JP2023070661A - ベータコロナウイルスの不活化抗原 - Google Patents

Abstract

【課題】不活化前から安全性が高められているウイルス株を元株として用いた不活化ワクチンを提供する。【解決手段】以下の変異を有する構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含むベータコロナウイルスの不活化抗原を含む不活化ワクチン：ＮＳＰ３における、特定の配列の第４０４位のＶ、第４４５位のＬ、第１７９２位のＫ、及び／又は第１８３２位のＤに相当する部位の変異；ＮＳＰ１４における、特定の配列の第２４８位のＧ、第４１６位のＧ、及び／又は第５０４位のＡに相当する部位の変異；ＮＳＰ１６における、特定の配列の第６７位のＶに相当する部位の変異；スパイクにおける、特定の配列の第５４位のＬ、第７３９位のＴ、及び／又は第８７９位のＡに相当する部位の変異、；エンベロープにおける、特定の配列の第２８位のＬに相当する部位の変異、並びに／若しくは、ヌクレオカプシドにおける、特定の配列の第２位のＳに相当する部位の変異。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼集会名：第７回日経・ＦＴ感染症会議 開催場所：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈａｎｎｅｌ．ｎｉｋｋｅｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｋａｎｓｅｎ２０２０／２５６３．ｈｔｍｌ（オンライン開催・発表会場ＵＲＬ） 開催日：令和２年１１月６日～７日 ▲２▼刊行物名：第２４回日本ワクチン学会学術集会 プログラム・抄録集 第６４頁 発行者名：日本ワクチン学会 発行日：令和２年１１月１７日 ▲３▼集会名：第２４回日本ワクチン学会学術集会 開催場所：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｓ－ｏｔｏ．ｃｏｍ／ｊｓｖａｃ２４／ｗｅｂ．ｈｔｍｌ（オンライン開催） 開催日：令和２年１２月１９日～２０日 ▲４▼ウェブサイト名：ｂｉｏＲｘｉｖ 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０２．１５．４３０８６３ 掲載日：令和３年２月１６日 ▲５▼刊行物名：日本薬学会第１４１年会（広島）Ｗｅｂ要旨集 ２７Ｖ０７－ｐｍ１５頁 発行者名：公益社団法人日本薬学会 掲載日：令和３年３月５日

特許法第３０条第２項適用申請有り ▲６▼集会名：日本薬学会第１４１年会（広島） 開催場所：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｇｂａｎｋ．ｊｐ／３／３／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ？ｉｄ＝ＷＧｔＸＡＤＬＷｘＰＫｒｌＰＫｐｏＹ２Ｙ７ｈＣｕ２０１６（オンライン開催） 開催日：令和３年３月２６日～２９日 ▲７▼刊行物名：日刊工業新聞第１１頁 発行者名：株式会社日刊工業新聞社 発行日：令和３年７月２日 ▲８▼ウェブサイト名：Ｖａｃｃｉｎｅ 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０２１．０８．０１８ 掲載日：令和３年８月１１日 ▲９▼ウェブサイト名：医薬経済ＷＥＢ 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｒｉｓｆａｘ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｙａｋｕｋｅｉｚａｉ／１７３８１５ 掲載日：令和３年１０月１５日 ▲１０▼集会名：第６８回日本ウイルス学会学術集会 開催場所：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｇｂａｎｋ．ｊｐ／３／６／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ？ｉｄ＝ｊｓｖ６８ｍ４ｙｚ９ｂＹ２ｗ６ＡＦ７Ｚ７ＬＷｇＵＥｐ２１４ （録画配信によるオンライン開催・発表会場ＵＲＬ及びオンデマンド配信ＵＲＬ） 開催日：令和３年１１月１６日～１８日（録画配信） 令和３年１２月１８日～２６日（オンデマンド配信）

特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１１▼集会名：第６９回日本実験動物学会総会 開催場所：仙台国際センター（宮城県仙台市青葉区青葉山無番地） 開催日：令和４年５月１８日～２０日 ▲１２▼ウェブサイト名：第６９回日本ウイルス学会学術集会 電子抄録 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｊｓｖ６９／ｔｏｐ 発行日：令和４年１０月１４日 ▲１３▼ウェブサイト名：ｉＳｃｉｅｎｃｅ 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｉｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／Ｓ２５８９－００４２（２２）０１６８４－４ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃｍｓ／１０．１０１６／ｊ．ｉｓｃｉ．２０２２．１０５４１２／ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ／ｃ８１２ｆ４ｆ３－５ｆ３２－４ａ６９－ａ４８２－ｄ９６５３ｅｂ２５ｂ１７／ｍｍｃ１．ｐｄｆ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ） 掲載日：令和４年１０月２０日

本発明は、ベータコロナウイルスの不活化抗原に関する。

新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）はパンデミックを引き起こし、今なお社会的な問題となっている。本感染症に対するワクチンとしては、ロシアで承認されたアデノウイルスベクターワクチンであるスプートニクＶ（非特許文献１）を皮切りとして、アデノウイルスベクターワクチン及びｍＲＮＡワクチンといった遺伝子ワクチンが承認され、世界中で接種が進められている。

ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ， ＶＯＬＵＭＥ ３９６， ＩＳＳＵＥ １０２５５， Ｐ８８７－８９７， ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ ２６，２０２０

しかしながら、遺伝子ワクチンは従来型のワクチンとは異なる次世代型のワクチンであり、発熱及び血栓症等の副反応が報告されている。このため、引き続き新たなワクチン開発は重要だと考えられる。不活化ワクチンは伝統的なワクチンの一つであり、大量に培養したウイルスを化学的な処理等により感染性を失わせ、これにより得られる不活化ウイルス粒子又はタンパク質をワクチン抗原とする。

不活化ワクチンを製造する際には、ウイルスの大量培養を必要とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する不活化ワクチンを製造するために、野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用すると、製造業務に従事する者に対する感染リスクが深刻である。また、ウイルスの感染性を失わせる処理が不十分な場合、製品中に微量ながら強毒性の生残ウイルスが混入し、同様の感染リスクがある。

そこで本発明は、上記リスクに鑑み、不活化前から安全性が高められているウイルス株をシード株（以下、元株ともいう）として用いた不活化抗原及び当該抗原を含む不活化ワクチンを提供することを目的とする。

本発明者は鋭意検討の結果、所定の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、ヒトの体温（いわゆる下気道温度）での増殖性が制限され低温（典型的にはヒトの上気道温度以下）特異的に増殖能を有する特性（以下において、「温度感受性」と記載する。）を獲得していること、及び、当該所定の変異が、ベータコロナウイルス一般において温度感受性をもたらし、不活化抗原の製造に伴うリスク低減に寄与し得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成された発明である。すなわち、本発明は以下に掲げる態様の発明を提供する。

項１． 以下の（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異を有する構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含むベータコロナウイルス温度感受性株の不活化抗原：
（ａ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｃ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｄ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基の変異、
（ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｉ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｊ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｋ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｌ）エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、及び
（ｍ）ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンに相当するアミノ酸残基の変異。

上記項１の発明の具体例として、以下の発明が挙げられる。
以下の（Ｉ－１）～（Ｉ－６）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の少なくともいずかのポリペプチドからなる構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含むベータコロナウイルス温度感受性株の不活化抗原：
（Ｉ－１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第４０４位バリンの変異（ａ’）、第４４５位ロイシンの変異（ｂ’）、第１７９２位リシンの変異（ｃ’）、及び第１８３２位アスパラギン酸の変異（ｄ’）の少なくともいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ３）、
（Ｉ－２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、第２４８位グリシンの変異（ｅ’）、第４１６位グリシンの変異（ｆ’）、及び第５０４位アラニンの変異（ｇ’）の少なくともいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１４）、
（Ｉ－３）配列番号３に示すアミノ酸配列において、第６７位バリンの変異（ｈ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１６）、
（Ｉ－４）配列番号４に示すアミノ酸配列において、第５４位ロイシンの変異（ｉ’）、第７３９位トレオニンの変異（ｊ’）、及び第８７９位アラニンの変異（ｋ’）の少なくともいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（スパイク）、
（Ｉ－５）配列番号５に示すアミノ酸配列において、第２８位ロイシンの変異（ｌ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（エンベロープ）、
（Ｉ－６）配列番号６に示すアミノ酸配列において、第２位セリンの変異（ｍ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヌクレオカプシド）；
（ＩＩ）前記（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記変異（ａ’）～（ｍ’）に係るアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、温度感受性能を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド；
（ＩＩＩ）前記（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のポリペプチドのアミノ酸配列における前記変異（ａ’）～（ｍ’）に係るアミノ酸残基を除いたアミノ酸配列の配列同一性が５０％以上であり、温度感受性を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド。

項２． 前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、項１に記載のウイルス温度感受性株の不活化抗原。

項３． 前記（ａ）の変異がアラニンへの置換であり、前記（ｂ）の変異がフェニルアラニンへの置換であり、前記（ｃ）の変異がアルギニンへの置換であり、前記（ｄ）の変異がアスパラギンへの置換であり、前記（ｅ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｆ）の変異がセリンへの置換であり、前記（ｇ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｈ）の変異がイソロイシンへの置換であり、前記（ｉ）の変異がトリプトファンへの置換であり、及び／又は、前記（ｊ）の変異がリシンへの置換であり、前記（ｋ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｌ）の変異がプロリンへの置換であり、及び／又は、前記（ｍ）の変異がフェニルアラニンへの置換である、項１又は２に記載の不活化抗原。
項４． 前記ベータコロナウイルス温度感受性株が、前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）の変異と前記（ｆ）の変異との組み合わせ、並びに／若しくは前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質を含む、項１又は２に記載の不活化抗原。
項５． 前記ベータコロナウイルス温度感受性株が、前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）の変異と前記（ｆ）の変異との組み合わせ、並びに／若しくは前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質を含む、項３に記載の不活化抗原。
項６． 項１、２又は５に記載の不活化抗原を含む、不活化ワクチン。
項７． 項３に記載の不活化抗原を含む、不活化ワクチン。
項８． 項４に記載の不活化抗原を含む、不活化ワクチン。
項９． 以下の（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異を有する構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含むベータコロナウイルス温度感受性株を不活化する工程を含む、不活化抗原の製造方法：
（ａ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｃ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｄ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基の変異、
（ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｉ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｊ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｋ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｌ）エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、及び
（ｍ）ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンに相当するアミノ酸残基の変異。
項１０． 前記不活化する工程を、物理的処理又は化学的処理によって行う、項９に記載の製造方法。
項１１． 前記化学的処理を、β－プロピオラクトンを用いて行う、項１０に記載の製造方法。

本発明によれば、不活化前から安全性が高められているウイルス株を元株として用いた不活化抗原及び当該抗原を含む不活化ワクチンが提供される。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性化方法を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性の確認結果（ＣＰＥ像）を示す。 各々のウイルス株の変異解析結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８）における変異を導入した組換えウイルスの温度感受性の確認結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８）における変異を導入した組換えウイルスの温度感受性の確認結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８）の増殖性解析結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８）の増殖性解析結果を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの体重変動を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの体重変動を示す。 肺内又は鼻腔洗浄液のウイルス量を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺画像を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺組織学的解析結果を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺組織学的解析結果（ＨＥ染色及びＩＨＣ染色）を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２再感染ハムスターの体重変動を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のハムスターの体重変動を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の回復ハムスター血清の中和抗体価を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性化方法（Ｇ～Ｌ５０シリーズ）を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性の確認結果（ＣＰＥ像）を示す。 追加分離株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０）の変異解析結果を示す。 温度感受性株（Ｈ５０－１１）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０）に関連して見出された塩基配列の欠失を示す。 図１７で示した塩基配列の欠失及びそれにコードされるアミノ酸配列の欠失の概要図を示す。 温度感受性株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０）の増殖性解析結果を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの体重変動を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺重量を示す。 肺内又は鼻腔洗浄液のウイルス量を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２再感染ハムスターの体重変動を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後ハムスター血清の中和抗体価を示す。 温度感受性株の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。 温度感受性株の投与経路による免疫誘導能の比較を示す。 温度感受性株の投与量による免疫誘導能の比較を示す。 温度感受性株の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。 温度感受性株の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株の不活化抗原のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図及びウエスタンブロッティング（ＷＢ）図を示す。 不活化抗原免疫血清の中和抗体価を示す。 不活化抗原免疫ハムスターの感染試験結果を示す。 ｒＴＳ－ａｌｌ株不活化抗原のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図及びウエスタンブロッティング（ＷＢ）図を示す。 ｒＴＳ－ａｌｌ株の不活化抗原免疫血清の中和抗体価を示す。 ｒＴＳ－ａｌｌ株の不活化抗原免疫ハムスターの感染試験結果を示す。

１．不活化ワクチン
本発明の不活化ワクチンは、所定の変異を有する構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含むベータコロナウイルスであって、温度感受性であるもの（以下において、「ベータコロナウイルス温度感受性株」とも記載する。）の不活化抗原を含むことを特徴とする。

１－１．有効成分（不活化抗原）
本発明の不活化ワクチンの有効成分は、ベータコロナウイルス温度感受性株の不活化抗原である。

コロナウイルスは、形態学的には、直径約１００～２００ｎｍの球形で、表面に突起を有する。コロナウイルスは、ウイルス学的には、ニドウイルス目・コロナウイルス亜科・コロナウイルス科に分類される。脂質二重膜のエンベロープの中に、ヌクレオカプシドタンパク質（以下において、「ヌクレオカプシド」又は「Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ」ともいう）に巻きついたプラス鎖の一本鎖ＲＮＡのゲノムがあり、エンベロープの表面にはスパイクタンパク質（以下において、「スパイク」又は「Ｓｐｉｋｅ」ともいう）、エンベロープタンパク質（以下において、「エンベロープ」又は「Ｅｎｖｅｌｏｐｅ」ともいう）、メンブレンタンパク質（以下において、「メンブレン」又は「Ｍｅｍｂｒａｎｅ」ともいう）が配置されている。ウイルスゲノムの大きさは、ＲＮＡウイルスの中で最長の約３０ｋｂである。ヌクレオカプシド、スパイク、エンベロープ及びメンブレンが、コロナウイルスの構造タンパク質である。ＮＳＰ１～ＮＳＰ１６が、コロナウイルスの非構造タンパク質である。

コロナウイルスは遺伝学的特徴から、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタのグループに分類される。ヒトに感染するコロナウイルスとしては、風邪の原因ウイルスとしてヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ－１の４種類、並びに、重篤な肺炎を引き起こす２００２年に発生した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス及び２０１２年に発生した中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルスが知られている。アルファコロナウイルス属にはヒトコロナウイルス２２９Ｅ及びＮＬ６３が分類され、ベータコロナウイルス属にはヒトコロナウイルスＯＣ４３、ＨＫＵ－１、ＳＡＲＳコロナウイルス及びＭＥＲＳコロナウイルスが分類される。

２０１９年武漢にて発生した新型コロナウイルス感染症の原因ウイルスとして、ＳＡＲＳコロナウイルスに分類されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が分離及び同定されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、初期の武漢株から変異を繰り返しており、英国で検出された株、南アフリカで検出された株、インドで検出された株などの変異株が見つかっている。いまだ検出されていない変異株や、今後新たに変異株が発生する可能性も考えられる。本発明において、ベータコロナウイルス属に含まれるウイルスには、上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の株に限定されず、それ以外の全てのベータコロナウイルス（例えば、今後新たに検出される他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルス、並びに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質を、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルス（今後新たに検出されるウイルスを含む）の少なくともいずれかのスパイクタンパク質に入れ替えた組換えウイルスなど）も含まれる。

有効成分の元株であるベータコロナウイルス温度感受性株が有する当該所定の変異について、下記表１に基づいて説明する。表１に示される「変異」は、温度感受性能を獲得するための変異を指す。また、表１において、「変異後アミノ酸」及び「ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体の場合」に示す事項は例示である。

本発明におけるベータコロナウイルス温度感受性株が有する当該所定の変異は、以下の（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異である。
（ａ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｃ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｄ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基の変異、
（ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｉ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｊ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｋ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｌ）エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、及び
（ｍ）ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンに相当するアミノ酸残基の変異。

配列番号１は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＮＳＰ３のアミノ酸配列であり；配列番号２は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＮＳＰ１４のアミノ酸配列であり；配列番号３は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＮＳＰ１６のアミノ酸配列であり；配列番号４は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるスパイクのアミノ酸配列であり；配列番号５は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるエンベロープのアミノ酸配列であり；配列番号６は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるヌクレオカプシドのアミノ酸配列である。

「相当するアミノ酸残基」とは、本発明におけるベータコロナウイルス温度感受性株がＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株である場合は、配列番号１～６のアミノ酸配列中の、上記所定位置に存在するアミノ酸残基をいい、本発明におけるベータコロナウイルス温度感受性株が上記変異株以外の他のベータコロナウイルスの変異株である場合は、他のベータコロナウイルスが有するポリペプチドの上記配列番号１～６に対応するアミノ酸配列中の、上記所定位置に対応する位置に存在するアミノ酸残基をいう。当該対応する位置は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列番号１～６のタンパク質と、配列番号１～６のタンパク質に対応する他のベータコロナウイルスのタンパク質についてアミノ酸配列のアラインメントを行うことで、特定することができる。

本発明におけるウイルス温度感受性株は、配列番号１～６のアミノ酸配列における上記所定位置に対応するアミノ酸残基が変異していればよいため、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株に限定されるものではなく、他のベータコロナウイルスの変異株（つまり、他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスの変異株）を含む。ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株とは、当該特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における配列番号１～６で表されるアミノ酸配列中の上記所定位置の少なくともいずれかのアミノ酸残基が変異した変異株であり、他のベータコロナウイルスの変異株とは、他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株（つまり、他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における上記配列番号１～６に対応するアミノ酸配列中の、上記所定位置に対応するアミノ酸残基が変異した変異株）と、ベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスの変異株（つまり、ベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスにおける上記配列番号１～６に対応するアミノ酸配列中の、上記所定位置に対応するアミノ酸残基が変異した変異株）との両方をいう。他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスの変異株には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質を、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルス（今後新たに検出されるウイルスを含む）の少なくともいずれかのスパイクタンパク質に入れ替えた組換えウイルスの変異株も含まれる。

他のベータコロナウイルスの変異株における上記配列番号１～６に対応するアミノ酸配列は、それぞれ、ポリペプチドの特性に大きく影響しない限り、配列番号１～６に示すアミノ酸配列と相違していることが許容される。ポリペプチドの特性に大きく影響しないとは、それぞれの構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質としての機能を保った状態をいう。具体的には、上記の配列番号１～６における変異に対応するアミノ酸残基以外の部位（以下において、「任意相違部位」とも記載する。）において、配列番号１～６との相違が許容される。許容される相違には、置換、付加、挿入、及び欠失の中から選択される１種類の相違（例えば置換）であってもよいし、２種以上の相違（例えば、置換及び挿入）を含んでいてもよい。他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における上記配列番号１～６に対応するアミノ酸配列と、配列番号１～６に示すアミノ酸配列との任意相違部位のみを比較して算出される配列同一性としては、５０％以上であればよい。他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２においては、当該配列同一性としては、好ましくは６０％以上又は７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上又は９０％以上、一層好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、より一層好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．３％以上、９９．５％以上、９９．７％以上、９９．９％以上が挙げられる。残りの任意のベータコロナウイルスにおいては、当該配列同一性としては、好ましくは６０％以上が挙げられる。ここで、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。

つまり、本発明におけるベータコロナウイルス温度感受性株は、より具体的には以下の通りである：
以下の（Ｉ－１）～（Ｉ－６）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の少なくともいずかのポリペプチドからなる構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含む、ベータコロナウイルス温度感受性株：
（Ｉ－１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第４０４位バリンの変異（ａ’）、第４４５位ロイシンの変異（ｂ’）、第１７９２位リシンの変異（ｃ’）、及び第１８３２位アスパラギン酸の変異（ｄ’）の少なくともいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ３）、
（Ｉ－２）配列番号２に示すアミノ酸配列において、第２４８位グリシンの変異（ｅ’）、第４１６位グリシンの変異（ｆ’）、及び第５０４位アラニンの変異（ｇ’）の少なくともいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１４）、
（Ｉ－３）配列番号３に示すアミノ酸配列において、第６７位バリンの変異（ｈ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１６）、
（Ｉ－４）配列番号４に示すアミノ酸配列において、第５４位ロイシンの変異（ｉ’）、第７３９位トレオニンの変異（ｊ’）、及び第８７９位アラニンの変異（ｋ’）の少なくともいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（スパイク）、
（Ｉ－５）配列番号５に示すアミノ酸配列において、第２８位ロイシンの変異（ｌ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（エンベロープ）、
（Ｉ－６）配列番号６に示すアミノ酸配列において、第２位セリンの変異（ｍ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヌクレオカプシド）；
（ＩＩ）前記（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記変異（ａ’）～（ｍ’）に係るアミノ酸残基以外の１個又は複数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、温度感受性能を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド；
（ＩＩＩ）前記（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のポリペプチドのアミノ酸配列における前記変異（ａ’）～（ｍ’）に係るアミノ酸残基を除いたアミノ酸配列の配列同一性が５０％以上であり、温度感受性能を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド。

上記（ａ’）～（ｍ’）の変異は、それぞれ、（ａ）～（ｍ）の変異が具体的に配列番号１～６のアミノ酸配列に存在する場合の変異を指す。つまり、上記（Ｉ－１）～（Ｉ－６）のポリペプチドは、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が有する配列番号１～６のアミノ酸配列からなるポリペプチドに、変異（ａ’）～（ｍ’）の少なくともいずれかの変異が導入されたものである。また、上記（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のポリペプチドは、他のベータコロナウイルスが有する配列番号１～６のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチドに、上述の変異（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異が導入されたものである。上記（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のポリペプチドの配列同一性の好ましい範囲は、既に述べた通りである。

このような変異を有することで、ベータコロナウイルスは、温度感受性特性を獲得することができる。本発明におけるウイルス温度感受性株は、ヒトの下気道温度での増殖能が、ヒトの下気道温度よりも低い温度での増殖能よりも少なくとも低下しており、好ましくは、ヒトの下気道温度での増殖能を有しない。本発明において、温度感受性は、ヒトの下気道温度にてウイルス温度感受性株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの下気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）が、ヒトの上気道温度にてウイルス温度感受性株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの上気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価と比較して、例えば、１０²以上、好ましくは１０³以上減少していることにより確認することができる。

典型的には、本発明におけるウイルス温度感受性株は、ヒトの下気道温度での増殖能が、上記（ａ）～（ｍ）のいずれの変異も有しない場合におけるヒトの下気道温度での増殖能に比べて低下している。このことは、ヒトの下気道温度にてウイルス温度感受性株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの下気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）が、ヒトの下気道温度にて上記（ａ）～（ｍ）のいずれの変異も有しない株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの下気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価と比較して、例えば、１０²以上、好ましくは１０³以上減少していることにより確認することができる。

ヒトの下気道温度の代表例としては約３７℃が挙げられ、具体的には後述の上気道温度より高い温度、好ましくは３６～３８℃、より好ましくは３６．５～３７．５℃又は３７～３８℃が挙げられる。また、本発明におけるウイルス温度感受性株は、ヒトの下気道温度未満の温度での増殖能は有していてもよい。例えば、ヒトの下気道温度より低い温度としては、例えばヒトの上気道温度（具体例として、約３２℃～３５．５℃）を包含していてもよい。

上記の（ａ）～（ｍ）の変異は、ウイルスが細胞に感染する際に重要な、ウイルス表面に存在するスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン上には存在しない。そのため、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２だけでなく、他のベータコロナウイルスにおいても、上記の（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異を導入することで、温度感受性化することができると合理的に予想される。つまり、世界的な感染症の流行により、ウイルスの免疫原性が変化するような変異が生じた場合においても、当該変異ウイルスにさらに上記の（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異を導入することで、当該変異ウイルスに対して温度感受性を付与できると合理的に予想される。

本発明におけるベータコロナウイルス温度感受性株の典型例においては、上記の（ａ）～（ｍ）の変異の中でも、少なくとも、変異（ｂ）、変異（ｅ）と変異（ｆ）との組み合わせ、及び／又は変異（ｈ）を含む。変異（ｂ）、変異（ｅ）と変異（ｆ）との組み合わせ、変異（ｈ）は、本発明におけるベータコロナウイルス温度感受性株の温度感受性の責任変異である。当該典型例においては、当該責任変異以外の他の変異（つまり、変異（ａ），（ｃ），（ｄ），（ｇ），（ｉ）～（ｍ））は、当該責任変異に加えて含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。

上記（ａ）の変異はバリン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｂ）の変異はロイシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｃ）の変異はリシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｄ）の変異はアスパラギン酸以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｅ）の変異はグリシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｆ）の変異はグリシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｇ）の変異はアラニン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｈ）の変異はバリン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｉ）の変異はロイシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｊ）の変異はトレオニン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｋ）の変異はアラニン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｌ）の変異はロイシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｍ）の変異はセリン以外のアミノ酸残基への置換であればよい。

本発明におけるウイルス温度感受性株の好ましい例においては、前記（ａ）の変異はアラニンへの置換であり、前記（ｂ）の変異はフェニルアラニンへの置換であり、前記（ｃ）の変異はアルギニンへの置換であり、前記（ｄ）の変異はアスパラギンへの置換であり、前記（ｅ）の変異はバリンへの置換であり、前記（ｆ）の変異はセリンへの置換であり、前記（ｇ）の変異はバリンへの置換であり、前記（ｈ）の変異はイソロイシンへの置換であり、前記（ｉ）の変異はトリプトファンへの置換であり、前記（ｊ）の変異はリシンへの置換であり、前記（ｋ）の変異はバリンへの置換であり、前記（ｌ）の変異はプロリンへの置換であり、及び／又は、前記（ｍ）の変異はフェニルアラニンへの置換である。

本発明におけるウイルス温度感受性株の別の例においては、前記置換は、いわゆる保存的置換であってもよい。保存的置換とは、構造及び／又は特性の類似したアミノ酸で置換されることをいい、例えば、保存的置換の例として、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸へ置換、置換前のアミノ酸が非電荷アミノ酸であれば他の非電荷アミノ酸へ置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸へ置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸へ置換されることが挙げられる。なお、一般的に、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれ、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。

本発明におけるウイルス温度感受性株のより好ましい例としては、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株であって、前記（ａ）の変異（つまり（ａ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンのアラニンへの置換（Ｖ４０４Ａ）であり；前記（ｂ）の変異（つまり（ｂ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンのフェニルアラニンへの置換（Ｌ４４５Ｆ）であり；前記（ｃ）の変異（つまり（ｃ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンのアルギニンへの置換（Ｋ１７９２Ｒ）であり；前記（ｄ）の変異（つまり（ｄ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸のアスパラギンへの置換（Ｄ１８３２Ｎ）であり；前記（ｅ）の変異（つまり（ｅ’）の変異）が、ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンのバリンへの置換（Ｇ２４８Ｖ）であり；前記（ｆ）の変異（つまり（ｆ’）の変異）が、ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンのセリンへの置換（Ｇ４１６Ｓ）であり；前記（ｇ）の変異（つまり（ｇ’）の変異）が、ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンのバリンへの置換（Ａ５０４Ｖ）であり；前記（ｈ）の変異（つまり（ｈ’）の変異）が、ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンのイソロイシンへの置換（Ｖ６７Ｉ）であり；前記（ｉ）の変異（つまり（ｉ’）の変異）が、スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンのトリプトファンへの置換（Ｌ５４Ｗ）であり；前記（ｊ）の変異（つまり（ｊ’）の変異）が、スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンのリシンへの置換（Ｔ７３９Ｋ）であり；前記（ｋ）の変異（つまり（ｋ’）の変異）が、スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンのバリンへの置換（Ａ８７９Ｖ）であり；前記（ｌ）の変異（つまり（ｌ’）の変異）が、エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンのプロリンへの置換（Ｌ２８Ｐ）であり；及び／又は、前記（ｍ）の変異（つまり（ｍ’）の変異）が、ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンのフェニルアラニンへの置換（Ｓ２Ｆ）であるものが挙げられる。

本発明におけるベータコロナウイルス温度感受性株は、さらに、配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列を欠失していてもよい。配列番号７に示す塩基配列は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオープンリーディングフレームの一部である。

本発明におけるウイルス温度感受性株の特に好ましい例としては、以下の株が挙げられる。
・責任変異として、前記（ｅ）の変異（好ましくは（ｅ’）の変異及び／又はＧ２４８Ｖ）及び前記（ｆ）の変異（好ましくは（ｆ’）の変異及び／又はＧ４１６Ｓ）を有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｇ）の変異（好ましくは（ｇ’）の変異及び／又はＡ５０４Ｖ）、前記（ｋ）の変異（好ましくは（ｋ’）の変異及び／又はＡ８７９Ｖ）、前記（ｌ）の変異（好ましくは（ｌ’）の変異及び／又はＬ２８Ｐ）、及び前記（ｍ）の変異（好ましくは（ｍ’）の変異及び／又はＳ２Ｆ）を有する株
・責任変異として、前記（ｈ）の変異（好ましくは（ｈ’）の変異及び／又はＶ６７Ｉ）を有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ａ）の変異（好ましくは（ａ’）の変異及び／又はＶ４０４Ａ）、前記（ｄ）の変異（好ましくは（ｄ’）の変異及び／又はＤ１８３２Ｎ）、前記（ｊ）の変異（好ましくは（ｊ’）の変異及び／又はＴ７３９Ｋ）を有する株；若しくはさらに配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列の欠失を有する株
・責任変異として、前記（ｂ）の変異（好ましくは（ｂ’）の変異及び／又はＬ４４５Ｆ）を有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｃ）の変異（好ましくは（ｃ’）の変異及び／又はＫ１７９２Ｒ）を有する株；若しくはさらに前記（ｉ）の変異（好ましくは（ｉ’）の変異及び／又はＬ５４Ｗ）を有する株；若しくはさらに配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列の欠失を有する株

有効成分であるベータコロナウイルス温度感受性株の不活化抗原は、上記ベータコロナウイルス温度感受性株が不活化されたものであり、その具体的形態は、全粒子及びスプリットのいずれであってもよい。ベータコロナウイルス温度感受性株を不活化する方法については、「２．不活化ワクチンの製造方法」で述べる通りである。

１－２．他の成分
本発明の不活化ワクチンには、上記の有効成分の他に、目的及び用途等に応じて、アジュバント、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯臭剤、光吸収色素、安定化剤、炭水化物、カゼイン消化物、各種ビタミン等の他の成分を含むことができる。

アジュバントとしては、例えば、動物油（スクアレン等）又はそれらの硬化油；植物油（パーム油、ヒマシ油等）又はそれらの硬化油；無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステル等を含む油性アジュバント；ＰＣＰＰ、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミニウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質等の水溶性アジュバント；水酸化アルミニウム（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩又はその組み合わせ、水酸化ナトリウム等の沈降性アジュバント；コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分；その他の成分（ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキン等）が挙げられる。

緩衝剤の例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の例としては、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、抗生物質、合成抗菌剤等が挙げられる。抗酸化剤の例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。

光吸収色素の例としては、リボフラビン、アデニン、アデノシン等が挙げられる。安定化剤の例としては、キレート剤、還元剤等が挙げられる。炭水化物の例としては、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストラン等が挙げられる。

さらに、本発明の不活化ワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９等のベータコロナウイルス感染症以外の他の疾患を発症するウイルス又は細菌に対する１又は複数の他のワクチンを含んでいてもよい。つまり、本発明のワクチンは、他のワクチンを含む混合ワクチンとして調製されてもよい。

１－３．剤型
本発明の不活化ワクチンの剤型については特に限定されず、投与方法及び保存条件等に基づいて適宜決定することができる。剤型の具体例としては、液体製剤及び固体製剤等が挙げられ、より具体的には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤；凍結乾燥製剤等の乾燥製剤、注射剤、噴霧剤、貼付剤等の非経口投与剤（具体的には、筋肉内投与剤、皮内投与剤、皮下投与剤、経鼻投与剤、経皮投与剤等）が挙げられる。

１－４．投与方法
本発明の不活化ワクチンの投与方法としては特に限定されず、筋肉、腹腔内、皮内及び皮下等の注射投与、鼻腔及び口腔からの吸入投与、並びに経口投与等のいずれであってもよいが、好ましくは筋肉、皮内及び皮下等の注射投与（筋肉内投与、皮内投与及び皮下投与）、鼻腔からの吸入投与（経鼻投与）、皮膚からの吸収投与（経皮投与）が挙げられ、より好ましくは、経鼻投与が挙げられる。

１－５．標的とするウイルス
本発明の不活化ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の初期の武漢株だけでなく、２０２０年９月に英国で検出され、２０２０年１０月に南アフリカで検出された変異株、及びその他の公知の変異株、並びにその他未だ検出されていない未知の変異株を含む、広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連株及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスにも有効であることが合理的に期待できる。従って、本発明の不活化ワクチンは、ベータコロナウイルスを標的とする。

１－６．適用対象
本発明の不活化ワクチンの適用対象としては、ベータコロナウイルス感染による諸症状を引き起こしうる対象（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によりＣＯＶＩＤ－１９症状を引き起こしうる対象）であれば特に限定されず、例えば哺乳類が挙げられ、より具体的には、ヒト；イヌ及びネコ等の愛玩動物；ネズミ、マウス、ハムスター等の実験動物等が挙げられる。

１－７．用量
本発明の不活化ワクチンの用量としては特に限定されず、有効成分の種類、投与方法、投与対象（年齢、体重、性別、基礎疾患の有無等の条件）に応じて適宜決定することができる。例えば、ヒトに対する用量として、全粒子の不活化抗原として５ｕｇ／ｄｏｓｅ以上、好ましくは１０ｕｇ／ｄｏｓｅ以上が挙げられる。また、本発明のワクチンのヒトに対する用量としては、全粒子 の不活化抗原として１×１０⁴ｕｇ／ｄｏｓｅ以下、好ましくは１×１０³ｕｇ／ｄｏｓｅ以下が挙げられる。

２．不活化ワクチンの製造方法
本発明の不活化ワクチンの製造方法は、ベータコロナウイルス温度感受性株を不活化する工程を含むことを特徴とする。また、本発明の不活化ワクチンの製造方法は、ベータコロナウイルス温度感受性株を作製する工程をさらに含んでもよい。

２－１．ベータコロナウイルス温度感受性株の作製工程
ベータコロナウイルス温度感受性株の作製方法としては、特に限定されず、上記「１－１．有効成分」で述べたアミノ酸配列情報に基づいて当業者が適宜決定することができる。例えば、比較的安価にかつロット差の少ないワクチンを製造する観点から、好ましくは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はイースト人工染色体（ＹＡＣ）などの人工染色体、若しくはベータコロナウイルスのゲノムフラグメントを用いたＣＰＥＲ法などを利用したリバースジェネティクス法が挙げられる。

リバースジェネティクス法によるウイルスの再構築方法においては、まず、ベータコロナウイルス温度感受性株の、上記（ａ）～（ｍ）のいずれの変異も有しない株（親株）のゲノムをクローニングする。この際に使用する親株としては、ベータコロナウイルスであればよく、具体的には、上記のＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、上記の他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスからなる群より選択することができる。

さらに、リバースジェネティクス法において人工染色体を利用する場合、ウイルスゲノムの全長ＤＮＡをＢＡＣ ＤＮＡ又はＹＡＣ ＤＮＡなどにクローニングし、ウイルスの配列の上流に真核細胞用の転写プロモーター配列を挿入する。プロモーター配列としてはＣＭＶプロモーター及びＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。ウイルスの配列の下流にはリボザイム配列並びにポリＡ配列を挿入する。リボザイム配列としてはＤ型肝炎ウイルスリボザイム及びハンマーヘッドリボザイムなどが挙げられる。ポリＡ配列としてはシミアン４０ウイルスのポリＡなどが挙げられる。

一方、リバースジェネティクス法においてＣＰＥＲ法を利用する場合、ウイルスゲノムの全長ＤＮＡを複数のフラグメント断片に分けて、クローニングする。フラグメント断片を獲得する方法としては、核酸の人工合成法、上記人工染色体又はフラグメント断片をクローニングしたプラスミドをテンプレートとするＰＣＲ法などが挙げられる。

上記の手法によりクローニングされたウイルスゲノムに対して上記（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異を導入するには、ダブルクロスオーバー及びλ／ＲＥＤリコンビネーション等の相同組換え法、オーバーラップＰＣＲ法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法など、公知の点変異導入法を用いることができる。

続いて、変異を導入した人工染色体を宿主細胞にトランスフェクションし、組換えウイルスを再構築させる。ＣＰＥＲ法によるリバースジェネティクス法の場合、変異を導入したフラグメントをＤＮＡポリメラーゼを用いた反応により連結した後、宿主細胞にトランスフェクションすることで、組換えウイルスを再構築させる。トランスフェクションの方法としても特に限定されず、公知の方法を用いることができる。また、宿主についても特に限定されず、公知の細胞を用いることができる。

続いて、再構築した組換えウイルスを培養細胞に添加して、組換えウイルスを継代培養する。その際に用いる培養細胞としても特に限定されないが、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＶｅｒｏＥ６細胞、ＴＭＰＲＥＳＳ２の発現を補ったＶｅｒｏ細胞、ＴＭＰＲＥＳＳ２の発現を補ったＶｅｒｏＥ６細胞、Ｃａｌｕ－３細胞、ＡＣＥ２の発現を補った２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、１０４Ｃ１細胞、マウス神経芽細胞腫由来ＮＡ細胞等が挙げられる。ウイルスの回収は、遠心分離及び膜ろ過など、公知の方法により行うことができる。また、回収したウイルスをさらに培養細胞に添加することにより、組換えウイルスの大量生産が可能になる。

２－２．不活化工程
ベータコロナウイルス温度感受性株を不活化する工程では、一般的な不活化ワクチンの製造方法において採用されるウイルス不活化方法を特に制限なく用いることができる。つまり、不活化する工程は、物理的処理又は化学的処理によって行うことができる。

物理的処理は、ベータコロナウイルス温度感受性株の培養液に対して行うことができ、具体的には、紫外線照射、Ｘ線照射、熱処理、超音波処理等が挙げられる。化学的処理は、ベータコロナウイルス温度感受性株の培養液に対して行うことができ、化学的処理に用いられる不活化剤としては、β－プロピオラクトン等のアルキル化剤；ホルマリン、クロロホルム等の有機溶媒；酢酸等の酸が挙げられる。

不活化する工程において行われる上記処理の中でも、好ましくは化学的処理が挙げられ、より好ましくはアルキル化剤による処理が挙げられ、より好ましくはβ－プロピオラクトンによる処理が挙げられる。上記の不活化工程にて、全粒子の不活化抗原を取得できる。なお、全粒子は、粒子の全ての構成要素が揃っていればよく、その形態としては、粒子構造が完全に保たれていてもよいし、不活化工程及び／又は不活化工程の前後に行われる任意の工程において目的外で部分的又は完全な破砕を受けていてもよい。部分的又は完全な破砕を受けた形態の全粒子は、全粒子の破砕物から目的の表面抗原のみを分離回収して得られた部分構造物であるスプリットとは区別される。

２－３．他の工程
本発明の不活化ワクチンの製造方法では、上記不活化工程に加えて、任意の他の工程を含むことができる。

他の工程の例としては、不活化工程の前に行われる、ベータコロナウイルス温度感受性株を培養する工程（温度感受性株培養工程）ベータコロナウイルス温度感受性株を精製する工程（温度感受性株精製工程）、不活化工程の後に行われる、不活化抗原を精製する工程（不活化抗原精製工程）が挙げられる。

また、他の工程の例としては、不活化されたベータコロナウイルス温度感受性株（不活化抗原）を、エーテル又は界面活性剤等を用いて破砕する工程（破砕工程）、及び破砕工程で破砕物として生じた表面抗原（スプリット）を精製する工程（スプリット精製工程）も挙げられる。当該破砕工程は、上記の不活化工程と同時に行われてもよいし、上記の不活化工程後に行われてもよい。当該破砕工程が上記の不活化工程後に行われる場合、不活化工程と破砕工程の間に、上記の不活化抗原精製工程を行うことができる。

上記の温度感受性株精製工程、不活化抗原精製工程、及びスプリット精製工程はいずれも、精製対象物を膜ろ過又は遠心分離等により回収及び精製することにより行うことができる。

上記のようにして精製された全粒子又はスプリットを不活化抗原（有効成分）とし、必要に応じて配合される上記「１－２．他の成分」を用い、通常の製剤化手法に従って上記「１－３．剤型」に製剤化すればよい。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

［試験例１］
［試験例１－１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性化株Ａ５０－１８株の分離
図１の手法に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床分離株（Ｂ－１株）（ＬＣ６０３２８６、本実施例において、Ｂ－１株、野生株（臨床分離株）、又は欧州型野生株（Ｂ－１株）ともいう）に、２種類の突然変異誘導剤５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（以下、５－ＦＵ）及び５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ（以下、５－ＡＺＡ）を添加することで、３２℃にて馴化させたＡ～Ｆ５０シリーズ及びＡ～Ｆ５００シリーズのウイルス集団を取得した。更に、各々のウイルス集団の継代を複数回行い、得られた４０６の候補株の中から、３２℃で増殖できる一方、３７℃で増殖性が著しく低下しているウイルス株（Ａ５０－１８株。以下においてＴｓ株と記載する場合もある。）を見出し、分離、選択した（図２）。

［試験例１－２］次世代シーケンスによる温度感受性株Ａ５０－１８株の解析
（１－２－１）各々のウイルス株の変異解析
次世代シークエンサーを用いて、以下のウイルス株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで、当該解析を行った。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして、武漢臨床分離株であるＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＮＣ０４５５１２）を用いた。
Ｂ－１ ：野生株（臨床分離株）
Ａ５０－１８ ：温度感受性株
Ｆ５０－３７ ：非温度感受性株
Ｃ５００－１ ：非温度感受性株
Ｆ５００－５３ ：非温度感受性株
Ｆ５００－４０ ：非温度感受性株
Ｆ５００－２ ：非温度感受性株
（Ｂ－１以外は、変異誘導させたウイルス）

（１－２－２）温度感受性株の変異
（１－２－１）より、図３Ａの解析結果を取得した。Ｄ６１４Ｇの点変異はＢ－１株にも見られるため、温度感受性株の特徴的な点変異ではなく、一方、温度感受性株（Ａ５０－１８）の特徴的な点変異として、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ、Ｇ４１６Ｓ、Ａ５０４Ｖ、ＳｐｉｋｅのＡ８７９Ｖ、ＥｎｖｅｌｏｐｅのＬ２８Ｐ、及びＮｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄのＳ２Ｆが見出された。

（１－２－３）復帰変異株の解析１
「復帰変異」とは、変異したウイルスに更なる変異が入ることにより、変異する前の最初のウイルスと同じ表現型に戻ることをいう。本明細書においては、「復帰変異」は、温度感受性株に更なる変異が入ることで、温度感受性の特性が失われることをいう。更なる変異は、温度感受性化した際に入った変異箇所のアミノ酸が、変異前のアミノ酸に戻ることを含む。

Ｂ－１株又はＡ５０－１８株をＭＯＩ＝０．０１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３２℃、３４℃、３７℃での増殖性を評価した結果、Ａ５０－１８株の中から、３７℃の増殖性が回復しているサンプル（以下、「復帰変異株」という）を見出した。復帰変異株では、温度感受性を獲得した温度感受性株（Ａ５０－１８株）が有する変異のうち、一部のアミノ酸残基が、変異前のアミノ酸に復帰変異（以下、単に「復帰変異」という）することで、温度感受性が低下し、３７℃の増殖性が回復したと思われる。このことを示すＣＰＥ像を図３Ｂに示す。得られたサンプルのシークエンスを確認したところ、ＮＳＰ１４におけるＧ２４８Ｖの変異が野生型のＧに復帰変異している一方、ＮＳＰ１４におけるＧ４１６Ｓ、Ａ５０４Ｖ及びＥｎｖｅｌｏｐｅにおけるＬ２８Ｐの変異は維持されていることが明らかとなった。このことから、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ変異が温度感受性に寄与する責任変異であることが示唆された。

（１－２－４）分離株の復帰変異の解析２
Ａ５０－１８株をｍｏｉ＝１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃、３８℃での増殖性を評価した。その結果、３７℃および３８℃での増殖性が回復しているサンプル（復帰変異株）を見出した。取得した復帰変異株を３７℃で３日培養した後のＣＰＥ像を図３Ｃに示す。得られた復帰変異株のシークエンスを確認したところ、以下＜１＞及び＜２＞の２種類の復帰パターンが見出された。
＜１＞ＮＳＰ１４におけるＧ２４８Ｖの変異が野生型のＧに復帰変異している一方でＧ４１６ＳやＡ５０４Ｖの変異は維持
＜２＞ＮＳＰ１４におけるＧ４１６Ｓの変異が野生型のＧに復帰変異している一方でＧ２４８ＶやＡ５０４Ｖの変異は維持

ＮＳＰ１４のＧ２４８ＶとＧ４１６Ｓのうち、少なくとも１つが復帰変異すると温度感受性を失ったことから、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ変異とＧ４１６Ｓ変異の組み合わせが温度感受性に寄与する責任変異であることが示唆された。

（１－２－５）野生型に変異を導入した組換えウイルスの解析
野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全ゲノムを有するＢＡＣ ＤＮＡに対し、Ａ５０－１８株由来のＮＳＰ１４、Ｓｐｉｋｅ、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、Ｅｎｖｅｌｏｐｅを相同組換えにより導入した。得られた組換えＢＡＣ ＤＮＡを２９３Ｔ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることでウイルスを再構築した。組換えウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃と３２℃でのＣＰＥを観察することで温度感受性を評価した。その結果を図３Ｄに示す。Ａ５０－１８株由来のＮＳＰ１４を導入することで、３７℃培養時にＣＰＥを示さない温度感受性株が得られたことから、ＮＳＰ１４が温度感受性に寄与する責任変異であることが明らかとなった。一方で、Ａ５０－１８株由来のＥｎｖｅｌｏｐｅを導入しても温度感受性にはならなかったことから、Ｅｎｖｅｌｏｐｅの変異は温度感受性に寄与していないと考えられる。

（１－２－６）野生型に変異を導入した組換えウイルスの解析２
ＣＰＥＲ法にて、ＮＳＰ１４の変異を導入したウイルスを再構築した。以下の各々のＮＳＰ１４の変異を有する、３種類の組換えウイルスを再構築した。
・Ｇ２４８Ｖのみ
・Ｇ４１６Ｓのみ
・Ｇ２４８Ｖ及びＧ４１６Ｓ（以下において、「二重変異株」とも記載する。）
それぞれの組換えウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃又は３２℃で３日間培養後のＣＰＥを観察した。図３Ｅより、Ｇ２４８Ｖのみ変異を有するウイルス、及びＧ４１６Ｓのみ変異を有するウイルスでは、３７℃及び３２℃にてＢ－１株と同様、ＣＰＥが観察されたため、温度感受性化されていないことがわかった。一方で、Ｇ２４８Ｖ及びＧ４１６Ｓの変異を有する二重変異株のウイルスでは、３２℃にてＣＰＥが観察されたが、３７℃ではＣＰＥがわずかに観察された程度で、３２℃と比べ明らかにＣＰＥが弱くなっていた。上記結果より、Ｇ２４８Ｖ及びＧ４１６Ｓの変異を有することで、３７℃でのウイルス増殖性が低下し、温度感受性化することが明らかとなった。これより、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ変異とＧ４１６Ｓ変異の組み合わせが、温度感受性に寄与する責任変異であることがわかった。

（１－２－６）サンガーシークエンスによる温度感受性株の解析
サンガーシークエンスを用いて、Ａ５０－１８株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで当該解析を行った。その結果、後述試験例２－２の（２－２－５）で認められたような欠失は見いだされなかった。

（１－２－７）温度感受性株の変異まとめ
温度感受性株Ａ５０－１８株では、下記表２に示す通り、表示の配列番号のアミノ酸配列においてチェックマークを付した変異が見出され、その中で、二重チェックマークを付した変異が責任変異として見出された。また、下記表２に示すとおり、ＮＳＰ１４の責任変異のみを有する二重変異株も温度感受性株であることを見出された。

［試験例１－３］温度感受性株Ａ５０－１８株の増殖性解析
（１－３－１）３２℃及び３７℃における解析
臨床分離株（Ｂ－１株）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）を、ＭＯＩ＝０．０１又は０．１の条件下で、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いて、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた（Ｎ＝３）。３７℃又は３２℃で培養させた後、０～５ｄｐｉにて、それぞれの培養上清を回収した。０～５ｄｐｉの培養上清ウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍＬにて、Ｖｅｒｏ細胞を用いて測定した。結果を図４Ａに示した。
図４Ａより、Ａ５０－１８株は３７℃における感染後３日目のウイルス力価が検出限界以下であり、３７℃での増殖性が著しく低下していることがわかった。

（１－３－２）３２℃、３４℃及び３７℃における解析
臨床分離株（Ｂ－１株）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）を、ＭＯＩ＝０．０１の条件下で、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いて、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた（Ｎ＝３）。３７℃、３４℃又は３２℃で培養させた後、０～５ｄｐｉにて、それぞれの培養上清を回収した。０～５ｄｐｉの培養上清ウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍＬにて、Ｖｅｒｏ細胞を用いて測定した。結果を図４Ｂに示した。
図４Ｂより、Ａ５０－１８株は３２℃、３４℃で臨床分離株と同程度に増殖する一方、３７℃での増殖性を著しく欠損していることがわかった。

［試験例１－４］温度感受性株Ａ５０－１８株の病原性解析
（１－４－１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの体重変動
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝４） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０⁴ ｏｒ １ｘ１０⁶ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与し、１０日間の体重変動を観察した。同用量のＤ－ＭＥＭ培地を経鼻投与した群を非感染コントロール （ＭＯＣＫ）とした。結果を図５に示した。Ａ５０－１８株を感染させた際に体重減少はみられず、病原性が著しく低いことが示唆された。

（１－４－２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺内又は鼻腔内のウイルス量
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝３） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０⁶ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。３日間の体重変動を観察した結果を図６に示した。３ ｄｐｉにてハムスターを安楽死させた後、鼻腔洗浄液をＤ－ＰＢＳ １ｍＬで回収した。また、ハムスターの肺を摘出し、右肺を破砕、Ｄ－ＭＥＭ １ ｍＬによる懸濁の後、遠心分離にて上清を肺破砕液として回収した。これらの鼻腔洗浄液及び肺破砕液中のウイルス量をＶｅｒｏ細胞にてプラークフォーメーションアッセイにて評価した結果を図７に示した。更に、摘出した左肺を１０％ホルマリンにて固定し、撮影したものを図８に示した。

図７より、鼻腔洗浄液ではＢ－１株とＡ５０－１８株でウイルス量に差がみられない一方、肺内ではＡ５０－１８株のウイルスが顕著に少ないことがわかった。また、図８より、Ｂ－１株が感染し、体重が減少しているハムスターは肺に膨潤や黒色変がみられる一方で、Ａ５０－１８株感染ハムスターは体重変動や肺に著変はみられないことがわかった。以上の結果より、温度感受性株は上気道で増殖する一方、下気道では増殖することができない弱毒株であると推定される。

（１－４－３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの組織学的解析
（１－４－２）にて実施したハムスターへの感染実験により得られたホルマリン固定肺から切片を作製し、ＨＥ染色することによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による肺の組織学的な病原性を解析した。その結果を図９に示した。

図９に示す通り、臨床分離株（Ｂ－１株）に感染したハムスターから得られた肺において、赤血球の浸潤や肺胞構造の崩壊が観察された。一方で、温度感受性株（Ａ５０－１８株）感染ハムスターの肺では、これらのような激しい病状は観察されなかった。このことからも、Ａ５０－１８株は感染時に肺にて激しい炎症を誘発せず、病原性が低いことが強く示唆された。

（１－４－４）免疫化学染色によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの組織学的解析
（１－４－３）にて観察された組織学的な病原性について、ウイルスの増殖と病原性の関連性を評価するため、免疫化学染色を行う事でウイルスタンパク質を検出した。４週齢雄性シリアンハムスター （Ｂ－１， Ａ５０－１８： ｎ＝５， ＭＯＣＫ： ｎ＝３） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０⁶ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。３ ｄｐｉにてハムスターを安楽死させた後、摘出した左肺を１０％ホルマリンにて固定し、連続切片を作製した。得られた連続切片についてＨＥ染色並びに免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＨＣ）染色ともいう）を実施した。免疫化学染色にはウサギ抗スパイクポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ： ４０５８９－Ｔ６２）を用いた。ＨＥ染色像及び免疫化学染色像を図１０に示す。（１－４－３）と同様にＢ－１株感染ハムスターでは赤血球の浸潤や肺胞構造の崩壊がみられ、免疫化学染色にて広範囲にスパイクタンパク質が検出された。一方で、Ａ５０－１８株感染ハムスターではこのような組織障害は見られず、スパイクタンパク質も局所的に限られた領域でのみ検出された。これらの結果からも、Ｂ－１株は肺組織中においてウイルスが顕著に増殖して組織障害性を示している一方で、Ａ５０－１８株は肺組織中で効率的にウイルスが増殖できず、肺組織障害性が低いことが明らかとなった。

［試験例１－５］温度感受性株Ａ５０－１８株の免疫原性解析
（１－５－１）温度感受性株感染ハムスターへの野生株攻撃試験
次の手順で、温度感受性株感染ハムスターへの野生株（臨床分離株）攻撃試験を行った。
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝４） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０⁴ ｏｒ １ｘ１０⁶ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。２１日後、再度臨床分離株（Ｂ－１株）（１ｘ１０⁶ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与し、１０日間の体重変動を観察した。この際に、同週齢の感染未経験ハムスター （ｎ＝３）をナイーブコントロールとして用いた。その結果を図１１に示した。

図１１に示す通り、ナイーブハムスターはＢ－１株の感染により、体重の減少が観察された一方で、Ｂ－１株又はＡ５０－１８株に１度感染したハムスターは体重が減少することがなかった。このことから、野生株であるＢ－１株だけでなく、病原性の低いＡ５０－１８株による感染においても、感染防御に寄与する免疫を誘導することが明らかとなった。

（１－５－２）温度感受性株感染ハムスターの中和抗体誘導解析
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝５） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０⁶ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。感染後の体重変動を図１２に示す。これまでの結果と同様に、Ｂ－１株の感染により体重が減少する一方、Ａ５０－１８株の感染では体重の減少は観察されなかった。

感染後２１日時点にて、全血を採取し、血清を分離したのち、５６℃で３０分間熱による血清の非働化を行った。１００ ＴＣＩＤ５０のＢ－１株と段階希釈した非働化血清を混和し、３７℃で１時間反応させた。反応後の培養液をＶｅｒｏ細胞に播種し、３７℃培養の後、ＣＰＥを観察することでウイルスの中和活性を評価した。ＣＰＥを生じない最高の希釈倍率を中和抗体価（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ）とした。結果を図１３に示す。非感染ハムスターの血清はＢ－１株に対する中和活性を示さない一方で、Ｂ－１株又はＡ５０－１８株感染ハムスター血清は中和抗体を誘導できていることが明らかとなった。

［試験例２］
［試験例２－１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株Ｈ５０－１１株，Ｌ５０－３３株，Ｌ５０－４０株の追加分離
更なる候補株の分離を目的とし、図１４の手法にて温度感受性株の分離を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床分離株（Ｂ－１株）をＶｅｒｏ細胞に感染させ、突然変異誘導剤５－ＦＵを添加した状態で、３２℃にて馴化させたＧ～Ｌ５０シリーズのウイルス集団を取得した。更に、各々のウイルス集団の継代を複数回行い、得られた２５３の株の中から、３２℃で増殖できる一方で、３７℃で増殖性が著しく低下しているウイルス株（Ｈ５０－１１株， Ｌ５０－３３株， Ｌ５０－４０株）を見出し、分離、選択した（図１５）。

［試験例２－２］次世代シーケンスによる温度感受性追加分離株Ｈ５０－１１株，Ｌ５０－３３株，Ｌ５０－４０株の解析
（２－２－１）追加分離株の変異解析法
次世代シークエンサーを用いて、以下のウイルス株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで、当該解析を行った。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして、武漢臨床分離株であるＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＮＣ０４５５１２）を用いた。
Ｈ５０－１１株： 温度感受性株
Ｌ５０－３３株： 温度感受性株
Ｌ５０－４０株： 温度感受性株

（２－２－２）温度感受性株変異解析結果
（２－２－１）にて、図１６Ａの解析結果を取得した。Ｈ５０－１１株の特徴的な点変異として、ＮＳＰ３のＶ４０４Ａ及びＤ１８３２Ｎ、ＮＳＰ１６のＶ６７Ｉ、並びにＳｐｉｋｅのＴ７３９Ｋが見出された。また、Ｌ５０－３３株の特徴的な点変異として、ＮＳＰ３のＬ４４５Ｆ、Ｋ１７９２Ｒが、Ｌ５０－４０株の特徴的な点変異として、ＮＳＰ３のＬ４４５Ｆ、Ｋ１７９２Ｒ、ＳｐｉｋｅのＬ５４Ｗが見出された。

（２－２－３）追加分離株の復帰変異株の解析（Ｈ５０－１１株）
Ｈ５０－１１株をｍｏｉ＝１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃、３８℃での増殖性を評価した。その結果、３７℃および３８℃での増殖性が回復しているサンプル（復帰変異株）を見出した。取得した復帰変異株を３８℃で３日培養した後のＣＰＥ像を図１６Ｂに示す。得られたサンプルのシークエンスを確認したところ、ＮＳＰ１６ Ｖ６７Ｉの変異が野生型のＶに復帰変異している一方、その他のアミノ酸変異は維持されていた。このことから、ＮＳＰ１６のＶ６７Ｉ変異が温度感受性に寄与する責任変異であることが示唆された。

（２－２－４）追加分離株の復帰変異株の解析（Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株）
Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株をＭＯＩ＝０．０１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３２℃、３４℃、３７℃での増殖性を評価した。その結果、Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株の中から、３７℃の増殖性が回復しているサンプル（以下、復帰変異株）を見出した。それぞれの株を３７℃で３日培養した後のＣＰＥ像を図１６Ｃに示す。Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株の復帰変異株を、それぞれ、Ｌ５０－３３株 Ｒｅｖ１、２及びＬ５０－４０株 Ｒｅｖ１、２と示す。得られたサンプルのシークエンスを確認したところ、ＮＳＰ３におけるＬ４４５Ｆの変異が野生型のＬ又はＣに変異している一方、ＮＳＰ３におけるＫ１７９２Ｒの変異は維持されていることが明らかとなった。このことから、ＮＳＰ３のＬ４４５Ｆ変異が温度感受性に寄与する責任変異である可能性が示唆された。

（２－２－５）サンガーシークエンスによる温度感受性株の解析
サンガーシークエンスを用いて、Ｈ５０－１１株、Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで当該解析を行った。

その結果、３株すべてに、図１７に示すような２７５４９～２８２５１位の塩基配列（配列番号７）の欠失が見出された。２７５４９～２８２５１位の塩基配列の欠失及びそれにコードされるアミノ酸配列の欠失の概要図を図１８に示す。また、図１８において、ＯＲＦ７ａは２７３９４～２７７５９位の塩基配列であり、ＯＲＦ７ｂは２７７５６～２７８８７位の塩基配列であり、ＯＲＦ８は２７８９４～２８２５９位の塩基配列である。

図１８に示す通り２７５４９～２８２５１位の塩基配列領域は、ＯＲＦ７ａの一部分（５３番目から末端のアミノ酸配列。以下同様）、ＯＲＦ７ｂ全体、及びＯＲＦ８の大部分のアミノ酸配列に該当する。本領域の欠失はフレームシフトを伴うため、ＯＲＦ７ａの１－５２番目のアミノ酸配列と、ＯＲＦ８の３’末端８塩基および遺伝子間領域とヌクレオカプシドの塩基配列がコードするアミノ酸配列が融合したタンパク質が産生されたと考えられた。また、ＯＲＦ７ｂは全体が欠失し、ＯＲＦ８の本来の配列も欠失した。

（２－２－６）温度感受性株の変異まとめ
温度感受性株Ｈ５０－１１株、Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株では、下記表３に示す通り、表示の配列番号のアミノ酸配列においてチェックマークを付した変異が見出され、その中で、二重チェックマークを付した変異が責任変異として見出された。

［試験例３］追加分離株Ｈ５０－１１株，Ｌ５０－３３株，Ｌ５０－４０株の増殖性解析
追加分離株を、ＭＯＩ＝０．０１の条件下でＶｅｒｏ細胞に感染させた（Ｎ＝３）。３７℃、３４℃又は３２℃で培養後、０～５ ｄ．ｐ．ｉ．において、それぞれの培養上清を回収した。これらの培養上清ウイルス力価をＴＣＩＤ₅₀／ｍＬにて、Ｖｅｒｏ細胞を用いて測定した。その結果を図１９に示す。これにより、得られた追加分離株は、３２℃、３４℃で増殖性を示す一方、３７℃では増殖性が低下した。

［試験例４］各温度感受性株の病原性解析
（４－１） 温度感受性株感染ハムスターの体重変動
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝５） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、Ｈ５０－１１株）（３ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与し、１０日間の体重変動を観察した。同用量のＤ－ＭＥＭ培地を経鼻投与した群を非感染コントロール（ＭＯＣＫ）とした。結果を図２０に示した。Ｂ－１株を感染させたハムスターでは７日間で２０％程度の体重低下が認められたのに対し、温度感受性株を感染させたハムスターではすべての群で顕著な体重低下はみられず、病原性が著しく低いことが示唆された。

（４－２） 温度感受性株感染ハムスターの肺内又は鼻腔内のウイルス量
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝５） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、Ｈ５０－１１株）（３ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。３ ｄｐｉにてハムスターを安楽死させた後、鼻腔洗浄液をＤ－ＰＢＳ １ｍＬで回収した。また、ハムスターの肺を摘出し、肺重量を測定したのち、右肺を破砕、Ｄ－ＭＥＭ １ ｍＬによる懸濁の後、遠心分離にて上清を肺破砕液として回収した。ハムスターの総体重あたりの肺重量を図２１に示した。またこれらの鼻腔洗浄液及び肺破砕液中のウイルス量をＶｅｒｏ細胞にてプラークフォーメーションアッセイにて評価した結果を図２２に示した。

ハムスターの総体重量あたりの肺重量を比較した結果、Ｂ－１株感染ハムスターは肺重量が増加しており、炎症などにより肺が膨潤していることが強く示唆された。一方で、温度感受性株感染ハムスターではこのような肺重量の増加は観察されなかった。また、鼻腔洗浄液中のウイルス量を比較した結果、Ｂ－１株感染ハムスターとＨ５０－１１株を除く温度感受性株感染ハムスターでは顕著な差がなく、Ｈ５０－１１株感染ハムスターは鼻腔洗浄液中のウイルス量が少なかった。更に、温度感受性株感染ハムスターはＢ－１株感染ハムスターより顕著に肺内ウイルス量が少ないことが明らかとなった。これらの結果から、各温度感受性株は試験例１におけるＡ５０－１８株と同様に下気道では増殖することができない弱毒株であることが推察された。

［試験例５］各温度感受性株の免疫原性解析
（５－１） 温度感受性株感染ハムスターへの野生株攻撃試験
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝５） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、Ｈ５０－１１株）（３ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。２１日後、再度臨床分離株（Ｂ－１株）（３ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与し、９日間の体重変動を観察した。この際に、同週齢の感染未経験ハムスター （ｎ＝５）をナイーブコントロールとして用いた。その結果を図２３に示した。ナイーブハムスターはＢ－１株の感染により、体重の減少が観察された一方で、Ｂ－１株および各温度感受性株に１度感染したハムスターの体重は減少しなかった。このことから、野生株であるＢ－１株だけでなく、病原性の低い各温度感受性株による感染においても、感染防御に寄与する免疫を誘導できることが明らかとなった。

（５－２） 温度感受性株感染ハムスターの中和抗体誘導解析
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝５） を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、Ｈ５０－１１株）（３ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。２０日後に部分採血を実施し、得られた血清を用いて臨床分離株（Ｂ－１株）に対する中和活性を測定した。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。測定結果を図２４に示す。Ｂ－１株の感染のみならず、各温度感受性株感染ハムスターでも中和活性を有する抗体が誘導されることが明らかとなった。

［試験例６］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株への有効性解析
（６－１） 温度感受性株感染ハムスター血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価
４週齢雄性シリアンハムスター（ｎ＝３又は５）を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株）（３ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。感染後３週間のハムスターから部分採血を実施し、得られた血清を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欧州型臨床分離株（Ｂ－１）およびブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）の生ウイルスに対する中和活性を測定した結果を図２５に示す。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。Ｂ－１株や温度感受性株に感染したハムスターはブラジル型変異株に対しても中和活性を示すことが明らかとなった。このことから、温度感受性株はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対しても有効である可能性が考えられた。

［試験例７］投与経路、投与量の比較検討実験
（７－１） 投与経路による免疫誘導能の比較
４週齢雄性シリアンハムスター（ｎ＝５）を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株）（３ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻、又は皮下投与した。未処置群をナイーブコントロール（ｎａｉｖｅ）とした。３週間後、ハムスターから部分採血により得られた血清を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）に対する中和活性を評価した。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。中和活性の結果を図２６に示した。ｉ．ｎは経鼻投与、Ｓ．Ｃは皮下投与を示す。Ｂ－１株やＡ５０－１８株の経鼻投与では生ウイルスに対して中和抗体を誘導できた。皮下投与については、試験した用量ではほとんど中和抗体を誘導できなかったが、経鼻投与での結果に鑑みると、用量を増やすと皮下投与でも中和抗体を誘導できると考えられた。

（７－２） 投与量による免疫誘導能の比較
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝５） を一週間飼育した後、温度感受性株（Ａ５０－１８株）を経鼻、又は皮下投与した。投与量を表４に示す。

感染後３週間のハムスターから部分採血を実施し、得られた血清を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）の生ウイルスに対する中和活性を測定した結果を図２７に示す。ｉ．ｎは経鼻投与、Ｓ．Ｃは皮下投与を示す。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。（７－１）と同様に、経鼻投与では１ｘ１０² ＴＣＩＤ５０／１０ μＬの低用量投与群でも中和抗体価の上昇が観察された。このことから、温度感受性株は少量の鼻腔投与でも十分な免疫を誘導できる可能性が示唆された。皮下投与については、試験した用量ではほとんど中和抗体を誘導できなかったが、経鼻投与での結果に鑑みると、用量を増やすと皮下投与でも中和抗体を誘導できると考えられた。

［試験例８］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株への有効性解析
４週齢雄性シリアンハムスター （ｎ＝４） を一週間飼育した後、１ｘ１０⁴ ＴＣＩＤ５０又は１ｘ１０² ＴＣＩＤ５０の温度感受性株（Ａ５０－１８株）を１０ μＬの用量で経鼻投与した。感染後３週間のハムスターから部分採血を実施し、得られた血清を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 欧州型野生株（Ｂ－１株）、インド型変異株（自家分離株）、ブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）の生ウイルスに対する中和活性を測定した結果を図２８に示す。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。Ａ５０－１８株を少量経鼻投与した個体でも、親株であり野生型であるＢ－１株のみならず、インド型変異株やブラジル型変異株に対する中和抗体を用量依存的に誘導できることが明らかとなった。

また、各個体の血清の各株に対する中和抗体価を比較した結果を図２９に示す。ブラジル型変異株に対しては一部の個体で中和抗体価の減少がみられるものの、すべての個体で中和抗体を保有していることが明らかとなった。これらの結果から温度感受性株の経鼻投与による免疫は交差防御を示す可能性が示唆された。

［試験例９］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株の不活化
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株であるＡ５０－１８株をＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ＝０．０１にて感染させ、３２℃，ＣＯ₂：５％条件下で３日間培養した。培養上清を遠心分離（１６００×ｇ，室温，１０分）した上清にβ－プロピオラクトンを０．０２５ｖ／ｖ％となるように添加し、４℃で２４時間静置することでウイルスを不活化した。その後、３７℃で２時間静置することにより、β－プロピオラクトンを加水分解した。得られた不活化ウイルス液を２０重量％ショ糖クッション超遠心分離（１７５０００×ｇ，４℃，２時間）により濃縮した後、１５重量％～６０重量％ショ糖溶液による密度勾配遠心により分画、精製した。得られた抗原タンパク質１．５μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ展開した後、ＣＢＢ染色した結果、ならびに抗原タンパク質０．５μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ展開及びウェスタンブロッティング（ＷＢ）した後に抗Ｓｐｉｋｅ（ＲＢＤ）抗体（Ｓｉｎｏ４０５９２－Ｔ６２）及び抗Ｍｅｍｂｒａｎｅ抗体（ＮＢ１００－５６５６９）を用いて各種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質を検出した結果を図３０に示す。ＣＢＢ染色にて観察されているメインバンドは分子量からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質の１つであるヌクレオカプシドであると思われる。また、ＷＢの結果、本精製抗原は中和抗体の標的となるスパイクタンパク質及びウイルスの構造タンパク質であるメンブレンタンパク質を含んでいることが明らかとなった。

［試験例１０］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株の不活化抗原の中和活性
雄性シリアンハムスター４週齢を１週間飼育したのち、試験例９の方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ－１株およびＡ５０－１８株から作製した不活化抗原（全粒子）を１μｇ（Ｌｏｗ）又は３μｇ（Ｈｉｇｈ）用い、抗原と水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌｕｍ）とが１：５の比率（重量比率）となるように混合し、筋肉内投与した。その後、２週間後に再度同用量にて免疫した。２回目の免疫の後、ハムスターから部分採血を実施し、免疫血清を獲得した。免疫血清を５６℃で１時間反応させることで非働化したのち、段階希釈した血清を１００ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ－１株と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。血清とウイルスの混合物をＶｅｒｏ細胞に播種し、３７℃、ＣＯ₂５％で一週間培養した際のＣＰＥ像を観察することで血清の生ウイルスに対する中和活性を評価した。ＣＰＥが見られない血清の最大希釈倍率を中和抗体価とした結果を図３１に示す。また、部分採血の後、同ハムスターに１ｘ１０⁵ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を経鼻感染させ、体重変動を観察した。その結果を図３２に示す。

図３１の結果から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 温度感受性株Ａ５０－１８株から作製した不活化抗原が、親株である臨床分離株Ｂ－１株から作製した不活化抗原と同程度の中和抗体を誘導することが示唆された。また、図３２の結果から、免疫群はネガティブコントロールであるアルミニウムアジュバントのみの接種群と比較して、Ｂ－１株の経鼻感染時に体重低下が緩やかであることが明らかとなった。これらの結果から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 温度感受性株Ａ５０－１８株は、不活化抗原を作成する際の元株として、臨床分離株（野生株）とそん色ない効果を示す可能性が示唆された。また、本発明で見出された温度感受性株の変異や温度感受性の責任変異は、免疫原となるスパイクタンパク質のＳ１ドメインやＲＢＤにはないため、Ａ５０－１８株以外の温度感受性株の不活化抗原であっても、Ａ５０－１８株と同等の免疫原性を示すと合理的に推認される。

［試験例１１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株（ｒＴｓ－ａｌｌ株）の不活化
（１１－１）ｒＴｓ－ａｌｌ株の作出
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株であるｒＴｓ－ａｌｌ株をＣＰＥＲ反応によって作出した。
ＣＰＥＲを用いたリバースジェネティクス法により、複数の温度感受性変異と欠失を有する株を構築した （Ｔｏｒｉｉ ｅｔ ａｌ． ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔ ２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ－１株のゲノムを断片化し、プラスミドにクローニングした。ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを用いて、クローニングされたフラグメントに目的の変異を導入した。野生型のフラグメントをクローニングしたプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型ゲノム断片フラグメントを獲得した。また、変異が導入されたプラスミド、又は目的の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲを行うことでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型ゲノム断片フラグメントを得た。

得られた断片フラグメント及びＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒを含むリンカーフラグメントを混合し、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＣＰＥＲを行う事で、複数の断片を環状化した。反応液をＢＨＫ／ｈＡＣＥ２細胞にトランスフェクションし、３２℃で培養を行うことで目的のｒＴｓ－ａｌｌ株を再構築した。ｒＴｓ－ａｌｌ株には、表５に示す通り、（ｂ’）の変異、（ｅ’）及び（ｆ’）の変異の組み合わせ、（ｈ’）の変異、及び２７５４９～２８２５１位の塩基配列（配列番号７）の欠失が導入された。

（１１－２）ｒＴｓ－ａｌｌ株の不活化
ｒＴｓ－ａｌｌ株をＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ＝０．１にて感染させ、３２℃， ５％ ＣＯ₂条件下で３日間培養した。培養上清を遠心分離（１６３０×ｇ， ＲＴ， １０ ｍｉｎ）した上清にβ－プロピオラクトンを０．０２５ ｖ／ｖ％となるように添加し、４℃で２４時間静置することでウイルスを不活化した。その後、３７℃で２時間撹拌することにより、β－プロピオラクトンを分解した。得られた不活化ウイルス液を２０％ショ糖クッション超遠心分離（１７００００×ｇ， ４℃， ２ｈ）により濃縮した後、１５％～６０％ショ糖溶液による密度勾配遠心（１５００００×ｇ， ４℃， ２ｈ）により分画した。得られた遠心画分のうち、不活化ウイルス粒子を含む画分を３０ ｍＬ ＰＢＳに懸濁し、超遠心分離（１５００００×ｇ， ４℃， ２ｈ）により目的タンパク質を沈降した。ペレットを８００ μＬ ＰＢＳにて懸濁し、不活化抗原タンパク質とした。
得られた抗原タンパク質１．９ μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ展開した後にＣＢＢ染色した結果、およびウエスタンブロッティングした後に抗Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， ＮＢ１００－５６５７６）を用いて検出した結果を図３３示す。ＣＢＢ染色ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各種構造タンパク質が検出された。ウエスタンブロッティングでも、粒子中にＮｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄが含まれることを確認した。

本試験例では、不活化処理をβ－プロピオラクトンを用いて行ったが、他の不活化方法であっても、上記と同様の結果が類推できる。

［試験例１２］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株（ｒＴｓ－ａｌｌ株）の中和活性
５週齢の雄性シリアンハムスター（ｎ＝５）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＴｓ－ａｌｌ株から作製した不活化抗原３ μｇと水酸化アルミニウムアジュバント１５ μｇの混合物、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，４０５８９－Ｖ０８Ｈ８）１０ μｇと水酸化アルミニウムアジュバント５０ μｇの混合物を筋肉内投与した。陽性対照群として、５週齢の雄性シリアンハムスター（ｎ＝５）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒＴｓ－ａｌｌ株（ＴＣＩＤ５０）を１００ μＬの用量で経鼻投与した。初回免疫から３週間後、不活化抗原免疫群およびＳｐｉｋｅタンパク質免疫群には、同用量の抗原を追加免疫した。
追加免疫の２週間後、ハムスターから部分採血を実施し、免疫血清を取得した。この免疫血清を５６℃で３０分間反応させることで、非働化した。中和抗体価の測定のため、段階希釈した血清を１００ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ－１株と混合し、３７℃で１時間、インキュベートした。血清ウイルス混合液をＶｅｒｏ細胞に播種し、３７℃，５％ ＣＯ₂で６日間培養した際のＣＰＥ像を観察することで、血清の生ウイルスに対する中和活性を評価した。ＣＰＥが見られない血清の最大希釈倍率を中和抗体価とした結果を図３４に示した。
また、追加免疫から２週間後に、同ハムスターに３×１０⁵ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ－１株を経鼻感染させ、体重変動を観察した。その結果を図３５に示した。

図３４より、ｒＴｓ－ａｌｌ株の不活化抗原の２回免疫は、生ウイルス（ｒＴｓ－ａｌｌ株）の１回感染と同程度の中和抗体を誘導した。加えて、Ｓｐｉｋｅタンパク質免疫と比較しても同程度の中和抗体価を誘導した。
さらに、図３５より、免疫したハムスターにＢ－１株を感染させると、ネガティブコントロールであるナイーブ群が体重を低下したのに対して、不活化抗原免疫群は生ウイルス（ｒＴｓ－ａｌｌ）感染群、Ｓｐｉｋｅタンパク質免疫群と同定度の推移で体重を維持した。これらの結果から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 温度感受性株ｒＴｓ－ａｌｌ株は、不活化抗原を作成する際の元株として、有用であると考えられる。また、温度感受性株の不活化抗原は、Ｓｐｉｋｅタンパク質と同等の効果を示し、有用なワクチン抗原になると類推できる。

Claims (11)

1. 以下の（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異を有する構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含むベータコロナウイルス温度感受性株の不活化抗原：
   （ａ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｃ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｄ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｉ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｊ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｋ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｌ）エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、及び
   （ｍ）ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンに相当するアミノ酸残基の変異。
2. 前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１に記載のウイルス温度感受性株の不活化抗原。
3. 前記（ａ）の変異がアラニンへの置換であり、前記（ｂ）の変異がフェニルアラニンへの置換であり、前記（ｃ）の変異がアルギニンへの置換であり、前記（ｄ）の変異がアスパラギンへの置換であり、前記（ｅ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｆ）の変異がセリンへの置換であり、前記（ｇ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｈ）の変異がイソロイシンへの置換であり、前記（ｉ）の変異がトリプトファンへの置換であり、及び／又は、前記（ｊ）の変異がリシンへの置換であり、前記（ｋ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｌ）の変異がプロリンへの置換であり、及び／又は、前記（ｍ）の変異がフェニルアラニンへの置換である、請求項１に記載の不活化抗原。
4. 前記ベータコロナウイルス温度感受性株が、前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）の変異と前記（ｆ）の変異との組み合わせ、並びに／若しくは前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質を含む、請求項１に記載の不活化抗原。
5. 前記ベータコロナウイルス温度感受性株が、前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）の変異と前記（ｆ）の変異との組み合わせ、並びに／若しくは前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質を含む、請求項３に記載の不活化抗原。
6. 請求項１、２又は５に記載の不活化抗原を含む、不活化ワクチン。
7. 請求項３に記載の不活化抗原を含む、不活化ワクチン。
8. 請求項４に記載の不活化抗原を含む、不活化ワクチン。
9. 以下の（ａ）～（ｍ）の少なくともいずれかの変異を有する構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質を含むベータコロナウイルス温度感受性株を不活化する工程を含む、不活化抗原の製造方法：
   （ａ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｃ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｄ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｉ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｊ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｋ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
   （ｌ）エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、及び
   （ｍ）ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンに相当するアミノ酸残基の変異。
10. 前記不活化する工程を、物理的処理又は化学的処理によって行う、請求項９に記載の製造方法。
11. 前記化学的処理を、β－プロピオラクトンを用いて行う、請求項１０に記載の製造方法。

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