WO2023080246A1 - ベータコロナウイルス弱毒株 - Google Patents

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WO2023080246A1
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mutations
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志郎 竹河
博貴 蝦名
真弥 岡村
秋穂 柏原
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一般財団法人阪大微生物病研究会
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    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to attenuated strains of betacoronavirus.
  • the infectious disease (COVID-19) caused by the new coronavirus (SARS-CoV-2) has caused a pandemic and is still a social problem.
  • genetic vaccines such as adenovirus vector vaccines and mRNA vaccines have been approved, starting with Sputnik V, an adenovirus vector vaccine approved in Russia (Non-Patent Document 1), and vaccination is now available worldwide. is underway.
  • genetic vaccines are next-generation vaccines that differ from conventional vaccines, and side effects such as fever and thrombosis have been reported. Therefore, it is considered important to continue to develop new vaccines.
  • the purpose of the present invention is to provide a strain useful as a new betacoronavirus vaccine.
  • the present inventors have found that a novel betacoronavirus having, as predetermined mutations related to attenuation, a combination of a predetermined substitution mutation related to temperature sensitivity and a predetermined deletion mutation related to growth reduction or other attenuation.
  • a novel betacoronavirus having, as predetermined mutations related to attenuation, a combination of a predetermined substitution mutation related to temperature sensitivity and a predetermined deletion mutation related to growth reduction or other attenuation.
  • it was found to be useful as a betacoronavirus vaccine strain with excellent attenuation.
  • the present invention is an invention completed by further studies based on this finding. That is, the present invention provides inventions in the following aspects.
  • Section 1 a nonstructural protein having the following mutations (b), a combination of mutations (e) and (f), and/or mutations (h); Structural proteins, accessory proteins and/or non-structural proteins having the following mutations (n), (o) and/or (r); Attenuated strains of betacoronavirus, including: (b) mutation of the amino acid residue corresponding to leucine at position 445 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in NSP3; (e) mutation of the amino acid residue corresponding to glycine at position 248 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in NSP14; (f) mutation of the amino acid residue corresponding to glycine at position 416 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in NSP14; (h) mutation of the amino acid residue corresponding to valine at position 67 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in NSP16; (n) a loss-of-function mutation of ORF8; (O) deletion
  • the attenuated virus strain of claim 1 wherein 4 mutations or combinations of mutations are selected among the species mutations or combinations of mutations.
  • Item 3. 1 to 2 mutations or a combination of mutations selected from the three types of mutations or combinations of mutations of the mutation (b), the combination of mutations (e) and (f), and the mutation (h) Item 3.
  • the attenuated virus strain according to any one of Items 1 to 3, wherein the structural protein further comprises the following (p) and/or (q) mutations: (p) mutations in the spike, including deletions of amino acid sequences corresponding to positions 679 to 680 and positions 685 to 686 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; (q) Mutation of the amino acid residue corresponding to valine at position 687 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the spike. Item 5. Item 5.
  • the virus-attenuated strain according to item 4 comprising a combination of the mutations (e) and (f) and the following mutation (g): (g) Mutation of an amino acid residue corresponding to alanine at position 504 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in NSP14.
  • Item 6. Item 6.
  • the mutation (b) is a substitution to phenylalanine
  • the mutation (e) is a substitution to valine
  • the mutation (f) is a substitution to serine
  • the mutation (h) is isoleucine 7.
  • Item 9. The virus-attenuated strain of any of paragraphs 1-8, wherein the betacoronavirus is the SARS-CoV-2 virus.
  • Item 10 is a substitution to phenylalanine
  • the mutation (e) is a substitution to valine
  • the mutation (f) is a substitution to serine
  • the mutation (h) is isoleucine 7.
  • a live attenuated vaccine comprising the virus attenuated strain according to any one of Items 1 to 9.
  • Item 11. The live attenuated vaccine of Item 10, which is administered intranasally.
  • Item 12. The live attenuated vaccine of Item 10, administered intramuscularly, subcutaneously or intradermally.
  • strains useful as new betacoronavirus vaccines are provided.
  • FIG. 2 shows confirmation results (CPE images) of temperature sensitivity of SARS-CoV-2. Mutation analysis results for each virus strain are shown. CPE images of a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) with the possibility of reversion are shown. CPE images of a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) with the possibility of reversion are shown. Fig. 2 shows the results of confirming the temperature sensitivity of a recombinant virus into which a mutation was introduced in a temperature sensitive strain (A50-18 [reference example]). Fig.
  • FIG. 2 shows the results of confirming the temperature sensitivity of a recombinant virus into which a mutation was introduced in a temperature sensitive strain (A50-18 [reference example]).
  • the results of proliferative analysis of a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) are shown.
  • the results of proliferative analysis of a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) are shown.
  • Fig. 2 shows body weight fluctuations of hamsters infected with a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]).
  • Fig. 2 shows body weight fluctuations of hamsters infected with a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]).
  • Figure 2 shows the viral load in lung or nasal washes of hamsters infected with a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]).
  • Lung images of a hamster infected with a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) are shown.
  • the results of lung histological analysis of hamsters infected with a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) are shown.
  • FIG. 1 shows lung histological analysis (HE staining and IHC staining) of temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) infected hamsters.
  • Fig. 2 shows weight fluctuations of hamsters reinfected with a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]).
  • FIG. 2 shows body weight changes of hamsters after infection with a temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]). Temperature-sensitive strain (A50-18 [reference example]) Neutralizing antibody titer of recovered hamster serum after infection is shown. SARS-CoV-2 temperature sensitization method (G-L50 series [Example]) is shown.
  • FIG. 2 shows confirmation results (CPE images) of temperature sensitivity of SARS-CoV-2 (G to L50 series [Examples]). Mutation analysis results of additional isolates (H50-11, L50-33, L50-40 [Example]) are shown. CPE images of a temperature-sensitive strain (H50-11 [Example]) with potential for reversion are shown.
  • FIG. 17 shows a schematic diagram of the deletion of the nucleotide sequence shown in FIG. 17 and the deletion of the amino acid sequence encoded by it.
  • the growth analysis results of temperature-sensitive strains (H50-11, L50-33, L50-40 [Example]) are shown.
  • Temperature-sensitive strains (A50-18 [reference example], and H50-11, L50-33, L50-40 [example]) show body weight changes of infected hamsters.
  • Lung weights of hamsters infected with temperature sensitive strains are shown.
  • Figure 2 shows viral loads in lung or nasal washes of hamsters infected with temperature-sensitive strains (A50-18 [reference example] and H50-11, L50-33, L50-40 [example]).
  • Temperature-sensitive strains show weight changes of re-infected hamsters.
  • Temperature-sensitive strains show neutralizing antibody titers of post-infection hamster sera.
  • Fig. 2 shows the evaluation of the neutralizing activity of a temperature-sensitive strain (A50-18 strain [reference example]) against SARS-CoV-2 mutants.
  • 1 shows a comparison of the ability of a temperature-sensitive strain (A50-18 strain [reference example]) to induce immunity depending on the route of administration.
  • a comparison of the dose-dependent immune induction of the temperature-sensitive strain is shown.
  • FIG. 2 shows the evaluation of the neutralizing activity of a temperature-sensitive strain (A50-18 strain [reference example]) against SARS-CoV-2 mutants.
  • Fig. 2 shows the evaluation of the neutralizing activity of a temperature-sensitive strain (A50-18 strain [reference example]) against SARS-CoV-2 mutants.
  • Vaccine candidate strains 1 to 7 Shown are CPE images during recovery culture after production. Temperature sensitivity evaluation of vaccine candidate strains 1-7 [Example] is shown. Temperature sensitivity evaluation of the rTs-all strain [Example] is shown. The ability of vaccine candidate strains 1, 3, 4, 6, and 7 [Examples] to induce neutralizing antibodies when administered at low titers and low doses is shown.
  • the results of the infection protection test after immunization with low titer and low dose administration of vaccine candidate strain 7 [Example] are shown. It shows the ability of vaccine candidate strains 2 and 5 [Example] to induce neutralizing antibodies when administered at a high titer and a high dose.
  • the growth evaluation of vaccine candidate strain 2 [Example] at each temperature is shown.
  • Fig. 2 shows results of persistence test of humoral immunity induced by administration of vaccine candidate strain 2 [Example].
  • FIG. 2 shows the results of an infection prevention test (body weight change of infected hamsters) by administration of vaccine candidate strain 2 [Example].
  • FIG. 10 shows the results of examining the restoration of virulence (presence or absence of CPE) during in vivo passage of vaccine candidate strain 2 [Example].
  • FIG. 10 shows the results of examining the reversion to virulence of vaccine candidate strain 2 [Example] during in vivo passage (sequence of viral RNA extracted from each nasal wash).
  • Fig. 10 shows the results (body weight change) of examination of reversion to virulence during in vivo passage of vaccine candidate strain 2 [Example].
  • Fig. 2 shows tissue damage evaluation (nasal cavity level 1) by vaccine candidate strain 2 [Example].
  • Fig. 2 shows tissue damage evaluation (nasal cavity level 2) by vaccine candidate strain 2 [Example].
  • FIG. 2 shows tissue damage evaluation (nasal cavity level 3) by vaccine candidate strain 2 [Example].
  • Fig. 2 shows tissue damage evaluation (lung) by vaccine candidate strain 2 [Example].
  • Fig. 2 shows neutralizing antibody titers induced by administration of vaccine candidate strain 2 [Example].
  • FIG. 2 shows the results of an infection prevention test (body weight change of infected hamsters) by administration of vaccine candidate strain 2 [Example].
  • Fig. 2 shows neutralizing antibody titers induced by administration of vaccine candidate strain 2 [Example].
  • Attenuated Betacoronavirus Strains comprise, as predetermined mutations for attenuation, nonstructural proteins having predetermined substitution mutations for temperature sensitivity, and predetermined deletion mutations for growth-reducing or other attenuation.
  • a betacoronavirus comprising in combination a structural protein, ancillary protein and/or a non-structural protein having
  • a given substitution mutation for temperature sensitivity is also referred to as a "temperature-sensitive mutation”
  • a given deletion mutation for growth-reducing is also referred to as a "proliferation-reducing mutation”
  • a given deletion other than a growth-reducing mutation Mutations are also described as "other attenuating mutations”.
  • Attenuation refers to the property of attenuating host pathogenicity of a virus.
  • temperature sensitivity refers to the characteristic of having limited proliferation at human body temperature (so-called lower respiratory tract temperature) and specific proliferation at low temperatures (typically lower than human upper respiratory tract temperature).
  • proliferation-reducing property refers to the property of restricted proliferation and the property of which is not temperature-specific.
  • the attenuated betacoronavirus strain of the present invention not only exhibits efficacy as a vaccine by having the above-described predetermined mutations related to attenuation, but also has a combination of substitution mutations and deletion mutations that are difficult to revert. Therefore, the possibility of reversal of toxicity is extremely low. In this respect, the usefulness is remarkably increased when the application to humans is assumed.
  • coronaviruses are spherical with a diameter of about 100 to 200 nm, and have projections on the surface. Coronaviruses are virologically classified into the order Nidoviridae, the subfamily Coronavirinae, and the family Coronaviridae.
  • nucleocapsid protein
  • Nucleocapsid nucleocapsid
  • spike protein protein
  • envelope protein envelope protein
  • membrane protein membrane protein
  • Coronaviruses are classified into alpha, beta, gamma, and delta groups based on their genetic characteristics. As coronaviruses that infect humans, there are four types of human coronavirus 229E, OC43, NL63, and HKU-1 as viruses that cause colds, and severe acute respiratory syndrome (SARS) that occurred in 2002 causing severe pneumonia. ) coronaviruses and the 2012 Middle East Respiratory Syndrome (MERS) coronavirus.
  • the Alphacoronavirus genus includes human coronaviruses 229E and NL63
  • the Betacoronavirus genus includes human coronaviruses OC43, HKU-1, SARS and MERS coronaviruses.
  • SARS-CoV-2 which is classified as a SARS coronavirus, has been isolated and identified as the causative virus of the new coronavirus infection that occurred in Wuhan in 2019.
  • SARS-CoV-2 has repeatedly mutated from the early Wuhan strain, and mutant strains such as the strain detected in the UK, the strain detected in South Africa, and the strain detected in India have been found. Mutants that have not yet been detected and new mutant strains may occur in the future.
  • viruses included in the genus Betacoronavirus are not limited to the strains of SARS-CoV-2 described above, and all other betacoronaviruses (e.g., other SARS-CoVs that will be newly detected in the future).
  • Mutation (b), a combination of mutation (e) and mutation (f), and/or mutation (h), indicated as "temperature-sensitive mutation” in Table 1, are substitution mutations and are betacoronaviruses of the invention. It is a responsible mutation that contributes to conferring temperature sensitivity, which is essential for attenuated strains. That is, in the present invention, the temperature-sensitive mutation includes three types of "mutation (b)", "a combination of mutation (e) and mutation (f)", and “mutation (h)”.
  • Typical attenuated betacoronavirus strains of the invention have one or two of these three temperature sensitive mutations.
  • Mutation (n), Mutation (O) and/or Mutation (r), indicated as “proliferation-reducing mutation” and “other attenuating mutation” in Table 1 are deletion mutations and are beta-coronaviruses of the present invention. It is thought to contribute to conferment of growth-reducing property and other attenuation, which is essential for virus-attenuated strains (in particular, mutation (r) is thought to contribute to conferring growth-reducing property), and is excellent in combination with temperature-sensitive mutations. It is a mutation that expresses attenuated toxicity.
  • Mutations (a), (c), (d), (g), (i) to (m), (p), and (q), indicated as "other mutations” in Table 1, are the beta Mutations that attenuated strains of coronavirus may optionally contain, and attenuated betacoronavirus strains of the invention may or may not contain at least one of the other mutations.
  • the essential attenuating mutation of the betacoronavirus of the present invention is a temperature-sensitive mutation, the following mutation (b), a combination of mutations (e) and (f), and / or (h) and mutations of (n), (o) and/or (r) below, which are growth-reducing or other attenuating mutations.
  • the above temperature-sensitive mutations that is, the combination of (b) mutations, (e) and (f) mutations, (h) 1 to 2 mutations or combinations of mutations are selected from among the 3 mutations or combinations of mutations of the above.
  • the (O) mutation and the (r) mutation are mentioned.
  • mutations related to attenuation that is, mutation (b), (e) and Combination of mutations of (f), mutations of (h), mutations of (n), mutations of (O), and mutations of (r)), 4 types of mutations or mutations A combination is selected.
  • the attenuated betacoronavirus strain of the present invention has the following (a), (c), (d), (g), (i) to (m), At least one of (p) and (q) may be mutated.
  • the betacoronavirus-attenuated strain of the present invention has other mutations, it preferably has the mutation (g) among the above other mutations from the viewpoint of enhancing temperature sensitivity.
  • the mutation (g) is used in combination with the mutations (e) and (f) from the viewpoint of enhancing temperature sensitivity. preferably.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of NSP3 in SARS-CoV-2 of NC_045512 (NCBI);
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of NSP14 in SARS-CoV-2 of NC_045512 (NCBI);
  • NC_045512 (NCBI) is the amino acid sequence of NSP16 in SARS-CoV-2.
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the spike in SARS-CoV-2 of NC_045512 (NCBI);
  • SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of the envelope in SARS-CoV-2 of NC_045512 (NCBI);
  • 6 is the amino acid sequence of the nucleocapsid in SARS-CoV-2 from NC_045512 (NCBI).
  • SEQ ID NO: 7 is a nucleotide sequence spanning part of the open reading frame of SARS-CoV-2 of NC_045512 (NCBI), specifically part of ORF7a, all of ORF7b, and most of ORF8; SEQ ID NO:8 is the amino acid sequence of NSP1 in SARS-CoV-2 from NC_045512 (NCBI).
  • Corresponding amino acid residues are SEQ ID NOs: 1-4 (or 1-6), 8 or the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, the amino acid residue present at the above-mentioned predetermined position, and the attenuated beta-coronavirus strain of the present invention is a beta-coronavirus other than the above mutant strain
  • the amino acid sequence encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 4 (or 1 to 6) refers to an amino acid residue present at a position corresponding to the above-mentioned predetermined position.
  • the corresponding position is the amino acid sequence encoded by the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 4 (or 1 to 6) or 8 of SARS-CoV-2 of NC_045512 (NCBI) or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 It can be identified by aligning the amino acid sequences of the protein having and other betacoronavirus proteins corresponding to the protein.
  • the virus-attenuated strain of the present invention is an amino acid residue corresponding to the predetermined position in the amino acid sequence encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 4 (or 1 to 6), 8 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, or the amino acid
  • the sequence is mutated, it is not limited to the specific SARS-CoV-2 variants listed in NC_045512 (NCBI), but other betacoronavirus variants [i.e., any other and variants of viruses other than SARS-CoV-2 included in the genus Betacoronavirus].
  • the specific SARS-CoV-2 mutant listed in NC_045512 is the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 4 (or 1 to 6), 8 in the specific SARS-CoV-2 or SEQ ID NO: A mutant strain in which at least one of the amino acid residues or the amino acid sequence at the predetermined position in the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in 7 is mutated, and other beta coronavirus mutant strains are any other SARS - Mutant strain of CoV-2 [that is, any other SARS-CoV-2 above SEQ ID NOS: 1 to 4 (or 1 to 6), the amino acid sequence of 8 or the amino acid encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 A mutant strain in which the amino acid residue or amino acid sequence corresponding to the predetermined position in the sequence is mutated] and a mutant strain of a virus other than SARS-CoV-2 included in the betacoronavirus genus [that is, in the betacoronavirus genus Cor
  • Betacoronavirus any other variants of SARS-CoV-2 and variants of viruses other than SARS-CoV-2 included in the genus Betacoronavirus include SARS-CoV-2 or a betacoronavirus other than SARS-CoV-2 Recombinant virus mutants in which the spike protein is replaced with at least one spike protein of other SARS-CoV-2 and betacoronaviruses other than SARS-CoV-2 (including viruses that will be newly detected in the future) is also included.
  • “Not significantly affecting the properties of the polypeptide” means a state in which the functions of each nonstructural protein, structural protein, and accessory protein are maintained.
  • Permissible differences may be one type of difference (e.g., substitution) selected from among substitutions, additions, insertions, and deletions, or two or more types of difference (e.g., substitutions and insertions). may contain. Any other SARS-CoV-2 amino acid sequence corresponding to SEQ ID NOS: 1 to 4 (or 1 to 6), 8 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NOS: 1 to 4 (or 1 to 6) , 8 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the sequence identity calculated by comparing only the arbitrary different sites may be 50% or more.
  • sequence identity is preferably 60% or more or 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more or 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, or 98% or more, more preferably 99% or more, particularly preferably 99.3% or more, 99.5% or more, 99.7% or more, 99.9% The above are mentioned.
  • sequence identity preferably includes 60% or more.
  • sequence identity means BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI)] bl2seq program (Tatiana A. Tats Usova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol.Lett., Vol.174, p247-250, 1999).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • betacoronavirus attenuated strains of the present invention are more specifically as follows: An attenuated strain of betacoronavirus comprising nonstructural, accessory and structural proteins consisting of at least one of the following polypeptides (I), (II) and (III): (I) at least one of the following (I-1) to (I-3) polypeptides and at least one of the following (1-4) to (I-6) polypeptides: (I-1) A polypeptide (NSP3) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a substitution mutation (b') of leucine at position 445 as a temperature-sensitive mutation; (I-2) A polypeptide consisting of an amino acid sequence having a substitution mutation (e') at position 248 glycine and a substitution mutation (f') at position 416 glycine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as temperature-sensitive mutations ( NSP14), (I-3) A polypeptide (NSP16) consisting of
  • the above (I-1) and (I-) contains other mutations in addition to temperature-sensitive mutations and growth-reducing or other attenuating mutations, as shown below, the above (I-1) and (I- The following ( It may be a polypeptide of I-1a) and (I-2a) and (I-5a), and the polypeptide of (I) above further has other mutations below (I-7a), ( It may also include polypeptides (structural proteins) of I-8a).
  • An attenuated strain of betacoronavirus comprising structural, accessory and nonstructural proteins consisting of at least one of the following polypeptides (I), (II) and (III): (I) At least one of the following (I-1a), (I-2a), and (I-3) and the following (I-4), (I-5a), and (I-6) polypeptides At least one, or in addition to at least one of the following (I-7a) and (I-8a): (I-1a) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, leucine mutation (b') at position 445 as a temperature-sensitive mutation, and valine mutation (a') at position 404 and lysine at position 1792 as other mutations A polypeptide (NSP3) consisting of an amino acid sequence having at least one of a mutation (c′) at position 1832 and a mutation (d′) at position 1832 aspartic acid; (I-2a) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a mutation (e')
  • polypeptide a polypeptide (spike) consisting of an amino acid sequence having at least one of a sequence deletion mutation (p') and a mutation (q') at position 687 valine;
  • a polypeptide (NSP1) consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having deletion mutations (r') at positions 32 to 39 as growth-reducing mutations
  • I-7a a polypeptide (envelope) consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and having a mutation (l') of leucine at position 28 as another mutation
  • I-8a A polypeptide (nucleocapsid) consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having a mutation (m') at position 2 serine as another mutation;
  • II) In the amino acid sequence of the polypeptide of (I), one other than the amino acid sequence related to the temperature-sensitive mutation, the growth-reducing or other attenuating mutation, or the amino acid residue or amino acid sequence related to other mutations
  • the above (a') to (r') mutations are specifically the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6, the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 7, and SEQ ID NOS: 8. Refers to mutations when present in an amino acid sequence. That is, the polypeptide of (I) above includes the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6 of SARS-CoV-2 of NC_045512 (NCBI), the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 A polypeptide consisting of an amino acid sequence has been introduced with temperature-sensitive mutations, growth-reducing or other attenuating mutations, or other mutations in addition thereto.
  • polypeptides of (II) and (III) above include the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6 possessed by other betacoronaviruses, the amino acid sequences encoded by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence corresponding to a sequence has been introduced with temperature-sensitive mutations and growth-reducing or other attenuating mutations, or other mutations in addition thereto.
  • the preferred ranges of sequence identity for the polypeptides (II) and (III) above are as described above.
  • Betacoronavirus can acquire temperature sensitivity by having the above temperature-sensitive mutation, and can acquire excellent attenuation by having the above-mentioned growth-reducing and other attenuating mutations together with the above temperature-sensitive mutation.
  • the attenuated virus strain of the present invention has at least a reduced ability to grow at human lower respiratory tract temperatures than it does at temperatures below human lower respiratory tract temperatures, preferably at human lower respiratory tract temperatures. No proliferative capacity.
  • the virus-attenuated strain of the present invention has reduced ability to grow at human lower respiratory tract temperatures compared to the ability to grow at human lower respiratory tract temperatures in the absence of the temperature sensitive mutation.
  • a representative example of the human lower respiratory tract temperature is about 37°C, specifically a temperature higher than the upper respiratory tract temperature described below, preferably 36 to 38°C, more preferably 36.5 to 37.5°C or 37°C. ⁇ 38°C.
  • the attenuated strains of the virus of the invention may have the ability to grow at temperatures below the human lower respiratory tract temperature.
  • temperatures below the human lower respiratory tract temperature may include, for example, the human upper respiratory tract temperature (eg, about 32° C. to 35.5° C.).
  • the above temperature-sensitive mutation does not exist on the receptor-binding domain of the spike protein present on the virus surface, which is important when the virus infects cells. Therefore, it is rational that not only the specific SARS-CoV-2 listed in NC_045512 (NCBI) but also other betacoronaviruses can be made temperature sensitive by introducing the above temperature-sensitive mutations. reasonably expected. In other words, even if a mutation that changes the immunogenicity of the virus occurs due to a worldwide epidemic of an infectious disease, by further introducing the above temperature-sensitive mutation into the mutant virus, It is reasonably expected that temperature sensitivity can be imparted by
  • the above mutation (b) may be a substitution with an amino acid residue other than leucine
  • the above mutation (e) may be a substitution with an amino acid residue other than glycine
  • the mutation (f) may be substitution with an amino acid residue other than glycine
  • the mutation (h) above may be substitution with an amino acid residue other than valine.
  • the above mutation (a) may be substitution with an amino acid residue other than valine
  • the above mutation (c) may be substitution with an amino acid residue other than lysine
  • the above (d ) mutation may be a substitution to an amino acid residue other than aspartic acid
  • the mutation in (g) may be a substitution to an amino acid residue other than alanine
  • the mutation in (i) is a substitution other than leucine It may be a substitution to an amino acid residue
  • the above mutation (j) may be a substitution to an amino acid residue other than threonine
  • the above mutation (k) may be a substitution to an amino acid residue other than alanine.
  • the above mutation (l) may be a substitution with an amino acid residue other than leucine
  • the above mutation (m) may be a substitution with an amino acid residue other than serine
  • the above (q) A mutation may be a substitution to an amino acid residue other than valine.
  • the temperature-sensitive mutation is a substitution of phenylalanine for the mutation (b), a substitution for valine for the mutation (e), and a substitution for valine for the mutation (f). It is a substitution to serine and/or the mutation in (h) is a substitution to isoleucine.
  • the other mutation is that the mutation in (a) is a substitution to alanine, the mutation in (c) is a substitution to arginine, and the (d ) is a substitution of asparagine, the mutation of (g) is a substitution of valine, the mutation of (i) is a substitution of tryptophan, and the mutation of (j) is a substitution of lysine wherein the mutation in (k) is a substitution to valine, the mutation in (l) is a substitution to proline, the mutation in (m) is a substitution to phenylalanine, and/or the Mutation of (q) is a substitution to isoleucine.
  • the substitution may be a so-called conservative substitution.
  • Conservative substitution refers to substitution with an amino acid similar in structure and / or properties. For example, as an example of conservative substitution, if the amino acid before substitution is a nonpolar amino acid, it is substituted with another nonpolar amino acid. , if the amino acid before substitution is a non-charged amino acid, it is substituted with another non-charged amino acid, if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, it is substituted with another acidic amino acid, and if the amino acid before substitution is a basic amino acid, it is substituted with another non-charged amino acid is substituted with a basic amino acid.
  • non-polar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan
  • non-charged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, Tyrosine, asparagine, and glutamine
  • acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid
  • basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • a more preferred example of the virus-attenuated strain of the present invention is a mutant strain of SARS-CoV-2 listed in NC_045512 (NCBI), wherein the mutation (b) (that is, the mutation (b')) is , NSP3, a substitution of phenylalanine for leucine at position 445 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (L445F); 2 substitution of glycine with valine at position 248 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (G248V), and the mutation of (f) (that is, mutation of (f')) is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in NSP14 substitution of glycine to serine at position 416 (G416S); and/or the mutation of (h) (that is, mutation of (h')) is the 67th amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in NSP16 valine to isoleucine substitution (V67I).
  • NCBI NC_045512
  • the mutation (a) (that is, the mutation (a')) is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in NSP3 at position 404 A substitution of valine with alanine (V404A);
  • the mutation of (c) (that is, the mutation of (c′)) is a substitution of arginine for lysine at position 1792 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in NSP3.
  • the mutation (d) (that is, the mutation (d')) is a substitution of asparagine for aspartic acid at position 1832 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in NSP3 (D1832N)
  • the mutation of (g) (that is, the mutation of (g')) is a substitution of alanine to valine at position 504 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in NSP14 (A504V);
  • the mutation (that is, (i') mutation is substitution of tryptophan for leucine at position 54 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the spike (L54W);
  • the above (j) mutation (that is, (j' ) mutation) is a substitution of lysine for threonine at position 739 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the spike (T739K); Substitution of alanine to valine (A879V) at position 879 of the amino acid sequence shown in SEQ ID
  • virus-attenuated strains of the invention include the following strains. - As temperature-sensitive mutations, the mutation (e) (preferably the mutation (e') and / or G248V) and the mutation (f) (preferably the mutation (f') and / or G416S), and (h) mutation (preferably (h') mutation and / or V67I); and growth-reducing or other attenuating mutation, the (n) mutation (preferably (n') mutation), the ( A strain having the mutation of o) and the mutation of (r); Mutation, and a strain having the mutation (q) (preferably the mutation (q') and / or V687I)-as a temperature-sensitive mutation, the mutation (e) (preferably the mutation (e') and / or G248V) and the mutation of (f) (preferably the mutation of (f′) and/or G416S); ), a strain having the mutation (O), and the mutation (r); A strain having the mutation (p) and the mutation (q
  • virus-attenuated strains of the invention include the following strains.
  • the mutation (e) preferably the mutation (e') and/or G248V) and the mutation (f) (preferably the mutation (f') and/or G416S); Strains having the (n) mutation (preferably (n') mutation, the (O) mutation, and the (r) mutation as sexual and other attenuating mutations; and further other mutations , the mutation (g) (preferably the mutation (g') and / or A504V), the mutation (p), and the mutation (q) (preferably the mutation (q') and / or V687I) stocks with
  • the attenuated beta coronavirus strain described in "1. Attenuated beta coronavirus strain” has a temperature-sensitive mutation, so it is effective only at temperatures lower than the human lower respiratory tract temperature. Therefore, it cannot grow efficiently at least in the deep part of the body, especially in the lower respiratory tract including the lung, which causes serious damage, and it can be expected that the pathogenicity will be remarkably reduced.
  • the attenuated betacoronavirus strain has growth-reducing and other attenuating mutations that limit its growth regardless of temperature. have By adopting such a complex form, the attenuated betacoronavirus strain will have growth-reducing or other Since deletion mutations, which are attenuating mutations, are resistant to reversion, it is expected that attenuation can be maintained.
  • the attenuated strain of the virus can be used as a live attenuated vaccine by infecting a living body with the attenuated virus itself. Accordingly, the present invention also provides a vaccine comprising the attenuated strain of betacoronavirus as an active ingredient.
  • the details of the active ingredient are as described in "1. Attenuated Betacoronavirus".
  • Attenuated Betacoronavirus Strains certain mutations contribute to conferring attenuation. Accordingly, the present invention also provides a betacoronavirus gene vaccine comprising, as active ingredients, genes encoding nonstructural proteins, accessory proteins, and structural proteins having the predetermined mutations described above. The details of the predetermined mutation contained in the active ingredient are as described in "1. Attenuated betacoronavirus strain”.
  • the vaccine of the present invention not only targets the early Wuhan strain of the SARS-CoV-2 virus, but also the variants detected in the UK in September 2020 and in South Africa in October 2020, and others.
  • the vaccine of the present invention targets betacoronavirus.
  • the vaccine of the present invention may contain adjuvants, buffers, tonicity agents, soothing agents, preservatives, antioxidants, corrigents, Other ingredients such as light absorbing pigments, stabilizers, carbohydrates, casein digests, various vitamins, and the like can be included.
  • Adjuvants include, for example, animal oils (squalene, etc.) or their hardened oils; vegetable oils (palm oil, castor oil, etc.) or their hardened oils; mannitol/oleic anhydride, liquid paraffin, polybutene, caprylic acid, oleic acid, Oily adjuvants containing higher fatty acid esters; PCPP, saponin, manganese gluconate, calcium gluconate, manganese glycerophosphate, soluble aluminum acetate, aluminum salicylate, acrylic acid copolymer, methacrylic acid copolymer, maleic anhydride copolymer, alkenyl derivative polymer, water water-soluble adjuvants such as oil emulsions, cationic lipids containing quaternary ammonium salts; aluminum salts such as aluminum hydroxide (alum), aluminum phosphate, aluminum sulfate or combinations thereof, precipitating adjuvants such as sodium hydroxide; Microorganism-
  • buffers include buffers such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • tonicity agents include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • soothing agents include benzyl alcohol and the like.
  • antiseptics include thimerosal, paraoxybenzoic acid esters, phenoxyethanol, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid, antibiotics, synthetic antibacterial agents, and the like.
  • antioxidants include sulfites, ascorbic acid, and the like.
  • Examples of light-absorbing pigments include riboflavin, adenine, and adenosine.
  • stabilizers include chelating agents, reducing agents, and the like.
  • Examples of carbohydrates include sorbitol, lactose, mannitol, starch, sucrose, glucose, dextran, and the like.
  • the vaccine of the present invention may contain one or more other vaccines against viruses or bacteria that cause diseases other than betacoronavirus infections, such as COVID-19. That is, the vaccine of the present invention may be prepared as a combination vaccine containing other vaccines.
  • Dosage form The dosage form of the vaccine of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined based on the administration method, storage conditions, and the like.
  • Specific examples of dosage forms include liquid formulations and solid formulations, and more specifically oral administration formulations such as tablets, capsules, powders, granules, pills, liquid formulations, and syrups; freeze-dried formulations.
  • parenteral administration agents such as dry formulations such as injections, sprays, patches (specifically, intramuscular administration agents, intradermal administration agents, subcutaneous administration agents, nasal administration agents, transdermal administration agents, etc.) is mentioned.
  • the administration method of the vaccine of the present invention is not particularly limited, and may be any of injection administration such as intramuscular, intraperitoneal, intradermal and subcutaneous administration, inhalation administration from nasal and oral cavities, and oral administration. , preferably intramuscular, intradermal and subcutaneous injection administration (intramuscular administration, intradermal administration and subcutaneous administration), inhalation administration through the nasal cavity (nasal administration), and absorption administration through the skin (transdermal administration). , and more preferably nasal administration.
  • the subject to which the vaccine of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a subject that can cause various symptoms due to betacoronavirus infection (preferably a subject that can cause COVID-19 symptoms due to SARS-CoV-2 virus infection).
  • mammals more specifically, humans; pet animals such as dogs and cats; laboratory animals such as rats, mice and hamsters.
  • dose of the vaccine of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of active ingredient, administration method, and administration subject (age, body weight, sex, presence or absence of underlying disease, etc.).
  • the dose per human of the vaccine of the present invention is 1 ⁇ 10 PFU/body or more, preferably 1 ⁇ 10 2 PFU/body or more, more preferably 2 ⁇ 10 2 PFU/body or more, more preferably 1 x10 3 PFU/body or more, more preferably 2 x 10 3 PFU/body or more.
  • the dose of the vaccine of the present invention per human is 6 ⁇ 10 11 PFU/body or less, preferably 1 ⁇ 10 11 PFU/body or less, more preferably 6 ⁇ 10 10 PFU/body or less, and further Preferably, it is 1 ⁇ 10 10 PFU/body or less.
  • the dose of the vaccine of the present invention to humans per dose is 1 ⁇ 10 TCID50/body or more, preferably 1 ⁇ 10 2 TCID50/body or more, more preferably 2 ⁇ 10 2 TCID50/body or more, more preferably 1 ⁇ 10 TCID50/body or more. ⁇ 10 3 TCID50/body or more, more preferably 2 ⁇ 10 3 TCID50/body or more.
  • the dose per human of the vaccine of the present invention is 6 ⁇ 10 11 TCID50/body or less, preferably 1 ⁇ 10 11 TCID50/body or less, more preferably 6 ⁇ 10 10 TCID50/body or less, and further Preferably 1*10 ⁇ 10> TCID50/body or less is also mentioned.
  • the method for producing an attenuated betacoronavirus strain of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on the amino acid sequence information described above.
  • CPER using an artificial chromosome such as a bacterial artificial chromosome (BAC) or a yeast artificial chromosome (YAC), or a betacoronavirus genome fragment
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • the genome of the attenuated betacoronavirus strain (parent strain) that does not have any temperature-sensitive mutations, growth-reducing mutations, or other attenuating mutations is cloned.
  • the parent strain used at this time may be a betacoronavirus, specifically, the specific SARS-CoV-2 listed in NC_045512 (NCBI) above, any other SARS-CoV above -2, and viruses other than SARS-CoV-2 within the genus Betacoronavirus.
  • the full-length DNA of the viral genome is cloned into BAC DNA or YAC DNA, etc., and a transcription promoter sequence for eukaryotic cells is inserted upstream of the viral sequence.
  • Promoter sequences include CMV promoter and CAG promoter.
  • a ribozyme sequence as well as a poly A sequence are inserted downstream of the viral sequence. Ribozyme sequences include hepatitis D virus ribozymes and hammerhead ribozymes. Examples of poly A sequences include the poly A of simian 40 virus.
  • the full-length DNA of the viral genome is divided into multiple fragments and cloned.
  • methods for obtaining fragments include artificial synthesis of nucleic acids, PCR using the above-mentioned artificial chromosomes or plasmids cloned with fragments as templates, and the like.
  • double crossover and ⁇ / Homologous recombination methods such as RED recombination, overlap PCR method, CRISPR/Cas9 method, and other known point mutation introduction methods can be used.
  • the host cells are transfected with artificial chromosomes introduced with temperature-sensitive mutations, growth-reducing or other attenuating mutations, and other mutations as necessary to reconstruct the recombinant virus.
  • fragments introduced with temperature-sensitive mutations, growth-reducing or other attenuating mutations, and, if necessary, other mutations are ligated by a reaction using DNA polymerase, and then transferred to host cells.
  • Recombinant viruses are reconstituted by transfection.
  • the transfection method is also not particularly limited, and known methods can be used.
  • the host is not particularly limited, and known cells can be used.
  • the reconstructed recombinant virus is added to the cultured cells, and the recombinant virus is subcultured.
  • the cultured cells used at that time are not particularly limited, but for example, Vero cells, VeroE6 cells, Vero cells supplemented with TMPRESS2 expression, VeroE6 cells supplemented with TMPRESS2 expression, Calu-3 cells, supplemented with ACE2 expression. 293T cells, BHK cells, 104C1 cells, mouse neuroblastoma-derived NA cells, Vero cells and the like.
  • Viruses can be recovered by known methods such as centrifugation and membrane filtration. Furthermore, by adding the recovered virus to the cultured cells, it becomes possible to mass-produce the recombinant virus.
  • Test Example 1 SARS-CoV-2 temperature-sensitive strain A50-18 strain (reference example)]
  • Test Example 1-1 Isolation of SARS-CoV-2 temperature-sensitive strain A50-18 strain Based on the method of Figure 1, SARS-CoV-2 clinical isolate (B-1 strain [comparative example]) (LC603286 , In this example, B-1 strain, wild strain (clinical isolate), European wild strain (B-1 strain), B-1 strain (D614G type: pre-alpha European strain)), 2 A to F50 series and A to F500 series conditioned at 32 ° C. by adding mutagens 5-fluorouracil (hereinafter, 5-FU) and 5-azacytidine (hereinafter, 5-AZA) A virus population was obtained.
  • 5-FU mutagens 5-fluorouracil
  • 5-AZA 5-azacytidine
  • each virus population was passaged multiple times, and among the 406 candidate strains obtained, a virus strain that can grow at 32°C but has significantly reduced growth at 37°C (strain A50-18 ., sometimes referred to as Ts strain below.) was found, isolated, and selected (Fig. 2).
  • Revertive mutation refers to a return to the same phenotype as the original virus before mutation due to further mutation in the mutated virus.
  • reverse mutation refers to loss of temperature-sensitive properties due to further mutation in a temperature-sensitive strain. Further mutation includes reverting the amino acid at the mutation site that was entered when the temperature was sensitized to the amino acid before the mutation.
  • a sample (hereinafter referred to as "revertant strain") in which the proliferation of the strain was recovered was found.
  • revertant strain among the mutations of the temperature-sensitive strain (A50-18 strain) that has acquired temperature sensitivity, some amino acid residues are reverted to the amino acid before mutation (hereinafter simply referred to as "revertant mutation”). It is thought that the temperature sensitivity decreased and the growth at 37°C was restored. A CPE image showing this is shown in FIG. 3B.
  • FIG. 3C shows a CPE image after the obtained revertant strain was cultured at 37° C. for 3 days.
  • G248V mutation in NSP14 is reverted to wild-type G, while G416S and A504V mutations are maintained ⁇ 2> G416S mutation in NSP14 is reverted to wild-type G, while G248V and A504V mutation maintained
  • Test Example 1-3 Proliferative analysis of temperature-sensitive strain A50-18 strain (1-3-1) Analysis at 32 ° C. and 37 ° C.
  • FIG. 6 shows the results of observing body weight fluctuations for three days. After euthanizing the hamsters at 3 dpi, nasal washes were collected with 1 mL of D-PBS. In addition, the hamster lung was removed, the right lung was crushed, suspended in 1 mL of D-MEM, and then centrifuged to recover the supernatant as a lung lysate.
  • FIG. 7 shows the results of evaluation of the amount of virus in these nasal washes and lung lysates by plaque formation assay using Vero cells. Further, the excised left lung was fixed with 10% formalin and photographed, as shown in FIG.
  • FIG. 10 shows the HE-stained image and the immunochemically-stained image.
  • IHC immunohistochemistry
  • each virus population was passaged multiple times, and among the 253 strains obtained, a virus strain that could grow at 32°C but had significantly reduced growth at 37°C (strain H50-11 , L50-33 strain, L50-40 strain) were found, isolated and selected (Fig. 15).
  • FIG. 16B shows a CPE image after the obtained revertant strain was cultured at 38° C. for 3 days.
  • FIG. 16C shows CPE images after culturing each strain at 37° C. for 3 days.
  • the revertants of strain L50-33 and strain L50-40 are designated as strain L50-33 Rev1,2 and strain L50-40 Rev1,2, respectively.
  • FIG. 18 shows a schematic diagram of the deletion of the nucleotide sequence at positions 27549-28251 and the deletion of the amino acid sequence encoded by it.
  • ORF7a is the base sequence of positions 27394-27759
  • ORF7b is the base sequence of positions 27756-27887
  • ORF8 is the base sequence of positions 27894-28259.
  • the base sequence region from positions 27549 to 28251 corresponds to a portion of ORF7a (amino acid sequence from 53rd position to the end; the same applies hereinafter), the entire ORF7b, and most of the amino acid sequence of ORF8. Since the deletion of this region is accompanied by a frameshift, a protein is produced in which the 1-52nd amino acid sequence of ORF7a is fused with the amino acid sequence encoded by the 8 bases at the 3' end of ORF8, the intergenic region, and the base sequence of the nucleocapsid. was thought to have been In addition, ORF7b was deleted in its entirety, and the original sequence of ORF8 was also deleted in its entirety.
  • FIG. 21 shows the lung weight per total body weight of hamsters.
  • the viral load in these nasal lavages and lung lysates was evaluated by plaque formation assay using Vero cells, and the results are shown in FIG.
  • n nasal administration
  • C indicates subcutaneous administration.
  • Nasal administration of B-1 and A50-18 strains induced neutralizing antibodies against the live virus.
  • Subcutaneous administration could hardly induce neutralizing antibodies at the tested doses, but considering the results of intranasal administration, it was thought that subcutaneous administration could also induce neutralizing antibodies at higher doses.
  • Partial blood collection was performed from hamsters 3 weeks after infection, and the obtained serum was used to neutralize the live virus of SARS-CoV-2 Brazilian mutant strain (hCoV-19/Japan/TY7-503/2021 strain). is shown in FIG. i. n is nasal administration; C indicates subcutaneous administration. The same method as in (1-5-2) was used to measure the neutralizing activity. Similar to (7-1), an increase in neutralizing antibody titer was observed in the intranasal administration group even in the low-dose administration group of 1 ⁇ 10 2 TCID50/10 ⁇ L. This suggests the possibility that the temperature-sensitive strain can induce sufficient immunity even with a small amount of intranasal administration. Subcutaneous administration could hardly induce neutralizing antibodies at the tested doses, but considering the results of intranasal administration, it was thought that subcutaneous administration could also induce neutralizing antibodies at higher doses.
  • FIG. 29 shows the results of comparing the neutralizing antibody titers against each strain in the sera of each individual. Although some individuals showed a decrease in neutralizing antibody titers against the Brazilian mutant strain, all individuals possessed neutralizing antibodies.
  • Temperature-sensitive mutations and growth-reducing and other attenuating mutations, as well as other mutations, are checked in Table 5 [that is, L445F of NSP3, G248V and G416S of NSP14, and V67I of NSP16; 8 amino acid deletion of spike furin clearance site (FCS) deletion (specifically spike 679-686 deletion and V687I), functional deletion of ORF8; found in temperature sensitive strains any of the other mutations (NSP3 K1792R and NSP14 A504V)] were used.
  • a strain was constructed that has the above-mentioned temperature-sensitive mutation and growth-reducing and other attenuating mutations in combination with other mutations (Torii et al. cell report 2020).
  • the genome of SARS-CoV-2 strain B-1 was fragmented and cloned into a plasmid.
  • the desired mutation was introduced into the cloned fragment using inverse PCR.
  • a SARS-CoV-2 wild-type genome fragment was obtained by PCR using the plasmid cloned with the wild-type fragment as a template.
  • a SARS-CoV-2 mutant genome fragment was obtained by performing PCR or RT-PCR using the mutated plasmid or the genome of the SARS-CoV-2 mutant strain having the desired mutation as a template. .
  • FIG. 30 shows temperature-sensitive strain mutations and/or growth-reducing or other attenuating mutations introduced into each candidate strain, as well as CPE images. Observation of CPE in VeroE6/TMPRSS II cells revealed that the virus was reconstituted.
  • Test Example 10 Evaluation of temperature sensitivity of candidate strains (Example) (10-1) Temperature sensitivity of candidate strains 1 to 7 In order to evaluate the temperature sensitivity of candidate strains 1 to 7 obtained in Test Example 9 (Example), 2 ⁇ L of the supernatant of the recovery culture of each candidate strain was Vero. Cells were infected and the proliferative properties at 34°C and 37°C were compared. A CPE image after 3 days of culture is shown in FIG. 31A. All strains showed CPE at 34°C, whereas candidate strains 1, 2, 3, 6, 7 did not show CPE at 37°C.
  • Candidate strains 4 and 5 produced slight CPE, but to a lesser extent than 34°C. This confirmed that the vaccine candidate strain exhibited temperature sensitivity.
  • the rTs-all strain was slightly delayed in growth at 32 ° C. compared to the rB-1 strain, so the level of temperature sensitivity was preferable (that is, the growth at 32 ° C. was rB-1 strain). From this result, in order to control the level of temperature sensitivity to a preferred degree, three types of temperature-sensitive mutations (that is, mutation (b), a combination of mutations (e) and (f), and mutation (h)) (mutation or combination of mutations), it was found that it is more preferable to select one or two types than to select three types.
  • Test Example 11 Immunogenicity evaluation of candidate strains 1, 3, 4, 6, and 7 at low titer and low dose (neutralizing antibody titer induction) (Example)
  • 100 TCID50 of each candidate strain was applied to five 5-week-old male hamsters. was administered intranasally at 10 ⁇ L.
  • SARS-CoV-2 temperature-sensitive strain A50-18 was intranasally administered at the same titer and dose.
  • the neutralizing activity against SARS-CoV-2 B-1 strain of the serum obtained by partial blood sampling after 3 weeks was evaluated.
  • Neutralizing activity is determined by mixing serially diluted serum and 100 TCID50 of SARS-CoV-2, reacting for 1 hour, adding to Vero cells, and observing CPE after 4 days of culture to determine the presence or absence of infectious virus. evaluated by the method.
  • the neutralizing antibody titer was defined as the maximum serum dilution rate at which CPE was not observed and virus infectivity could be neutralized. The results are shown in FIG.
  • candidate strains 4 and 6 were constructed by combining temperature-sensitive mutations and other attenuating mutations to ensure safety.
  • candidate strain 7 was constructed by combining temperature-sensitive mutations and growth-reducing or other attenuating mutations, despite the fact that the growth in the body was significantly reduced. It maintained excellent immunogenicity.
  • candidate strain 2 seroconversion of neutralizing antibodies was observed in 4 out of 5 individuals by administration of 1 ⁇ 10 3 TCID50, and seroconversion of neutralizing antibodies was observed in all individuals when 1 ⁇ 10 4 TCID50 was administered. observed.
  • candidate strain 2 seroconversion of neutralizing antibodies was observed in 4 out of 5 individuals by administration of 1 ⁇ 10 3 TCID50, and seroconversion of neutralizing antibodies was observed in all individuals when 1 ⁇ 10 4 TCID50 was administered. observed.
  • Candidate Strain 5 only 1 out of 5 mice was confirmed to have serum neutralizing activity when 1 ⁇ 10 3 TCID50 was administered, but neutralization activity was observed in 3 out of 5 mice when 1 ⁇ 10 4 TCID50 was administered. Induction of antibody was observed.
  • candidate strain 2 proliferated at 32°C to the same extent as the clinical isolate (B-1 strain [Comparative example]), but its growth at 37°C was significantly reduced.
  • candidate strain 2 increased the serum neutralizing antibody titer to 6-12.
  • 4 weeks after the first administration no increase in neutralizing antibody titer was observed when the second administration was performed, suggesting that a single administration induces sufficient humoral immunity. was done.
  • the serum neutralizing antibody thus obtained did not significantly decrease even 4 months after administration.
  • candidate strain 2 induces sufficient humoral immunity in a hamster model with a single administration of 1 ⁇ 10 3 TCID50, and that humoral immunity persists for at least 4 months after administration.
  • antigen-specific production of IFN- ⁇ was induced by stimulating spleen cells of candidate strain 2-infected hamsters with the spike antigen peptide. From these results, it was revealed that administration of candidate strain 2 induces antigen-specific Th1 cells, and that candidate strain 2 also induces cell-mediated immunity.
  • Test Example 16 Infection protection test by administration of candidate strain 2 (Example) In Test Example 13, 1 ⁇ 10 3 , 1 ⁇ 10 4 TCID50 candidate strain 2, or 1 ⁇ 10 3 TCID50 SARS-CoV-2 temperature-sensitive strain A50-18 was intranasally administered to 20 ⁇ L of hamsters for the first time. A challenge test was performed by intranasal administration of the SARS-CoV-2 strain B-1 (3 ⁇ 10 5 TCID50) at a dose of 100 ⁇ L under anesthesia conditions 3 weeks after . The body weight of the hamsters after the challenge test was measured up to 6 days after administration. The results are shown in FIG.
  • Fig. 38 shows the presence or absence of CPE in Vero cells inoculated with nasal washings after each passage;
  • FIG. 40 shows the results of hamster body weight changes during passage.
  • the A50-18 strain is a temperature-sensitive strain, it does not cause CPE when cultured at 37 ° C. or 39 ° C. after infecting Vero cells, but from FIG. CPE was observed to occur when nasal washes were added to Vero cells and cultured at 37°C and 39°C.
  • FIG. 39 as a result of confirming the sequence of the viral RNA contained in the nasal wash after in vivo passage, among the mutations of NSP14 that cause temperature sensitivity, the G416S and G248V mutations are lost. It became clear. Furthermore, from FIG.
  • the attenuated betacoronavirus strain of the present invention is a combination of a predetermined temperature-sensitive mutation (substitution mutation) and a predetermined growth-reducing or other attenuating mutation (deletion mutation). Even when the virus is inoculated to humans as a live vaccine, it can be speculated that the usefulness as a vaccine has remarkably improved in that the possibility of transmission of the virus that has returned to virulence is low.
  • SARS-CoV-2 strain B-1 (1 ⁇ 10 5 TCID50) was intranasally administered at a dose of 100 ⁇ L under anesthesia.
  • the virus fluid reached the upper respiratory tract of the hamster, and by nasal administration of 100 ⁇ L, the virus fluid reached the lower respiratory tract of the hamster.
  • the head and lungs were fixed with formalin after euthanasia, and tissue toxicity was evaluated by HE staining, and Rabbit anti-spike RBD antibody (Sinobiological (40592-T62)) was used. Viral antigens were detected by IHC staining.
  • Table 6 shows the scores for lesions in the nasal cavities and lungs of each individual and the detection of viral antigens by IHC.
  • Level 1 indicates the tip of the nasal cavity
  • Level 2 indicates the middle part of the nasal cavity
  • Level 3 indicates the deep part of the nasal cavity.
  • Representative examples of each site of each virus-infected hamster are shown in FIG. 41 for Level 1, FIG. 42 for Level 2, FIG. 43 for Level 3, and FIG. 44 for lungs.
  • candidate strain 2 (Example) and temperature-sensitive strain A50-18 strain (Reference example) cause viral proliferation and accompanying tissue damage at the tip of the nasal cavity close to the outside temperature, while the nasal cavity close to body temperature Virus multiplication and accompanying tissue damage are suppressed in deep areas and lungs, candidate strain 2 (Example) has a higher inhibitory effect on viral multiplication and accompanying tissue damage, and olfactory impairment is observed. It was strongly suggested that the risk of occurrence was low.
  • a challenge test was conducted by intranasally administering TY41-702 strain (3 ⁇ 10 5 PFU) at a dose of 100 ⁇ L under anesthesia to candidate strain 2-administered hamsters and naive hamsters. carried out. Body weight was measured over time and infectious virus was quantified in lung and nasal washes after euthanasia of the hamsters at 4 days after the challenge test was performed.
  • FIG. 46 shows the weight fluctuation at that time.
  • Test Example 20 Evaluation of immunogenicity by candidate strain 2 (Evaluation of neutralizing activity by heterozygous strain) It was evaluated whether immunity induced with candidate strain 2 was effective against SARS-CoV-2 delta and gamma variants.
  • the neutralizing activity of the candidate strain 2 immune serum obtained in Test Example 13 against gamma and delta variants was measured. 100 TCID50 of BK325 strain (delta variant) or TY7-501 strain (gamma variant) was mixed with serially diluted inactivated serum and allowed to react at 37° C. for 1 hour. The culture medium after the reaction was inoculated on Vero cells, and after culturing at 37° C., CPE was observed to evaluate the virus neutralizing activity.
  • the lowest dilution rate that does not cause CPE was defined as the neutralizing antibody titer.
  • the results are shown in FIG. 47 together with the evaluation of neutralizing activity against the wild strain in Test Example 13. In FIG. 47, Low indicates the result of nasal administration of 20 ⁇ L of the candidate strain of 1 ⁇ 10 3 TCID50, and High indicates the result of nasal administration of 20 ⁇ L of the candidate strain of 1 ⁇ 10 4 TCID50.
  • Fig. 47 shows that the immunity induced by candidate strain 2 exhibited neutralizing activity against gamma and delta variants and was effective. These results suggested that the immunity induced by administration of candidate strain 2 was also effective against heterozygous strain variants.

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Abstract

本発明は、新たなベータコロナウイルスワクチンとして有用な株を提供することを目的とする。温度感受性に関する所定の置換変異と、弱毒化に関する所定の欠失変異とを組み合わせで有する新規のベータコロナウイルスが、弱毒性に優れたベータコロナウイルスのワクチン株として有用であることを見出した。

Description

ベータコロナウイルス弱毒株
　本発明は、ベータコロナウイルス弱毒株に関する。
　新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）はパンデミックを引き起こし、今なお社会的な問題となっている。本感染症に対するワクチンとしては、ロシアで承認されたアデノウイルスベクターワクチンであるスプートニクＶ（非特許文献１）を皮切りとして、アデノウイルスベクターワクチン及びｍＲＮＡワクチンといった遺伝子ワクチンが承認され、世界中で接種が進められている。
THE LANCET, VOLUME 396, ISSUE 10255, P887-897, SEPTEMBER 26,2020
　しかしながら、遺伝子ワクチンは従来型のワクチンとは異なる次世代型のワクチンであり、発熱及び血栓症等の副反応が報告されている。このため、引き続き新たなワクチン開発は重要だと考えられる。
　そこで本発明は、新たなベータコロナウイルスワクチンとして有用な株を提供することを目的とする。
　本発明者らは鋭意検討の結果、弱毒性に関する所定の変異として、温度感受性に関する所定の置換変異と、増殖低減性その他の弱毒性に関する所定の欠失変異とを組み合わせて有する新規のベータコロナウイルスが、弱毒性に優れたベータコロナウイルスのワクチン株として有用であることを見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成された発明である。すなわち、本発明は以下に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　以下の（ｂ）の変異、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、並びに／若しくは（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
　以下の（ｎ）、（о）及び／又は（ｒ）の変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び／又は非構造タンパク質と、
を含む、ベータコロナウイルス弱毒株：
（ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｎ）ＯＲＦ８の機能欠失変異、
（о）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８１位～第６８４位に相当するアミノ酸配列の欠失、
（ｒ）ＮＳＰ１における、配列番号８に示すアミノ酸配列の第３２位～第３９位に相当するアミノ酸配列の欠失。
項２．　前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異、前記（ｎ）の変異、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異の６種の変異又は変異の組み合わせのうち、４種の変異又は変異の組み合わせが選択される、項１に記載のウイルス弱毒株。
項３．前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異の３種の変異又は変異の組み合わせのうち、１～２種の変異又は変異の組み合わせが選択される、項１又は２に記載のウイルス弱毒株。
項４．　前記構造タンパク質がさらに以下の（ｐ）及び／又は（ｑ）の変異を含む、項１～３のいずれかに記載のウイルス弱毒株：
（ｐ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６７９位～第６８０位及び第６８５～６８６位に相当するアミノ酸配列の欠失を含む変異、
（ｑ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異。
項５．　前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせと以下の（ｇ）の変異とを含む、項４に記載のウイルス弱毒株：
（ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異。
項６．　前記（ｎ）の変異が、配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の欠失である、項４又は５に記載のベータコロナウイルス弱毒株。
項７．　前記（ｂ）の変異がフェニルアラニンへの置換であり、前記（ｅ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｆ）の変異がセリンへの置換であり、前記（ｈ）の変異がイソロイシンへの置換である、項１～６のいずれかに記載のウイルス弱毒株。
項８．　前記（ｑ）の変異がイソロイシンへの置換である、項４～７のいずれかに記載のウイルス弱毒株。
項９．　前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、項１～８のいずれかに記載のウイルス弱毒株。
項１０．　項１～９のいずれかに記載のウイルス弱毒株を含む、弱毒生ワクチン。
項１１．　経鼻投与される、項１０に記載の弱毒生ワクチン。
項１２．　筋肉内投与、皮下投与又は皮内投与される、項１０に記載の弱毒生ワクチン。
　本発明によれば、新たなベータコロナウイルスワクチンとして有用な株が提供される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性化方法を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性の確認結果（ＣＰＥ像）を示す。 各々のウイルス株の変異解析結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）における変異を導入した組換えウイルスの温度感受性の確認結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）における変異を導入した組換えウイルスの温度感受性の確認結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の増殖性解析結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の増殖性解析結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの体重変動を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの体重変動を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺内又は鼻腔洗浄液のウイルス量を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺画像を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺組織学的解析結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺組織学的解析（HE染色及びIHC染色）を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）再感染ハムスターの体重変動を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染後ハムスターの体重変動を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染後回復ハムスター血清の中和抗体価を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性化方法（Ｇ～Ｌ５０シリーズ［実施例］）を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｇ～Ｌ５０シリーズ［実施例］）の温度感受性の確認結果（ＣＰＥ像）を示す。 追加分離株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）の変異解析結果を示す。 温度感受性株（Ｈ５０－１１［実施例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。 温度感受性株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）に関連して見出された塩基配列の欠失を示す。 図１７で示した塩基配列の欠失及びそれにコードされるアミノ酸配列の欠失の概要図を示す。 温度感受性株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）の増殖性解析結果を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染ハムスターの体重変動を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染ハムスターの肺重量を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染ハムスターの肺内又は鼻腔洗浄液のウイルス量を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）再感染ハムスターの体重変動を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染後ハムスター血清の中和抗体価を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の投与経路による免疫誘導能の比較を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の投与量による免疫誘導能の比較を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。 温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。 ワクチン候補株１～７［実施例］作出後、回復培養時のＣＰＥ像を示す。 ワクチン候補株１～７［実施例］の温度感受性評価を示す。 ｒＴｓ－ａｌｌ株［実施例］の温度感受性評価を示す。 ワクチン候補株１，３，４，６，７［実施例］の低力価、低用量投与時の中和抗体誘導能を示す。 ワクチン候補株７［実施例］の低力価、低用量投与免疫後の感染防御試験の結果を示す。 ワクチン候補株２，５［実施例］の高力価、高用量投与時の中和抗体誘導能を示す。 ワクチン候補株２［実施例］の各温度における増殖性評価を示す。 ワクチン候補株２［実施例］の投与により誘導された液性免疫の持続性試験結果を示す。 ワクチン候補株２［実施例］の投与による感染防御試験結果（感染ハムスターの体重変動）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］のｉｎ　ｖｉｖｏ継代時における毒力復帰検討結果（ＣＰＥ有無）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］のｉｎ　ｖｉｖｏ継代時における毒力復帰検討結果（各鼻腔洗浄液から抽出したウイルスＲＮＡの配列）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］のｉｎ　ｖｉｖｏ継代時における毒力復帰検討結果（体重変動）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（鼻腔ｌｅｖｅｌ１）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（鼻腔ｌｅｖｅｌ２）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（鼻腔ｌｅｖｅｌ３）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（肺）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］の投与により誘導された中和抗体価を示す。 ワクチン候補株２［実施例］の投与による感染防御試験結果（感染ハムスターの体重変動）を示す。 ワクチン候補株２［実施例］の投与により誘導された中和抗体価を示す。
１．ベータコロナウイルス弱毒株
　本発明のベータコロナウイルス弱毒株は、弱毒性に関する所定の変異として、温度感受性に関する所定の置換変異を有する非構造タンパク質と、増殖低減性その他の弱毒性に関する所定の欠失変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び／又は非構造タンパク質と、を組み合わせで有するベータコロナウイルスであることを特徴とする。以下において、温度感受性に関する所定の置換変異を「温度感受性変異」とも記載し、増殖低減性に関する所定の欠失変異を「増殖低減性変異」とも記載し、増殖低減性変異以外の所定の欠失変異を「他の弱毒性変異」とも記載する。
　なお、本発明において、「弱毒性」とは、ウイルスの宿主病原性を減弱する特性をいう。また、本発明において、「温度感受性」とは、ヒトの体温（いわゆる下気道温度）での増殖性が制限され低温（典型的にはヒトの上気道温度以下）特異的に増殖能を有する特性をいう。また、本発明において、「増殖低減性」とは、増殖性が制限された特性であって且つその特性が温度特異的でないものをいう。
　本発明のベータコロナウイルス弱毒株は、上記の弱毒性に関する所定の変異を有することでワクチンとしての有効性を奏するだけでなく、置換変異に、復帰変異しにくい欠失変異が組み合わされていることで、毒力復帰が生じる可能性が極めて低くなっている。この点で、ヒトへの応用を想定した場合の有用性が顕著に高まっている。
　コロナウイルスは、形態学的には、直径約１００～２００ｎｍの球形で、表面に突起を有する。コロナウイルスは、ウイルス学的には、ニドウイルス目・コロナウイルス亜科・コロナウイルス科に分類される。脂質二重膜のエンベロープの中に、ヌクレオカプシドタンパク質（以下において、「ヌクレオカプシド」又は「Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ」ともいう）に巻きついたプラス鎖の一本鎖ＲＮＡのゲノムがあり、エンベロープの表面にはスパイクタンパク質（以下において、「スパイク」又は「Ｓｐｉｋｅ」ともいう）、エンベロープタンパク質（以下において、「エンベロープ」又は「Ｅｎｖｅｌｏｐｅ」ともいう）、メンブレンタンパク質（以下において、「メンブレン」又は「Ｍｅｍｂｒａｎｅ」ともいう）が配置されている。ウイルスゲノムの大きさは、ＲＮＡウイルスの中で最長の約３０ｋｂである。ヌクレオカプシド、スパイク、エンベロープ及びメンブレンが、コロナウイルスの構造タンパク質である。ＮＳＰ１～ＮＳＰ１６が、コロナウイルスの非構造タンパク質である。また、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ７ｂ、ＯＲＦ８などがコロナウイルスの付属タンパク質である。なお、付属タンパク質はアクセサリータンパク質と呼ぶこともできる。
　コロナウイルスは遺伝学的特徴から、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタのグループに分類される。ヒトに感染するコロナウイルスとしては、風邪の原因ウイルスとしてヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、ＨＫＵ－１の４種類、並びに、重篤な肺炎を引き起こす２００２年に発生した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス及び２０１２年に発生した中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルスが知られている。アルファコロナウイルス属にはヒトコロナウイルス２２９Ｅ及びＮＬ６３が分類され、ベータコロナウイルス属にはヒトコロナウイルスＯＣ４３、ＨＫＵ－１、ＳＡＲＳコロナウイルス及びＭＥＲＳコロナウイルスが分類される。
　２０１９年武漢にて発生した新型コロナウイルス感染症の原因ウイルスとして、ＳＡＲＳコロナウイルスに分類されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が分離及び同定されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、初期の武漢株から変異を繰り返しており、英国で検出された株、南アフリカで検出された株、インドで検出された株などの変異株が見つかっている。いまだ検出されていない変異株や、今後新たに変異株が発生する可能性も考えられる。本発明において、ベータコロナウイルス属に含まれるウイルスは、上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の株に限定されず、それ以外の全てのベータコロナウイルス（例えば、今後新たに検出される他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルス、並びに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質を、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルス（今後新たに検出されるウイルスを含む）の少なくともいずれかのスパイクタンパク質に入れ替えた組換えウイルスなど）も含む。
　本発明のベータコロナウイルス弱毒株が有する、当該弱毒性に関する所定の変異について、下記表１に基づいて説明する。表１で「温度感受性変異」として示される、変異（ｂ）、変異（ｅ）と変異（ｆ）との組み合わせ、及び／又は変異（ｈ）は、置換変異であり、本発明のベータコロナウイルス弱毒株が必須で含む、温度感受性能の付与に寄与する責任変異である。つまり、本発明において、温度感受性変異としては、「変異（ｂ）」と、「変異（ｅ）及び変異（ｆ）の組み合わせ」と、「変異（ｈ）」との３種が挙げられる。本発明の典型的なベータコロナウイルス弱毒株は、これら３種の温度感受性変異のうち、１種又は２種を有する。表１で「増殖低減性変異」及び「他の弱毒性変異」として示される、変異（ｎ）、変異（о）及び／又は変異（ｒ）は、欠失変異であり、本発明のベータコロナウイルス弱毒株が必須で含む、増殖低減性その他の弱毒性の付与に寄与すると考えられ（特に、変異（ｒ）は増殖低減性の付与に寄与すると考えられ）且つ温度感受性変異との組み合わせで優れた弱毒性を発現する変異である。表１で「他の変異」として示される、変異（ａ），（ｃ），（ｄ），（ｇ），（ｉ）～（ｍ），（ｐ），（ｑ）は、本発明のベータコロナウイルス弱毒株が任意で含むことができる変異であり、本発明のベータコロナウイルス弱毒株は、他の変異の少なくともいずれかを、含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　すなわち、本発明のベータコロナウイルスが有する必須の弱毒性に関する変異は、温度感受性変異である、以下の（ｂ）の変異、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、並びに／若しくは（ｈ）の変異と；増殖低減性その他の弱毒性変異である、以下の（ｎ）、（о）及び／又は（ｒ）の変異である。
（ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｎ）ＯＲＦ８の機能欠失変異、
（о）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８１～６８４位に相当するアミノ酸残基の欠失、
（ｒ）ＮＳＰ１における、配列番号８に示すアミノ酸配列の第３２～３９位に相当するアミノ酸配列の欠失。
　上記（ｎ）の変異は、ＯＲＦ８の機能が欠失する変異であればいかなる変異も許容されるが、好ましくは、配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の欠失が挙げられる。
　本発明の好ましい形態においては、温度感受性のレベルを好ましい程度に制御する観点から、上記の温度感受性変異（すなわち、（ｂ）の変異、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、（ｈ）の変異の３種の変異又は変異の組み合わせ）のうち、１～２種の変異又は変異の組み合わせが選択される。
　本発明の好ましい形態においては、上記の増殖低減性その他の弱毒性変異の中でも、好ましくは、（о）の変異、（ｒ）の変異が挙げられる。
　本発明の好ましい形態においては、好ましい弱毒性を奏しつつ、併せて、好ましい免疫原性も奏する観点から、上記弱毒性に関する所定の変異６種（すなわち、（ｂ）の変異と、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせと、（ｈ）の変異と、（ｎ）の変異と、（о）の変異と、（ｒ）の変異との６種）のうち、４種の変異又は変異の組み合わせが選択される。
　本発明のベータコロナウイルス弱毒株は、上記必須の変異に加え、さらに、他の変異として、以下の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、（ｉ）～（ｍ）、（ｐ）、（ｑ）の少なくともいずれかの変異を含むことができる。
（ａ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｃ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｄ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基の変異、
（ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｉ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｊ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｋ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｌ）エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｍ）ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｐ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６７９位～第６８０位及び第６８５～６８６位に相当するアミノ酸残基の欠失を含む変異、
（ｑ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異。
　本発明のベータコロナウイルス弱毒株が他の変異を有する場合、温度感受性を増強する観点から、上記の他の変異の中でも、（ｇ）の変異を有することが好ましい。本発明のベータコロナウイルス弱毒株が他の変異として（ｇ）の変異を有する場合、温度感受性を増強する観点から、（ｇ）の変異は、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせと共に用いられることが好ましい。
　配列番号１は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＮＳＰ３のアミノ酸配列であり；配列番号２は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＮＳＰ１４のアミノ酸配列であり；配列番号３は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＮＳＰ１６のアミノ酸配列である。
　また、配列番号４は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるスパイクのアミノ酸配列であり；配列番号５は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるエンベロープのアミノ酸配列であり；配列番号６は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるヌクレオカプシドのアミノ酸配列である。
　さらに、配列番号７は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオープンリーディングフレームの一部、具体的には、ＯＲＦ７ａの一部分と、ＯＲＦ７ｂ全体と、ＯＲＦ８の大部分とにわたる塩基配列であり；配列番号８は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２におけるＮＳＰ１のアミノ酸配列である。
　「相当するアミノ酸残基」とは、本発明のベータコロナウイルス弱毒株がＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株である場合は、配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列中の、上記所定位置に存在するアミノ酸残基をいい、本発明のベータコロナウイルス弱毒株が上記変異株以外の他のベータコロナウイルス変異株である場合は、他のベータコロナウイルスが有するポリペプチドの上記配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列中の、上記所定位置に対応する位置に存在するアミノ酸残基をいう。当該対応する位置は、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくは配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質と、当該タンパク質に対応する他のベータコロナウイルスのタンパク質と、についてアミノ酸配列のアラインメントを行うことで、特定することができる。
　本発明のウイルス弱毒株は、配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列における上記所定位置に対応するアミノ酸残基又はアミノ酸配列が変異していればよいため、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株に限定されるものではなく、他のベータコロナウイルス変異株［つまり、他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株、及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスの変異株］を含む。ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株とは、当該特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列中の上記所定位置の少なくともいずれかのアミノ酸残基又はアミノ酸配列が変異した変異株であり、他のベータコロナウイルス変異株とは、他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株［つまり、他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における上記配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列中の、上記所定位置に対応するアミノ酸残基又はアミノ酸配列が変異した変異株］と、ベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスの変異株［つまり、ベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスにおける上記配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列中の、上記所定位置に対応するアミノ酸残基又はアミノ酸配列が変異した変異株］との両方をいう。他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスの変異株には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルスのスパイクタンパク質を、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のベータコロナウイルス（今後新たに検出されるウイルスを含む）の少なくともいずれかのスパイクタンパク質に入れ替えた組換えウイルスの変異株も含まれる。
　他のベータコロナウイルス変異株における上記配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列に対応する配列は、それぞれ、ポリペプチドの特性に大きく影響しない限り、配列番号１～４（又は１～６）、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列と相違していることが許容される。ポリペプチドの特性に大きく影響しないとは、それぞれの非構造タンパク質、構造タンパク質、及び付属タンパク質としての機能を保った状態をいう。具体的には、配列番号１～４、８のアミノ酸配列若しくは配列番号７に示す塩基配列における、上記弱毒性に関する所定の変異に対応するアミノ酸又は塩基配列以外の部位、若しくは、他の変異をさらに有する場合にあっては、さらに、上記の配列番号５、６における他の変異に対応するアミノ酸残基以外の部位（これら変異に対応するアミノ酸残基又は塩基以外の部位を、以下において、「任意相違部位」とも記載する。）において、配列番号１～４、７、８（又は１～８）との相違が許容される。許容される相違には、置換、付加、挿入、及び欠失の中から選択される１種類の相違（例えば置換）であってもよいし、２種以上の相違（例えば、置換及び挿入）を含んでいてもよい。他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における上記配列番号１～４（又は１～６）、８に対応するアミノ酸配列又は配列番号７に示す塩基配列と、配列番号１～４（又は１～６）、８に示すアミノ酸配列又は配列番号７に示す塩基配列との任意相違部位のみを比較して算出される配列同一性としては、５０％以上であればよい。他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２においては、当該配列同一性としては、好ましくは６０％以上又は７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上又は９０％以上、一層好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、より一層好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．３％以上、９９．５％以上、９９．７％以上、９９．９％以上が挙げられる。残りの任意のベータコロナウイルスにおいては、当該配列同一性としては、好ましくは６０％以上が挙げられる。ここで、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　つまり、本発明のベータコロナウイルス弱毒株は、より具体的には以下の通りである：
　以下の（I）、（II）及び（III）の少なくともいずれかのポリペプチドからなる非構造タンパク質、付属タンパク質及び構造タンパク質を含む、ベータコロナウイルス弱毒株：
（I）以下の（I-1）～（I-3）のポリペプチドの少なくともいずれかと、以下の（1-4）～（I-6）のポリペプチドの少なくともいずれか：
　（I-1）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第４４５位ロイシンの置換変異（ｂ’）を温度感受性変異として有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ３）、
　（I-2）配列番号２に示すアミノ酸配列において、第２４８位グリシンの置換変異（ｅ’）及び第４１６位グリシンの置換変異（ｆ’）を温度感受性変異として有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１４）、
　（I-3）配列番号３に示すアミノ酸配列において、第６７位バリンの置換変異（ｈ’）を温度感受性変異として有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１６）、
　（I-4）配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列の欠失変異（ｎ’）を他の弱毒性変異として有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＯＲＦ）、
　（I-5）配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６８１位～第６８４位の欠失変異（о’）を他の弱毒性変異として有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（スパイク）、
　（I-6）配列番号８に示すアミノ酸配列において、第３２位～第３９位の欠失変異（ｒ’）を増殖低減性変異として有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１）；
（II）前記(I)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記温度感受性変異に係るアミノ酸残基及び前記増殖低減性その他の弱毒性変異に係るアミノ酸配列以外の１個又は複数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、温度感受性能及び弱毒化能を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド；
（III）前記(I)のポリペプチドのアミノ酸配列における前記温度感受性変異に係るアミノ酸残基及び前記増殖低減性その他の弱毒性変異に係るアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列の配列同一性が５０％以上であり、温度感受性能及び弱毒化能を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド。
　上記のより具体的なベータコロナウイルス弱毒株が、温度感受性変異及び増殖低減性その他の弱毒性変異に加え他の変異も含む場合は、以下に示す通り、上記（I-1）及び（I-2）のポリペプチド（非構造タンパク質）並びに上記（I-5）のポリペプチド（構造タンパク質）が、それぞれ、温度感受性変異及び増殖低減性その他の弱毒性変異に加え他の変異も有する以下の（I-1a）及び（I-2a）並びに（I-5a）のポリペプチドであってもよく、上記（I）のポリペプチドが、さらに、他の変異を有する以下の（I-7a），（I-8a）のポリペプチド（構造タンパク質）を包含していてもよい。
　以下の（I）、（II）及び（III）の少なくともいずかのポリペプチドからなる、構造タンパク質、付属タンパク質及び非構造タンパク質を含む、ベータコロナウイルス弱毒株：
（I）以下の（I-1a），（I-2a），（I-3）の少なくともいずれかと、以下の（I-4），（I-5a），（I-6）のポリペプチドの少なくともいずれか、又はそれらに加えて以下（I-7a），（I-8a）の少なくともいずれかのポリペプチド：
　　（I-1a）配列番号１に示すアミノ酸配列において、温度感受性変異として第４４５位ロイシンの変異（ｂ’）と、他の変異として、第４０４位バリンの変異（ａ’）、第１７９２位リシンの変異（ｃ’）、及び第１８３２位アスパラギン酸の変異（ｄ’）の少なくともいずれかの変異とを有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ３）、
　　（I-2a）配列番号２に示すアミノ酸配列において、温度感受性変異として第２４８位グリシンの変異（ｅ’）及び第４１６位グリシンの変異（ｆ’）と、他の変異として第５０４位アラニンの変異（ｇ’）とを有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１４）、
　　（I-3）配列番号３に示すアミノ酸配列において、温度感受性変異として第６７位バリンの変異（ｈ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１６）、
　　（I-4）他の弱毒性変異として配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列の欠失変異（ｎ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＯＲＦ）、
　　（I-5a）配列番号４に示すアミノ酸配列において、他の弱毒性変異として第６８１位～第６８４位の欠失変異（о’）と；他の変異として、第５４位ロイシンの変異（ｉ’）、第７３９位トレオニンの変異（ｊ’）、及び第８７９位アラニンの変異（ｋ’）の少なくともいずれかの変異、並びに第６７９位～第６８０位及び第６８５位～第６８６位のアミノ酸配列の欠失変異（ｐ’）及び第６８７位バリンの変異（ｑ’）の少なくともいずれかの変異と、を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（スパイク）、
　　（I-6）配列番号８に示すアミノ酸配列において、増殖低減性変異として第３２位～第３９位の欠失変異（ｒ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＳＰ１）
　　（I-7a）配列番号５に示すアミノ酸配列において、他の変異として第２８位ロイシンの変異（ｌ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（エンベロープ）、
　　（I-8a）配列番号６に示すアミノ酸配列において、他の変異として第２位セリンの変異（ｍ’）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（ヌクレオカプシド）；
（II）前記（Ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記温度感受性変異、前記増殖低減性その他の弱毒性変異に係るアミノ酸配列及び他の変異に係るアミノ酸残基又はアミノ酸配列以外の１個又は複数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、温度感受性能及び弱毒化能を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド；
（III）前記（Ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列における前記温度感受性変異、前記増殖低減性その他の弱毒性変異に係るアミノ酸配列及び他の変異に係るアミノ酸残基又はアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列の配列同一性が５０％以上であり、温度感受性能及び弱毒化能を獲得したベータコロナウイルスを構成するポリペプチド。
　上記（ａ’）～（ｒ’）の変異は、それぞれ、（ａ）～（ｒ）の変異が具体的に配列番号１～６のアミノ酸配列、配列番号７の塩基配列、及び配列番号８のアミノ酸配列に存在する場合の変異を指す。つまり、上記（I）のポリペプチドは、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が有する配列番号１～６のアミノ酸配列、配列番号７の塩基配列にコードされるアミノ酸配列、及び配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチドに、温度感受性変異及び増殖低減性その他の弱毒性変異、又はそれらに加えて他の変異が導入されたものである。また、上記（II）及び（III）のポリペプチドは、他のベータコロナウイルスが有する配列番号１～６のアミノ酸配列、配列番号７の塩基配列にコードされるアミノ酸配列、及び配列番号８のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチドに、温度感受性変異及び増殖低減性その他の弱毒性変異、又はそれらに加えて他の変異が導入されたものである。上記（II）及び（III）のポリペプチドの配列同一性の好ましい範囲は、既に述べた通りである。
　ベータコロナウイルスは、上記の温度感受性変異を有することで温度感受性を獲得し、上記の温度感受性変異とともに上記の増殖低減性その他の弱毒性変異を有することで優れた弱毒性を獲得することができる。本発明のウイルス弱毒株は、ヒトの下気道温度での増殖能が、ヒトの下気道温度よりも低い温度での増殖能よりも少なくとも低下しており、好ましくは、ヒトの下気道温度での増殖能を有しない。本発明において、温度感受性能は、ヒトの下気道温度にてウイルス弱毒株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの下気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）が、ヒトの上気道温度にてウイルス弱毒株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの上気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価と比較して、例えば、１０2以上、好ましくは１０3以上減少していることにより確認することができる。
　典型的には、本発明のウイルス弱毒株は、ヒトの下気道温度での増殖能が、上記温度感受性変異を有しない場合におけるヒトの下気道温度での増殖能に比べて低下している。このことは、ヒトの下気道温度にてウイルス弱毒株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの下気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）が、ヒトの下気道温度にて上記温度感受性変異を有しない株をＭＯＩ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させた後、ヒトの下気道温度にて１日培養させた後の培養上清中のウイルス力価と比較して、例えば、１０2以上、好ましくは１０3以上減少していることにより確認することができる。
　ヒトの下気道温度の代表例としては約３７℃が挙げられ、具体的には後述の上気道温度より高い温度、好ましくは３６～３８℃、より好ましくは３６．５～３７．５℃又は３７～３８℃が挙げられる。また、本発明のウイルス弱毒株は、ヒトの下気道温度未満の温度での増殖能は有していてもよい。例えば、ヒトの下気道温度より低い温度としては、例えばヒトの上気道温度（具体例として、約３２℃～３５．５℃）を包含していてもよい。
　上記の温度感受性変異は、ウイルスが細胞に感染する際に重要な、ウイルス表面に存在するスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン上には存在しない。そのため、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２だけでなく、他のベータコロナウイルスにおいても、上記の温度感受性変異を導入することで、温度感受性化することができると合理的に予想される。つまり、世界的な感染症の流行により、ウイルスの免疫原性が変化するような変異が生じた場合においても、当該変異ウイルスにさらに上記の温度感受性変異を導入することで、当該変異ウイルスに対して温度感受性を付与できると合理的に予想される。
　また、温度感受性変異に関して、上記（ｂ）の変異はロイシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｅ）の変異はグリシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｆ）の変異はグリシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｈ）の変異はバリン以外のアミノ酸残基への置換であればよい。他の変異に関して、上記（ａ）の変異はバリン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｃ）の変異はリシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｄ）の変異はアスパラギン酸以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｇ）の変異はアラニン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｉ）の変異はロイシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｊ）の変異はトレオニン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｋ）の変異はアラニン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｌ）の変異はロイシン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｍ）の変異はセリン以外のアミノ酸残基への置換であればよく、上記（ｑ）の変異はバリン以外のアミノ酸残基への置換であればよい。
　本発明のウイルス弱毒株の好ましい例においては、温度感受性変異は、前記（ｂ）の変異がフェニルアラニンへの置換であり、前記（ｅ）の変異がバリンへの置換且つ前記（ｆ）の変異がセリンへの置換であり、及び／又は、前記（ｈ）の変異がイソロイシンへの置換である。当該好ましい例がさらに他の変異を有する場合においては、他の変異は、前記（ａ）の変異がアラニンへの置換であり、前記（ｃ）の変異がアルギニンへの置換であり、前記（ｄ）の変異がアスパラギンへの置換であり、前記（ｇ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｉ）の変異がトリプトファンへの置換であり、前記（ｊ）の変異がリシンへの置換であり、前記（ｋ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｌ）の変異がプロリンへの置換であり、前記（ｍ）の変異がフェニルアラニンへの置換であり、及び／又は、前記（ｑ）の変異がイソロイシンへの置換である。
　本発明のウイルス弱毒株の別の例においては、前記置換は、いわゆる保存的置換であってもよい。保存的置換とは、構造及び／又は特性の類似したアミノ酸で置換されることをいい、例えば、保存的置換の例として、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸へ置換、置換前のアミノ酸が非電荷アミノ酸であれば他の非電荷アミノ酸へ置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸へ置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸へ置換されることが挙げられる。なお、一般的に、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれ、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
　本発明のウイルス弱毒株のより好ましい例としては、ＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株であって、前記（ｂ）の変異（つまり（ｂ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンのフェニルアラニンへの置換（Ｌ４４５Ｆ）であり；前記（ｅ）の変異（つまり（ｅ’）の変異）が、ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンのバリンへの置換（Ｇ２４８Ｖ）、且つ、前記（ｆ）の変異（つまり（ｆ’）の変異）が、ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンのセリンへの置換（Ｇ４１６Ｓ）であり；及び／又は、前記（ｈ）の変異（つまり（ｈ’）の変異）が、ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンのイソロイシンへの置換（Ｖ６７Ｉ）であるものが挙げられる。当該より好ましい例が他の変異も有する場合の例としては、さらに、前記（ａ）の変異（つまり（ａ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４０４位のバリンのアラニンへの置換（Ｖ４０４Ａ）であり；前記（ｃ）の変異（つまり（ｃ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７９２位のリシンのアルギニンへの置換（Ｋ１７９２Ｒ）であり；前記（ｄ）の変異（つまり（ｄ’）の変異）が、ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１８３２位のアスパラギン酸のアスパラギンへの置換（Ｄ１８３２Ｎ）であり；前記（ｇ）の変異（つまり（ｇ’）の変異）が、ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンのバリンへの置換（Ａ５０４Ｖ）であり；前記（ｉ）の変異（つまり（ｉ’）の変異）が、スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第５４位のロイシンのトリプトファンへの置換（Ｌ５４Ｗ）であり；前記（ｊ）の変異（つまり（ｊ’）の変異）が、スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第７３９位のトレオニンのリシンへの置換（Ｔ７３９Ｋ）であり；前記（ｋ）の変異（つまり（ｋ’）の変異）が、スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第８７９位のアラニンのバリンへの置換（Ａ８７９Ｖ）であり；前記（ｌ）の変異（つまり（ｌ’）の変異）が、エンベロープにおける、配列番号５に示すアミノ酸配列の第２８位のロイシンのプロリンへの置換（Ｌ２８Ｐ）であり；前記（ｍ）の変異（つまり（ｍ’）の変異）が、ヌクレオカプシドにおける、配列番号６に示すアミノ酸配列の第２位のセリンのフェニルアラニンへの置換（Ｓ２Ｆ）であり；及び／又は、前記（ｑ）の変異（つまり（ｑ’）の変異）が、スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８７位のバリンのイソロイシンへの置換（Ｖ６８７Ｉ）であるものが挙げられる。
　本発明のウイルス弱毒株の特に好ましい例としては、以下の株が挙げられる。
・温度感受性変異として、前記（ｅ）の変異（好ましくは（ｅ’）の変異及び／又はＧ２４８Ｖ）及び前記（ｆ）の変異（好ましくは（ｆ’）の変異及び／又はＧ４１６Ｓ）、及び前記（ｈ）の変異（好ましくは（ｈ’）の変異及び／又はＶ６７Ｉ）と；増殖低減性その他の弱毒性変異として、前記（n）の変異（好ましくは（n’）の変異）、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異とを有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｇ）の変異（好ましくは（ｇ’）の変異及び／又はＡ５０４Ｖ）、前記（ｐ）の変異、及び前記（ｑ）の変異（好ましくは（ｑ’）の変異及び／又はＶ６８７Ｉ）を有する株
・温度感受性変異として、前記（ｅ）の変異（好ましくは（ｅ’）の変異及び／又はＧ２４８Ｖ）及び前記（ｆ）の変異（好ましくは（ｆ’）の変異及び／又はＧ４１６Ｓ）と；増殖低減性その他の弱毒性変異として、前記（n）の変異（好ましくは（n’）の変異）、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異とを有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｇ）の変異（好ましくは（ｇ’）の変異及び／又はＡ５０４Ｖ）、前記（ｐ）の変異、及び前記（ｑ）（好ましくは（ｑ’）の変異及び／又はＶ６８７Ｉ）の変異を有する株
・温度感受性変異として、前記（ｅ）の変異（好ましくは（ｅ’）の変異及び／又はＧ２４８Ｖ）、前記（ｆ）の変異（好ましくは（ｆ’）の変異及び／又はＧ４１６Ｓ）、及び前記（ｈ）の変異（好ましくは（ｈ’）の変異及び／又はＶ６７Ｉ）と；他の弱毒性変異として、前記（n）の変異（好ましくは（n’）の変異）、及び前記（о）の変異とを有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｇ）の変異（好ましくは（ｇ’）の変異及び／又はＡ５０４Ｖ）、前記（ｐ）の変異、及び前記（ｑ）（好ましくは（ｑ’）の変異及び／又はＶ６８７Ｉ）の変異を有する株
・温度感受性変異として、前記（ｂ）の変異（好ましくは（ｂ’）の変異及び／又はＬ４４５Ｆ）、前記（ｅ）の変異（好ましくは（ｅ’）の変異及び／又はＧ２４８Ｖ）及び前記（ｆ）の変異（好ましくは（ｆ’）の変異及び／又はＧ４１６Ｓ）と；他の弱毒性変異として、前記（n）の変異（好ましくは（n’）の変異）、及び前記（о）の変異とを有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｃ）の変異（好ましくは（ｃ’）の変異及び／又はＫ１７９２Ｒ）、前記（ｇ）の変異（好ましくは（ｇ’）の変異及び／又はＡ５０４Ｖ）、前記（ｐ）の変異、及び前記（ｑ）（好ましくは（ｑ’）の変異及び／又はＶ６８７Ｉ）の変異を有する株
・温度感受性変異として、前記（ｂ）の変異（好ましくは（ｂ’）の変異及び／又はＬ４４５Ｆ）、及び前記（ｈ）の変異（好ましくは（ｈ’）の変異及び／又はＶ６７Ｉ）と；他の弱毒性変異として、前記（n）の変異（好ましくは（n’）の変異）、及び前記（о）の変異とを有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｃ）の変異（好ましくは（ｃ’）の変異及び／又はＫ１７９２Ｒ）、前記（ｐ）の変異、及び前記（ｑ）（好ましくは（ｑ’）の変異及び／又はＶ６８７Ｉ）の変異を有する株
・温度感受性変異として、前記（ｅ）の変異（好ましくは（ｅ’）の変異及び／又はＧ２４８Ｖ）、前記（ｆ）の変異（好ましくは（ｆ’）の変異及び／又はＧ４１６Ｓ）、及び前記（ｈ）の変異（好ましくは（ｈ’）の変異及び／又はＶ６７Ｉ）と；増殖低減性その他の弱毒性変異として、前記（n）の変異（好ましくは（n’）の変異）、及び前記（ｒ）の変異（好ましくは（ｒ’）の変異）とを有する株；若しくはさらに他の変異として、前記（ｇ）の変異（好ましくは（ｇ’）の変異及び／又はＡ５０４Ｖ）を有する株
　本発明のウイルス弱毒株の最も好ましい例としては、以下の株が挙げられる。
　温度感受性変異として、前記（ｅ）の変異（好ましくは（ｅ’）の変異及び／又はＧ２４８Ｖ）及び前記（ｆ）の変異（好ましくは（ｆ’）の変異及び／又はＧ４１６Ｓ）と；増殖低減性その他の弱毒性変異として、前記（n）の変異（好ましくは（n’）の変異）、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異とを有する株；並びにさらに他の変異として、前記（ｇ）の変異（好ましくは（ｇ’）の変異及び／又はＡ５０４Ｖ）、前記（ｐ）の変異、及び前記（ｑ）（好ましくは（ｑ’）の変異及び／又はＶ６８７Ｉ）の変異を有する株
２．ワクチン
２－１．弱毒化ワクチンの有効成分
　上述のとおり、「１．ベータコロナウイルス弱毒株」で述べたベータコロナウイルス弱毒株は、温度感受性変異を有することで、ヒトの下気道温度よりも低い温度でしか効率的に増殖できないため、少なくとも生体深部、中でも、重大な障害を引き起こす肺を含む下気道においては効率的に増殖することができず、病原性が著しく低下していることが期待できる。それに加え、当該ベータコロナウイルス弱毒株は、増殖低減性その他の弱毒性変異を有することで、温度に関わらず増殖性が制限されており、上記の温度感受性変異との複合によって、優れた弱毒性を有する。このような複合形態をとることで、当該ベータコロナウイルス弱毒株は、弱毒生ワクチンが宿主体内で増殖を伴う場合に、仮に温度感受性変異が失われた場合であっても、増殖低減性その他の弱毒性変異である欠失変異が復帰変異しにくい特性を有するため、弱毒性を維持できることが期待できる。
　従って、当該ウイルス弱毒株はそれ自体が弱毒化されたウイルスとして、生体に感染させることで弱毒生ワクチンとして使用することができる。従って、本発明は、上記のベータコロナウイルス弱毒株を有効成分として含むワクチンも提供する。有効成分の詳細については、「１．ベータコロナウイルス弱毒株」で述べた通りである。
２－２．遺伝子ワクチンの有効成分
　上記「１．ベータコロナウイルス弱毒株」で述べた通り、所定の変異は、弱毒性の付与に寄与する。従って、本発明は、上記の所定の変異を有する非構造タンパク質、付属タンパク質及び構造タンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含む、ベータコロナウイルス遺伝子ワクチンも提供する。有効成分に含まれる所定の変異の詳細については、「１．ベータコロナウイルス弱毒株」で述べた通りである。
２－３．標的とするウイルス
　本発明のワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの初期の武漢株だけでなく、２０２０年９月に英国で検出され、２０２０年１０月に南アフリカで検出された変異株、及びその他の公知の変異株、並びにその他未だ検出されていない未知の変異株を含む、広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス関連株及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスにも有効であることが合理的に期待できる。従って、本発明のワクチンは、ベータコロナウイルスを標的とする。
２－４．他の成分
　本発明のワクチンには、上記の有効成分の他に、目的及び用途等に応じて、アジュバント、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯臭剤、光吸収色素、安定化剤、炭水化物、カゼイン消化物、各種ビタミン等の他の成分を含むことができる。
　アジュバントとしては、例えば、動物油(スクアレン等)又はそれらの硬化油；植物油(パーム油、ヒマシ油等)又はそれらの硬化油；無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステル等を含む油性アジュバント；PCPP、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミニウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質等の水溶性アジュバント；水酸化アルミニウム（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩又はその組み合わせ、水酸化ナトリウム等の沈降性アジュバント；コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分；その他の成分（ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキン等）が挙げられる。
　緩衝剤の例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール等が挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の例としては、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、抗生物質、合成抗菌剤等が挙げられる。抗酸化剤の例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
　光吸収色素の例としては、リボフラビン、アデニン、アデノシン等が挙げられる。安定化剤の例としては、キレート剤、還元剤等が挙げられる。炭水化物の例としては、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストラン等が挙げられる。
　さらに、本発明のワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９等のベータコロナウイルス感染症以外の他の疾患を発症するウイルス又は細菌に対する１又は複数の他のワクチンを含んでいてもよい。つまり、本発明のワクチンは、他のワクチンを含む混合ワクチンとして調製されてもよい。
２－５．剤型
　本発明のワクチンの剤型については特に限定されず、投与方法及び保存条件等に基づいて適宜決定することができる。剤型の具体例としては、液体製剤及び固体製剤等が挙げられ、より具体的には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤；凍結乾燥製剤等の乾燥製剤、注射剤、噴霧剤、貼付剤等の非経口投与剤（具体的には、筋肉内投与剤、皮内投与剤、皮下投与剤、経鼻投与剤、経皮投与剤等）が挙げられる。
２－６．投与方法
　本発明のワクチンの投与方法としては特に限定されず、筋肉、腹腔内、皮内及び皮下等の注射投与、鼻腔及び口腔からの吸入投与、並びに経口投与等のいずれであってもよいが、好ましくは筋肉、皮内及び皮下等の注射投与（筋肉内投与、皮内投与及び皮下投与）、鼻腔からの吸入投与（経鼻投与）、皮膚からの吸収投与（経皮投与）が挙げられ、より好ましくは、経鼻投与が挙げられる。
２－７．適用対象
　本発明のワクチンの適用対象としては、ベータコロナウイルス感染による諸症状を引き起こしうる対象（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染によりＣＯＶＩＤ－１９症状を引き起こしうる対象）であれば特に限定されず、例えば哺乳類が挙げられ、より具体的には、ヒト；イヌ及びネコ等の愛玩動物；ネズミ、マウス、ハムスター等の実験動物等が挙げられる。
２－８．用量
　本発明のワクチンの用量としては特に限定されず、有効成分の種類、投与方法、投与対象（年齢、体重、性別、基礎疾患の有無等の条件）に応じて適宜決定することができる。
　また、本発明のワクチンのヒトに対する１回当たりの用量として、１×１０ＰＦＵ／body以上、好ましくは１×１０2ＰＦＵ／body以上、より好ましくは２×１０2ＰＦＵ／body以上、さらに好ましくは１×１０3ＰＦＵ／body以上、さらに好ましくは２×１０3ＰＦＵ／body以上が挙げられる。また、本発明のワクチンのヒトに対する１回当たりの用量としては、６×１０11ＰＦＵ／body以下、好ましくは１×１０11ＰＦＵ／body以下、より好ましくは６×１０10ＰＦＵ／body以下、さらに好ましくは１×１０10ＰＦＵ／body以下も挙げられる。
　また、本発明のワクチンの１回当たりのヒトに対する用量として、１×１０ＴＣＩＤ５０／body以上、好ましくは１×１０2ＴＣＩＤ５０／body以上、より好ましくは２×１０2ＴＣＩＤ５０／body以上、より好ましくは１×１０3ＴＣＩＤ５０／body以上、より好ましくは２×１０3ＴＣＩＤ５０／body以上が挙げられる。また、本発明のワクチンのヒトに対する１回当たりの用量としては、６×１０11ＴＣＩＤ５０／body以下、好ましくは１×１０11ＴＣＩＤ５０／body以下、より好ましくは６×１０10ＴＣＩＤ５０／body以下、さらに好ましくは１×１０10ＴＣＩＤ５０／body以下も挙げられる。
３．ベータコロナウイルス弱毒株の製造方法
　本発明のベータコロナウイルス弱毒株の製造方法としては、特に限定されず、上述のアミノ酸配列情報に基づいて当業者が適宜決定することができる。例えば、比較的安価にかつロット差の少ないワクチンを製造する観点から、好ましくは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はイースト人工染色体（ＹＡＣ）などの人工染色体、若しくはベータコロナウイルスのゲノムフラグメントを用いたＣＰＥＲ法などを利用したリバースジェネティクス法が挙げられる。
　リバースジェネティクス法によるウイルスの再構築方法においては、まず、ベータコロナウイルス弱毒株の、いずれの温度感受性変異及び増殖低減性その他の弱毒性変異も有しない株（親株）のゲノムをクローニングする。この際に使用する親株としては、ベータコロナウイルスであればよく、具体的には、上記のＮＣ＿０４５５１２（ＮＣＢＩ）に収載されている特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、上記の他の任意のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びベータコロナウイルス属に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のウイルスからなる群より選択することができる。
　さらに、リバースジェネティクス法において人工染色体を利用する場合、ウイルスゲノムの全長ＤＮＡをＢＡＣ　ＤＮＡ又はＹＡＣ　ＤＮＡなどにクローニングし、ウイルスの配列の上流に真核細胞用の転写プロモーター配列を挿入する。プロモーター配列としてはＣＭＶプロモーター及びＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。ウイルスの配列の下流にはリボザイム配列並びにポリＡ配列を挿入する。リボザイム配列としてはＤ型肝炎ウイルスリボザイム及びハンマーヘッドリボザイムなどが挙げられる。ポリＡ配列としてはシミアン４０ウイルスのポリＡなどが挙げられる。
　一方、リバースジェネティクス法においてＣＰＥＲ法を利用する場合、ウイルスゲノムの全長ＤＮＡを複数のフラグメント断片に分けて、クローニングする。フラグメント断片を獲得する方法としては、核酸の人工合成法、上記人工染色体又はフラグメント断片をクローニングしたプラスミドをテンプレートとするＰＣＲ法などが挙げられる。
　上記の手法によりクローニングされたウイルスゲノムに対して上記少なくともいずれかの温度感受性変異、増殖低減性その他の弱毒性変異、及び必要に応じて他の変異を導入するには、ダブルクロスオーバー及びλ／ＲＥＤリコンビネーション等の相同組換え法、オーバーラップＰＣＲ法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法など、公知の点変異導入法を用いることができる。
　続いて、温度感受性変異、増殖低減性その他の弱毒性変異、及び必要に応じて他の変異を導入した人工染色体を宿主細胞にトランスフェクションし、組換えウイルスを再構築させる。ＣＰＥＲ法によるリバースジェネティクス法の場合、温度感受性変異、増殖低減性その他の弱毒性変異、及び必要に応じて他の変異を導入したフラグメントをＤＮＡポリメラーゼを用いた反応により連結した後、宿主細胞にトランスフェクションすることで、組換えウイルスを再構築させる。トランスフェクションの方法としても特に限定されず、公知の方法を用いることができる。また、宿主についても特に限定されず、公知の細胞を用いることができる。
　続いて、再構築した組換えウイルスを培養細胞に添加して、組換えウイルスを継代培養する。その際に用いる培養細胞としても特に限定されないが、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＶｅｒｏＥ６細胞、ＴＭＰＲＥＳＳ２の発現を補ったＶｅｒｏ細胞、ＴＭＰＲＥＳＳ２の発現を補ったＶｅｒｏＥ６細胞、Ｃａｌｕ－３細胞、ＡＣＥ２の発現を補った２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、１０４Ｃ１細胞、マウス神経芽細胞腫由来ＮＡ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等が挙げられる。ウイルスの回収は、遠心分離及び膜ろ過など、公知の方法により行うことができる。また、回収したウイルスをさらに培養細胞に添加することにより、組換えウイルスの大量生産が可能になる。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［試験例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性株Ａ５０－１８株（参考例）］
［試験例１－１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性株Ａ５０－１８株の分離
　図１の手法に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）（ＬＣ６０３２８６、本実施例において、Ｂ－１株、野生株（臨床分離株）、欧州型野生株（Ｂ－１株）、Ｂ－１株（Ｄ６１４Ｇ型：ｐｒｅ－ａｌｐｈａ欧州株）ともいう）に、２種類の突然変異誘導剤５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（以下、５－ＦＵ）及び５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ（以下、５－ＡＺＡ）を添加することで、３２℃にて馴化させたＡ～Ｆ５０シリーズ及びＡ～Ｆ５００シリーズのウイルス集団を取得した。更に、各々のウイルス集団の継代を複数回行い、得られた４０６の候補株の中から、３２℃で増殖できる一方、３７℃で増殖性が著しく低下しているウイルス株（Ａ５０－１８株。以下においてＴｓ株と記載する場合もある。）を見出し、分離、選択した（図２）。
［試験例１－２］次世代シーケンスによる温度感受性株Ａ５０－１８株の解析
（１－２－１）各々のウイルス株の変異解析
　次世代シークエンサーを用いて、以下のウイルス株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで、当該解析を行った。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして、武漢臨床分離株であるＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＮＣ０４５５１２）を用いた。
　　　　Ｂ－１　　　　：野生株（臨床分離株）
　　　　Ａ５０－１８　　　：温度感受性株
　　　　Ｆ５０－３７　　　：非温度感受性株
　　　　Ｃ５００－１　　　：非温度感受性株
　　　　Ｆ５００－５３　　：非温度感受性株
　　　　Ｆ５００－４０　　：非温度感受性株
　　　　Ｆ５００－２　　　：非温度感受性株
　　　　（Ｂ－１以外は、変異誘導させたウイルス）
（１－２－２）温度感受性株の変異
　（１－２－１）より、図３Ａの解析結果を取得した。Ｄ６１４Ｇの点変異はＢ－１株にも見られるため、温度感受性株に特徴的な点変異ではない。一方、温度感受性株（Ａ５０－１８）の特徴的な点変異として、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ、Ｇ４１６Ｓ、Ａ５０４Ｖ、ＳｐｉｋｅのＡ８７９Ｖ、ＥｎｖｅｌｏｐｅのＬ２８Ｐ、及びＮｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄのＳ２Ｆが見出された。
（１－２－３）復帰変異株の解析１
　「復帰変異」とは、変異したウイルスに更なる変異が入ることにより、変異する前の最初のウイルスと同じ表現型に戻ることをいう。本明細書においては、「復帰変異」は、温度感受性株に更なる変異が入ることで、温度感受性の特性が失われることをいう。更なる変異には、温度感受性化した際に入った変異箇所のアミノ酸が、変異前のアミノ酸に戻ることを含む。
　Ｂ－１株又はＡ５０－１８株をＭＯＩ＝０．０１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３２℃、３４℃、３７℃での増殖性を評価した結果、Ａ５０－１８株の中から、３７℃の増殖性が回復しているサンプル（以下、「復帰変異株」という）を見出した。復帰変異株では、温度感受性を獲得した温度感受性株（Ａ５０－１８株）が有する変異のうち、一部のアミノ酸残基が、変異前のアミノ酸に復帰変異（以下、単に「復帰変異」という）することで、温度感受性が低下し、３７℃の増殖性が回復したと思われる。このことを示すＣＰＥ像を図３Ｂに示した。得られたサンプルのシークエンスを確認したところ、ＮＳＰ１４におけるＧ２４８Ｖの変異が野生型のＧに復帰変異している一方、ＮＳＰ１４におけるＧ４１６Ｓ、Ａ５０４Ｖ及びＥｎｖｅｌｏｐｅにおけるＬ２８Ｐの変異は維持されていることが明らかとなった。このことから、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ変異が温度感受性に寄与する責任変異（温度感受性変異）であることが示唆された。
（１－２－４）分離株の復帰変異の解析２
　Ａ５０－１８株をｍｏｉ＝１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃、３８℃での増殖性を評価した。その結果、３７℃及び３８℃での増殖性が回復しているサンプル（復帰変異株）を見出した。取得した復帰変異株を３７℃で３日培養した後のＣＰＥ像を図３Ｃに示した。得られた復帰変異株のシークエンスを確認したところ、以下＜１＞及び＜２＞の２種類の復帰パターンが見出された。
＜１＞ＮＳＰ１４におけるＧ２４８Ｖの変異が野生型のＧに復帰変異している一方でＧ４１６ＳやＡ５０４Ｖの変異は維持
＜２＞ＮＳＰ１４におけるＧ４１６Ｓの変異が野生型のＧに復帰変異している一方でＧ２４８ＶやＡ５０４Ｖの変異は維持
　ＮＳＰ１４のＧ２４８ＶとＧ４１６Ｓのうち、少なくとも１つが復帰変異すると温度感受性を失ったことから、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ変異とＧ４１６Ｓ変異の組み合わせが温度感受性に寄与する責任変異（温度感受性変異）であることが示唆された。
（１－２－５）野生型に変異を導入した組換えウイルスの解析
　野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全ゲノムを有するＢＡＣ　ＤＮＡに対し、Ａ５０－１８株由来のＮＳＰ１４、Ｓｐｉｋｅ、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、Ｅｎｖｅｌｏｐｅを相同組換えにより導入した。得られた組換えＢＡＣ　ＤＮＡを２９３Ｔ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎすることでウイルスを再構築した。組換えウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃と３２℃でのＣＰＥを観察することで温度感受性を評価した。その結果を図３Ｄに示した。Ａ５０－１８株由来のＮＳＰ１４を導入することで、３７℃培養時にＣＰＥを示さない温度感受性株が得られたことから、ＮＳＰ１４が温度感受性に寄与する責任変異（温度感受性変異）であることが明らかとなった。一方で、Ａ５０－１８株由来のＥｎｖｅｌｏｐｅを導入しても温度感受性にはならなかったことから、Ｅｎｖｅｌｏｐｅの変異は温度感受性に寄与していないと考えられる。
（１－２－６）野生型に変異を導入した組換えウイルスの解析２
　ＣＰＥＲ法にて、ＮＳＰ１４の変異を導入したウイルスを再構築した。以下の各々のＮＳＰ１４の変異を有する、３種類の組換えウイルスを再構築した。
・Ｇ２４８Ｖのみ
・Ｇ４１６Ｓのみ
・Ｇ２４８Ｖ及びＧ４１６Ｓ（以下において、「二重変異株」とも記載する。）
　それぞれの組換えウイルスをＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃又は３２℃で３日間培養後のＣＰＥを観察した。図３－Ｅより、Ｇ２４８Ｖのみ変異を有するウイルス、及びＧ４１６Ｓのみ変異を有するウイルスでは、３７℃及び３２℃にてＢ－１株と同様、ＣＰＥが観察されたため、温度感受性化されていないことがわかった。一方で、Ｇ２４８Ｖ及びＧ４１６Ｓの変異を有する二重変異株のウイルスでは、３２℃にてＣＰＥが観察されたが、３７℃ではＣＰＥがわずかに観察された程度で、３２℃と比べ明らかにＣＰＥが弱くなっていた。上記結果より、Ｇ２４８Ｖ及びＧ４１６Ｓの変異を有することで、３７℃でのウイルス増殖性が低下し、温度感受性化することが明らかとなった。これより、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ変異とＧ４１６Ｓ変異の組み合わせが、温度感受性に寄与する責任変異（温度感受性変異）であることがわかった。
（１－２－７）サンガーシークエンスによる温度感受性株の解析
　サンガーシークエンスを用いて、Ａ５０－１８株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで当該解析を行った。その結果、後述する試験例２－２の（２－２－５）で認められたような欠失は見いだされなかった。
（１－２－８）温度感受性株の変異まとめ
　温度感受性株Ａ５０－１８株では、下記表２に示す通り、表示の配列番号のアミノ酸配列においてチェックマークを付した変異が見出され、その中で、二重チェックマークを付した変異が温度感受性変異として見出された。また、下記表２に示すとおり、ＮＳＰ１４の温度感受性変異のみを有する二重変異株も温度感受性株であることが見出された。
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［試験例１－３］温度感受性株Ａ５０－１８株の増殖性解析
（１－３－１）３２℃及び３７℃における解析
　臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）を、ＭＯＩ＝０．０１又は０．１の条件下で、６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを用いて、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた（Ｎ＝３）。３７℃又は３２℃で培養させた後、０～５ｄｐｉにて、それぞれの培養上清を回収した。０～５ｄｐｉの培養上清ウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍＬにて、Ｖｅｒｏ細胞を用いて測定した。結果を図４Ａに示した。
　図４Ａより、Ａ５０－１８株は３７℃における感染後３日目のウイルス力価が検出限界以下であり、３７℃での増殖性が著しく低下していることがわかった。
（１－３－２）３２℃、３４℃及び３７℃における解析
　臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）を、ＭＯＩ＝０．０１の条件下で、６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを用いて、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた（Ｎ＝３）。３７℃、３４℃又は３２℃で培養させた後、０～５ｄｐｉにて、それぞれの培養上清を回収した。０～５ｄｐｉの培養上清ウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍＬにて、Ｖｅｒｏ細胞を用いて測定した。結果を図４Ｂに示した。
　図４Ｂより、Ａ５０－１８株は３２℃、３４℃で臨床分離株と同程度に増殖する一方、３７℃での増殖性を著しく欠損していることがわかった。
［試験例１－４］温度感受性株Ａ５０－１８株の病原性解析
（１－４－１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの体重変動
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝４）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０4　ｏｒ　１ｘ１０6　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与し、１０日間の体重変動を観察した。同用量のＤ－ＭＥＭ培地を経鼻投与した群を非感染コントロール　（ＭＯＣＫ）とした。結果を図５に示した。
図５より、Ａ５０－１８株を感染させた際に体重減少はみられず、病原性が著しく低いことが示唆された。
（１－４－２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの肺内又は鼻腔内のウイルス量
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝３）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０6　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。３日間の体重変動を観察した結果を図６に示した。３　ｄｐｉにてハムスターを安楽死させた後、鼻腔洗浄液をＤ－ＰＢＳ　１ｍＬで回収した。また、ハムスターの肺を摘出し、右肺を破砕、Ｄ－ＭＥＭ　１　ｍＬによる懸濁の後、遠心分離にて上清を肺破砕液として回収した。これらの鼻腔洗浄液及び肺破砕液中のウイルス量をＶｅｒｏ細胞にてプラークフォーメーションアッセイにて評価した結果を図７に示した。更に、摘出した左肺を１０％ホルマリンにて固定し、撮影したものを図８に示した。
　図７より、鼻腔洗浄液ではＢ－１株とＡ５０－１８株でウイルス量に差がみられない一方、肺内ではＡ５０－１８株のウイルスが顕著に少ないことがわかった。また、図８より、Ｂ－１株が感染し、体重が減少しているハムスターは肺に膨潤や黒色変がみられる一方で、Ａ５０－１８株感染ハムスターは体重変動や肺に著変はみられないことがわかった。以上の結果より、温度感受性株は上気道で増殖する一方、下気道では増殖することができない弱毒株であると推定された。
（１－４－３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの組織学的解析
　（１－４－２）にて実施したハムスターへの感染実験により得られたホルマリン固定肺から切片を作製し、ＨＥ染色することによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による肺の組織学的な病原性を解析した。その結果を図９に示した。
　図９に示す通り、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）に感染したハムスターから得られた肺において、赤血球の浸潤や肺胞構造の崩壊が観察された。一方で、温度感受性株（Ａ５０－１８株）感染ハムスターの肺では、これらのような激しい病状は観察されなかった。このことからも、Ａ５０－１８株は感染時に肺にて激しい炎症を誘発せず、病原性が低いことが強く示唆された。
（１－４－４）免疫化学染色によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターの組織学的解析
　（１－４－３）にて観察された組織学的な病原性について、ウイルスの増殖と病原性の関連性を評価するため、免疫化学染色を行う事でウイルスタンパク質を検出した。４週齢雄性シリアンハムスター　（Ｂ－１，　Ａ５０－１８：　ｎ＝５，　ＭＯＣＫ：　ｎ＝３）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）及び温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０6　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。３　ｄｐｉにてハムスターを安楽死させた後、摘出した左肺を１０％ホルマリンにて固定し、連続切片を作製した。得られた連続切片についてＨＥ染色並びに免疫化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＨＣ）染色ともいう）を実施した。免疫化学染色にはウサギ抗スパイクポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ：　４０５８９－Ｔ６２）を用いた。ＨＥ染色像及び免疫化学染色像を図１０に示した。（１－４－３）と同様にＢ－１株感染ハムスターでは赤血球の浸潤や肺胞構造の崩壊がみられ、免疫化学染色にて広範囲にスパイクタンパク質が検出された。一方で、Ａ５０－１８株感染ハムスターではこのような組織障害は見られず、スパイクタンパク質も局所的に限られた領域でのみ検出された。これらの結果からも、Ｂ－１株は肺組織中においてウイルスが顕著に増殖して組織障害性を示している一方で、Ａ５０－１８株は肺組織中で効率的にウイルスが増殖できず、肺組織障害性が低いことが明らかとなった。
［試験例１－５］温度感受性株Ａ５０－１８株の免疫原性解析
（１－５－１）温度感受性株感染ハムスターへの野生株攻撃試験
　次の手順で、温度感受性株感染ハムスターへの野生株（臨床分離株）攻撃試験を行った。
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝４）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０4 ｏｒ　１ｘ１０6 ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。２１日後、再度臨床分離株（Ｂ－１株）（１ｘ１０6 ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与し、１０日間の体重変動を観察した。この際に、同週齢の非感染ハムスター　（ｎ＝３）をナイーブコントロールとして用いた。その結果を図１１に示した。
　図１１に示す通り、ナイーブハムスターはＢ－１株の感染により、体重の減少が観察された一方で、Ｂ－１株又はＡ５０－１８株に１度感染したハムスターは体重が減少することがなかった。このことから、野生株であるＢ－１株だけでなく、病原性の低いＡ５０－１８株による感染においても、感染防御に寄与する免疫を誘導することが明らかとなった。
（１－５－２）温度感受性株感染ハムスターの中和抗体誘導解析
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝５）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株）（１ｘ１０6　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。感染後の体重変動を図１２に示した。これまでの結果と同様に、Ｂ－１株の感染により体重が減少する一方、Ａ５０－１８株の感染では体重の減少は観察されなかった。
　感染後２１日時点にて、全血を採取し、血清を分離したのち、５６℃で３０分間熱による血清の非働化を行った。１００　ＴＣＩＤ５０のＢ－１株と段階希釈した非働化血清を混和し、３７℃で１時間反応させた。反応後の培養液をＶｅｒｏ細胞に播種し、３７℃培養の後、ＣＰＥを観察することでウイルスの中和活性を評価した。ＣＰＥを生じない最高の希釈倍率を中和抗体価（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ）とした。結果を図１３に示した。非感染ハムスターの血清はＢ－１株に対する中和活性を示さない一方で、Ｂ－１株又はＡ５０－１８株感染ハムスター血清は中和抗体を誘導できた。
［試験例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株Ｈ５０－１１株，Ｌ５０－３３株，Ｌ５０－４０株（実施例）］
［試験例２－１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株Ｈ５０－１１株，Ｌ５０－３３株，Ｌ５０－４０株の追加分離
　更なる候補株の分離を目的とし、図１４の手法にて温度感受性株の分離を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）をＶｅｒｏ細胞に感染させ、突然変異誘導剤５－ＦＵを添加した状態で、３２℃にて馴化させたＧ～Ｌ５０シリーズのウイルス集団を取得した。更に、各々のウイルス集団の継代を複数回行い、得られた２５３の株の中から、３２℃で増殖できる一方で、３７℃で増殖性が著しく低下しているウイルス株（Ｈ５０－１１株，　Ｌ５０－３３株，　Ｌ５０－４０株）を見出し、分離、選択した（図１５）。
［試験例２－２］次世代シーケンスによる温度感受性追加分離株Ｈ５０－１１株，Ｌ５０－３３株，Ｌ５０－４０株の解析
（２－２－１）追加分離株の変異解析法
　次世代シークエンサーを用いて、以下のウイルス株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで、当該解析を行った。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅとして、武漢臨床分離株であるＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＮＣ０４５５１２）を用いた。
　Ｈ５０－１１株：　温度感受性株
　Ｌ５０－３３株：　温度感受性株
　Ｌ５０－４０株：　温度感受性株
（２－２－２）温度感受性株変異解析結果
　（２－２－１）にて、図１６Ａの解析結果を取得した。Ｈ５０－１１株の特徴的な点変異として、ＮＳＰ３のＶ４０４Ａ及びＤ１８３２Ｎ、ＮＳＰ１６のＶ６７Ｉ、並びにＳｐｉｋｅのＴ７３９Ｋが見出された。また、Ｌ５０－３３株の特徴的な点変異として、ＮＳＰ３のＬ４４５Ｆ、Ｋ１７９２Ｒが、Ｌ５０－４０株の特徴的な点変異として、ＮＳＰ３のＬ４４５Ｆ、Ｋ１７９２Ｒ、ＳｐｉｋｅのＬ５４Ｗが見出された。
（２－２－３）追加分離株の復帰変異株の解析（Ｈ５０－１１株）
　Ｈ５０－１１株をｍｏｉ＝１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３７℃、３８℃での増殖性を評価した。その結果、３７℃及び３８℃での増殖性が回復しているサンプル（復帰変異株）を見出した。取得した復帰変異株を３８℃で３日培養した後のＣＰＥ像を図１６Ｂに示した。得られたサンプルのシークエンスを確認したところ、ＮＳＰ１６　Ｖ６７Ｉの変異が野生型のＶに復帰変異していた一方、その他のアミノ酸変異は維持されていた。このことから、ＮＳＰ１６のＶ６７Ｉ変異が温度感受性に寄与する責任変異（温度感受性変異）であることが示唆された。
（２－２－４）追加分離株の復帰変異株の解析（Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株）
　Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株をＭＯＩ＝０．０１にてＶｅｒｏ細胞に感染させ、３２℃、３４℃、３７℃での増殖性を評価した。その結果、Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株の中から、３７℃の増殖性が回復しているサンプル（以下、復帰変異株）を見出した。それぞれの株を３７℃で３日培養した後のＣＰＥ像を図１６Ｃに示した。Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株の復帰変異株を、それぞれ、Ｌ５０－３３株　Ｒｅｖ１、２及びＬ５０－４０株　Ｒｅｖ１、２と示す。得られたサンプルのシークエンスを確認したところ、ＮＳＰ３におけるＬ４４５Ｆの変異が野生型のＬ又はＣに変異している一方、ＮＳＰ３におけるＫ１７９２Ｒの変異は維持されていることが明らかとなった。このことから、ＮＳＰ３のＬ４４５Ｆ変異が温度感受性に寄与する責任変異（温度感受性変異）である可能性が示唆された。
（２－２－５）サンガーシークエンスによる温度感受性株の解析
　サンガーシークエンスを用いて、Ｈ５０－１１株、Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株の変異解析を行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清からＲＮＡを抽出することで当該解析を行った。
　その結果、３株すべてに、図１７に示すような２７５４９～２８２５１位の塩基配列（配列番号７）の欠失が見出された。２７５４９～２８２５１位の塩基配列の欠失及びそれにコードされるアミノ酸配列の欠失の概要図を図１８に示した。また、図１８において、ＯＲＦ７ａは２７３９４～２７７５９位の塩基配列であり、ＯＲＦ７ｂは２７７５６～２７８８７位の塩基配列であり、ＯＲＦ８は２７８９４～２８２５９位の塩基配列である。
　図１８に示す通り２７５４９～２８２５１位の塩基配列領域は、ＯＲＦ７ａの一部分（５３番目から末端のアミノ酸配列。以下同様）、ＯＲＦ７ｂ全体、及びＯＲＦ８の大部分のアミノ酸配列に該当する。本領域の欠失はフレームシフトを伴うため、ＯＲＦ７ａの１－５２番目のアミノ酸配列と、ＯＲＦ８の３’末端８塩基及び遺伝子間領域とヌクレオカプシドの塩基配列がコードするアミノ酸配列が融合したタンパク質が産生されたと考えられた。また、ＯＲＦ７ｂは全体が欠失し、ＯＲＦ８の本来の配列も全体が欠失した。
（２－２－６）温度感受性株の変異まとめ
　温度感受性株Ｈ５０－１１株、Ｌ５０－３３株及びＬ５０－４０株では、下記表３に示す通り、表示の配列番号のアミノ酸配列においてチェックマークを付した変異が見出され、その中で、二重チェックマークを付した変異が温度感受性変異として見出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［試験例３］追加分離株Ｈ５０－１１株，Ｌ５０－３３株，Ｌ５０－４０株の増殖性解析（実施例）
　追加分離株を、ＭＯＩ＝０．０１の条件下でＶｅｒｏ細胞に感染させた（Ｎ＝３）。３７℃、３４℃又は３２℃で培養後、０～５　ｄ．ｐ．ｉ．において、それぞれの培養上清を回収した。これらの培養上清ウイルス力価をＴＣＩＤ50／ｍＬにて、Ｖｅｒｏ細胞を用いて測定した。その結果を図１９に示した。これにより、得られた追加分離株は、３２℃、３４℃で増殖性を示す一方、３７℃では増殖性が低下した。
［試験例４］各温度感受性株の病原性解析
（４－１）　温度感受性株感染ハムスターの体重変動
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝５）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］、並びに、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、及びＨ５０－１１株［実施例］）（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与し、１０日間の体重変動を観察した。同用量のＤ－ＭＥＭ培地を経鼻投与した群を非感染コントロール（ＭＯＣＫ）とした。結果を図２０に示した。Ｂ－１株を感染させたハムスターでは７日間で２０％程度の体重低下が認められたのに対し、温度感受性株を感染させたハムスターではすべての群で顕著な体重低下はみられず、病原性が著しく低いことが示唆された。
（４－２）　温度感受性株感染ハムスターの肺内又は鼻腔内のウイルス量
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝５）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］、並びに、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、及びＨ５０－１１株［実施例］）（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。３　ｄｐｉにてハムスターを安楽死させた後、鼻腔洗浄液をＤ－ＰＢＳ　１ｍＬで回収した。また、ハムスターの肺を摘出し、肺重量を測定したのち、右肺を破砕、Ｄ－ＭＥＭ　１　ｍＬによる懸濁の後、遠心分離にて上清を肺破砕液として回収した。ハムスターの総体重あたりの肺重量を図２１に示した。またこれらの鼻腔洗浄液及び肺破砕液中のウイルス量をＶｅｒｏ細胞にてプラークフォーメーションアッセイにて評価した結果を図２２に示した。
　ハムスターの総体重量あたりの肺重量を比較した結果、Ｂ－１株感染ハムスターは肺重量が増加しており、炎症などにより肺が膨潤していることが強く示唆された。一方で、温度感受性株感染ハムスターではこのような肺重量の増加は観察されなかった。また、鼻腔洗浄液中のウイルス量を比較した結果、Ｂ－１株感染ハムスターとＨ５０－１１株を除く温度感受性株感染ハムスターでは顕著な差がなく、Ｈ５０－１１株感染ハムスターは鼻腔洗浄液中のウイルス量が少なかった。更に、温度感受性株感染ハムスターはＢ－１株感染ハムスターより顕著に肺内ウイルス量が少ないことが明らかとなった。これらの結果から、各温度感受性株は試験例１におけるＡ５０－１８株と同様に下気道では増殖することができない弱毒株であることが推察された。
［試験例５］各温度感受性株の免疫原性解析
（５－１）　温度感受性株感染ハムスターへの野生株攻撃試験
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝５）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］、並びに、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、及びＨ５０－１１株［実施例］）（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。２１日後、再度臨床分離株（Ｂ－１株）（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与し、９日間の体重変動を観察した。この際に、同週齢の非感染ハムスター　（ｎ＝５）をナイーブコントロールとして用いた。その結果を図２３に示した。ナイーブハムスターはＢ－１株の感染により、体重の減少が観察された一方で、Ｂ－１株及び各温度感受性株に１度感染したハムスターの体重は減少しなかった。このことから、野生株であるＢ－１株だけでなく、病原性の低い各温度感受性株による感染においても、感染防御に寄与する免疫を誘導できることが明らかとなった。
（５－２）　温度感受性株感染ハムスターの中和抗体誘導解析
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝５）　を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］、並びに、Ｌ５０－３３株、Ｌ５０－４０株、及びＨ５０－１１株［実施例］）（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。２０日後に部分採血を実施し、得られた血清を用いて臨床分離株（Ｂ－１株）に対する中和活性を測定した。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。測定結果を図２４に示した。Ｂ－１株の感染のみならず、各温度感受性株感染ハムスターでも中和活性を有する抗体が誘導されることが明らかとなった。
［試験例６］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株への有効性解析（参考例）
　温度感受性株感染ハムスター血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価
　４週齢雄性シリアンハムスター（ｎ＝３又は５）を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。感染後３週間のハムスターから部分採血を実施し、得られた血清を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欧州型臨床分離株（Ｂ－１）及びブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）の生ウイルスに対する中和活性を測定した結果を図２５に示した。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。Ｂ－１株や温度感受性株に感染したハムスターはブラジル型変異株に対しても中和活性を示すことが明らかとなった。このことから、本弱毒生ワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対しても有効であることが推察された。
［試験例７］投与経路、投与量の比較検討実験（参考例）
（７－１）　投与経路による免疫誘導能の比較
　４週齢雄性シリアンハムスター（ｎ＝５）を一週間飼育した後、臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）又は温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻、又は皮下投与した。未処置群をナイーブコントロール（ｎａiｖｅ）とした。３週間後、ハムスターから部分採血により得られた血清を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）に対する中和活性を評価した。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。中和活性の結果を図２６に示した。ｉ．ｎは経鼻投与、Ｓ．Ｃは皮下投与を示す。Ｂ－１株やＡ５０－１８株の経鼻投与では生ウイルスに対して中和抗体を誘導できた。皮下投与については、試験した用量ではほとんど中和抗体を誘導できなかったが、経鼻投与での結果に鑑みると、用量を増やすと皮下投与でも中和抗体を誘導できると考えられた。
（７－２）　投与量による免疫誘導能の比較
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝５）　を一週間飼育した後、温度感受性株（Ａ５０－１８株）を経鼻、又は皮下投与した。投与量を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　感染後３週間のハムスターから部分採血を実施し、得られた血清を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）の生ウイルスに対する中和活性を測定した結果を図２７に示した。ｉ．ｎは経鼻投与、Ｓ．Ｃは皮下投与を示す。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。（７－１）と同様に、経鼻投与では１ｘ１０2　ＴＣＩＤ５０／１０　μＬの低用量投与群でも中和抗体価の上昇が観察された。このことから、温度感受性株は少量の鼻腔投与でも十分な免疫を誘導できる可能性が示唆された。皮下投与については、試験した用量ではほとんど中和抗体を誘導できなかったが、経鼻投与での結果に鑑みると、用量を増やすと皮下投与でも中和抗体を誘導できると考えられた。
［試験例８］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株への有効性解析（参考例）
　４週齢雄性シリアンハムスター　（ｎ＝４）　を一週間飼育した後、１ｘ１０4　ＴＣＩＤ５０又は１ｘ１０2　ＴＣＩＤ５０の温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）を１０　μＬの用量で経鼻投与した。感染後３週間のハムスターから部分採血を実施し、得られた血清を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　欧州型野生株（Ｂ－１株）、インド型変異株（自家分離株）、ブラジル型変異株（ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０３／２０２１株）の生ウイルスに対する中和活性を測定した結果を図２８に示した。中和活性の測定方法は（１－５－２）と同様の手法を用いた。親株であり野生型であるＢ－１株のみならず、Ａ５０－１８株を少量経鼻投与した個体でも、インド型変異株やブラジル型変異株に対する中和抗体を用量依存的に誘導できたことが明らかとなった。
　また、各個体の血清の各株に対する中和抗体価を比較した結果を図２９に示した。ブラジル型変異株に対しては一部の個体で中和抗体価の減少がみられるものの、すべての個体で中和抗体を保有していることが明らかとなった。これらの結果から温度感受性株の経鼻投与による免疫は交差防御を示す可能性が示唆された。
［試験例９］ＣＰＥＲ反応によるワクチン候補株の作出（実施例）
　本来、弱毒生ワクチンは宿主体内で増殖を伴うため、核酸複製の際に発生する突然変異により、強毒型の野生株が発生する可能性がある。その可能性を低減するため、温度感受性変異と増殖低減性その他の弱毒性変異を複合した株を構築した。このような株は、温度感受性変異が失われた場合であっても弱毒性を維持できるように構築した。温度感受性変異及び増殖低減性その他の弱毒性変異、並びに他の変異として、表５にチェックで示す変異［つまり、ＮＳＰ３のＬ４４５Ｆ、ＮＳＰ１４のＧ２４８Ｖ及びＧ４１６Ｓ、及びＮＳＰ１６のＶ６７Ｉ；ＮＳＰ１の３２～３９番目の８アミノ酸欠失、スパイクのｆｕｒｉｎ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｓｉｔｅ（ＦＣＳ）の欠失（具体的には、スパイクの６７９～６８６番目の欠失及びＶ６８７Ｉ）、ＯＲＦ８の機能欠失；温度感受性株で見出された他の変異（ＮＳＰ３　Ｋ１７９２Ｒ及びＮＳＰ１４　Ａ５０４Ｖ）のいずれか］を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＣＰＥＲを用いたリバースジェネティクス法により、上記温度感受性変異と増殖低減性その他の弱毒性変異とを他の変異とともに複合して有する株を構築した (Torii et al. cell report 2020)。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株　のゲノムを断片化し、プラスミドにクローニングした。ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを用いて、クローニングされたフラグメントに目的の変異を導入した。野生型のフラグメントをクローニングしたプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型ゲノム断片フラグメントを獲得した。また、変異が導入されたプラスミド、又は目的の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲを行うことでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異型ゲノム断片フラグメントを獲得した。
　得られた断片フラグメント及びＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒを含むリンカーフラグメントを混合し、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＣＰＥＲを行う事で、複数の断片を環状化した。反応液をＢＨＫ／ｈＡＣＥ２細胞にトランスフェクションし、３４℃で培養を行うことで目的のウイルスを再構築した。得られた細胞の培養上清をＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ　II細胞に添加し、３４℃で培養することで、再構築されたウイルスの回復培養を行った。各候補株に導入した温度感受性株変異及び／又は増殖低減性その他の弱毒性変異並びにＣＰＥ像を図３０に示す。ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ　II細胞でＣＰＥが観察されていることから、ウイルスが再構築されたことが明らかとなった。
［試験例１０］候補株の温度感受性評価（実施例）
　（１０－１）候補株１～７の温度感受性
　試験例９で得られた候補株１～７（実施例）の温度感受性を評価するため、それぞれの候補株の回復培養の上清２μＬをＶｅｒｏ細胞に感染させ、３４℃、３７℃での増殖性を比較した。３日間培養した後のＣＰＥ像を図３１Ａに示した。全ての株が３４℃でＣＰＥを示したのに対し、候補株１、２、３、６、７は３７℃でＣＰＥを示さなかった。候補株４、５は、わずかにＣＰＥを生じたものの、その程度は３４℃よりも弱かった。このことから、ワクチン候補株が温度感受性を示すことが確かめられた。
　（１０－２）すべての温度感受性変異を導入し再構築した株の温度感受性
　すべての温度感受性変異を導入し再構築した株（ｒＴｓ－ａｌｌ株［実施例］）を得た。ｒＴｓ－ａｌｌ株は、温度感受性変異として、（ｂ）の変異と、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせと、（ｈ）の変異との３種が導入され、且つ、他の弱毒性変異として、（ｎ）の変異のみが導入され、他の変異は導入されていない。
　ｒＴｓ－ａｌｌ株をＶｅｒｏ細胞にＭＯＩ＝０．０１で感染させ、３２、３７、３９℃で５日間培養し、培養上清を経時的にサンプリングした（ｎ＝３）。各時点でのウイルス力価をＴＣＩＤ５０法で測定した。比較対象には、ＣＰＥＲ法で作製したＢ－１株（ｒＢ－１株）を用いた。得られた増殖曲線を図３１Ｂに示した。図３１Ｂに示されるとおり、ｒＴｓ－ａｌｌ株は３２℃で増殖する一方、３７℃及び３９℃の増殖性が著しく低下した（ｄａｙ１に検出限界を下回り、以降増殖しなかった）。なお、ｒＴｓ－ａｌｌ株は、３２℃における増殖がｒＢ－１株と比較してやや遅延していたことから、温度感受性のレベルとしては、好ましい程度（つまり、３２℃での増殖性がｒＢ－１株と同程度）よりも強く発現したと認められる。この結果から、温度感受性のレベルを好ましい程度に制御するためには、温度感受性変異（すなわち、（ｂ）の変異、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、（ｈ）の変異の３種の変異又は変異の組み合わせ）のうち、３種を選択するよりも、１種又は２種を選択する方が好ましいことが判った。
［試験例１１］候補株１，３，４，６，７の低力価、低用量時の免疫原性評価（中和抗体価誘導）（実施例）
　試験例９で得られた候補株のうち、候補株１，３，４，６，７（実施例）の免疫原性を評価するため、５週齢雄性ハムスター５匹に１００　ＴＣＩＤ５０の各候補株を１０μＬ経鼻投与した。また、陽性対照としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株Ａ５０－１８株を同力価、同用量で経鼻投与した。３週間後に部分採血を実施して得られた血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株に対する中和活性を評価した。中和活性は段階希釈血清と１００　ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を混合し、１時間反応した後、Ｖｅｒｏ細胞に添加、４日間培養後のＣＰＥを観察することで感染性ウイルスの有無を判定する方法により評価した。ＣＰＥが見られず、ウイルスの感染性を中和することができた血清の最大希釈倍率を中和抗体価とした。その結果を図３２に示した。
　陽性対象群であるＡ５０－１８株（参考例）の感染ハムスターでは全個体で中和活性の陽転が観察された。候補株１及び候補株３では、本試験例での投与条件では中和活性の陽転が観察されなかったため、免疫原性を発現させるためには、さらに高用量で投与する必要があることが示唆される。一方、候補株４、６、７はいずれも、一部個体又は全個体で中和活性の陽転が観察されており、本試験例のような低用量でも免疫原性を有していたことが判った。特に、候補株７（実施例）の感染ハムスターではＡ５０－１８株と同様に全個体で中和活性の陽転が観察されていたため、免疫原性の程度が、特に優れていた。つまり、本試験例での投与条件で中和活性の陽転が観察された候補株のうち、候補株４、６は温度感受性変異と他の弱毒性変異とを組み合わせて構築されることで安全性が向上しており、特に候補株７については、温度感受性変異と増殖低減性その他の弱毒性変異とを組み合わせて構築されることで、体内での増殖性が著しく低下しているにも関わらず優れた免疫原性を維持していた。
［試験例１２］候補株７の低力価、低用量時の免疫原性評価（攻撃試験）（実施例）
　候補株７で誘導された免疫が感染防御に寄与しているかどうか評価するため、免疫後のハムスター（雄性８週齢）に３×１０5　ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株を１００μＬ経鼻投与することで攻撃試験を実施した。その際のハムスターの体重変動を図３３に示した。陽性対照として用いたＡ５０－１８株（参考例）と同様に、候補株７（実施例）に感染したハムスターはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株に感染させた際に体重が低下しなかった。この結果から、候補株７（実施例）はＡ５０－１８株（参考例）同様に感染防御に寄与する免疫を誘導できたことが明らかとなった。
［試験例１３］候補株２，５の高力価、高用量時の免疫原性評価（実施例）
　候補株２、５（実施例）について、高力価、高用量で実験した際の免疫原性を評価した。５週齢雄性ハムスター５匹に１×１０3又は１×１０4　ＴＣＩＤ５０の候補株を２０μＬ経鼻投与した。また、陽性対象としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株Ａ５０－１８株（参考例）１×１０3　ＴＣＩＤ５０を同用量で経鼻投与した。３週間後の感染回復ハムスターから部分採血を実施し、得られた血清の中和活性を評価した。中和活性の測定は試験例３と同等の方法で実施した。その結果を図３４に示した。
　候補株２では１×１０3　ＴＣＩＤ５０の投与により、５匹中４匹の個体で中和抗体の陽転が観察され、１×１０4　ＴＣＩＤ５０を投与した際には全個体で中和抗体の陽転が観察された。候補株５では１×１０3　ＴＣＩＤ５０の投与では５匹中１匹でのみ血清の中和活性が確認されたものの、１×１０4　ＴＣＩＤ５０のウイルスを投与することにより、５匹中３匹で中和抗体の誘導が観察された。これらの結果から、温度感受性変異と増殖低減性その他の弱毒性変異とを複合したワクチン候補株は、温度感受性変異のみを有する株と比較して同用量では免疫原性が低いものの、用量を上げることで中和抗体の誘導に必要な免疫原性を示すことが明らかとなった。また、候補株２は、サルにおいても中和活性が確認されたため、免疫誘導を示すことがわかった。
［試験例１４］候補株２の各温度における増殖性評価
　臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）及び候補株２（［実施例］）を、ＭＯＩ＝０．０１の条件下で、６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを用いて、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた（Ｎ＝３）。３７℃、又は３２℃で培養し、０～５ｄｐｉにて、それぞれの培養上清を回収した。０～５ｄｐｉの培養上清ウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍＬにて、Ｖｅｒｏ細胞を用いて測定した。結果を図３５に示した。
　図３５より、候補株２（［実施例］）は３２℃で臨床分離株（Ｂ－１株［比較例］）と同程度に増殖する一方、３７℃での増殖性が著しく低下した。
［試験例１５］候補株２の投与により誘導された液性免疫の持続性試験（実施例）
　４週齢雄性シリアンハムスター（ｎ＝１０）を一週間飼育した後、麻酔条件下で候補株２（実施例）（１ｘ１０3　ＴＣＩＤ５０　又は　１ｘ１０4　ＴＣＩＤ５０）を２０　μＬの用量で経鼻投与した。２回投与の群においては、１回目投与後４週の時点において、麻酔条件下で再度候補株２（１ｘ１０3　ＴＣＩＤ５０　又は　１ｘ１０4　ＴＣＩＤ５０）を２０　μＬの用量で経鼻投与した。経時的に部分採血を行い、得られた血清を５６℃で３０分間熱処理することで非働化を行った。１００　ＴＣＩＤ５０のＢ－１株（Ｄ６１４Ｇ型：　ｐｒｅ－ａｌｐｈａ欧州株）又はＴＹ３８－８７３株（オミクロンバリアント）と段階希釈した非働化血清を混和し、３７℃で１時間反応させた。反応後の培養液をＶｅｒｏ細胞に播種し、３７℃培養の後、ＣＰＥを観察することでウイルスの中和活性を評価した。ＣＰＥを生じない最低の希釈倍率を中和抗体価（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ）とした。その結果を図３６に示した。
　図３６より、候補株２の単回投与により、血清の中和抗体価が６～１２まで上昇した。また、１回目投与後４週の時点において、２回目の投与を行った際に、中和抗体価の上昇は見られず、単回投与により十分な液性免疫を誘導していることが示唆された。また、このようにして得られた血清中和抗体は投与後４か月時点においても、顕著に減少することはなかった。これらの結果から候補株２はハムスターモデルにおいて、１ｘ１０3　ＴＣＩＤ５０の単回投与で十分な液性免疫を誘導し、その液性免疫は投与後少なくとも４か月まで持続することが明らかとなった。また、候補株２感染ハムスターの脾臓細胞をスパイク抗原ペプチドで刺激することで抗原特異的なＩＦＮ－γの産生が誘導された。この結果から候補株２の投与により、抗原特異的なＴｈ１細胞が誘導されており、候補株２は細胞性免疫も誘導することが明らかとなった。
［試験例１６］候補株２投与による感染防御試験（実施例）
　試験例１３にて１×１０3、１×１０4　ＴＣＩＤ５０の候補株２、又は１×１０3　ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２温度感受性株Ａ５０－１８株を２０μＬ経鼻投与したハムスターについて、初回投与の３週間後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株（３ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を麻酔条件下で１００μＬの用量で経鼻投与することで攻撃試験を実施した。攻撃試験実施後のハムスターの体重を投与後６日まで測定した。その結果を図３７に示した。
　図３７より、候補株２又はＡ５０－１８株を感染させたハムスターはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株の感染時に体重が低下することがなく、感染防御に寄与する免疫を誘導できていることが明らかとなった。
［試験例１７］候補株２のｉｎ　ｖｉｖｏ継代時における毒力復帰検討（実施例）
　４週齢雄性シリアンハムスター（ｎ＝５）を一週間飼育した後、麻酔条件下で温度感受性株Ａ５０－１８株又は候補株２（１ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を１００　μＬの用量で経鼻投与した。この投与量は、ハムスター無有害作用量からヒト無有害作用量を外挿する除数３０を用いたヒト等価用量で、２×１０5ＰＦＵ／ｄｏｓｅに相当する。体重変動を観察するとともに、投与後３日の時点においてハムスターを安楽死させたのち、５００　μＬのＰＢＳを用いて鼻腔洗浄液を回収した。得られた鼻腔洗浄液を０．２２　μｍのフィルターでろ過滅菌したのち、その１００　μＬの鼻腔洗浄液を次代のハムスターに麻酔条件下で経鼻投与した。同様の操作を３回行うことで、１回～４回のｉｎ　ｖｉｖｏ継代を行った際の鼻腔洗浄液を獲得した。得られた鼻腔洗浄液をＶｅｒｏ細胞に播種し、各温度で培養することで感染性のウイルスの有無及びそのウイルスの温度感受性を評価した。また、鼻腔洗浄液からウイルスＲＮＡを抽出し、サンガーシークエンス法により、目的部位の塩基配列を確認した。各継代後の鼻腔洗浄液を播種したＶｅｒｏ細胞におけるＣＰＥの有無を図３８、４回目のｉｎ　ｖｉｖｏ継代を行った際の鼻腔洗浄液から抽出したウイルスＲＮＡの配列確認結果を図３９、各ｉｎ　ｖｉｖｏ継代時のハムスターの体重変動の結果を図４０に示した。
　Ａ５０－１８株は温度感受性株であるため、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた後、３７℃や３９℃で培養した際にＣＰＥを引き起こさないが、図３８より、Ａ５０－１８株を感染させたハムスターの鼻腔洗浄液をＶｅｒｏ細胞に添加し、３７℃や３９℃で培養した際にはＣＰＥを引き起こすことが観察された。また、図３９より、ｉｎ　ｖｉｖｏ継代後の鼻腔洗浄液中に含まれるウイルスＲＮＡの配列を確認した結果、温度感受性をもたらす変異であるＮＳＰ１４の変異のうち、Ｇ４１６ＳやＧ２４８Ｖの変異が失われていることが明らかとなった。さらに、図４０より、ｉｎ　ｖｉｖｏ継代時のハムスターの体重変動を評価すると、Ａ５０－１８株のｉｎ　ｖｉｖｏ継代後の鼻腔洗浄液を感染させたハムスターは体重が低下することが観察された。これらの結果から、Ａ５０－１８株はハムスターの体内において、温度感受性をもたらす変異が失われることで、温度感受性を失った毒力復帰株が発生し別の個体に伝播する可能性があることが示唆された。
　一方で、候補株２においては、図３８より、１回目のｉｎ　ｖｉｖｏ継代後の鼻腔洗浄液からは温度感受性を示すウイルスが検出される一方、２回目以降のｉｎ　ｖｉｖｏ継代後の鼻腔洗浄液からはウイルスがほとんど検出されなかった。また、図３９より、ｉｎ　ｖｉｖｏ継代後の鼻腔洗浄液中に含まれるウイルスＲＮＡの配列を確認した結果、温度感受性をもたらす変異の一部が失われていたものもあった（但し、そのような継代株でも、ＮＳＰ１４における２４８位及び４１６位の変異の組み合わせの一方が失われたのみであった）。一方、弱毒性をもたらす変異であるＮＳＰ１の一部欠失（増殖低減性変異）、スパイクのフリン開裂部位の欠失、及びＯＲＦ７ａ－８の欠失は保たれていた。さらに、図４０より、候補株２のｉｎ　ｖｉｖｏ継代後の鼻腔洗浄液を感染させたハムスターでも体重の低下は認められなかった。これらの結果から、候補株２は、温度感受性をもたらす変異のみを有するＡ５０－１８株と比較して、毒力復帰が生じる可能性の少ない候補株であることが示唆された。この結果から、本発明のベータコロナウイルス弱毒株は、所定の温度感受性変異（置換変異）に、さらに所定の増殖低減性その他の弱毒性変異（欠失変異）が組み合わせられていることで、当該ウイルスを生ワクチンとしてヒトに接種した場合も、毒力復帰したウイルスが伝播する可能性が低い点でワクチンとしての有用性が顕著に向上したことが推測できる。
［試験例１８］候補株２による組織障害性評価（実施例）
　４週齢雄性シリアンハムスター（ｎ＝４）を一週間飼育した後、麻酔条件下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株［比較例］、温度感受性株Ａ５０－１８株［参考例］又は候補株２［実施例］（１ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を２０　μＬの用量で経鼻投与した。この投与量は、ハムスター無有害作用量からヒト無有害作用量を外挿する除数３０を用いたヒト等価用量で、４×１０4ＰＦＵ／ｄｏｓｅに相当する。非感染群（ｎａｉｖｅ）には麻酔条件下で同用量の培地を経鼻投与した。また、ポジティブコントロールとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株（１ｘ１０5　ＴＣＩＤ５０）を麻酔条件下で１００　μＬの用量で経鼻投与した。２０　μＬの用量で経鼻投与することによりハムスターの上気道までウイルス液が到達し、１００　μＬの用量で経鼻投与することによりハムスターの下気道までウイルス液が到達した。投与後３日時点において、安楽死させたのち頭部ならびに肺をホルマリン固定し、ＨＥ染色にて組織障害性を評価するとともに、Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ｓｐｉｋｅ　ＲＢＤ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（４０５９２－Ｔ６２））を用いたＩＨＣ染色にてウイルス抗原を検出した。各個体の鼻腔、肺部における病変ならびにＩＨＣによるウイルス抗原の検出のスコアを表６に示した。本表のＬｅｖｅｌ１は鼻腔の先端部、Ｌｅｖｅｌ２は鼻腔の中部、Ｌｅｖｅｌ３は鼻腔の奥を示す。また、各ウイルス感染ハムスターの各部位における代表例について、Ｌｅｖｅｌ１を図４１、Ｌｅｖｅｌ２を図４２、Ｌｅｖｅｌ３を図４３、肺を図４４に示した。
　図４１～図４４より、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｂ－１株（比較例）を投与した系では、下気道までウイルス液を経鼻投与したポジティブコントロールのみならず、上気道にウイルス液を経鼻投与したハムスターにおいて、鼻腔の先端部から深部ならびに肺において組織障害及びウイルスの抗原が検出された。Ａ５０－１８株（参考例）又は候補株２（実施例）を上気道に経鼻投与したハムスターでは鼻腔先端部でのみ軽度の組織障害及びウイルス抗原が検出された一方で、鼻腔深部及び肺では組織障害及びウイルス抗原は検出されなかった。これらの結果から、候補株２（実施例）及び温度感受性株Ａ５０－１８株（参考例）は、外気温に近い鼻腔先端部ではウイルスの増殖やそれに伴う組織障害が生じる一方、体温に近い鼻腔深部や肺ではウイルス増殖及びそれに伴う組織障害が抑制されること、及び、候補株２（実施例）の方が、ウイルスの増殖及びそれに伴う組織障害の抑制効果がより高いこと、更に嗅覚障害が起こるリスクが低いことが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［試験例１９］候補株２による免疫原性評価（ヘテロ株による攻撃試験）
　候補株２で誘導された免疫がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　オミクロンバリアントの感染防御に寄与しているかどうかを評価した。４週齢雄性シリアンハムスターを一週間飼育した後、麻酔条件下で候補株２（１ｘ１０3　ＰＦＵ）を２０　μＬの用量で経鼻投与した。投与後４週の時点において、部分採血により血清を採取した。得られた血清を５６℃で３０分間熱処理することで非働化を行った。１００　ＴＣＩＤ５０のＢ－１株（Ｄ６１４Ｇ型：ｐｒｅ－ａｌｐｈａ欧州株）又はＴＹ４１－７０２株（オミクロンバリアント：ＢＡ．５）と段階希釈した非働化血清を混和し、３７℃で１時間反応させた。反応後の培養液をＶｅｒｏ細胞に播種し、３７℃培養の後、ＣＰＥを観察することでウイルスの中和活性を評価した。ＣＰＥを生じない最低の希釈倍率を中和抗体価（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ）とした。その結果を図４５に示す。また、投与後４週の時点において、候補株２投与ハムスターとナイーブハムスターに対して、麻酔条件下でＴＹ４１－７０２株（３ｘ１０5　ＰＦＵ）を１００　μＬの用量で経鼻投与することで攻撃試験を実施した。経時的に体重を測定し、攻撃試験の実施後４日の時点において、ハムスターを安楽死した後、肺内および鼻腔洗浄液中の感染性ウイルスを定量した。その際の体重変動を図４６に示す。
　図４５より、中和抗体価の測定の結果、候補株２を投与することによってＢ－１株に対する中和抗体だけでなく、オミクロンバリアントＢＡ．５に対する中和抗体もある程度誘導することが明らかとなった。更に、これらの候補株２を投与したハムスターに対してオミクロンバリアントＢＡ．５による攻撃試験を実施したところ、図４６より、ナイーブハムスターと比較して体重の回復が早い傾向が見られた。また、感染後４日における肺内、鼻腔洗浄液中のウイルス量を定量した結果、ナイーブハムスターと比較して候補株２を投与したハムスターでは体内ウイルス量が少ないことが示唆された。
［試験例２０］ 候補株２による免疫原性評価（ヘテロ株による中和活性評価）
　候補株２で誘導された免疫が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　デルタバリアント及びガンマバリアントに有効かどうかを評価した。試験例１３にて得られた候補株２免疫血清のガンマバリアント及びデルタバリアントに対する中和活性を測定した。１００　ＴＣＩＤ５０のＢＫ３２５株（デルタバリアント）又はＴＹ７－５０１株（ガンマバリアント）と段階希釈した非働化血清を混和し、３７℃で１時間反応させた。反応後の培養液をＶｅｒｏ細胞に播種し、３７℃培養の後、ＣＰＥを観察することでウイルスの中和活性を評価した。ＣＰＥを生じない最低の希釈倍率を中和抗体価（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ）とした。その結果を、試験例１３における野生株に対する中和活性評価と並べて図４７に示す。図４７中、Ｌｏｗは１×１０3　ＴＣＩＤ５０の候補株を２０μＬ経鼻投与した結果であり、Ｈｉｇｈは１×１０4　ＴＣＩＤ５０の候補株を２０μＬ経鼻投与した結果である。
　図４７より、候補株２により誘導された免疫はガンマバリアント及びデルタバリアントに対して中和活性を示し、有効であることが示された。これらの結果から、候補株２の投与により誘導される免疫はヘテロ株のバリアントに対しても有効性を示すことが示唆された。

Claims (12)

  1. 　以下の（ｂ）の変異、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、並びに／若しくは（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
    　以下の（ｎ）、（о）及び／又は（ｒ）の変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び／又は非構造タンパク質と、
    を含む、ベータコロナウイルス弱毒株：
    （ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
    （ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
    （ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
    （ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
    （ｎ）ＯＲＦ８の機能欠失変異、
    （о）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８１位～第６８４位に相当するアミノ酸配列の欠失、
    （ｒ）ＮＳＰ１における、配列番号８に示すアミノ酸配列の第３２位～第３９位に相当するアミノ酸配列の欠失。
  2. 　前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異、前記（ｎ）の変異、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異の６種の変異又は変異の組み合わせのうち、４種の変異又は変異の組み合わせが選択される、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
  3. 　前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異の３種の変異又は変異の組み合わせのうち、１～２種の変異又は変異の組み合わせが選択される、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
  4. 　前記構造タンパク質がさらに以下の（ｐ）及び／又は（ｑ）の変異を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株：
    （ｐ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６７９位～第６８０位及び第６８５～６８６位に相当するアミノ酸配列の欠失を含む変異、
    （ｑ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異。
  5. 　前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせと以下の（ｇ）の変異とを含む、請求項４に記載のウイルス弱毒株：
    （ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異。
  6. 　前記（ｎ）の変異が、配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の欠失である、請求項４に記載のベータコロナウイルス弱毒株。
  7. 　前記（ｂ）の変異がフェニルアラニンへの置換であり、前記（ｅ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｆ）の変異がセリンへの置換であり、前記（ｈ）の変異がイソロイシンへの置換である、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
  8. 　前記（ｑ）の変異がイソロイシンへの置換である、請求項４に記載のウイルス弱毒株。
  9. 　前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
  10. 　請求項１に記載のウイルス弱毒株を含む、弱毒生ワクチン。
  11. 　経鼻投与される、請求項１０に記載の弱毒生ワクチン。
  12. 　筋肉内投与、皮下投与又は皮内投与される、請求項１０に記載の弱毒生ワクチン。
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