutamine, proline, tyrosine, tryptophan, asparagine sun, glutamic acid, arginine, lysine, histidine are preferred, valine, Either leucine or isoleucine is more preferred, and leucine is most preferred.
  • the amino acid at position 394 of the N protein is not particularly limited as long as it is an amino acid other than tyrosine.
  • the amino acid at position 333 of the G protein is not particularly limited as long as it is an amino acid other than arginine or lysine.
  • glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, glutamine, proline, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, asparagine sun, glutamic acid, histidine are preferred, glycine, leucine, Any one of isoleucine, serine, methionine, and glutamic acid is more preferable, and glutamic acid is most preferable.
  • mutant rabies virus in which 273 of the N protein is leucine, 394 of the N protein is histidine, and 333 of the G protein is glutamic acid, for example, the N protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 described And a mutant rabies virus containing a G protein having the amino acid sequence as a structural protein.
  • the present invention encompasses all rabies vaccine preparations containing at least the mutant rabies virus described above.
  • the mutant rabies virus according to the present invention can be applied to both attenuated live vaccines and inactivated vaccines, as described above, because it can produce a rabies vaccine preparation at a relatively low cost and has a high effect as a vaccine. It is more preferable to use it as a live attenuated vaccine.
  • Buffers, isotonic agents, soothing agents, preservatives, antioxidants, and the like may be appropriately added to the vaccine according to the purpose and use.
  • a buffer solution such as phosphate, acetate, carbonate, citrate and the like can be used.
  • tonicity agent for example, sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like can be used.
  • benzyl alcohol can be used as a suitable example of the soothing agent.
  • antiseptic agents include, for example, thimerosal, paraoxybenzoates, phenoxyethanol, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid, other antiseptics, antibiotics, and synthetic antibacterials.
  • An agent or the like can be used.
  • antioxidant for example, sulfite, ascorbic acid and the like can be used.
  • this drug includes auxiliary ingredients such as light-absorbing dyes (riboflavin, adenine, adenosine, etc.) that serve as storage and efficacy aids, and chelating / reducing agents (vitamin C, citric acid, etc.) for stabilization.
  • auxiliary ingredients such as light-absorbing dyes (riboflavin, adenine, adenosine, etc.) that serve as storage and efficacy aids, and chelating / reducing agents (vitamin C, citric acid, etc.) for stabilization.
  • auxiliary ingredients such as light-absorbing dyes (riboflavin, adenine, adenosine, etc.) that serve as storage and efficacy aids, and chelating / reducing agents (vitamin C, citric acid, etc.) for stabilization.
  • Carbohydrates sorbitol, lactose, mannitol, starch, sucrose, glucose, dextran, etc.
  • casein digests various vitamins
  • a well-known thing can be employ
  • it may be used as a liquid preparation, or may be mixed with food for oral administration after treatment such as lyophilization.
  • inactivated vaccine preparation when used as an inactivated vaccine preparation, known methods such as physical treatment (ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, heat treatment, ultrasonic treatment, etc.), chemical treatment (organic by formalin, chloroform, etc.) Inactivation can be performed by solvent treatment, acid treatment with a weak acid such as acetic acid, treatment with alcohol, chlorine, mercury, or the like.
  • formalin is inactivated by adding formalin to the culture solution at a volume concentration of 0.001 to 2.0%, more preferably 0.01 to 1.0%, and sensitizing the culture solution at 4 to 30 ° C for 1 to 3 days. It can be performed.
  • the inactivated virus may be washed with a buffer or the like to remove an inactivating agent such as formalin, or may be neutralized by adding a neutralizing agent to the inactivated virus. Further, the inactivated virus may be recovered by membrane filtration or centrifugation.
  • the amount of inactivated virus contained in the inactivated vaccine is not particularly limited.
  • the amount of virus before inactivation is preferably in the range of 10 3 to 10 11 FFU, and in the range of 10 4 to 10 11 FFU. More preferred.
  • a known adjuvant When using as an inactivated vaccine preparation, a known adjuvant may be added.
  • Known adjuvants include, for example, animal oils (such as squalene) or hydrogenated oils thereof, vegetable oils (such as palm oil and castor oil) or hydrogenated oils thereof, mannitol / oleic anhydride, liquid paraffin, polybutene, caprylic acid, oleic acid , Oily adjuvants including higher fatty acid esters, PCPP, saponin, manganese gluconate, calcium gluconate, manganese glycerophosphate, soluble aluminum acetate, aluminum salicylate, acrylic acid copolymer, methacrylic acid copolymer, maleic anhydride copolymer, alkenyl derivative polymer, Oil-in-water emulsions, water-soluble adjuvants such as cationic lipids containing quaternary ammonium salts, precipitation adjuvants such as aluminum hydroxide (
  • this vaccine preparation may be a mixed vaccine preparation with one or a plurality of vaccines against other diseases.
  • the present invention encompasses all methods for producing a rabies vaccine preparation comprising the step of artificially synthesizing the mutant rabies virus described above using cultured cells.
  • This mutant rabies virus can be artificially synthesized using cultured cells by the reverse genetics method, so that a vaccine preparation can be produced at a relatively low cost and with little lot difference.
  • a genome / plasmid of a recombinant rabies virus is prepared.
  • rabies virus for example, those described above can be used.
  • mutations are introduced into the nucleotide sequences encoding the three amino acids of the N protein at positions 273 and 394 and the G protein at position 333. Mutagenesis can be performed by a known point mutation introduction method such as an overlap PCR method.
  • T7 promoter sequence upstream (3 ′ end) of the cDNA fragment and the base sequence encoding hepatitis D virus ribozyme downstream (5 ′ end) T7 RNA polymerase
  • the 3 ′ end of the artificial plus-strand genomic RNA transcribed by can be made the same sequence as the original virus.
  • a known plasmid vector can be used and is not particularly limited.
  • the recombinant rabies virus genome / plasmid is transfected into the cultured cells, and the recombinant virus is expressed in the culture supernatant.
  • a known method can be used, and it is not particularly limited.
  • the cultured cells known cells such as BHK cells can be widely used.
  • T7 RNA polymerase a cultured cell in which T7 RNA polymerase is constitutively expressed is established and used. May be.
  • a plasmid that also expresses the N protein of rabies virus, a plasmid that also expresses the P protein, and a plasmid that also expresses the L protein are simultaneously transfected as helper plasmids. By doing so, the mutant rabies virus can be efficiently synthesized.
  • the recombinant rabies virus expressed in the culture supernatant is added to the cultured cells to express the recombinant virus in large quantities.
  • mouse neuroblastoma-derived NA cells or Vero cells can be used as cultured cells.
  • Virus recovery can be performed by a known method such as centrifugation or membrane filtration. Further, by adding the recovered virus to the cultured cells, the recombinant virus can be scaled up and mass-produced.
  • a buffer, an isotonic agent, a soothing agent, a preservative, an antioxidant, etc. are appropriately added to the collected virus to produce a product.
  • a buffer, an isotonic agent, a soothing agent, a preservative, an antioxidant, etc. are appropriately added. It may be commercialized.
  • the present invention encompasses all uses of the mutant rabies virus described above for the production of a rabies vaccine formulation.
  • the present invention includes all rabies prevention / treatment methods including at least a treatment for administering a rabies vaccine preparation containing at least the mutant rabies virus described above.
  • the present invention can be applied to animals that can be infected with rabies, such as humans and non-human animals such as dogs, cats, foxes, raccoons, skunks, bats, and mice.
  • the rabies vaccine preparation may be administered to a healthy individual for immunization to prevent the development of rabies, or the rabies vaccine preparation may be administered intensively immediately after receiving rabies virus exposure from a bite. Rabies may be treated by eliciting an immune response.
  • This rabies vaccine preparation may be administered by subcutaneous, intracutaneous, intramuscular injection or the like, or in the case of wild animals or the like, and may be administered orally by mixing with food.
  • a live attenuated vaccine preparation for example, 10 3 to 10 11 FFU is administered per subcutaneous injection, intracutaneous or intramuscular injection, and 10 4 to 10 11 FFU is administered per oral administration, for example.
  • an inactivated vaccine preparation for example, 10 3 to 10 11 viruses at a time for subcutaneous, intradermal, intramuscular injection, and 10 4 for virus by oral administration.
  • Administer 11 to 10 doses are not particularly limited, but is preferably once or several times at intervals of 1 week to 3 months. In addition, administration at least once a year is preferable.
  • Example 1 artificial synthesis of recombinant rabies virus was attempted by the reverse genetics method.
  • Encodes the T7 promoter sequence in the upstream region (3 'end side) of the full-length cDNA of ERA strain, one of the highly toxic fixed strains of rabies virus, and the hepatitis D virus ribozyme directly under the downstream (5' end) CDNA fragments each having the nucleotide sequence to be amplified were amplified by PCR.
  • the coding sequence of hepatitis D virus ribozyme was inserted so that the 3 ′ end of the artificial plus-strand genomic RNA transcribed by T7 RNA polymerase had the same sequence as the original virus.
  • ERA strain genome plasmid a genome plasmid carrying the ERA strain genome full-length cDNA (hereinafter referred to as “ERA strain genome plasmid”) was prepared.
  • the genomic full-length cDNA coding region on the ERA strain genomic plasmid was replaced with a mutated genomic full-length cDNA fragment by restriction enzyme digestion and ligation.
  • a genome plasmid (hereinafter referred to as “ERA-N”) having the genome full length cDNA of the mutant strain (ERA-N273 / 394-G333 strain) in which the amino acid sequence at three positions is mutated out of the genome length of the ERA strain.
  • N273 / 394-G333 strain genomic plasmid was prepared (see SEQ ID NO: 3 for the nucleotide sequence of the ERA-N273 / 394-G333 strain genome).
  • ERA-G333 strain genomic genome a genome / plasmid (hereinafter referred to as “ERA-G333 strain genomic genome”) containing the full-length cDNA of a mutant strain (ERA- G333 strain) in which the amino acid at position 333 of G protein is substituted with glutamic acid.
  • the “plasmid” was prepared in the same procedure.
  • a helper plasmid As a helper plasmid, a plasmid expressing the N protein of rabies virus, a plasmid expressing the P protein, and a plasmid expressing the L protein were also prepared (see Non-Patent Document 5).
  • BHK / T7-9 cells T7 RNA polymerase constitutively expressing BHK cells
  • the transfected BHK / T7-9 cells were fixed and then stained with an anti-rabies virus N protein monoclonal antibody. Then, the presence of the virus mutant was confirmed using the expansion of the fluorescence signal as an index.
  • the collected culture supernatant was added to cultivate mouse neuroblastoma-derived NA cells, and the culture supernatant was collected when about 50% of the cells dropped due to cytopathic effect.
  • the culture supernatant was centrifuged, and the supernatant was stored at ⁇ 80 ° C. as a virus mutant stock.
  • the virus titer of the recombinant virus artificially synthesized by the above procedure was measured.
  • the NA cells on a 24-well tissue culture plate were inoculated with 100 ⁇ L / well of each virus solution diluted 10-fold. After allowing to stand at 37 ° C. for 1 hour to adsorb the virus to the cells, the cells were washed. A culture solution containing 0.5% methylcellulose was added to the cells and cultured at 37 ° C. for 2 days. After fixing the infected cells, the cells were fluorescently stained with an anti-rabies virus N protein monoclonal antibody, and the number of fluorescent focus per well was counted. As the virus titer, the focus forming unit (FFU) / mL was calculated based on the average number of focus appearing in 3 holes of the same dilution.
  • FFU focus forming unit
  • Example 2 the growth of the recombinant virus (ERA-N273 / 394-G333 strain) was examined.
  • the virus titer of ERA-N273 / 394-G333 strain in Vero cells was 1 ⁇ 10 6 FFU / mL or more on the 7th day after infection and 1 ⁇ 10 8 FFU / mL or more on the 11th day after infection. Yes, it was almost equivalent to the virus titer of ERA strain. From these results, it was shown that the virus growth ability was not impaired even if the amino acids at the three positions of N protein 273 and 394 and G protein 333 were simultaneously mutated in the structural protein of rabies virus.
  • Example 3 the immunogenicity of the recombinant virus (ERA-N273 / 394-G333 strain) was examined.
  • a 96-well tissue culture plate was inoculated with NA cell suspension (3 ⁇ 10 5 cells / mL, 0.1 mL / hole) and inoculated with a serum-virus mixture.
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 3 days. After fixing the infected cells, the cells were fluorescently stained with an anti-rabies virus N protein monoclonal antibody, and the virus neutralizing antibody titer was calculated by the Reed and Munch method.
  • the same measurement was performed on standard serum (0.5 international units [IU / mL]) obtained from the International Organization for Animal Health (OIE), and neutralizing antibody titers were converted to international units [IU / mL].
  • FIG. 1 is a graph showing the neutralizing antibody titer of mouse serum when mice were immunized with ERA-N273 / 394-G333 strain.
  • "ERA-G333” on the horizontal axis shows the results when mice were immunized with ERA-G333 strain
  • the vertical axis represents the neutralizing antibody titer of mouse serum (unit: IU / mL).
  • the ERA-N273 / 394-G333 strain when immunized by intramuscular inoculation with 10 4 FFU of recombinant rabies virus, the ERA-N273 / 394-G333 strain showed a neutralizing antibody titer of mouse serum of 0.5 IU / It was more than mL, and was higher than ERA-G333 strain. From these results, it was shown that the ERA-N273 / 394-G333 strain has higher immunogenicity than the ERA-G333 strain.
  • Example 4 the ED 50 (50% effective dose) of the recombinant virus (ERA-N273 / 394-G333 strain) was examined.
  • Immunization was carried out by intramuscular inoculation of 10 2 to 10 5 FFU ERA-G333 strain or ERA-N273 / 394-G333 strain into one group of 5 ddY mice (6 weeks old, female). Six weeks after the inoculation, immunized mice were inoculated in the brain with a standard challenge strain for vaccine test (CVS strain) 25 times the 50% lethal dose. Each mouse was observed for 14 days, and the ED 50 (50% effective dose) of each strain was calculated from the survival rate.
  • CVS strain standard challenge strain for vaccine test
  • FIG. 2 is a graph showing the ED 50 (50% effective dose) of the ERA-N273 / 394-G333 strain.
  • “ERA-G333” on the horizontal axis represents the results for the ERA-G333 strain
  • “ERA-N273 / 394-G333” represents the results for the ERA-N273 / 394-G333 strain
  • the vertical axis represents the ED 50 (50% effective dose, unit: FFU).
  • ED- 50 50% effective dose of ERA-N273 / 394-G333 strain is 5,000 FFU or less, and the equivalent effect is obtained with about 1/3 dose compared to ERA-G333 strain. It was.
  • Example 3 As described above, the results of Example 3 and Example 4 indicate that the ERA-N273 / 394-G333 strain has high immunogenicity and safety, that is, is useful as a live attenuated vaccine against rabies.
  • Example 5 it was examined whether virus virulence occurs when the amino acid at position 194 of G protein of ERA-N273 / 394-G333 strain is changed to lysine.
  • the ERA-N273 / 394-G333 strain genomic plasmid or ERA-G333 strain genomic plasmid was mutated so that the amino acid at position 194 of the G protein was replaced with lysine.
  • G194 / 333 strain) and a mutant virus (ERA-G194 / 333 strain) in which amino acids at positions 333 and 194 were mutated were artificially synthesized.
  • FIGS. 3A and 3B The results are shown in FIGS. 3A and 3B.
  • 3A is a graph showing the survival rate when the ERA-G194 / 333 strain is inoculated in the brain
  • FIG. 3B is a graph showing the survival rate when the ERA-N273 / 394-G194 / 333 strain is inoculated in the brain. is there.
  • the horizontal axis shows the number of days after virus inoculation
  • the vertical axis shows the survival rate (%)
  • each graph shows the case when no virus was administered (non-infected) or when 10 2 to 10 4 FFU was inoculated with virus.
  • Each result is represented.
  • Example 3 the graph which shows the neutralizing antibody titer of a mouse
  • Graph in Example 4 ED 50 of ERA-N273 / 394-G333 strain (50% effective dose).
  • Example 5 the graph showing the survival rate at the time of inoculating ERA-G194 / 333 strain in the brain.
  • Example 5 the graph showing the survival rate when ERA-N273 / 394-G194 / 333 strain is inoculated in the brain.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

　【課題】安全性が高く、効果的かつ安価な狂犬病ワクチンの提供。　【解決手段】狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス（例えば、図２中、ERA-N273/394-G333株）、これらの変異狂犬病ウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤などを提供する。Gタンパク質333位のアミノ酸の変異導入による狂犬病ウイルスの弱毒化に加え、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸に変異導入することにより免疫原性及び安全性を向上できる。加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸に変異導入することにより、Gタンパク質の194位がリジンに変異した場合にも強毒化を防止できるため、突然変異による病原性復帰が起こる可能性を低減でき、安全性をより高めることができる。

Description

変異狂犬病ウイルス及びワクチン
　本発明は、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス、このウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤、狂犬病予防・治療方法、狂犬病ワクチン製造方法、狂犬病ワクチン製剤製造のための使用などに関連する。
　狂犬病は、狂犬病ウイルスの咬傷などからの感染によって起こる人獣共通感染症である。治療法は未だに確立されておらず、発症した場合、重篤な神経症状を伴って、ほぼ100%死亡する。
　狂犬病ウイルスは非常に広い宿主域を有し、ヒトを含む全ての哺乳類に感染するとされている。発展途上国などでは犬が、先進国などではキツネ、アライグマ、スカンク、コウモリなどの野生動物が主な感染源となっており、現在でも、毎年50,000人以上が狂犬病で死亡していると推定されている。
　狂犬病は、ワクチン接種により予防できるとされ、現在、不活化狂犬病ワクチンが広く用いられている。しかし、不活化ワクチンの場合、充分な効果を得るためには多量の抗原が必要であり、ワクチンがコスト高になる。一方、弱毒生ワクチンは、不活化ワクチンよりも安価に製造できるが、安全性の懸念がある。そのため、特に発展途上国などで、ワクチンが充分に普及していない。
　狂犬病ウイルスはラブドウイルス科リッサウイルス属に分類される。ウイルス粒子は幅60～110nm、長さ130～250nmの弾丸状の形態を有し、Gタンパク質、Mタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質の5つの構造タンパク質を含む。ウイルスゲノムは、全長約12,000塩基、マイナス鎖一本鎖のRNAで、上流(3’末端側)より、N、P、M、G、Lの順で、5つの構造タンパク質をコードする遺伝子を含む。
　近年、狂犬病ウイルスの病原性決定因子の研究などの進展に伴い、Gタンパク質の333位のアミノ酸をアルギニン又はリジン以外のアミノ酸に置換することにより、ウイルスを弱毒化できることが明らかにされた(非特許文献１など参照)。また、Gタンパク質の333位のアミノ酸を弱毒型に置換したウイルスが、ヨーロッパなどにおいて、野生動物の経口免疫用の弱毒生ワクチンとして実際に用いられている(特許文献１など参照)。
　この弱毒変異型ウイルスについては、Gタンパク質の333位が弱毒型に変異していても、突然変異でGタンパク質の194位がリジンに変異することにより強毒化することが報告されている（非特許文献２参照）。このため、Gタンパク質の194位の突然変異による病原性復帰が懸念されており、Gタンパク質の333位のみの弱毒変異型ウイルスは安全性が必ずしも充分ではない。
　本発明者らは、狂犬病弱毒株のNi-CE株において、狂犬病のNタンパク質の273位と394位のアミノ酸が、RIG-I(Retinoic　acid-inducible　gene　I)を介した抗ウイルス応答及び病原性に重要であることを報告している（非特許文献３参照）。
　その他、非特許文献４及び非特許文献５は、後述するリバース・ジェネティクス法による狂犬病ウイルス変異株の人工合成に関する文献である。
US2011/0064764　A1 Dietzschold　B　et　al,　"Characterization　of　an　antigenic　determinant　of　the　glycoprotein　that　correlates　with　pathogenicity　of　rabies　virus."　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA.　80:70-74,　1983 Milosz　Faber　et　al,　"A　single　amino　acid　change　in　rabies　virus　glycoprotein　increases　virus　spread　and　enhances　virus　pathogenicity."　Journal　of　Virology,　vol.79,No.22　p14141-14148.2005 Tatsunori　Masatani　et　al,　"Amino　acids　at　position　273　and　394　in　rabies　virus　nucleoprotein　are　important　for　both　evasion　of　host　RIG-I-mediated　antiviral　response　and　pathogenicity."　Virus　Research　155(2011)168-174. Naoto　Ito　et　al,　"Rescue　of　rabies　virus　from　cloned　cDNA　and　identification　of　the　pathogenicity-related　gene:　Glycoprotein　gene　is　associated　with　virulence　for　adult　mice."　Journal　of　Virology　Vol.75,No.19　p9121-9128　2001. Naoto　Ito　et　al,　"Improved　recovery　of　rabies　virus　from　cloned　cDNA　using　a　vaccinia　virus-free　reverse　genetics　system."　Microbiol　Immunol.　2003;47(8):613-7.
　上述の通り、狂犬病の弱毒生ワクチンは、不活化ワクチンよりも安価に製造できるが、病原性復帰などの安全性の懸念がある。そこで、本発明では、安全性が高く、有効かつ安価な狂犬病ワクチンを提供することなどを目的とする。
　本発明者らは、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、Gタンパク質の333位のアミノ酸が置換された弱毒化狂犬病ウイルスについて、Gタンパク質の333位に加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸を変異導入することにより、免疫原性及び安全性を向上でき、かつGタンパク質の194位がリジンに変異した場合にも強毒化しないことを新規に見出した。
　そこで、本発明では、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス、これらの変異狂犬病ウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤などを提供する。
　Gタンパク質の333位のアミノ酸に変異導入することにより狂犬病ウイルスを弱毒化するとともに、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸に変異導入することにより免疫原性を向上できる。また、Gタンパク質の333位に加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸を変異導入することにより、Gタンパク質の333位にのみ変異を加えた場合と比較して、少ない接種量で充分な免疫効果を奏するため、接種量を少なくでき、より安全性を高めることができる。
　加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸に変異導入することにより、Gタンパク質の194位がリジンに変異した場合にも強毒化を防止できるため、突然変異による病原性復帰が起こる可能性を低減でき、安全性をより高めることができる。
　従って、本発明は、変異狂犬病ウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤として有用であり、このワクチン製剤を投与することにより、狂犬病を有効に予防・治療できる。
　その他、この組換えウイルスは、培養細胞を用いて人工合成することもできるため、例えば、弱毒生ワクチンとして用いる場合には、比較的安価に狂犬病ワクチン製剤を製造できるという有利性がある。
　本発明により、免疫原性を高めることができる。また、突然変異による病原性復帰などの安全性への懸念が少なく、効果的かつ安価な狂犬病ワクチンを提供できる。
　＜本発明に係る変異狂犬病ウイルスについて＞
　本発明は、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルスをすべて包含する。即ち、本発明は、ウイルスの作出手段などによって狭く限定されず、例えば、鶏胚及び／又は培養細胞などで継代して得られた変異ウイルス、クローンcDNAなどを用いて人工合成された変異ウイルスなども広く包含する。
　狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位のフェニルアラニンをそれ以外のアミノ酸に、Nタンパク質の394位のチロシンをそれ以外のアミノ酸に、Gタンパク質の333位のアルギニン又はリジンをそれ以外のアミノ酸にそれぞれ置換することにより、狂犬病ウイルスを弱毒化でき、免疫原性及び安全性を向上でき、かつ突然変異による病原性復帰などの危険性を低く抑えることができる。
　Nタンパク質の273位、Nタンパク質の394位、Gタンパク質の333位以外の部分のアミノ酸配列は、公知の狂犬病ウイルス株における配列と実質的に同一であればよく、特に限定されない。アミノ酸配列が公知の狂犬病ウイルス株として、例えば、CVS株、ERA株、西ヶ原株、HEP-Flury株、LEP-Flury株、SAD　Bern株、SAD　B19株などが挙げられる。なお、「実質的に同一」とは、該当領域のアミノ酸配列が、80～100％、さらに好適には90～100％の同一性を有するものをいう。
　Nタンパク質の273位のアミノ酸は、フェニルアラニン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、トリプトファン、アスパラギンサン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンのいずれかが好適であり、バリン、ロイシン、イソロイシンのいずれかがより好適であり、ロイシンが最も好適である。
　Nタンパク質の394位のアミノ酸は、チロシン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギンサン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンのいずれかが好適であり、アルギニン、リジン、ヒスチジンのいずれかがより好適であり、ヒスチジンが最も好適である。
　Gタンパク質の333位のアミノ酸は、アルギニン又はリジン以外のアミノ酸であればよく、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギンサン、グルタミン酸、ヒスチジンのいずれかが好適であり、グリシン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、グルタミン酸のいずれかがより好適であり、グルタミン酸が最も好適である。
　Nタンパク質の273位がロイシン、Nタンパク質の394位がヒスチジン、Gタンパク質の333位がグルタミン酸である変異狂犬病ウイルスとして、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するNタンパク質、及び、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するGタンパク質を構造タンパク質として含有する変異狂犬病ウイルスが挙げられる。
　＜本発明に係る狂犬病ワクチン製剤について＞
　本発明は、上述の変異狂犬病ウイルスを少なくとも含有する狂犬病ワクチン製剤を全て包含する。
　本発明に係る変異狂犬病ウイルスは、弱毒生ワクチンと不活化ワクチンのいずれにも適用できるが、上述の通り、比較的安価に狂犬病ワクチン製剤を製造でき、かつワクチンとしての効果も高いという点から、弱毒生ワクチンとして用いる方がより好適である。
　ワクチンには、目的・用途などに応じて、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加してもよい。
　緩衝剤の好適な例として、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液などを用いることができる。
　等張化剤の好適な例として、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどを用いることができる。
　無痛化剤の好適な例として、例えば、ベンジルアルコールなどを用いることができる。
　防腐を目的とした薬剤の好適な例として、例えば、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、その他、各種防腐剤、抗生物質、合成抗菌剤などを用いることができる。
　抗酸化剤の好適な例として、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを用いることができる。
　その他、この薬剤には、補助成分、例えば、保存・効能の助剤となる光吸収色素(リボフラビン、アデニン、アデノシンなど)、安定化のためのキレート剤・還元剤(ビタミンC、クエン酸など)、炭水化物(ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストランなど)、カゼイン消化物、各種ビタミンなどを含有させてもよい。
　ワクチン製剤の剤型などについては、公知のものを採用でき、特に限定されない。例えば、液体製剤として用いてもよいし、経口投与用に、凍結乾燥などの処置の後、餌などに混入させてもよい。
　一方、不活化ワクチン製剤として用いる場合、公知の方法、例えば、培養液に対し、物理的処理(紫外線照射、X線照射、熱処理、超音波処理など)、化学的処理(ホルマリン・クロロホルムなどによる有機溶媒処理、酢酸などの弱酸による酸処理、アルコール・塩素・水銀などによる処理)などにより、不活化を行うことができる。
　例えば、培養液にホルマリンを0.001～2.0％、より好適には0.01～1.0％の容量濃度で添加し、培養液を4～30℃で、1～3日間感作することにより、ホルマリンによる不活化を行うことができる。例えば、緩衝液などで不活化処理ウイルスを洗浄してホルマリンなどの不活化剤を除去したり、不活化処理ウイルスに中和剤を添加して中和したりしてもよい。また、膜ろ過や遠心分離などにより不活化処理ウイルスを回収してもよい。
　不活化ワクチンに含まれる不活化ウイルスの量は、特に制限はないが、例えば、不活化前のウイルスの量が103～1011FFUの範囲が好適で、104～1011FFUの範囲がより好適である。
　不活化ワクチン製剤として用いる場合、公知のアジュバントを添加してもよい。公知のアジュバントとして、例えば、動物油(スクアレンなど)又はそれらの硬化油、植物油(パーム油、ヒマシ油など)又はそれらの硬化油、無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステルなどを含む油性アジュバント、PCPP、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質などの水溶性アジュバント、水酸化アルミニウム(ミョウバン)、水酸化ナトリウムなどの沈降性アジュバント、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分、その他、ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキンなどが挙げられる。また、これらを混合したものでもよい。
　その他、このワクチン製剤は、他の疾患に対する一又は複数のワクチンとの混合ワクチン製剤であってもよい。
　＜本発明に係る狂犬病ワクチン製剤製造方法について＞
　本発明は、培養細胞を用いて、上述の変異狂犬病ウイルスを人工合成する工程を含む狂犬病ワクチン製剤製造方法をすべて包含する。
　この変異狂犬病ウイルスは、リバース・ジェネティクス法により、培養細胞を用いて人工合成することもできるため、比較的安価に、かつロット差の少ないワクチン製剤を製造できる。
　まず、組換え狂犬病ウイルスのゲノム・プラスミドを作製する。
　狂犬病ウイルスの親株には、例えば、上述のものを用いることができる。狂犬病ウイルスの親株のゲノム全長cDNAのうち、Nタンパク質273位及び394位、並びにGタンパク質333位の三カ所のアミノ酸をコードする塩基配列に変異導入する。変異導入は、オーバーラップPCR法など、公知の点変異導入法により行うことができる。
　変異導入したcDNA断片を、制限酵素切断及びライゲーションなどにより、プラスミドベクターのマルチクローニングサイトに挿入する。その際、例えば、そのcDNA断片の上流域(3'末端側)にT7プロモーターの配列を、下流(5'末端)にD型肝炎ウイルスリボザイムをコードする塩基配列を配置することにより、T7　RNAポリメラーゼによって転写される人工プラス鎖ゲノムRNAの3'末端を本来のウイルスと同様の配列にすることができる。
　プラスミドベクターには、公知のものを用いることができ、特に限定されない。
　続いて、培養細胞にその組換え狂犬病ウイルスのゲノム・プラスミドをトランスフェクションし、培養上清に組換えウイルスを発現させる。トランスフェクションは、公知の方法を用いることができ、特に限定されない。また、培養細胞も、BHK細胞など、公知のものを広く用いることができるが、例えば、T7　RNAポリメラーゼによってウイルスを発現させる場合には、T7　RNAポリメラーゼ恒常発現している培養細胞を樹立して用いてもよい。
　組換え狂犬病ウイルスのゲノム・プラスミドをトランスフェクションする際には、ヘルパー・プラスミドとして、狂犬病ウイルスのNタンパク質を発現するプラスミド、同じくPタンパク質を発現するプラスミド、同じくLタンパク質を発現するプラスミドを同時にトランスフェクションすることにより、変異狂犬病ウイルスを効率的に合成できる。
　続いて、培養上清に発現した組換え狂犬病ウイルスを培養細胞に添加して、組換えウイルスを大量発現させる。その際に用いる培養細胞には、例えば、マウス神経芽細胞腫由来NA細胞、Vero細胞などを用いることができる。
　ウイルスの回収は、遠心分離・膜ろ過など、公知の方法により行うことができる。また、回収したウイルスをさらに培養細胞に添加することにより、組換えウイルスのスケールアップ、大量生産が可能になる。
　組換えウイルスを弱毒生ワクチンとして用いる場合には、例えば、回収したウイルスに、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加して製品化する。組換えウイルスを不活化ワクチンとして用いる場合には、例えば、公知の方法でウイルスを不活化した後、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加して製品化してもよい。
　＜本発明に係る狂犬病ワクチン製剤製造のためのウイルスの使用について＞
　本発明は、上述の変異狂犬病ウイルスの、狂犬病ワクチン製剤製造のための使用をすべて包含する。
　狂犬病ワクチン製剤製造のために、この変異狂犬病ウイルスを使用することにより、病原性復帰などの安全性の懸念が少なく、ワクチン効果の高い狂犬病ワクチンを比較的安価にかつ大量に製造できる。
　＜本発明に係る狂犬病予防・治療方法について＞
　本発明は、上述の変異狂犬病ウイルスを少なくとも含有する狂犬病ワクチン製剤を投与する処置を少なくとも含む狂犬病予防・治療方法をすべて包含する。
　本発明は、狂犬病に感染しうる動物、例えば、ヒト、及び、犬、ネコ、キツネ、アライグマ、スカンク、コウモリ、ネズミなどの非ヒト動物などに適用できる。
　例えば、健常な個体にこの狂犬病ワクチン製剤を投与して免疫することにより、狂犬病罹患を予防してもよいし、咬傷による狂犬病ウイルスの暴露を受けた直後から集中的にこの狂犬病ワクチン製剤を投与し、免疫反応を惹起させて狂犬病を治療してもよい。
　この狂犬病ワクチン製剤は、液剤を皮下・皮内・筋肉注射などにより投与してもよいし、野生動物などの場合では、餌などに混入させて経口投与してもよい。弱毒生ワクチンの製剤を用いる場合、皮下・皮内・筋肉注射などでは、例えば、一回当たり、103～1011FFU、経口投与では、例えば、一回当たり、104～1011FFU投与する。不活化ワクチンの製剤を用いる場合、皮下・皮内・筋肉注射などでは、例えば、一回当たり、ウイルス数で103～1011個、経口投与では、例えば、一回当たり、ウイルス数で104～1011個投与する。投与回数は、特に限定されないが、1回又は1週間～3カ月間隔で数回が好適である。また、1年に1回以上の投与が好適である。
　実施例１では、リバース・ジェネティクス法により、組換え狂犬病ウイルスの人工合成を試みた。
　狂犬病ウイルスの強毒固定株の一つであるERA株のゲノム全長cDNAの上流域(3'末端側)にT7プロモーターの配列を、下流(5'末端)の直下にD型肝炎ウイルスリボザイムをコードする塩基配列をそれぞれ配置したcDNA断片をPCR法により増幅した。なお、D型肝炎ウイルスリボザイムのコード配列は、T7　RNAポリメラーゼによって転写される人工プラス鎖ゲノムRNAの3'末端を本来のウイルスと同様の配列にするために挿入した。
　制限酵素切断及びライゲーションにより、プラスミドベクターpUC19のマルチクローニングサイトにそのcDNA断片を挿入した。以上の手順で、ERA株のゲノム全長cDNAを保有するゲノム・プラスミド（以下、「ERA株ゲノム・プラスミド」とする。）を作製した。
　次に、ERA株のゲノム全長のうち、Nタンパク質273位及び394位、並びにGタンパク質333位の三カ所のアミノ酸がそれぞれロイシン、ヒスチジン、グルタミン酸に置換されるように塩基配列を変異させたcDNA断片を、ERA株ゲノム・プラスミドを鋳型とし、オーバーラップPCR法により増幅した(非特許文献４参照)。
　制限酵素切断及びライゲーションにより、ERA株ゲノム・プラスミド上におけるゲノム全長cDNAのコード領域を、変異させたゲノム全長cDNA断片に置き換えた。以上の手順で、ERA株のゲノム全長のうち、三カ所のアミノ酸配列を変異させた変異株(ERA-N273/394-G333株)のゲノム全長cDNAを保有するゲノム・プラスミド（以下、「ERA-N273/394-G333株ゲノム・プラスミド」とする。）を作製した（ERA-N273/394-G333株ゲノムの塩基配列については、配列番号3参照。）。
　その他、ERA株のゲノム全長のうち、Gタンパク質333位のアミノ酸をグルタミン酸に置換させた変異株(ERA- G333株)のゲノム全長cDNAを保有するゲノム・プラスミド（以下、「ERA-G333株ゲノム・プラスミド」とする。）についても、同様の手順で作製した。
　シークエンス解析を行った結果、目的の変異が各ゲノム・プラスミド上に存在することを確認した。
　続いて、これらのゲノム・プラスミドを用いて、各組換えウイルスの人工合成を試みた。
　まず、ヘルパー・プラスミドとして、狂犬病ウイルスのNタンパク質を発現するプラスミド、同じくPタンパク質を発現するプラスミド、同じくLタンパク質を発現するプラスミドを準備した(非特許文献５参照)。
　前日、T7　RNAポリメラーゼ恒常発現BHK細胞(以下、「BHK/T7-9細胞」とする。)を、24穴組織培養プレートに播種した。当日、BHK/T7-9細胞に、ゲノム・プラスミド(2μg/穴)、及び、3種類のヘルパー・プラスミド(各0.4、0.1、0.2μg/穴)をコトランスフェクションし、4～5日間培養した後、その培養上清を回収し、-80℃で保存した。
　また、トランスフェクションしたBHK/T7-9細胞を固定した後、抗狂犬病ウイルスNタンパク質モノクローナル抗体で蛍光染色した。そして、蛍光シグナルの拡大を指標として、ウイルス変異株の存在を確認した。
　続いて、組換えウイルスのストック作製を試みた。
　回収した培養上清を添加してマウス神経芽細胞腫由来NA細胞を培養し、細胞変性効果により約50%の細胞が脱落した時点でその培養上清を回収した。その培養上清を遠心分離し、その上清をウイルス変異株のストックとして、-80℃で保存した。
　以上の手順で人工合成した組換えウイルスについて、ウイルス力価を測定した。
　24穴組織培養プレート上のNA細胞に、10倍段階希釈した各ウイルス液を100μL/穴接種した。37℃で1時間静置し、ウイルスを細胞に吸着させた後、細胞を洗浄した。0.5％メチルセルロースを含む培養液を細胞に加え、37℃で2日間培養した。感染細胞を固定した後、抗狂犬病ウイルスNタンパク質モノクローナル抗体で蛍光染色し、1穴当たりの蛍光フォーカス数をカウントした。ウイルス力価として、同一希釈の3穴に出現した平均フォーカス数に基づき、フォーカス形成単位(FFU;　Focus　forming　unit)/mLを算出した。
　実施例２では、組換えウイルス(ERA-N273/394-G333株)の増殖性を検討した。
　T-25培養フラスコにシートさせたVero細胞に、感染多重度=0.01の条件で、ERA株又はあるいはERA-N273/394-G333株を接種した。37℃で1時間静置し、ウイルスを細胞に吸着させた後、細胞を洗浄した。1フラスコ当たり7mLの培養液を細胞に加え、37℃で培養した。感染3、5、7、9、11日目に培養液をそれぞれ100μL回収し、実施例１と同様の手順でウイルス力価を測定した。
　その結果、Vero細胞におけるERA-N273/394-G333株のウイルス力価は、感染後7日目で1×106FFU/mL以上、感染後11日目で1×108FFU/mL以上であり、ERA株のウイルス力価とほぼ同等であった。この結果より、狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、Nタンパク質273位及び394位、並びにGタンパク質333位の三カ所のアミノ酸を同時に変異しても、ウイルス増殖能は障害されないことが示された。
　実施例３では、組換えウイルス(ERA-N273/394-G333株)の免疫原性を検討した。
　104FFUのERA-G333株又はERA-N273/394-G333株を1群5匹のddYマウス（6週齢、雌）に筋肉内接種することにより免疫した。
　接種後2週目に免疫マウスから採血し、その血清を2倍希釈した後、56℃、30分間非動化した。次に、2倍階段希釈された血清（25μL）と、50%組織培養感染量の200倍に相当するCVS株を含むウイルス液（25μL）を混和させた。この混合液を4℃で一晩感作させることにより、希釈血清中の中和抗体をウイルスに感作させた。
　96穴組織培養プレート上にNA細胞浮遊液（3×105個/mL、0.1mL/穴）を播種し、血清-ウイルス混合液を接種した。細胞を37℃で3日間培養した。感染細胞を固定した後、抗狂犬病ウイルスNタンパク質モノクローナル抗体で蛍光染色し、ウイルス中和抗体価をReed　and　Munch法により計算した。同時に、国際獣疫事務局（OIE）から入手した標準血清(0.5国際単位[IU/mL])についても同様の測定を行い、中和抗体価を国際単位[IU/mL]に換算した。
　結果を図１に示す。図１は、ERA-N273/394-G333株でマウスに免疫した場合におけるマウス血清の中和抗体価を示すグラフである。図１中、横軸の「ERA-G333」はERA-G333株でマウスに免疫した場合の結果を、「ERA-N273/394-G333」はERA-N273/394-G333株でマウスに免疫した場合の結果をそれぞれ表わし、縦軸はマウス血清の中和抗体価(単位：IU/mL)を表す。
　図１に示す通り、104FFUの組換え狂犬病ウイルスを筋肉内接種することにより免疫した場合、ERA-N273/394-G333株では、全ての個体でマウス血清の中和抗体価が0.5IU/mL以上であり、ERA-G333株と比較して高い値であった。この結果より、ERA-N273/394-G333株はERA-G333株と比較して高い免疫原性を有していることが示された。
　実施例４では、組換えウイルス(ERA-N273/394-G333株)のED50(50%有効投与量)を検討した。
　102～105FFUのERA-G333株又はERA-N273/394-G333株を1群5匹のddYマウス（6週齢、雌）に筋肉内接種することにより免疫した。接種後6週目に、50%致死量の25倍のワクチン検定用標準攻撃株(CVS株)を免疫マウスに脳内接種した。各マウスを14日間観察し、その生存率から、各株のED50(50%有効投与量)を算出した。
　結果を図２に示す。図２は、ERA-N273/394-G333株のED50(50%有効投与量)を示すグラフである。図２中、横軸の「ERA-G333」はERA-G333株の結果を、「ERA-N273/394-G333」はERA-N273/394-G333株の結果をそれぞれ表わし、縦軸はED50(50%有効投与量、単位：FFU)を表す。
　図２に示す通り、ERA-N273/394-G333株のED50(50%有効投与量)は5,000FFU以下であり、ERA-G333株と比較して約1/3量で同等の効果が得られた。
　この結果は、Gタンパク質の333位とNタンパク質の273位及び394位に変異を加えた株では、Gタンパク質の333位にのみ変異を加えた場合と比較して、免疫原性が向上することを示唆する。また、免疫原性の向上により、接種量を少なくしても同等の免疫効果を期待できるため、本結果は、接種量を少なくすることにより、結果として、より安全性を高めることができることを示唆する。
　以上、実施例３及び実施例４の結果より、ERA-N273/394-G333株が高い免疫原性と安全性を有すること、即ち、狂犬病に対する弱毒生ワクチンとして有用であることが示された。
　上述の通り、Gタンパク質333位のアミノ酸に変異を加えて狂犬病ウイルスを弱毒化した場合でも、Gタンパク質194位のアミノ酸がリジンに突然変異で置換した場合、ウイルスが強毒化し、病原性が復帰することが知られている。そこで、実施例５では、ERA-N273/394-G333株のGタンパク質194位のアミノ酸がリジンに変化した場合に、ウイルスの強毒化が起こるかどうかについて、検討した。
　ERA-N273/394-G333株ゲノム・プラスミド又はERA-G333株ゲノム・プラスミドに、実施例１と同様の方法で、Gタンパク質194位のアミノ酸がリジンに置換されるように変異導入した。そのゲノム・プラスミドを用いて、実施例１と同様の方法により、ERA株のゲノム全長のうち、上述の三カ所のアミノ酸配列とGタンパク質194位を変異させた変異ウイルス(ERA-N273/394-G194/333株)、及び、Gタンパク質333位及び194位のアミノ酸を変異させた変異ウイルス(ERA-G194/333株)を人工合成した。
　102～10４FFUのERA-N273/394-G194/333株又はERA-G194/333株を1群5匹のddYマウス（6週齢、雌）に脳内接種した。各マウスを18日間観察し、その生存率の推移を調べた。
　結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａは、ERA-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフ、図３Ｂは、ERA-N273/394-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフである。両図中、横軸はウイルス接種後日数を、縦軸は生存率(%)を、各グラフはウイルスを投与しなかった場合(非感染)又はウイルスを102～104FFU接種した場合の結果を、それぞれ表す。
　ERA-G194/333株を脳内接種した場合では、図３Ａに示す通り、102FFU接種した際の接種後17日における生存率が20%、103FFU接種した際の接種後17日における生存率が40%で、ウイルスの強毒化が起こっていたのに対し、ERA-N273/394-G194/333株を脳内接種した場合では、図３Ｂに示す通り、いずれの濃度でも、生存率が100%で、ウイルスの強毒化は観察されなかった。
　この結果は、ERA-N273/394-G333株では、Gタンパク質194位のアミノ酸が突然変異によりリジンに置換した場合でも、ウイルスが強毒化しないことを示し、Gタンパク質の333位に加えて、Nタンパク質の273位及び394位のアミノ酸を変異導入することにより、Gタンパク質の194位がリジンに置換した場合にも強毒化しないこと、即ち、突然変異による病原性復帰の危険性が低いことを示唆する。
実施例３において、ERA-N273/394-G333株でマウスに免疫した場合におけるマウス血清の中和抗体価を示すグラフ。 実施例４において、ERA-N273/394-G333株のED50(50%有効投与量)を示すグラフ。 実施例５において、ERA-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフ。 実施例５において、ERA-N273/394-G194/333株を脳内接種した場合における生存率を表すグラフ。

Claims (8)

  1. 　狂犬病ウイルスの構造タンパク質中、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルス。
  2. 　培養細胞を用いて人工合成された請求項１記載の変異狂犬病ウイルス。
  3. 　前記Nタンパク質の273位がロイシン、前記Nタンパク質の394位がヒスチジン、前記Gタンパク質の333位がグルタミン酸である請求項１記載の変異狂犬病ウイルス。
  4. 　配列番号１記載のアミノ酸配列を有するNタンパク質、及び、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するGタンパク質を構造タンパク質として含有する請求項１記載の変異狂犬病ウイルス。
  5. 　請求項１記載の変異狂犬病ウイルスを含有する狂犬病ワクチン製剤。
  6. 　請求項５記載のワクチン製剤を投与する、狂犬病予防・治療方法。
  7. 　培養細胞を用いて、少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルスを人工合成する工程を含む、狂犬病ワクチン製剤製造方法。
  8. 　少なくとも、Nタンパク質の273位がフェニルアラニン以外のアミノ酸、Nタンパク質の394位がチロシン以外のアミノ酸、Gタンパク質の333位がアルギニン又はリジン以外のアミノ酸である変異狂犬病ウイルスの、狂犬病ワクチン製剤製造のための使用。
PCT/JP2012/067927 2011-07-15 2012-07-13 変異狂犬病ウイルス及びワクチン WO2013011942A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280035160.9A CN103781902A (zh) 2011-07-15 2012-07-13 变异狂犬病毒及疫苗
JP2013524703A JP5946453B2 (ja) 2011-07-15 2012-07-13 変異狂犬病ウイルス及びワクチン

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011156973 2011-07-15
JP2011-156973 2011-07-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013011942A1 true WO2013011942A1 (ja) 2013-01-24

Family

ID=47558120

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/067927 WO2013011942A1 (ja) 2011-07-15 2012-07-13 変異狂犬病ウイルス及びワクチン

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP5946453B2 (ja)
CN (1) CN103781902A (ja)
WO (1) WO2013011942A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106432486A (zh) * 2016-11-29 2017-02-22 广州泰诺迪生物科技有限公司 全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6961172B2 (ja) * 2018-04-13 2021-11-05 共立製薬株式会社 心不全検出方法、心不全検出用器具、サンドイッチ免疫学的測定方法、並びに抗体の組合せ

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110064764A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-17 Thomas Jefferson University Attenuated Live Triple G Protein Recombinant Rabies Virus Vaccine for Pre- and Post-Exposure Prophylaxis of Rabies

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101818132B (zh) * 2010-02-11 2012-04-25 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 嵌合狂犬病病毒株rLEP333Q-L(H)的构建及其生物学功能的研究

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110064764A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-17 Thomas Jefferson University Attenuated Live Triple G Protein Recombinant Rabies Virus Vaccine for Pre- and Post-Exposure Prophylaxis of Rabies

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIETZSCHOLD B ET AL.: "Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 80, 1983, pages 70 - 74 *
FABER M ET AL.: "A Single Amino Acid Change in Rabies Virus Glycoprotein Increases Virus Spread and Enhances Virus Pathogenicity", J. VIROL., vol. 79, no. 22, 2005, pages 14141 - 14148 *
KEISUKE NAKAGAWA ET AL.: "Kyokenbyo Virus G Tanpakushitsu 333-i no Amino-San Hen'i ga Virus Zoshokuno ni Oyobosu Eikyo", JAPANESE SOCIETY OF VETERIANY SCIENCE GAKUJUTSU SHUKAI KOEN YOSHISHU, vol. 146, no. F-33, 2008, pages 224 *
MASATANI T ET AL.: "Amino acids at positions 273 and 394 in rabies virus nucleoprotein are important for both evasion of host RIG-I-mediated antiviral response and pathogenicity", VIRUS RES., vol. 155, 25 September 2010 (2010-09-25), pages 168 - 174 *
MORIMOTO K ET AL.: "Genetic engineering of live rabies vaccines", VACCINE, vol. 19, 2001, pages 3543 - 3551 *
NAKAGAWA K ET AL.: "Generation of a live rabies vaccine strain attenuated by multiple mutations and evaluation of its safety and efficacy", VACCINE, vol. 30, 2012, pages 3610 - 3617 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106432486A (zh) * 2016-11-29 2017-02-22 广州泰诺迪生物科技有限公司 全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途
CN106432486B (zh) * 2016-11-29 2018-11-09 广州泰诺迪生物科技有限公司 全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN103781902A (zh) 2014-05-07
JPWO2013011942A1 (ja) 2015-02-23
JP5946453B2 (ja) 2016-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Qin et al. Identification of novel T-cell epitopes on infectious bronchitis virus N protein and development of a multi-epitope vaccine
EP4093415A1 (en) Recombinant influenza viruses with stabilized na
Tan et al. Infectious bronchitis virus poly-epitope-based vaccine protects chickens from acute infection
US20230381296A1 (en) Temperature-sensitive betacoronavirus strain and vaccine
Guo et al. The adaptation of a CTN-1 rabies virus strain to high-titered growth in chick embryo cells for vaccine development
JP5675789B2 (ja) 免疫接種のための発現ベクターとしての水疱性口内炎ウイルスの異なる複数の抗原型
US9913896B2 (en) Attenuated parvovirus vaccine for muscovy duck parvovirus and goose parvovirus (derzsy's disease)
US7074413B2 (en) Genetically engineered rabies recombinant vaccine for immunization of stray dogs and wildlife
JP5946453B2 (ja) 変異狂犬病ウイルス及びワクチン
JP6589159B2 (ja) 新規ネコモルビリウイルス株、不活化ワクチン製剤、並びにネコモルビリウイルス感染症予防方法
US7235245B2 (en) Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides
US10190099B2 (en) IBV strains and uses thereof
EP1439856A1 (en) Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use
ES2669018T3 (es) Procedimiento para la vacunación por vía oral/mucosa por medio de levaduras recombinantes
Yang et al. Safety and immunogenicity of recombinant rabies virus (ERAGS) in mice and raccoon dogs
CA2382993A1 (en) Attenuated recombinant rabies virus mutants and live vaccines thereof
JP6132420B2 (ja) 変異狂犬病ウイルス合成・増殖方法、並びに狂犬病ワクチン製剤
ES2410593T3 (es) Ácidos nucleicos y polipéptidos de lisavirus quiméricos
Alsakini et al. Adjuvant effects of novel water/oil emulsion formulations on immune responses against infectious bronchitis (IB) vaccine in mice
EP4316514A1 (en) Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2
KR102320271B1 (ko) 부유세포 배양에 적응된 A/ASIA/Sea-97 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 조성물
JP2002512504A (ja) 機能が不全な７１遺伝子領域を含む組換えウマヘルペスウィルス１型（ｅｈｖ−１）、および、そのワクチンとしての使用
Shivanandappa et al. WE WILL OVERCOME COVID 19 TOO…
Amara Old, Running and Future Vaccines: Where are we
JP2023070661A (ja) ベータコロナウイルスの不活化抗原

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12815409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013524703

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12815409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1