TW202334404A - β冠狀病毒減毒株 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的在於提供一種可用作為新β冠狀病毒疫苗之株。發現組合並具有與溫度敏感性相關之預定置換變異，以及，與減毒化相關之預定缺失變異的新穎之β冠狀病毒，可用作為減毒性優異之β冠狀病毒之疫苗株。
Description
發明領域
本發明係關於一種β冠狀病毒減毒株。
發明背景
新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)導致之傳染病(COVID-19)引起大流行，如今仍為社會性之問題。作為針對本傳染病之疫苗，以俄羅斯所許可之腺病毒載體疫苗，即史普尼克V (Sputnik V) (非專利文獻1)為始，腺病毒載體疫苗及mRNA疫苗等基因疫苗被許可，於全世界進行接種。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]THE LANCET, VOLUME 396, ISSUE 10255, P887-897, SEPTEMBER 26, 2020
發明概要
[發明欲解決之課題]
然而，基因疫苗係不同於現有型之疫苗的下一代疫苗，報告有發熱及血栓症等副反應。因此，認為重要的是繼續開發新疫苗。
因此，本發明之目的在於提供一種可用作為新β冠狀病毒疫苗之株。
[用以解決課題之手段]
本發明者等人進行銳意探討之結果，發現在與減毒性相關之預定變異方面，組合並具有與溫度敏感性相關之預定置換變異，以及，與增殖減少性等減毒性相關之預定缺失變異的新穎之β冠狀病毒，可用作為減毒性優異之β冠狀病毒之疫苗株。本發明係基於該見解而藉由進一步反覆探討所完成之發明。即，本發明提供以下所揭示之態樣之發明。
項1.一種β冠狀病毒減毒株，包含具有以下(b)之變異、(e)及(f)之變異之組合、及/或(h)之變異之非結構蛋白、以及
具有以下(n)、(o)及/或(r)之變異之結構蛋白、附屬蛋白及/或非結構蛋白：
(b)NSP3中，相當於序列編號1所示胺基酸序列第445位白胺酸之胺基酸殘基之變異、
(e)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第248位甘胺酸之胺基酸殘基之變異、
(f)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第416位甘胺酸之胺基酸殘基之變異、
(h)NSP16中，相當於序列編號3所示胺基酸序列第67位纈胺酸之胺基酸殘基之變異、
(n)ORF8之功能缺失變異、
(o)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第681位～第684位之胺基酸序列之缺失、
(r)NSP1中，相當於序列編號8所示胺基酸序列第32位～第39位之胺基酸序列之缺失。
項2.如項1所記載之病毒減毒株，其中前述(b)之變異、前述(e)及(f)之變異之組合、前述(h)之變異、前述(n)之變異、前述(o)之變異、及前述(r)之變異之6種變異或變異之組合中，選擇4種變異或變異之組合。
項3.如項1或2所記載之病毒減毒株，其中前述(b)之變異、前述(e)及(f)之變異之組合、前述(h)之變異之3種變異或變異之組合中，選擇1～2種變異或變異之組合。
項4.如項1至3中任一項所記載之病毒減毒株，其中前述結構蛋白進一步包含以下(p)及/或(q)之變異：
(p)棘蛋白中，包含相當於序列編號4所示胺基酸序列第679位～第680位及第685～686位之胺基酸序列之缺失的變異、
(q)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第687位纈胺酸之胺基酸殘基之變異。
項5.如項4所記載之病毒減毒株，其包含前述(e)及(f)之變異之組合與以下(g)之變異：
(g)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第504位丙胺酸之胺基酸殘基之變異。
項6.如項4或5所記載之β冠狀病毒減毒株，其中前述(n)之變異為相當於由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列的胺基酸序列之缺失。
項7.如項1至6中任一項所記載之病毒減毒株，其中前述(b)之變異為向苯丙胺酸之置換，前述(e)之變異為向纈胺酸之置換，前述(f)之變異為向絲胺酸之置換，前述(h)之變異為向異白胺酸之置換。
項8.如項4至7中任一項所記載之病毒減毒株，其中前述(q)之變異為向異白胺酸之置換。
項9.如項1至8中任一項所記載之病毒減毒株，其中前述β冠狀病毒為SARS-CoV-2病毒。
項10.一種減毒活疫苗，包含如項1至9中任一項所記載之病毒減毒株。
項11.如項10所記載之減毒活疫苗，其係經鼻投予。
項12.如項10所記載之減毒活疫苗，其係肌內投予、皮下投予或皮內投予。
[發明之效果]
根據本發明，可提供一種可用作為新β冠狀病毒疫苗之株。
1.β冠狀病毒減毒株
本發明之β冠狀病毒減毒株之特徵在於：其係組合包含具有與溫度敏感性相關之預定置換變異的非結構蛋白、以及具有與增殖減少性等減毒性相關之預定缺失變異的結構蛋白、附屬蛋白及/或非結構蛋白作為與減毒性相關之預定變異之β冠狀病毒。以下亦將與溫度敏感性相關之預定置換變異記載為「溫度敏感性變異」，亦將與增殖減少性相關之預定缺失變異記載為「增殖減少性變異」，且亦將增殖減少性變異以外之預定缺失變異記載為「其他減毒性變異」。
再者，於本發明中，「減毒性」係指減弱病毒之宿主病原性之特性。又，於本發明中，「溫度敏感性」係指人類體溫(所謂下呼吸道溫度)下之增殖性受到限制而具有低溫(典型而言為人類之上呼吸道溫度以下)特異性地增殖之能力之特性。又，於本發明中，「增殖減少性」係指增殖性受到限制之特性，且該特性並非溫度特異性。
本發明之β冠狀病毒減毒株藉由具有上述與減毒性相關之預定變異，不僅發揮作為疫苗之有效性，而且藉由對置換變異組合不易回覆變異之缺失變異，發生毒力回覆之可能性變得極低。就該方面而言，在假定應用於人類之情形時之有用性顯著提高。
冠狀病毒於形態學上為直徑約100～200nm之球形，於表面具有突起。冠狀病毒於病毒學上被分類為網巢病毒目-冠狀病毒亞科-冠狀病毒科。脂質雙層膜之包膜蛋白中存在纏繞於核殼蛋白質(以下亦稱為「核殼蛋白」或「Nucleocapsid」)之正鏈之單鏈RNA之基因組，於包膜蛋白之表面配置有棘蛋白質(以下亦稱為「棘蛋白」或「Spike」)、包膜蛋白質(以下亦稱為「包膜蛋白」或「Envelope」)、膜蛋白質(以下亦稱為「膜蛋白」或「Membrane」)。病毒基因組之大小於RNA病毒中為最長之約30kb。核殼蛋白、棘蛋白、包膜蛋白及膜蛋白為冠狀病毒之結構蛋白。NSP1～NSP16為冠狀病毒之非結構蛋白。又，ORF7a、ORF7b、ORF8等為冠狀病毒之附屬蛋白。再者，附屬蛋白亦可稱為輔助蛋白。
冠狀病毒根據遺傳學特徵分類為α、β、γ、δ之組。作為感染人類之冠狀病毒，作為感冒之致病病毒，已知有人類冠狀病毒229E、OC43、NL63、HKU-1之4種、以及引起嚴重之肺炎之於2002年產生之嚴重急性呼吸道症候群(SARS)冠狀病毒及於2012年產生之中東呼吸道症候群(MERS)冠狀病毒。人類冠狀病毒229E及NL63被分類為α冠狀病毒屬，人類冠狀病毒OC43、HKU-1、SARS冠狀病毒及MERS冠狀病毒被分類為β冠狀病毒屬。
作為2019年武漢所產生之新型冠狀病毒感染之致病病毒，分離及鑑定出被分類為SARS冠狀病毒之SARS-CoV-2。SARS-CoV-2自初期之武漢株起反覆變異，已發現英國檢測到之株、南非檢測到之株、印度檢測到之株等變異株。亦認為存在產生尚未檢測到之變異株或今後新產生變異株之可能性。於本發明中，β冠狀病毒屬所含之病毒並不限定於上述SARS-CoV-2之株，亦包括其以外之全部β冠狀病毒(例如今後新檢測之其他SARS-CoV-2變異株及SARS-CoV-2以外之β冠狀病毒、以及將SARS-CoV-2或SARS-CoV-2以外之β冠狀病毒之棘蛋白質替換為其他SARS-CoV-2及SARS-CoV-2以外之β冠狀病毒(包括今後新檢測之病毒)之至少任一棘蛋白質而成之重組病毒等)。
基於下述表1對本發明之β冠狀病毒減毒株所具有之該與減毒性相關之預定變異進行說明。表1中作為「溫度敏感性變異」所示出之變異(b)、變異(e)與變異(f)之組合、及/或變異(h)為置換變異，為本發明之β冠狀病毒減毒株必須包含之有助於賦予溫度敏感性能力的責任變異。即，於本發明中，作為溫度敏感性變異，可列舉「變異(b)」、「變異(e)及變異(f)之組合」、以及「變異(h)」之3種。本發明之典型之β冠狀病毒減毒株具有該等3種溫度敏感性變異中之1種或2種。表1中作為「增殖減少性變異」及「其他減毒性變異」所示出之變異(n)、變異(o)及/或變異(r)為缺失變異，為本發明之β冠狀病毒減毒株必須包含之被認為有助於賦予增殖減少性等減毒性(尤其是變異(r)被認為有助於賦予增殖減少性)且以與溫度敏感性變異之組合表現出優異之減毒性的變異。表1中作為「其他變異」所示出之變異(a)、(c)、(d)、(g)、(i)～(m)、(p)、(q)為本發明之β冠狀病毒減毒株可任意包含之變異，本發明之β冠狀病毒減毒株可包含其他變異之至少任一者，亦可不包含。
[表1]
| 變異符號 | 多肽 | 變異前胺基酸 | 變異後胺基酸 | NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2之變異體之情形 | |||
| 序列編號 | 左序列編號中之變異符號 | 左序列編號中之變異位置 | |||||
| 其他變異 | (a) | NSP3 | 纈胺酸(V) | 丙胺酸(A) | 1 | (a') | 404 |
| 溫度敏感性變異 | (b) | NSP3 | 白胺酸 (L) | 苯丙胺酸 (F) | 1 | (b') | 445 |
| 其他變異 | (c) | NSP3 | 離胺酸(K) | 精胺酸(R) | 1 | (c') | 1792 |
| 其他變異 | (d) | NSP3 | 天冬胺酸(D) | 天冬醯胺(N) | 1 | (d') | 1832 |
| 溫度敏感性變異 | (e) (f) | NSP14 NSP14 | 甘胺酸 (G) 甘胺酸 (G) | 纈胺酸 (V) 絲胺酸 (S) | 2 2 | (e') (f') | 248 416 |
| 其他變異 | (g) | NSP14 | 丙胺酸(A) | 纈胺酸(V) | 2 | (g') | 504 |
| 溫度敏感性變異 | (h) | NSP16 | 纈胺酸 (V) | 異白胺酸 (I) | 3 | (h') | 67 |
| 其他變異 | (i) | 棘蛋白 | 白胺酸(L) | 色胺酸(W) | 4 | (i') | 54 |
| 其他變異 | (j) | 棘蛋白 | 蘇胺酸(T) | 離胺酸(K) | 4 | (j') | 739 |
| 其他變異 | (k) | 棘蛋白 | 丙胺酸(A) | 纈胺酸(V) | 4 | (k') | 879 |
| 其他變異 | (l) | 包膜蛋白 | 白胺酸(L) | 脯胺酸(P) | 5 | (l') | 28 |
| 其他變異 | (m) | 核殼蛋白 | 絲胺酸(S) | 苯丙胺酸(F) | 6 | (m') | 2 |
| 其他減毒性變異 | (n) | ORF8 | ( 功能完整 ) | ( 功能缺失 ) | 7 | (n') | 1-703( 缺失 )* |
| 其他減毒性變異 | (o) | 棘蛋白 | ( 完整 ) | ( 局部缺失 ) | 4 | (o') | 681-684( 缺失 ) |
| 其他變異 | (p) | 棘蛋白 | (完整) | (局部缺失) | 4 | (p') | 679-680(缺失) 685-686(缺失) |
| 其他變異 | (q) | 棘蛋白 | 纈胺酸(V) | 異白胺酸(I) | 4 | (q') | 687 |
| 增殖減少性變異 | (r) | NSP1 | ( 完整 ) | ( 局部缺失 ) | 8 | (r') | 32-39( 缺失 ) |
| 上述 (b) 之變異、 (e) 及 (f) 之變異之組合、 (h) 之變異、 (n) 之變異、 (o) 之變異、及 (r) 之變異為與減毒性相關之 預定變異 。*於相當於序列編號7之1-703位之序列缺失之情形時，由橫跨ORF7a中途至ORF8中途之鹼基序列編碼之胺基酸序列缺失。 |
即，本發明之β冠狀病毒所具有之必需之與減毒性相關之變異為作為溫度敏感性變異之以下(b)之變異、(e)及(f)之變異之組合、及/或(h)之變異；以及作為增殖減少性等減毒性變異之以下(n)、(o)及/或(r)之變異。
(b)NSP3中，相當於序列編號1所示胺基酸序列第445位白胺酸之胺基酸殘基之變異、
(e)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第248位甘胺酸之胺基酸殘基之變異、
(f)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第416位甘胺酸之胺基酸殘基之變異、
(h)NSP16中，相當於序列編號3所示胺基酸序列第67位纈胺酸之胺基酸殘基之變異、
(n)ORF8之功能缺失變異、
(o)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第681～684位之胺基酸殘基之缺失、
(r)NSP1中，相當於序列編號8所示胺基酸序列第32～39位之胺基酸序列之缺失。
上述(n)之變異只要為ORF8之功能缺失之變異，則可容許任意變異，較佳可列舉相當於由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列的胺基酸序列之缺失。
於本發明之較佳之形態中，就將溫度敏感性之水準控制為較佳之程度之觀點而言，選擇上述溫度敏感性變異(即(b)之變異、(e)及(f)之變異之組合、(h)之變異之3種變異或變異之組合)中之1～2種變異或變異之組合。
於本發明之較佳之形態中，於上述增殖減少性等減毒性變異中，較佳可列舉(o)之變異、(r)之變異。
於本發明之較佳之形態中，就發揮較佳之減毒性、並且亦發揮較佳之免疫原性之觀點而言，選擇上述與減毒性相關之預定變異6種(即(b)之變異、(e)及(f)之變異之組合、(h)之變異、(n)之變異、(o)之變異、以及(r)之變異之6種)中之4種變異或變異之組合。
本發明之β冠狀病毒減毒株除了上述必需之變異以外，可進一步包含以下(a)、(c)、(d)、(g)、(i)～(m)、(p)、(q)之至少任一變異作為其他變異。
(a)NSP3中，相當於序列編號1所示胺基酸序列第404位纈胺酸之胺基酸殘基之變異、
(c)NSP3中，相當於序列編號1所示胺基酸序列第1792位離胺酸之胺基酸殘基之變異、
(d)NSP3中，相當於序列編號1所示胺基酸序列第1832位天冬胺酸之胺基酸殘基之變異、
(g)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第504位丙胺酸之胺基酸殘基之變異、
(i)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第54位白胺酸之胺基酸殘基之變異、
(j)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第739位蘇胺酸之胺基酸殘基之變異、
(k)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第879位丙胺酸之胺基酸殘基之變異、
(l)包膜蛋白中，相當於序列編號5所示胺基酸序列第28位白胺酸之胺基酸殘基之變異、
(m)核殼蛋白中，相當於序列編號6所示胺基酸序列第2位絲胺酸之胺基酸殘基之變異、
(p)棘蛋白中，包含相當於序列編號4所示胺基酸序列第679位～第680位及第685～686位之胺基酸殘基之缺失的變異、
(q)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第687位纈胺酸之胺基酸殘基之變異。
於本發明之β冠狀病毒減毒株具有其他變異之情形時，就增強溫度敏感性之觀點而言，於上述其他變異中，宜為具有(g)之變異。於本發明之β冠狀病毒減毒株具有(g)之變異作為其他變異之情形時，就增強溫度敏感性之觀點而言，宜為將(g)之變異與(e)及(f)之變異之組合一起使用。
序列編號1係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2中之NSP3之胺基酸序列，序列編號2係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2中之NSP14之胺基酸序列，序列編號3係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2中之NSP16之胺基酸序列。
又，序列編號4係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2中之棘蛋白之胺基酸序列，序列編號5係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2中之包膜蛋白之胺基酸序列，序列編號6係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2中之核殼蛋白之胺基酸序列。
進而，序列編號7係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2之開放閱讀框架之一部分、具體而言為跨ORF7a之一部分、ORF7b整體、及ORF8之大部分之鹼基序列，序列編號8係NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2中之NSP1之胺基酸序列。
關於「相當之胺基酸殘基」，於本發明之β冠狀病毒減毒株為NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2之變異株之情形時，係指於序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或由序列編號7所示之鹼基序列編碼之胺基酸序列中之上述規定位置存在之胺基酸殘基，於本發明之β冠狀病毒減毒株為上述變異株以外之其他β冠狀病毒變異株之情形時，係指於其他β冠狀病毒所具有之多肽之上述序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或由序列編號7所示之鹼基序列編碼之胺基酸序列中之上述規定位置所對應之位置存在之胺基酸殘基。該對應之位置可藉由對NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2之具有序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列的蛋白質或具有由序列編號7所示之鹼基序列編碼之胺基酸序列的蛋白質、及對應於該蛋白質之其他β冠狀病毒之蛋白質進行胺基酸序列之比對而特定出。
本發明之病毒減毒株只要與序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列中之上述規定位置相對應的胺基酸殘基或胺基酸序列發生變異即可，因此並不限定於收載於NC_045512(NCBI)中之特定之SARS-CoV-2之變異株，還包括其他β冠狀病毒變異株[即，其他任意之SARS-CoV-2之變異株、及β冠狀病毒屬所包含之SARS-CoV-2以外之病毒之變異株]。收載於NC_045512(NCBI)中之特定之SARS-CoV-2之變異株為該特定之SARS-CoV-2中之序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列中之上述規定位置之至少任一胺基酸殘基或胺基酸序列發生變異之變異株，其他β冠狀病毒變異株係其他任意之SARS-CoV-2之變異株[即，其他任意之SARS-CoV-2中之上述序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列中之與上述規定位置相對應之胺基酸殘基或胺基酸序列發生變異之變異株]、及β冠狀病毒屬所包含之SARS-CoV-2以外之病毒之變異株[即，β冠狀病毒屬所包含之SARS-CoV-2以外之病毒中之上述序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列中之與上述規定位置相對應之胺基酸殘基或胺基酸序列發生變異之變異株]之兩者。其他任意之SARS-CoV-2之變異株及β冠狀病毒屬所包含之SARS-CoV-2以外之病毒之變異株亦包括將SARS-CoV-2或SARS-CoV-2以外之β冠狀病毒之棘蛋白質替換為其他SARS-CoV-2及SARS-CoV-2以外之β冠狀病毒(包括今後新檢測之病毒)之至少任一棘蛋白質而成之重組病毒之變異株。
其他β冠狀病毒變異株中之上述序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或序列編號7所示鹼基序列所對應之序列只要各自不會對多肽之特性造成較大影響，則容許與序列編號1～4(或1～6)、8之胺基酸序列或序列編號7所示之鹼基序列不同。所謂不會對多肽之特性造成較大影響係指保持各自作為非結構蛋白、結構蛋白、及附屬蛋白之功能之狀態。具體而言，於進一步具有序列編號1～4、8之胺基酸序列或序列編號7所示鹼基序列中之上述與減毒性相關之預定變異所對應之胺基酸或鹼基序列以外之部位、或其他變異之情形時，進而於上述序列編號5、6中之其他變異所對應之胺基酸殘基以外之部位(以下亦將與該等變異相對應之胺基酸殘基或鹼基以外之部位記載為「任意不同部位」)中，容許與序列編號1～4、7、8(或1～8)之不同。所容許之不同可為選自於置換、附加、插入、及缺失中之1種不同(例如置換)，亦可包含2種以上不同(例如置換及插入)。作為僅將其他任意之SARS-CoV-2中之與上述序列編號1～4(或1～6)、8相對應之胺基酸序列或序列編號7所示鹼基序列與序列編號1～4(或1～6)、8所示胺基酸序列或序列編號7所示鹼基序列之任意不同部位加以比較所算出之序列同一性，為50%以上即可。於其他任意之SARS-CoV-2中，作為該序列同一性，可列舉宜為60%以上或70%以上，更宜為80%以上，進而宜為85%以上或90%以上，更宜為95%以上、96%以上、97%以上、或98%以上，更進一步宜為99%以上，尤其宜為99.3%以上、99.5%以上、99.7%以上、99.9%以上。於其餘任意之β冠狀病毒中，作為該序列同一性，可列舉宜為60%以上。此處，「序列同一性」表示藉由BLASTPACKAGE[sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information(NCBI)]之bl2seq program(Tatiana A.Tatsusova, Thomas L.Madden, FEMS Microbiol.Lett., Vol.174, p247-250, 1999)所獲得之胺基酸序列之同一性之值。參數設定為Gap insertion Cost value: 11、Gap extension Cost value: 1即可。
即，本發明之β冠狀病毒減毒株更具體而言如以下所述：
一種β冠狀病毒減毒株，包含由以下(I)、(II)及(III)之至少任一多肽構成之非結構蛋白、附屬蛋白及結構蛋白：
(I)以下之(I-1)～(I-3)之多肽之至少任一者、及以下之(I-4)～(I-6)之多肽之至少任一者：
(I-1)由序列編號1所示胺基酸序列中具有第445位白胺酸之置換變異(b')作為溫度敏感性變異之胺基酸序列構成之多肽(NSP3)、
(I-2)由序列編號2所示胺基酸序列中具有第248位甘胺酸之置換變異(e')及第416位甘胺酸之置換變異(f')作為溫度敏感性變異之胺基酸序列構成之多肽(NSP14)、
(I-3)由序列編號3所示胺基酸序列中具有第67位纈胺酸之置換變異(h')作為溫度敏感性變異之胺基酸序列構成之多肽(NSP16)、
(I-4)由具有由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列之缺失變異(n')作為其他減毒性變異之胺基酸序列構成之多肽(ORF)、
(I-5)由序列編號4所示胺基酸序列中具有第681位～第684位之缺失變異(o')作為其他減毒性變異之胺基酸序列構成之多肽(棘蛋白)、
(I-6)由序列編號8所示胺基酸序列中具有第32位～第39位之缺失變異(r')作為增殖減少性變異之胺基酸序列構成之多肽(NSP1)；
(II)前述(I)之多肽之胺基酸序列中置換、附加、插入或缺失與前述溫度敏感性變異相關之胺基酸殘基及與前述增殖減少性等減毒性變異相關之胺基酸序列以外之1個或多個胺基酸殘基而成、且構成獲得溫度敏感性能力及減毒化能力之β冠狀病毒之多肽；
(III)前述(I)之多肽之胺基酸序列中之除與前述溫度敏感性變異相關之胺基酸殘基及與前述增殖減少性等減毒性變異相關之胺基酸序列以外之胺基酸序列之序列同一性為50%以上、且構成獲得溫度敏感性能力及減毒化能力之β冠狀病毒之多肽。
於上述更具體之β冠狀病毒減毒株除了溫度敏感性變異及增殖減少性等減毒性變異以外亦包含其他變異之情形時，如以下所示，上述(I-1)及(I-2)之多肽(非結構蛋白)及上述(I-5)之多肽(結構蛋白)分別可為除了溫度敏感性變異及增殖減少性等減毒性變異以外亦具有其他變異之以下(I-1a)及(I-2a)及(I-5a)之多肽，上述(I)之多肽可進一步包含具有其他變異之以下(I-7a)、(I-8a)之多肽(結構蛋白)。
一種β冠狀病毒減毒株，包含由以下(I)、(II)及(III)之至少任一多肽構成之結構蛋白、附屬蛋白及非結構蛋白：
(I)以下(I-1a)、(I-2a)、(I-3)之至少任一者與以下(I-4)、(I-5a)、(I-6)之多肽之至少任一者、或除了該等以外還包含以下(I-7a)、(I-8a)之至少任一多肽：
(I-1a)由序列編號1所示胺基酸序列中具有作為溫度敏感性變異之第445位白胺酸之變異(b')與作為其他變異之第404位纈胺酸之變異(a')、第1792位離胺酸之變異(c')、及第1832位天冬胺酸之變異(d')之至少任一變異之胺基酸序列構成之多肽(NSP3)、
(I-2a)由序列編號2所示胺基酸序列中具有作為溫度敏感性變異之第248位甘胺酸之變異(e')及第416位甘胺酸之變異(f')與作為其他變異之第504位丙胺酸之變異(g')之胺基酸序列構成之多肽(NSP14)、
(I-3)由序列編號3所示胺基酸序列中具有作為溫度敏感性變異之第67位纈胺酸之變異(h')之胺基酸序列構成之多肽(NSP16)、
(I-4)由具有作為其他減毒性變異之由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列之缺失變異(n')之胺基酸序列構成之多肽(ORF)、
(I-5a)由序列編號4所示胺基酸序列中具有作為其他減毒性變異之第681位～第684位之缺失變異(o')、作為其他變異之第54位白胺酸之變異(i')、第739位蘇胺酸之變異(j')、及第879位丙胺酸之變異(k')之至少任一變異、以及第679位～第680位及第685位～第686位之胺基酸序列之缺失變異(p')及第687位纈胺酸之變異(q')之至少任一變異之胺基酸序列構成之多肽(棘蛋白)、
(I-6)由序列編號8所示胺基酸序列中具有作為增殖減少性變異之第32位～第39位之缺失變異(r')之胺基酸序列構成之多肽(NSP1)
(I-7a)由序列編號5所示胺基酸序列中具有作為其他變異之第28位白胺酸之變異(l')之胺基酸序列構成之多肽(包膜蛋白)、
(I-8a)由序列編號6所示胺基酸序列中具有作為其他變異之第2位絲胺酸之變異(m')之胺基酸序列構成之多肽(核殼蛋白)；
(II)前述(I)之多肽之胺基酸序列中置換、附加、插入或缺失與前述溫度敏感性變異、前述增殖減少性等減毒性變異相關之胺基酸序列及與其他變異相關之胺基酸殘基或胺基酸序列以外之1個或多個胺基酸殘基而成、且構成獲得溫度敏感性能力及減毒化能力之β冠狀病毒之多肽；
(III)前述(I)之多肽之胺基酸序列中之除與前述溫度敏感性變異、前述增殖減少性等減毒性變異相關之胺基酸序列及與其他變異相關之胺基酸殘基或胺基酸序列以外之胺基酸序列之序列同一性為50%以上、且構成獲得溫度敏感性能力及減毒化能力之β冠狀病毒之多肽。
上述(a')～(r')之變異分別係指(a)～(r)之變異具體存在於序列編號1～6之胺基酸序列、序列編號7之鹼基序列、及序列編號8之胺基酸序列中之情形時之變異。即，上述(I)之多肽係對由NC_045512(NCBI)之SARS-CoV-2所具有之序列編號1～6之胺基酸序列、由序列編號7之鹼基序列編碼之胺基酸序列、及序列編號8之胺基酸序列構成之多肽導入溫度敏感性變異及增殖減少性等減毒性變異、或除了該等以外還導入其他變異而成者。又，上述(II)及(III)之多肽係對由其他β冠狀病毒所具有之序列編號1～6之胺基酸序列、由序列編號7之鹼基序列編碼之胺基酸序列、及序列編號8之胺基酸序列所對應之胺基酸序列構成之多肽導入溫度敏感性變異及增殖減少性等減毒性變異、或除了該等以外還導入其他變異而成者。上述(II)及(III)之多肽之序列同一性之較佳範圍如已說明般。
藉由具有上述溫度敏感性變異，β冠狀病毒可獲得溫度敏感性，藉由具有上述溫度敏感性變異及上述增殖減少性等減毒性變異，β冠狀病毒可獲得優異之減毒性。本發明之病毒減毒株至少於人類下呼吸道溫度下之增殖能力相較於低於人類下呼吸道溫度之溫度下之增殖能力而有所降低，宜為不具有人類下呼吸道溫度下之增殖能力。於本發明中，溫度敏感性能力可藉由以下進行確認：於人類下呼吸道溫度下使病毒減毒株以MOI=0.01感染Vero細胞後於人類下呼吸道溫度下培養1天後之培養上清液中之病毒效價(TCID50/mL)與於人類上呼吸道溫度下使病毒減毒株以MOI=0.01感染Vero細胞後於人類上呼吸道溫度下培養1天後之培養上清液中之病毒效價相比，例如減少10
2以上、宜為減少10
3以上。
典型而言，本發明之病毒減毒株之人類下呼吸道溫度下之增殖能力與不具有上述溫度敏感性變異之情形時的人類下呼吸道溫度下之增殖能力相比有所降低。該情況可藉由以下進行確認：於人類下呼吸道溫度下使病毒減毒株以MOI=0.01感染Vero細胞後於人類下呼吸道溫度下培養1天後之培養上清液中之病毒效價(TCID50/mL)與於人類下呼吸道溫度下使不具有上述溫度敏感性變異之株以MOI=0.01感染Vero細胞後於人類下呼吸道溫度下培養1天後之培養上清液中之病毒效價相比，例如減少10
2以上、宜為減少10
3以上。
作為人類下呼吸道溫度之代表例，可列舉約37℃，具體而言，可列舉較下文所述之上呼吸道溫度更高之溫度，宜為36～38℃，更宜為36.5～37.5℃或37～38℃。又，本發明之病毒減毒株可具有未達人類下呼吸道溫度之溫度下之增殖能力。例如作為低於人類下呼吸道溫度之溫度，例如可包含人類上呼吸道溫度(作為具體例約為32℃～35.5℃)。
上述溫度敏感性變異不存在於病毒感染細胞時重要之存在於病毒表面之棘蛋白質之受體結合域上。因此可合理地預想，不僅於收載於NC_045512(NCBI)中之特定之SARS-CoV-2中，而且於其他β冠狀病毒中，藉由導入上述溫度敏感性變異，亦可進行溫度敏感性化。即，可合理地預想，即便於因世界性傳染病之流行導致產生如病毒之免疫原性發生變化之變異之情形時，藉由對該變異病毒進一步導入上述溫度敏感性變異，亦可對該變異病毒賦予溫度敏感性。
又，關於溫度敏感性變異，上述(b)之變異為向白胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(e)之變異為向甘胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(f)之變異為向甘胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(h)之變異為向纈胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可。關於其他變異，上述(a)之變異為向纈胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(c)之變異為向離胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(d)之變異為向天冬胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(g)之變異為向丙胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(i)之變異為向白胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(j)之變異為向蘇胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(k)之變異為向丙胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(l)之變異為向白胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(m)之變異為向絲胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可，上述(q)之變異為向纈胺酸以外之胺基酸殘基之置換即可。
於本發明之病毒減毒株之較佳例中，關於溫度敏感性變異，前述(b)之變異為向苯丙胺酸之置換，前述(e)之變異為向纈胺酸之置換，且前述(f)之變異為向絲胺酸之置換，及/或前述(h)之變異為向異白胺酸之置換。於該較佳例進一步具有其他變異之情形時，關於其他變異，前述(a)之變異為向丙胺酸之置換，前述(c)之變異為向精胺酸之置換，前述(d)之變異為向天冬醯胺之置換，前述(g)之變異為向纈胺酸之置換，前述(i)之變異為向色胺酸之置換，前述(j)之變異為向離胺酸之置換，前述(k)之變異為向纈胺酸之置換，前述(l)之變異為向脯胺酸之置換，前述(m)之變異為向苯丙胺酸之置換，及/或前述(q)之變異為向異白胺酸之置換。
於本發明之病毒減毒株之其他例中，前述置換亦可為所謂保守性置換。所謂保守性置換係指經結構及/或特性類似之胺基酸置換，例如，作為保守性置換之例，若置換前之胺基酸為非極性胺基酸，則可列舉向其他非極性胺基酸置換，若置換前之胺基酸為非帶電胺基酸，則可列舉向其他非帶電胺基酸置換，若置換前之胺基酸為酸性胺基酸，則可列舉向其他酸性胺基酸置換，及若置換前之胺基酸為鹼性胺基酸，則可列舉向其他鹼性胺基酸置換。再者，通常，「非極性胺基酸」包括丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、及色胺酸，「非帶電胺基酸」包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺、及麩醯胺，「酸性胺基酸」包括天冬胺酸及麩胺酸，「鹼性胺基酸」包括離胺酸、精胺酸、及組胺酸。
作為本發明之病毒減毒株之更佳例，可列舉為收載於NC_045512(NCBI)中之SARS-CoV-2之變異株，且：前述(b)之變異(即(b')之變異)為NSP3中之序列編號1所示胺基酸序列第445位白胺酸向苯丙胺酸之置換(L445F)；前述(e)之變異(即(e')之變異)為NSP14中之序列編號2所示胺基酸序列第248位甘胺酸向纈胺酸之置換(G248V)，且前述(f)之變異(即(f')之變異)為NSP14中之序列編號2所示胺基酸序列第416位甘胺酸向絲胺酸之置換(G416S)；及/或前述(h)之變異(即(h')之變異)為NSP16中之序列編號3所示胺基酸序列第67位纈胺酸向異白胺酸之置換(V67I)。作為該更佳例亦具有其他變異之情形時之例，進一步可列舉：前述(a)之變異(即(a')之變異)為NSP3中之序列編號1所示胺基酸序列第404位纈胺酸向丙胺酸之置換(V404A)；前述(c)之變異(即(c')之變異)為NSP3中之序列編號1所示胺基酸序列第1792位離胺酸向精胺酸之置換(K1792R)；前述(d)之變異(即(d')之變異)為NSP3中之序列編號1所示胺基酸序列第1832位天冬胺酸向天冬醯胺之置換(D1832N)；前述(g)之變異(即(g')之變異)為NSP14中之序列編號2所示胺基酸序列第504位丙胺酸向纈胺酸之置換(A504V)；前述(i)之變異(即(i')之變異)為棘蛋白中之序列編號4所示胺基酸序列第54位白胺酸向色胺酸之置換(L54W)；前述(j)之變異(即(j')之變異)為棘蛋白中之序列編號4所示胺基酸序列第739位蘇胺酸向離胺酸之置換(T739K)；前述(k)之變異(即(k')之變異)為棘蛋白中之序列編號4所示胺基酸序列第879位丙胺酸向纈胺酸之置換(A879V)；前述(l)之變異(即(l')之變異)為包膜蛋白中之序列編號5所示胺基酸序列第28位白胺酸向脯胺酸之置換(L28P)；前述(m)之變異(即(m')之變異)為核殼蛋白中之序列編號6所示胺基酸序列第2位絲胺酸向苯丙胺酸之置換(S2F)；及/或前述(q)之變異(即(q')之變異)為棘蛋白中之序列編號4所示胺基酸序列第687位纈胺酸向異白胺酸之置換(V687I)。
作為本發明之病毒減毒株之尤佳例，可列舉以下株。
・具有作為溫度敏感性變異之前述(e)之變異(宜為(e')之變異及/或G248V)及前述(f)之變異(宜為(f')之變異及/或G416S)、及前述(h)之變異(宜為(h')之變異及/或V67I)；與作為增殖減少性等減毒性變異之前述(n)之變異(宜為(n')之變異)、前述(o)之變異、及前述(r)之變異之株；或進一步具有作為其他變異之前述(g)之變異(宜為(g')之變異及/或A504V)、前述(p)之變異、及前述(q)之變異(宜為(q')之變異及/或V687I)之株
・具有作為溫度敏感性變異之前述(e)之變異(宜為(e')之變異及/或G248V)及前述(f)之變異(宜為(f')之變異及/或G416S)；與作為增殖減少性等減毒性變異之前述(n)之變異(宜為(n')之變異)、前述(o)之變異、及前述(r)之變異之株；或進一步具有作為其他變異之前述(g)之變異(宜為(g')之變異及/或A504V)、前述(p)之變異、及前述(q)(宜為(q')之變異及/或V687I)之變異之株
・具有作為溫度敏感性變異之前述(e)之變異(宜為(e')之變異及/或G248V)、前述(f)之變異(宜為(f')之變異及/或G416S)、及前述(h)之變異(宜為(h')之變異及/或V67I)；與作為其他減毒性變異之前述(n)之變異(宜為(n')之變異)、及前述(o)之變異之株；或進一步具有作為其他變異之前述(g)之變異(宜為(g')之變異及/或A504V)、前述(p)之變異、及前述(q)(宜為(q')之變異及/或V687I)之變異之株
・具有作為溫度敏感性變異之前述(b)之變異(宜為(b')之變異及/或L445F)、前述(e)之變異(宜為(e')之變異及/或G248V)及前述(f)之變異(宜為(f')之變異及/或G416S)；與作為其他減毒性變異之前述(n)之變異(宜為(n')之變異)、及前述(o)之變異之株；或進一步具有作為其他變異之前述(c)之變異(宜為(c')之變異及/或K1792R)、前述(g)之變異(宜為(g')之變異及/或A504V)、前述(p)之變異、及前述(q)(宜為(q')之變異及/或V687I)之變異之株
・具有作為溫度敏感性變異之前述(b)之變異(宜為(b')之變異及/或L445F)、及前述(h)之變異(宜為(h')之變異及/或V67I)；與作為其他減毒性變異之前述(n)之變異(宜為(n')之變異)、及前述(o)之變異之株；或進一步具有作為其他變異之前述(c)之變異(宜為(c')之變異及/或K1792R)、前述(p)之變異、及前述(q)(宜為(q')之變異及/或V687I)之變異之株
・具有作為溫度敏感性變異之前述(e)之變異(宜為(e')之變異及/或G248V)、前述(f)之變異(宜為(f')之變異及/或G416S)、及前述(h)之變異(宜為(h')之變異及/或V67I)；與作為增殖減少性等減毒性變異之前述(n)之變異(宜為(n')之變異)、及前述(r)之變異(宜為(r')之變異)之株；或進一步具有作為其他變異之前述(g)之變異(宜為(g')之變異及/或A504V)之株
作為本發明之病毒減毒株之最佳例，可列舉以下株。
具有作為溫度敏感性變異之前述(e)之變異(宜為(e')之變異及/或G248V)及前述(f)之變異(宜為(f')之變異及/或G416S)；與作為增殖減少性等減毒性變異之前述(n)之變異(宜為(n')之變異)、前述(o)之變異、及前述(r)之變異之株；及進一步具有作為其他變異之前述(g)之變異(宜為(g')之變異及/或A504V)、前述(p)之變異、及前述(q)(宜為(q')之變異及/或V687I)之變異之株
2.疫苗
2-1.減毒化疫苗之有效成分
如上所述，「1.β冠狀病毒減毒株」中所說明之β冠狀病毒減毒株藉由具有溫度敏感性變異，而僅於較人類下呼吸道溫度更低之溫度下可高效地增殖，因此至少於生物體深部、其中於包括引起嚴重損傷之肺之下呼吸道中無法高效地增殖，而可期待病原性顯著降低。並且，該β冠狀病毒減毒株藉由具有增殖減少性等減毒性變異，而可無關於溫度地限制增殖性，藉由與上述溫度敏感性變異之複合，而具有優異之減毒性。藉由採用此種複合形態，該β冠狀病毒減毒株於減毒活疫苗於宿主體內伴隨增殖之情形時，即便於失去溫度敏感性變異之情形時，由於具有作為增殖減少性等減毒性變異之缺失變異不易回覆變異之特性，故而亦可期待能夠維持減毒性。
因此，該病毒減毒株作為其自身經減毒化之病毒，可藉由感染生物體而用作減毒活疫苗。因此，本發明亦提供一種包含上述β冠狀病毒減毒株作為有效成分之疫苗。關於有效成分之詳細，如「1.β冠狀病毒減毒株」中所說明般。
2-2.基因疫苗之有效成分
如上述「1.β冠狀病毒減毒株」中所說明般，預定變異有助於賦予減毒性。因此，本發明亦提供一種β冠狀病毒基因疫苗，其包含編碼具有上述預定變異之非結構蛋白、附屬蛋白及結構蛋白之基因作為有效成分。關於有效成分所包含之預定變異之詳細，如「1.β冠狀病毒減毒株」中所說明般。
2-3.設為目標之病毒
不僅可合理期待本發明之疫苗對於SARS-CoV-2病毒之初期之武漢株有效，而且可合理期待對於包括2020年9月於英國檢測出、2020年10月於南非檢測出之變異株、及其他公知之變異株、以及其他尚未檢測出之未知之變異株在內的大範圍之SARS-CoV-2病毒相關株及β冠狀病毒屬所包含之SARS-CoV-2以外之病毒亦有效。因此，本發明之疫苗以β冠狀病毒為目標。
2-4.其他成分
除了上述有效成分以外，可根據目的及用途等於本發明之疫苗中包含佐劑、緩衝劑、等張劑、鎮痛劑、防腐劑、抗氧化劑、矯臭劑、光吸收色素、穩定劑、碳水化合物、酪蛋白消化物、各種維生素等其他成分。
作為佐劑，例如可列舉：動物油(角鯊烯等)或該等之氫化油；植物油(棕櫚油、蓖麻油等)或該等之氫化油；包含無水甘露醇-油酸酯、液態石蠟、聚丁烯、辛酸、油酸、高級脂肪酸酯等之油性佐劑；PCPP、皂苷、葡萄糖酸錳、葡萄糖酸鈣、甘油磷酸錳、可溶性乙酸鋁、水楊酸鋁、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、順丁烯二酸酐共聚物、烯基衍生物聚合物、水包油型乳液、含有四級銨鹽之陽離子脂質等水溶性佐劑；氫氧化鋁(明礬)、磷酸鋁、硫酸鋁等鋁鹽或其組合、氫氧化鈉等沈澱性佐劑；霍亂毒素、大腸桿菌忌熱性腸毒素等源自微生物之毒素成分；其他成分(膨潤土、胞壁醯二肽衍生物、介白素等)。
作為緩衝劑之例，可列舉：磷酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等緩衝液等。作為等張劑之例，可列舉：氯化鈉、甘油、D-甘露醇等。作為鎮痛劑之例，可列舉苄醇等。作為防腐劑之例，可列舉：硫柳汞、對羥基苯甲酸酯類、苯氧基乙醇、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、去氫乙酸、山梨酸、抗生素、合成抗菌劑等。作為抗氧化劑之例，可列舉：亞硫酸鹽、抗壞血酸等。
作為光吸收色素之例，可列舉：核黃素、腺嘌呤、腺苷等。作為穩定劑之例，可列舉：螯合劑、還原劑等。作為碳水化合物之例，可列舉：山梨糖醇、乳糖、甘露醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、聚葡萄糖等。
本發明之疫苗可進一步包含針對引發COVID-19等β冠狀病毒感染以外之其他疾病之病毒或細菌的一種或多種其他疫苗。即，本發明之疫苗可製備為包含其他疫苗之混合疫苗。
2-5.劑型
對本發明之疫苗之劑型並無特別限定，可基於投予方法及保存條件等適當確定。作為劑型之具體例，可列舉液體製劑及固體製劑等，更具體而言，可列舉：錠劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、液劑、糖漿劑等經口投予劑；冷凍乾燥製劑等乾燥製劑、注射劑、噴霧劑、貼附劑等非經口投予劑(具體而言為肌內投予劑、皮內投予劑、皮下投予劑、經鼻投予劑、經皮投予劑等)。
2-6.投予方法
作為本發明之疫苗之投予方法，並無特別限定，可為肌肉、腹腔內、皮內及皮下等注射投予、自鼻腔及口腔之吸入投予、及經口投予等任一者，較佳可列舉肌肉、皮內及皮下等注射投予(肌內投予、皮內投予及皮下投予)、自鼻腔之吸入投予(經鼻投予)、自皮膚之吸收投予(經皮投予)，更佳可列舉經鼻投予。
2-7.應用對象
作為本發明之疫苗之應用對象，只要為可引起β冠狀病毒感染之各症狀之對象(宜為因SARS-CoV-2病毒感染而可引起COVID-19症狀之對象)，則無特別限定，例如可列舉哺乳類，更具體而言，可列舉：人類；狗及貓等寵物；鼠、小鼠、倉鼠等實驗動物等。
2-8.劑量
作為本發明之疫苗之劑量，並無特別限定，可根據有效成分之種類、投予方法、投予對象(年齡、體重、性別、基礎疾病之有無等條件)適當確定。
又，作為本發明之疫苗針對人類之每次之劑量，可列舉1×10PFU/body以上，較佳可列舉1×10
2PFU/body以上，更佳可列舉2×10
2PFU/body以上，進而較佳可列舉1×10
3PFU/body以上，進而較佳可列舉2×10
3PFU/body以上。又，作為本發明之疫苗針對人類之每次之劑量，亦可列舉6×10
11PFU/body以下，較佳可列舉1×10
11PFU/body以下，更佳可列舉6×10
10PFU/body以下，進而較佳可列舉1×10
10PFU/body以下。
又，作為本發明之疫苗之針對人類之每次之劑量，可列舉1×10TCID50/body以上，較佳可列舉1×10
2TCID50/body以上，更佳可列舉2×10
2TCID50/body以上，更佳可列舉1×10
3TCID50/body以上，更佳可列舉2×10
3TCID50/body以上。又，作為本發明之疫苗針對人類之每次之劑量，亦可列舉6×10
11TCID50/body以下，較佳可列舉1×10
11TCID50/body以下，更佳可列舉6×10
10TCID50/body以下，進而較佳可列舉1×10
10TCID50/body以下。
3.β冠狀病毒減毒株之製造方法
作為本發明之β冠狀病毒減毒株之製造方法，並無特別限定，可基於上述胺基酸序列資訊由業者適當確定。例如，就製造相對廉價且批次差較少之疫苗之觀點而言，較佳可列舉利用細菌人工染色體(BAC)或酵母人工染色體(YAC)等人工染色體、或使用β冠狀病毒之基因組片段之CPER法等之反轉基因法。
於利用反轉基因法之病毒之重建方法中，首先，選殖β冠狀病毒減毒株之不具有任一溫度敏感性變異及增殖減少性等減毒性變異之株(母株)的基因組。作為此時所使用之母株，只要為β冠狀病毒即可，具體而言，可選自於由上述收載於NC_045512(NCBI)中之特定之SARS-CoV-2、上述其他任意之SARS-CoV-2、及β冠狀病毒屬所包含之SARS-CoV-2以外之病毒所組成之群。
進一步地，於在反轉基因法中利用人工染色體之情形時，將病毒基因組之全長DNA選殖為BAC DNA或YAC DNA等，於病毒之序列之上游插入真核細胞用之轉錄啟動子序列。作為啟動子序列，可列舉CMV啟動子及CAG啟動子等。於病毒之序列之下游插入核糖核酸酶序列及多腺苷酸序列。作為核糖核酸酶序列，可列舉D型肝炎病毒核糖核酸酶及錘頭型核糖核酸酶等。作為多腺苷酸序列，可列舉猿猴病毒40之多腺苷酸等。
另一方面，於在反轉基因法中利用CPER法之情形時，將病毒基因組之全長DNA分成多個片段進行選殖。作為獲得片段之方法，可列舉核酸之人工合成法、以將上述人工染色體或片段選殖而成之質體作為模板之PCR法等。
於對藉由上述方法選殖之病毒基因組導入上述至少任一溫度敏感性變異、增殖減少性等減毒性變異、及視需要之其他變異時，可使用雙交換及λ/RED重組等同源重組法、重疊PCR法、CRISPR/Cas9法等公知之點變異導入法。
繼而，將導入有溫度敏感性變異、增殖減少性等減毒性變異、及視需要之其他變異之人工染色體轉染至宿主細胞，使重組病毒重建。於藉由CPER法之反轉基因法之情形時，藉由使用DNA聚合酶之反應將導入有溫度敏感性變異、增殖減少性等減毒性變異、及視需要之其他變異之片段連結後，轉染至宿主細胞，藉此使重組病毒重建。作為轉染之方法，亦無特別限定，可使用公知之方法。又，宿主亦無特別限定，可使用公知之細胞。
繼而，將經重建之重組病毒添加至培養細胞中，將重組病毒進行繼代培養。作為此時所使用之培養細胞，亦無特別限定，例如可列舉：Vero細胞、VeroE6細胞、補充了TMPRESS2之表現之Vero細胞、補充了TMPRESS2之表現之VeroE6細胞、Calu-3細胞、補充了ACE2之表現之293T細胞、BHK細胞、104C1細胞、源自小鼠神經母細胞瘤之NA細胞、Vero細胞等。病毒之回收可藉由離心分離及濾膜等公知之方法進行。又，藉由將所回收之病毒進一步添加至培養細胞中，能夠大量生產重組病毒。
[實施例]
以下，列舉實施例對本發明進行詳細說明，但本發明並不限定於該等。
[試驗例1：SARS-CoV-2之溫度敏感性株A50-18株(參考例)]
[試驗例1-1]SARS-CoV-2之溫度敏感性株A50-18株之分離
基於圖1之方法，於SARS-CoV-2之臨床分離株(B-1株[比較例])(LC603286，本實施例中亦稱為B-1株、野生株(臨床分離株)、歐洲型野生株(B-1株)、B-1株(D614G型：pre-alpha歐洲株))中添加2種突變誘導劑5-氟尿嘧啶(以下為5-FU)及5-氮雜胞苷(以下為5-AZA)，藉此獲得於32℃馴化之A～F50系列及A～F500系列之病毒集群。進一步地，進行多次各病毒集群之繼代，自所獲得之406個候選株中發現可於32℃增殖且於37℃增殖性顯著降低之病毒株(A50-18株。以下有時亦記載為Ts株)，並分離、選擇(圖2)。
[試驗例1-2]藉由下一代定序進行之溫度敏感性株A50-18株之解析
(1-2-1)各病毒株之變異解析
使用下一代定序儀，進行以下病毒株之變異解析。自感染SARS-CoV-2之Vero細胞之培養上清液提取RNA，藉此進行該解析。作為參照，使用作為武漢臨床分離株之Wuhan-Hu-1(NC045512)。
B-1：野生株(臨床分離株)
A50-18：溫度敏感性株
F50-37：非溫度敏感性株
C500-1：非溫度敏感性株
F500-53：非溫度敏感性株
F500-40：非溫度敏感性株
F500-2：非溫度敏感性株
(除了B-1以外，為經變異誘導之病毒)
(1-2-2)溫度敏感性株之變異
根據(1-2-1)獲得圖3A之解析結果。D614G之點變異亦見於B-1株，因此對於溫度敏感性株而言並非特徵性之點變異。另一方面，作為溫度敏感性株(A50-18)之特徵性之點變異，發現了NSP14之G248V、G416S、A504V、棘蛋白之A879V、包膜蛋白之L28P、及核殼蛋白之S2F。
(1-2-3)回覆變異株之解析1
「回覆變異」係指藉由對已變異之病毒進一步導入變異而恢復為與變異前之最初之病毒相同之表現型。於本說明書中，「回覆變異」係指藉由對溫度敏感性株進一步導入變異而喪失溫度敏感性之特性。進一步之變異包括於溫度敏感性化時導入之變異部位之胺基酸恢復為變異前之胺基酸。
使B-1株或A50-18株以MOI=0.01感染Vero細胞，對於32℃、34℃、37℃之增殖性進行評價，結果自A50-18株中發現恢復了37℃之增殖性之樣本(以下稱為「回覆變異株」)。於回覆變異株中，認為獲得溫度敏感性之溫度敏感性株(A50-18株)所具有之變異中，藉由一部分胺基酸殘基回覆變異為變異前之胺基酸(以下簡稱為「回覆變異」)，溫度敏感性降低，37℃之增殖性恢復。將表示該情況之CPE圖像示於圖3B。對所獲得之樣本之序列進行確認，結果可知，NSP14中之G248V之變異回覆變異為野生型之G，另一方面，NSP14中之G416S、A504V及包膜蛋白中之L28P之變異得以維持。由此表明，NSP14之G248V變異為有助於溫度敏感性之責任變異(溫度敏感性變異)。
(1-2-4)分離株之回覆變異之解析2
使A50-18株以moi=1感染Vero細胞，對於37℃、38℃之增殖性進行評價。其結果為，發現恢復了於37℃及38℃之增殖性之樣本(回覆變異株)。將所獲得之回覆變異株於37℃培養3天，將所獲得之CPE圖像示於圖3C。對所獲得之回覆變異株之序列進行確認，結果發現以下＜1＞及＜2＞之2種回覆模式。
＜1＞NSP14中之G248V之變異回覆變異為野生型之G，另一方面，G416S或A504V之變異得以維持
＜2＞NSP14中之G416S之變異回覆變異為野生型之G，另一方面，G248V或A504V之變異得以維持
若NSP14之G248V與G416S中至少一者發生回覆變異，則喪失溫度敏感性，由此表明NSP14之G248V變異與G416S變異之組合為有助於溫度敏感性之責任變異(溫度敏感性變異)。
(1-2-5)對野生型導入變異而成之重組病毒之解析
藉由同源重組對具有野生型之SARS-CoV-2全部基因組之BAC DNA導入源自A50-18株之NSP14、棘蛋白、核殼蛋白、包膜蛋白。將所獲得之重組BAC DNA轉染至293T細胞，藉此將病毒重建。使重組病毒感染Vero細胞，對於37℃與32℃之CPE進行觀察，藉此對溫度敏感性進行評價。將其結果示於圖3D。藉由導入源自A50-18株之NSP14，可獲得於37℃培養時不表現CPE之溫度敏感性株，由此可知NSP14為有助於溫度敏感性之責任變異(溫度敏感性變異)。另一方面，導入源自A50-18株之包膜蛋白亦不會成為溫度敏感性，因此認為包膜蛋白之變異無助於溫度敏感性。
(1-2-6)對野生型導入變異之重組病毒之解析2
藉由CPER法將導入有NSP14之變異之病毒重建。將具有以下各NSP14之變異之3種重組病毒重建。
・僅G248V
・僅G416S
・G248V及G416S(以下亦記載為「雙重變異株」)
使各重組病毒感染Vero細胞，對於37℃或32℃培養3天後之CPE進行觀察。根據圖3-E可知，於僅G248V具有變異之病毒、及僅G416S具有變異之病毒中，於37℃及32℃與B-1株同樣地觀察到CPE，因此未經溫度敏感性化。另一方面，於具有G248V及G416S之變異之雙重變異株之病毒中，於32℃觀察到CPE，但於37℃為僅少量觀察到CPE之程度，與32℃相比CPE明顯變弱。根據上述結果可知，藉由具有G248V及G416S之變異，於37℃之病毒增殖性降低，發生溫度敏感性化。由此可知，NSP14之G248V變異與G416S變異之組合為有助於溫度敏感性之責任變異(溫度敏感性變異)。
(1-2-7)藉由桑格定序進行之溫度敏感性株之解析
使用桑格定序，進行A50-18株之變異解析。自感染SARS-CoV-2之Vero細胞之培養上清液提取RNA，藉此進行該解析。其結果為，未發現如下文所述之試驗例2-2之(2-2-5)中可見之缺失。
(1-2-8)溫度敏感性株之變異彙總
於溫度敏感性株A50-18株中，如下述表2所示，於所顯示之序列編號之胺基酸序列中發現標註有核取標記之變異，其中，發現標註有雙重核取標記之變異為溫度敏感性變異。又，如下述表2所示，發現僅具有NSP14之溫度敏感性變異之雙重變異株亦為溫度敏感性株。
[表2]
| 變異符號 | 多肽 | 對應序列編號** | 變異前胺基酸 | 對應變異位置*** | 變異後胺基酸 | A50-18 (Ts) | 雙重變異株 | |
| (a) | NSP3 | 1 | V | 404 | A | |||
| [1] | (b) | NSP3 | 1 | L | 445 | F | ||
| (c) | NSP3 | 1 | K | 1792 | R | |||
| (d) | NSP3 | 1 | D | 1832 | N | |||
| [1] | (e) (f) | NSP14 NSP14 | 2 2 | G G | 248 416 | V S | ||
| (g) | NSP14 | 2 | A | 504 | V | |||
| [1] | (h) | NSP16 | 3 | V | 67 | I | ||
| (i) | 棘蛋白 | 4 | L | 54 | W | |||
| (j) | 棘蛋白 | 4 | T | 739 | K | |||
| (k) | 棘蛋白 | 4 | A | 879 | V | |||
| (l) | 包膜蛋白 | 5 | L | 28 | P | |||
| (m) | 核殼蛋白 | 6 | S | 2 | F | |||
| [1]為溫度敏感性變異。 **表示實際使用之株所具有之序列所對應的NC_045512(NCBI)株中之序列。 ***以NC_045512(NCBI)株之序列中之位置表示實際使用之株所具有之序列中之變異位置。 所對應之序列及變異位置係藉由序列比對進行鑑定。 |
[試驗例1-3]溫度敏感性株A50-18株之增殖性解析
(1-3-1)於32℃及37℃之解析
於MOI=0.01或0.1之條件下，使用6孔盤使臨床分離株(B-1株[比較例])及溫度敏感性株(A50-18株)感染Vero細胞(N=3)。於37℃或32℃培養後，以0～5dpi將各培養上清液回收。於TCID50/mL下，使用Vero細胞測定0～5dpi之培養上清液病毒效價。將結果示於圖4A。
根據圖4A可知，A50-18株於37℃之感染後第3天之病毒效價為檢測極限以下，於37℃之增殖性顯著降低。
(1-3-2)於32℃、34℃及37℃之解析
於MOI=0.01之條件下，使用6孔盤使臨床分離株(B-1株[比較例])及溫度敏感性株(A50-18株)感染Vero細胞(N=3)。於37℃、34℃或32℃培養後，以0～5dpi將各培養上清液回收。於TCID50/mL下，使用Vero細胞測定0～5dpi之培養上清液病毒效價。將結果示於圖4B。
根據圖4B可知，A50-18株於32℃、34℃與臨床分離株相同程度地增殖，另一方面，顯著缺損於37℃之增殖性。
[試驗例1-4]溫度敏感性株A50-18株之病原性解析
(1-4-1)SARS-CoV-2感染倉鼠之體重變動
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=4)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])及溫度敏感性株(A50-18株)(1×10
4或1×10
6TCID50)以100μL之劑量經鼻投予，觀察10天之體重變動。以經鼻投予相同劑量之D-MEM培養基之組作為非感染對照組(MOCK)。將結果示於圖5。
根據圖5，表明於感染A50-18株時未見體重減少，病原性顯著較低。
(1-4-2)SARS-CoV-2感染倉鼠之肺內或鼻腔內之病毒量
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=3)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])及溫度敏感性株(A50-18株)(1×10
6TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。觀察3天之體重變動，將所得之結果示於圖6。以3dpi使倉鼠安樂死後，利用D-PBS 1mL回收鼻腔洗淨液。又，摘除倉鼠之肺，使右肺破碎，利用D-MEM 1 mL使其懸浮後，藉由離心分離回收上清液作為肺破碎液。於Vero細胞中藉由溶斑定量法對該等鼻腔洗淨液及肺破碎液中之病毒量進行評價，將所得之結果示於圖7。進一步地，藉由10%福馬林將所摘除之左肺固定，將拍攝所得者示於圖8。
根據圖7可知，鼻腔洗淨液中B-1株與A50-18株之病毒量未見差異，另一方面，肺內A50-18株之病毒顯著較少。又，根據圖8可知，感染B-1株且體重減少之倉鼠於肺中可見膨潤或黑色色變，另一方面，A50-18株感染倉鼠未見體重變動或肺中未見顯著變化。根據以上結果推定，溫度敏感性株係於上呼吸道增殖、但於下呼吸道無法增殖之減毒株。
(1-4-3)SARS-CoV-2感染倉鼠之組織學解析
由藉由(1-4-2)中所實施之對倉鼠之感染實驗所獲得之福馬林固定肺製作切片，並進行HE染色，藉此對SARS-CoV-2感染之肺之組織學病原性進行解析。將其結果示於圖9。
如圖9所示，於自感染臨床分離株(B-1株[比較例])之倉鼠獲得之肺中，觀察到紅血球之浸潤或肺泡結構之崩解。另一方面，於溫度敏感性株(A50-18株)感染倉鼠之肺中，未觀察到如該等之遽烈之症狀。該情況亦強烈表明A50-18株於感染時於肺中不會誘發遽烈之炎症，病原性較低。
(1-4-4)藉由免疫化學染色進行之SARS-CoV-2感染倉鼠之組織學解析
對於(1-4-3)中所觀察到之組織學病原性，為了對病毒之增殖與病原性之相關性進行評價，而藉由進行免疫化學染色對病毒蛋白進行檢測。將4週齡雄性敍利亞倉鼠(B-1，A50-18：n=5，MOCK：n=3)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])及溫度敏感性株(A50-18株)(1×10
6TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。以3dpi使倉鼠安樂死後，藉由10%福馬林將所摘除之左肺固定，製作連續切片。對所獲得之連續切片實施HE染色及免疫化學染色(亦稱為Immunohistochemistry(IHC)染色)。免疫化學染色使用兔抗棘蛋白多株抗體(Sinobiological：40589-T62)。將HE染色像及免疫化學染色像示於圖10。與(1-4-3)同樣，於B-1株感染倉鼠中可見紅血球之浸潤或肺泡結構之崩解，藉由免疫化學染色大範圍地檢測到棘蛋白質。另一方面，於A50-18株感染倉鼠中未見此種組織損傷，棘蛋白質亦僅局部地於有限之區域中檢測到。根據該等結果亦可知，B-1株於肺組織中，病毒顯著增殖而表現出組織損傷性，另一方面，A50-18株於肺組織中，病毒無法高效增殖，肺組織損傷性較低。
[試驗例1-5]溫度敏感性株A50-18株之免疫原性解析
(1-5-1)對溫度敏感性株感染倉鼠之野生株攻擊試驗
按照以下順序進行對溫度敏感性株感染倉鼠之野生株(臨床分離株)攻擊試驗。
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=4)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株)(1×10
4或1×10
6TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。21天後，再次將臨床分離株(B-1株)(1×10
6TCID50)以100μL之劑量經鼻投予，觀察10天之體重變動。此時，使用相同週齡之非感染倉鼠(n=3)作為初始對照組。將其結果示於圖11。
如圖11所示，初始倉鼠因B-1株之感染而觀察到體重之減少，另一方面，感染一次B-1株或A50-18株之倉鼠不存在體重減少之情況。由此可知，不僅作為野生株之B-1株，而且於病原性較低之A50-18株引起之感染中，亦可誘導有助於感染防禦之免疫。
(1-5-2)溫度敏感性株感染倉鼠之中和抗體誘導解析
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株)(1×10
6TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。將感染後之體重變動示於圖12。與目前為止之結果同樣，因B-1株之感染導致體重減少，另一方面，於A50-18株之感染中未觀察到體重之減少。
於感染後21天之時點，採集全血，將血清分離後，於56℃進行30分鐘之利用熱之血清之非活化。將100TCID50之B-1株與經連續稀釋之非活化血清混合，於37℃反應1小時。將反應後之培養液接種於Vero細胞並於37℃培養之後，對CPE進行觀察，藉此對病毒之中和活性進行評價。以不產生CPE之最高之稀釋倍率作為中和抗體效價(Neutralizing antibody titer)。將結果示於圖13。可知非感染倉鼠之血清對B-1株未表現出中和活性，另一方面，B-1株或A50-18株感染倉鼠血清成功誘導出中和抗體。
[試驗例2：SARS-CoV-2溫度敏感性株H50-11株、L50-33株、L50-40株(實施例)]
[試驗例2-1]SARS-CoV-2溫度敏感性株H50-11株、L50-33株、L50-40株之追加分離
以候選株之進一步分離為目的，藉由圖14之方法進行溫度敏感性株之分離。使SARS-CoV-2之臨床分離株(B-1株[比較例])感染Vero細胞，於添加突變誘導劑5-FU之狀態下，獲得於32℃馴化之G～L50系列之病毒集群。進一步地，進行多次各病毒集群之繼代，自所獲得之253之株中，發現於32℃能夠增殖但於37℃增殖性顯著降低之病毒株(H50-11株、L50-33株、L50-40株)並分離、選擇(圖15)。
[試驗例2-2]利用下一代定序之溫度敏感性追加分離株H50-11株、L50-33株、L50-40株之解析
(2-2-1)追加分離株之變異解析法
使用下一代定序儀，進行以下病毒株之變異解析。自感染SARS-CoV-2之Vero細胞之培養上清液提取RNA，藉此進行該解析。作為參照，使用作為武漢臨床分離株之Wuhan-Hu-1(NC045512)。
H50-11株：溫度敏感性株
L50-33株：溫度敏感性株
L50-40株：溫度敏感性株
(2-2-2)溫度敏感性株變異解析結果
於(2-2-1)中獲得圖16A之解析結果。作為H50-11株之特徵性之點變異，發現NSP3之V404A及D1832N、NSP16之V67I、及棘蛋白之T739K。又，作為L50-33株之特徵性之點變異，發現NSP3之L445F、K1792R，作為L50-40株之特徵性之點變異，發現NSP3之L445F、K1792R、棘蛋白之L54W。
(2-2-3)追加分離株之回覆變異株之解析(H50-11株)
使H50-11株以moi=1感染Vero細胞，對於37℃、38℃之增殖性進行評價。其結果為，發現恢復了於37℃及38℃之增殖性之樣本(回覆變異株)。將所獲得之回覆變異株於38℃培養3天，將所得之CPE圖像示於圖16B。對所獲得之樣本之序列進行確認，結果NSP16 V67I之變異回覆變異為野生型之V，另一方面，其他胺基酸變異得以維持。由此表明，NSP16之V67I變異為有助於溫度敏感性之責任變異(溫度敏感性變異)。
(2-2-4)追加分離株之回覆變異株之解析(L50-33株及L50-40株)
使L50-33株及L50-40株以MOI=0.01感染Vero細胞，對於32℃、34℃、37℃之增殖性進行評價。其結果為，自L50-33株及L50-40株中發現恢復了37℃之增殖性之樣本(以下為回覆變異株)。將各株於37℃培養3天，將所得之CPE圖像示於圖16C。將L50-33株及L50-40株之回覆變異株分別表示為L50-33株Rev1、2及L50-40株Rev1、2。對所獲得之樣本之序列進行確認，結果可知，NSP3中之L445F之變異向野生型之L或C變異，另一方面，NSP3中之K1792R之變異得以維持。由此表明存在NSP3之L445F變異為有助於溫度敏感性之責任變異(溫度敏感性變異)之可能性。
(2-2-5)藉由桑格定序進行之溫度敏感性株之解析
使用桑格定序，進行H50-11株、L50-33株及L50-40株之變異解析。自感染SARS-CoV-2之Vero細胞之培養上清液提取RNA，藉此進行該解析。
其結果為，於3株中全部發現如圖17所示之27549～28251位之鹼基序列(序列編號7)之缺失。將27549～28251位之鹼基序列之缺失及由其編碼之胺基酸序列之缺失之概要圖示於圖18。又，於圖18中，ORF7a為27394～27759位之鹼基序列，ORF7b為27756～27887位之鹼基序列，ORF8為27894～28259位之鹼基序列。
如圖18所示，27549～28251位之鹼基序列區域相當於ORF7a之一部分(第53號至末端之胺基酸序列。以下同樣)、ORF7b整體、及ORF8之大部分之胺基酸序列。本區域之缺失伴隨框移，因此認為產生ORF7a之第1-52號胺基酸序列和ORF8之3'末端8個鹼基及基因間區域與核殼蛋白之鹼基序列所編碼之胺基酸序列融合而成之蛋白質。又，ORF7b整體缺失，ORF8之原來之序列亦整體缺失。
(2-2-6)溫度敏感性株之變異彙總
於溫度敏感性株H50-11株、L50-33株及L50-40株中，如下述表3所示，於所顯示之序列編號之胺基酸序列中發現標註有核取標記之變異，其中發現標註有雙重核取標記之變異為溫度敏感性變異。
[表3]
| 變異符號 | 多肽 | 對應序列編號** | 變異前胺基酸 | 對應變異位置*** | 變異後胺基酸 | H50-11 | L50-33 | L50-40 | |
| (a) | NSP3 | 1 | V | 404 | A | ||||
| [1] | (b) | NSP3 | 1 | L | 445 | F | |||
| (c) | NSP3 | 1 | K | 1792 | R | ||||
| (d) | NSP3 | 1 | D | 1832 | N | ||||
| [1] | (e) (f) | NSP14 NSP14 | 2 2 | G G | 248 416 | V S | |||
| (g) | NSP14 | 2 | A | 504 | V | ||||
| [1] | (h) | NSP16 | 3 | V | 67 | I | |||
| (i) | 棘蛋白 | 4 | L | 54 | W | ||||
| (j) | 棘蛋白 | 4 | T | 739 | K | ||||
| (k) | 棘蛋白 | 4 | A | 879 | V | ||||
| (l) | 包膜蛋白 | 5 | L | 28 | P | ||||
| (m) | 核殼蛋白 | 6 | S | 2 | F | ||||
| [2] | (n) | ORF7a-8 | 7 | ( 完整 ) | 1-703 | ( 缺失 ) | |||
| [1]為溫度敏感性變異， [2]為增殖減少性等減毒性變異。 **表示實際使用之株所具有之序列所對應的NC_045512(NCBI)株中之序列。 ***以NC_045512(NCBI)株之序列中之位置表示實際使用之株所具有之序列中之變異位置。 所對應之序列及變異位置係藉由序列比對進行鑑定。 |
[試驗例3]追加分離株H50-11株、L50-33株、L50-40株之增殖性解析(實施例)
於MOI=0.01之條件下使追加分離株感染Vero細胞(N=3)。於37℃、34℃或32℃培養後，於0～5d.p.i.下將各培養上清液回收。使用Vero細胞以TCID
50/mL測定該等培養上清液病毒效價。將其結果示於圖19。藉此，所獲得之追加分離株於32℃、34℃表現出增殖性，另一方面，於37℃增殖性降低。
[試驗例4]各溫度敏感性株之病原性解析
(4-1) 溫度敏感性株感染倉鼠之體重變動
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株[參考例]、以及L50-33株、L50-40株、及H50-11株[實施例])(3×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻投予，觀察10天之體重變動。將經鼻投予相同劑量之D-MEM培養基之組設為非感染對照組(MOCK)。將結果示於圖20。於感染了B-1株之倉鼠中，7天內可見20%左右之體重降低，與此相對，於感染了溫度敏感性株之倉鼠中，全部組中未見顯著之體重降低，表明病原性顯著較低。
(4-2) 溫度敏感性株感染倉鼠之肺內或鼻腔內之病毒量
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株[參考例]、以及L50-33株、L50-40株、及H50-11株[實施例])(3×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。以3dpi使倉鼠安樂死後，利用D-PBS 1mL回收鼻腔洗淨液。又，摘除倉鼠之肺，測定肺重量後，使右肺破碎，利用D-MEM 1 mL使其懸浮後，藉由離心分離回收上清液作為肺破碎液。將相對於倉鼠之總體重之肺重量示於圖21。又，於Vero細胞中藉由溶斑定量法對該等鼻腔洗淨液及肺破碎液中之病毒量進行評價，將所得之結果示於圖22。
將相對於倉鼠之總體重量之肺重量加以比較，結果為B-1株感染倉鼠之肺重量有所增加，強烈表明肺因炎症等而膨潤。另一方面，溫度敏感性株感染倉鼠中未觀察到此種肺重量之增加。又，將鼻腔洗淨液中之病毒量加以比較，結果為B-1株感染倉鼠與除H50-11株以外之溫度敏感性株感染倉鼠無顯著差異，H50-11株感染倉鼠之鼻腔洗淨液中之病毒量較少。進一步地，可知溫度敏感性株感染倉鼠與B-1株感染倉鼠相比，肺內病毒量顯著較少。根據該等結果，推測各溫度敏感性株為與試驗例1中之A50-18株同樣地無法於下呼吸道增殖之減毒株。
[試驗例5]各溫度敏感性株之免疫原性解析
(5-1)對溫度敏感性株感染倉鼠之野生株攻擊試驗
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株[參考例]、以及L50-33株、L50-40株、及H50-11株[實施例])(3×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。21天後，再次將臨床分離株(B-1株)(3×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻投予，觀察9天之體重變動。此時，使用相同週齡之非感染倉鼠(n=5)作為初始對照組。將其結果示於圖23。初始倉鼠因B-1株之感染而觀察到體重之減少，另一方面，感染一次B-1株及各溫度敏感性株之倉鼠之體重未減少。由此可知，不僅作為野生株之B-1株，而且於病原性較低之各溫度敏感性株引起之感染中，亦可誘導有助於感染防禦之免疫。
(5-2) 溫度敏感性株感染倉鼠之中和抗體誘導解析
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株[參考例]、以及L50-33株、L50-40株、及H50-11株[實施例])(3×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。20天後實施局部採血，使用所獲得之血清，測定針對臨床分離株(B-1株)之中和活性。中和活性之測定方法使用與(1-5-2)同樣之方法。將測定結果示於圖24。可知不僅B-1株之感染，而且各溫度敏感性株感染倉鼠中亦誘導具有中和活性之抗體。
[試驗例6]針對SARS-CoV-2變異株之有效性解析(參考例)
溫度敏感性株感染倉鼠血清之對SARS-CoV-2變異株之中和活性評價
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=3或5)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株[參考例])(3×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。自感染後3週之倉鼠實施局部採血，使用所獲得之血清，測定對於SARS-CoV-2歐洲型臨床分離株(B-1)及巴西型變異株(hCoV-19/Japan/TY7-503/2021株)之活病毒之中和活性，將所得之結果示於圖25。中和活性之測定方法使用與(1-5-2)同樣之方法。可知感染B-1株或溫度敏感性株之倉鼠對巴西型變異株亦表現出中和活性。由此推測，本減毒活疫苗對SARS-CoV-2變異株亦有效。
[試驗例7]投予路徑、投予量之比較研究實驗(參考例)
(7-1)利用投予路徑之免疫誘導能力之比較
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，將臨床分離株(B-1株[比較例])或溫度敏感性株(A50-18株[參考例])(3×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻、或皮下投予。以未處置組作為初始對照組(naive)。3週後，使用自倉鼠局部採血所獲得之血清，評價對於SARS-CoV-2巴西型變異株(hCoV-19/Japan/TY7-503/2021株)之中和活性。中和活性之測定方法使用與(1-5-2)同樣之方法。將中和活性之結果示於圖26。i.n表示經鼻投予，S.C表示皮下投予。B-1株或A50-18株之經鼻投予中對活病毒成功誘導出中和抗體。對於皮下投予，於所試驗之劑量下幾乎未能誘導中和抗體，但若鑒於經鼻投予中之結果，可認為若增加劑量，則皮下投予亦可誘導中和抗體。
(7-2)利用投予量之免疫誘導能力之比較
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，將溫度敏感性株(A50-18株)經鼻、或皮下投予。將投予量示於表4。
[表4]
| 第一次感染 | ||
| 接種效價 | 路徑 | |
| mock(n.c) | ||
| 強效價感染(p.c) | 3.0×10 5TCID 50 | i.n 100μL |
| 高劑量i.n | 1.0×10 4TCID 50 | i.n 10μL |
| 低劑量i.n | 1.0×10 2TCID 50 | i.n 10μL |
| 高劑量s.c | 1.0×10 4TCID 50 | s.c 100μL |
| 低劑量s.c | 1.0×10 2TCID 50 | s.c 100μL |
自感染後3週之倉鼠實施局部採血，使用所獲得之血清測定對於SARS-CoV-2巴西型變異株(hCoV-19/Japan/TY7-503/2021株)之活病毒之中和活性，將所得之結果示於圖27。i.n表示經鼻投予，S.C表示皮下投予。中和活性之測定方法使用與(1-5-2)同樣之方法。與(7-1)同樣，於經鼻投予中即便為1×10
2TCID50/10μL之低劑量投予組亦觀察到中和抗體效價之上升。由此表明存在溫度敏感性株即便為少量之鼻腔投予亦能夠誘導充分之免疫之可能性。對於皮下投予，於所試驗之劑量下幾乎未能誘導中和抗體，但若鑒於經鼻投予中之結果，可認為若增加劑量，則皮下投予亦可誘導中和抗體。
[試驗例8]針對SARS-CoV-2變異株之有效性解析(參考例)
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=4)餵養一週後，將1×10
4TCID50或1×10
2TCID50之溫度敏感性株(A50-18株[參考例])以10μL之劑量經鼻投予。自感染後3週之倉鼠實施局部採血，使用所獲得之血清測定對於SARS-CoV-2 歐洲型野生株(B-1株)、印度型變異株(自家分離株)、巴西型變異株(hCoV-19/Japan/TY7-503/2021株)之活病毒之中和活性，將所得之結果示於圖28。中和活性之測定方法使用與(1-5-2)同樣之方法。可知於少量經鼻投予A50-18株之個體中，亦為不僅母株且為野生型之B-1株，而且可劑量依賴性地誘導對於印度型變異株或巴西型變異株之中和抗體。
又，將各個體之血清對各株之中和抗體效價進行比較，將所得之結果示於圖29。可知對於巴西型變異株，雖然於一部分個體中可見中和抗體效價之減少，但於全部個體中保有中和抗體。該等結果表明存在利用溫度敏感性株之經鼻投予獲得之免疫表現出交叉防禦之可能性。
[試驗例9]藉由CPER反應之疫苗候選株之製作(實施例)
減毒活疫苗原本於宿主體內伴隨增殖，因此存在於核酸複製時所產生之突變導致產生強毒型之野生株之可能性。為了降低該可能性，而構建將溫度敏感性變異與增殖減少性等減毒性變異複合而成之株。此種株以即便於喪失溫度敏感性變異之情形時亦可維持減毒性之方式構建。作為溫度敏感性變異及增殖減少性等減毒性變異、以及其他變異，使用表5中以核取標記表示之變異[即，NSP3之L445F、NSP14之G248V及G416S、及NSP16之V67I；NSP1之第32～39號之8個胺基酸缺失、棘蛋白之弗林蛋白酶切割位點(FCS)之缺失(具體而言，棘蛋白之第679～686號之缺失及V687I)、ORF8之功能缺失；溫度敏感性株中所發現之其他變異(NSP3 K1792R及NSP14 A504V)之任一者]。
[表5]
| 變異符號 | 多肽 | 對應序列編號** | 變異前胺基酸 | 對應變異位置*** | 變異後胺基酸 | 候選株 1 | 候選株 2 | 候選株 3 | 候選株 4 | 候選株 5 | 候選株 6 | 候選株 7 | |
| (a) | NSP3 | 1 | V | 404 | A | ||||||||
| [1] | (b) | NSP3 | 1 | L | 445 | F | |||||||
| (c) | NSP3 | 1 | K | 1792 | R | ||||||||
| (d) | NSP3 | 1 | D | 1832 | N | ||||||||
| [1] | (e) (f) | NSP14 NSP14 | 2 2 | G G | 248 416 | V S | |||||||
| (g) | NSP14 | 2 | A | 504 | V | ||||||||
| [1] | (h) | NSP16 | 3 | V | 67 | I | |||||||
| (i) | 棘蛋白 | 4 | L | 54 | W | ||||||||
| (j) | 棘蛋白 | 4 | T | 739 | K | ||||||||
| (k) | 棘蛋白 | 4 | A | 879 | V | ||||||||
| (l) | 包膜蛋白 | 5 | L | 28 | P | ||||||||
| (m) | 核殼蛋白 | 6 | S | 2 | F | ||||||||
| [2] | (n) | ORF7a-8 | 7 | ( 完整 ) | 1-703 | ( 缺失 ) | |||||||
| [2] | (o) | 棘蛋白 | 4 | ( 完整 ) | 681-684 | ( 缺失 ) | |||||||
| (o) | 棘蛋白 | 4 | ( 完整 ) | 681-684 | ( 缺失 ) | ||||||||
| (p) | 棘蛋白 | 4 | (完整) | 679-680 685-686 | ( 缺失 ) ( 缺失 ) | ||||||||
| (p) | 棘蛋白 | 4 | (完整) | 679-680 685-686 | ( 缺失 ) ( 缺失 ) | ||||||||
| (q) | 棘蛋白 | 4 | V | 687 | I | ||||||||
| (q) | 棘蛋白 | 4 | V | 687 | I | ||||||||
| [2] | (r) | NSP1 | 8 | ( 完整 ) | 32-39 | ( 缺失 ) | |||||||
| 棘蛋白序列之來源株* | Br | WT | WT | WT | WT | WT | SA | ||||||
| 棘蛋白序列以外之序列之來源株* | WT | WT | WT | WT | WT | WT | WT | ||||||
| [1]為溫度敏感性變異， [2]為增殖減少性等減毒性變異。 *序列之來源株之詳細如以下所述： WT=野生型(B-1株；LC603286) Br=巴西型(GISAID：EPI_ISL_877769) SA=南非株(於B-1株中導入K417N、E484K、N501Y而成之株) **對於棘蛋白以外之序列，表示WT所具有之序列所對應之NC_045512(NCBI)株中之序列。 對於棘蛋白之序列，表示WT、Br或SA所具有之序列所對應之NC_045512(NCBI)株中之序列。 ***以NC_045512(NCBI)株之序列中之位置表示實際使用之WT、Br或SA序列中之變異位置。 所對應之序列及變異位置係藉由序列比對進行鑑定。 |
藉由使用CPER之反轉基因法，構建將上述溫度敏感性變異及增殖減少性等減毒性變異與其他變異一起複合而具有之株(Torii et al. cell report 2020)。將SARS-CoV-2 B-1株之基因組片段化，選殖為質體。使用反向PCR，將目標變異導入所選殖之片段中。以選殖野生型片段之質體作為模板，藉由PCR獲得SARS-CoV-2野生型基因組片段。又，以導入有變異之質體、或具有目標變異之SARS-CoV-2變異株之基因組作為模板，進行PCR或RT-PCR，藉此獲得SARS-CoV-2變異型基因組片段。
將所獲得之片段及包含CMV啟動子之連接子片段混合，使用PrimeStar GXL聚合酶進行CPER，藉此將多個片段環狀化。將反應液轉染至BHK/hACE2細胞，於34℃進行培養，藉此將目標病毒重建。將所獲得之細胞之培養上清液添加至VeroE6/TMPRSS II細胞中，於34℃進行培養，藉此進行所重建之病毒之恢復培養。將導入至各候選株中之溫度敏感性株變異及/或增殖減少性等減毒性變異及CPE圖像示於圖30。於VeroE6/TMPRSS II細胞中觀察到CPE，由此可知病毒得以重建。
[試驗例10]候選株之溫度敏感性評價(實施例)
(10-1)候選株1～7之溫度敏感性
為了對試驗例9中所獲得之候選株1～7(實施例)之溫度敏感性進行評價，使各候選株之恢復培養之上清液2μL感染Vero細胞，將於34℃、37℃之增殖性加以比較。將培養3天後之CPE圖像示於圖31A。全部株於34℃表現出CPE，與此相對，候選株1、2、3、6、7於37℃未表現出CPE。候選株4、5雖然產生少量CPE，但其程度弱於34℃。由此確認疫苗候選株表現出溫度敏感性。
(10-2)導入全部溫度敏感性變異並重建之株之溫度敏感性
獲得導入全部溫度敏感性變異並重建之株(rTs-all株[實施例])。rTs-all株中作為溫度敏感性變異而導入了(b)之變異、(e)及(f)之變異之組合、以及(h)之變異之3種，且僅導入(n)之變異作為其他減毒性變異，而未導入其他變異。
使rTs-all株以MOI=0.01感染Vero細胞，於32、37、39℃培養5天，經時性地對培養上清液進行採樣(n=3)。藉由TCID50法測定各時點下之病毒效價。比較對象使用藉由CPER法所製作之B-1株(rB-1株)。將所獲得之增殖曲線示於圖31B。如圖31B所示，rTs-all株於32℃增殖，另一方面，37℃及39℃之增殖性顯著降低(於第1天低於檢測極限，之後未增殖)。再者，rTs-all株之32℃之增殖與rB-1株相比稍有延遲，因此認為，作為溫度敏感性之水準，表現為強於較佳之程度(即於32℃之增殖性與rB-1株相同之程度)。根據該結果可知，為了將溫度敏感性之水準控制為較佳之程度，相較於選擇溫度敏感性變異(即(b)之變異、(e)及(f)之變異之組合、(h)之變異之3種變異或變異之組合)中之3種，宜為選擇1種或2種。
[試驗例11]候選株1、3、4、6、7之低效價、低劑量時之免疫原性評價(中和抗體效價誘導)(實施例)
為了對試驗例9中所獲得之候選株中之候選株1、3、4、6、7(實施例)之免疫原性進行評價，對5週齡雄性倉鼠5隻經鼻投予100TCID50之各候選株10μL。又，作為陽性對照，以相同效價、相同劑量經鼻投予SARS-CoV-2溫度敏感性株A50-18株。於3週後實施局部採血，對所獲得之血清對SARS-CoV-2 B-1株之中和活性進行評價。中和活性係藉由如下方法進行評價：將連續稀釋血清與100TCID50之SARS-CoV-2混合，反應1小時後，添加至Vero細胞中，對培養4天後之CPE進行觀察，藉此判定感染性病毒之有無。以未見CPE而能夠中和病毒之感染性之血清之最大稀釋倍率作為中和抗體效價。將其結果示於圖32。
於作為陽性對象組之A50-18株(參考例)之感染倉鼠之全部個體中觀察到中和活性轉為陽性。於候選株1及候選株3中，於本試驗例中之投予條件下未觀察到中和活性轉為陽性，因此表明，為了表現免疫原性，需要以更高劑量投予。另一方面，候選株4、6、7均於一部分個體或全部個體中觀察到中和活性轉為陽性，可知即便為如本試驗例之低劑量亦具有免疫原性。尤其是於候選株7(實施例)之感染倉鼠中，與A50-18株同樣，於全部個體中觀察到中和活性轉為陽性，因此免疫原性之程度尤其優異。即，於本試驗例中之投予條件下觀察到中和活性轉為陽性之候選株中，候選株4、6藉由將溫度敏感性變異與其他減毒性變異組合構建，而使安全性提高，尤其是對於候選株7，藉由將溫度敏感性變異與增殖減少性等減毒性變異組合構建，儘管體內之增殖性顯著降低，但亦維持了優異之免疫原性。
[試驗例12]候選株7之低效價、低劑量時之免疫原性評價(攻擊試驗)(實施例)
為了評價由候選株7所誘導之免疫是否有助於感染防禦，對免疫後之倉鼠(雄性8週齡)經鼻投予3×10
5TCID50之SARS-CoV-2 B-1株100μL，藉此實施攻擊試驗。將此時之倉鼠之體重變動示於圖33。與用作陽性對照之A50-18株(參考例)同樣，感染候選株7(實施例)之倉鼠於感染SARS-CoV-2 B-1株時體重並未降低。根據該結果可知，候選株7(實施例)與A50-18株(參考例)同樣成功誘導出有助於感染防禦之免疫。
[試驗例13]候選株2、5之高效價、高劑量時之免疫原性評價(實施例)
對於候選株2、5(實施例)，對以高效價、高劑量進行實驗時之免疫原性進行評價。對5週齡雄性倉鼠5隻經鼻投予1×10
3或1×10
4TCID50之候選株20μL。又，作為陽性對象，以相同劑量經鼻投予SARS-CoV-2溫度敏感性株A50-18株(參考例)1×10
3TCID50。自3週後之感染恢復倉鼠實施局部採血，對所獲得之血清之中和活性進行評價。中和活性之測定係以與試驗例3同等之方法實施。將其結果示於圖34。
於候選株2中，藉由投予1×10
3TCID50，於5隻中之4隻個體中觀察到中和抗體轉為陽性，於投予1×10
4TCID50時，於全部個體中觀察到中和抗體轉為陽性。於候選株5中，藉由投予1×10
3TCID50而僅於5隻中之1隻中確認到血清之中和活性，但藉由投予1×10
4TCID50之病毒，而於5隻中之3隻中觀察到中和抗體之誘導。根據該等結果可知，將溫度敏感性變異與增殖減少性等減毒性變異複合而成之疫苗候選株與僅具有溫度敏感性變異之株相比，雖然相同劑量下免疫原性較低，但藉由提高劑量而表現出中和抗體之誘導所需之免疫原性。又，候選株2於猴中亦確認到中和活性，因此可知表現出免疫誘導。
[試驗例14]候選株2於各溫度下之增殖性評價
於MOI=0.01之條件下，使用6孔盤使臨床分離株(B-1株[比較例])及候選株2([實施例])感染Vero細胞(N=3)。於37℃、或32℃進行培養，以0～5dpi將各培養上清液回收。於TCID50/mL下，使用Vero細胞測定0～5dpi之培養上清液病毒效價。將結果示於圖35。
根據圖35，候選株2([實施例])於32℃以與臨床分離株(B-1株[比較例])相同之程度增殖，另一方面，於37℃之增殖性顯著降低。
[試驗例15]藉由候選株2之投予所誘導之體液免疫之持續性試驗(實施例)
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=10)餵養一週後，於麻醉條件下以20μL之劑量經鼻投予候選株2(實施例)(1×10
3TCID50或1×10
4TCID50)。於投予2次之組中，於第1次投予後4週之時點，於麻醉條件下再次以20μL之劑量經鼻投予候選株2(1×10
3TCID50或1×10
4TCID50)。經時性地進行局部採血，於56℃將所獲得之血清熱處理30分鐘，藉此進行非活化。將100TCID50之B-1株(D614G型：pre-alpha歐洲株)或TY38-873株(omicron變異株)與經連續稀釋之非活化血清混合，於37℃反應1小時。將反應後之培養液接種於Vero細胞並於37℃培養之後，對CPE進行觀察，藉此對病毒之中和活性進行評價。以不產生CPE之最低之稀釋倍率作為中和抗體效價(Neutralizing antibody titer)。將其結果示於圖36。
根據圖36，藉由候選株2之單次投予，血清之中和抗體效價上升至6～12。又，於第1次投予後4週之時點進行第2次投予，此時，中和抗體效價未見上升，表明藉由單次投予而誘導出充分之體液免疫。又，以上述方式獲得之血清中和抗體於投予後4個月時點亦不存在顯著減少之情況。根據該等結果可知，候選株2於倉鼠模型中，藉由1×10
3TCID50之單次投予而誘導出充分之體液免疫，該體液免疫持續至投予後至少4個月。又，藉由以棘蛋白抗原肽刺激候選株2感染倉鼠之脾臟細胞，誘導出抗原特異性IFN-γ之產生。根據該結果可知，藉由候選株2之投予而誘導出抗原特異性Th1細胞，候選株2亦誘導細胞性免疫。
[試驗例16]藉由候選株2投予進行之感染防禦試驗(實施例)
對於試驗例13中經鼻投予1×10
3、1×10
4TCID50之候選株2、或1×10
3TCID50之SARS-CoV-2溫度敏感性株A50-18株20μL之倉鼠，於初次投予之3週後，於麻醉條件下以100μL之劑量經鼻投予SARS-CoV-2 B-1株(3×10
5TCID50)，藉此實施攻擊試驗。測定實施攻擊試驗後之倉鼠之體重直至投予後6天為止。將其結果示於圖37。
根據圖37可知，感染候選株2或A50-18株之倉鼠於感染SARS-CoV-2 B-1株時不存在體重降低之情況，誘導出有助於感染防禦之免疫。
[試驗例17]候選株2於活體內繼代時之毒力回覆研究(實施例)
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=5)餵養一週後，於麻醉條件下以100μL之劑量經鼻投予溫度敏感性株A50-18株或候選株2(1×10
5TCID50)。該投予量以使用由倉鼠無有害作用量外推人類無有害作用量之除數30之人類等效劑量計，相當於2×10
5PFU/dose。觀察體重變動，並且於投予後3天之時點使倉鼠安樂死後，使用500μL之PBS將鼻腔洗淨液回收。利用0.22μm過濾器將所獲得之鼻腔洗淨液過濾殺菌後，於麻醉條件下將其中100μL之鼻腔洗淨液經鼻投予至下一代倉鼠。將同樣之操作進行3次，藉此獲得進行1次～4次活體內繼代時之鼻腔洗淨液。將所獲得之鼻腔洗淨液接種至Vero細胞，於各溫度下進行培養，藉此對感染性之病毒之有無及該病毒之溫度敏感性進行評價。又，自鼻腔洗淨液提取病毒RNA，藉由桑格定序法確認目標部位之鹼基序列。將接種了各繼代後之鼻腔洗淨液之Vero細胞中的CPE之有無示於圖38，將自進行了第4次活體內繼代時之鼻腔洗淨液提取之病毒RNA之序列確認結果示於圖39，將各活體內繼代時之倉鼠之體重變動之結果示於圖40。
A50-18株為溫度敏感性株，因此於感染Vero細胞後，於37℃或39℃培養時未引起CPE，但根據圖38觀察到，於將感染A50-18株之倉鼠之鼻腔洗淨液添加至Vero細胞中且於37℃或39℃培養時引起CPE。又，根據圖39可知，對活體內繼代後之鼻腔洗淨液中所含之病毒RNA之序列進行確認，其結果為，作為帶來溫度敏感性之變異之NSP14之變異中喪失了G416S或G248V之變異。進一步地，根據圖40觀察到，若對活體內繼代時之倉鼠之體重變動進行評價，則感染了A50-18株之活體內繼代後之鼻腔洗淨液之倉鼠的體重降低。該等結果表明，A50-18株於倉鼠之體內，因喪失帶來溫度敏感性之變異，而存在產生喪失溫度敏感性之毒力回覆株而傳播至其他個體之可能性。
另一方面，於候選株2中，根據圖38，自第1次活體內繼代後之鼻腔洗淨液檢測到表現溫度敏感性之病毒，另一方面，自第2次之後之活體內繼代後之鼻腔洗淨液幾乎未檢測到病毒。又，根據圖39，對活體內繼代後之鼻腔洗淨液中所含之病毒RNA之序列進行確認，其結果為，亦存在喪失帶來溫度敏感性之變異之一部分者(但此種繼代株中亦為僅喪失NSP14中之248位及416位之變異之組合之一者)。另一方面，保持了作為帶來減毒性之變異之NSP1之局部缺失(增殖減少性變異)、棘蛋白之弗林蛋白斷裂部位之缺失、及ORF7a-8之缺失。進一步地，根據圖40，於感染了候選株2之活體內繼代後之鼻腔洗淨液的倉鼠中亦未見體重之降低。該等結果表明，候選株2與僅具有帶來溫度敏感性之變異之A50-18株相比，為產生毒力回覆之可能性較少之候選株。根據該結果可推測，本發明之β冠狀病毒減毒株藉由對預定溫度敏感性變異(置換變異)進一步組合預定增殖減少性等減毒性變異(缺失變異)，於將該病毒作為活疫苗接種於人類之情形時，毒力回覆之病毒傳播之可能性亦較低，就該方面而言，作為疫苗之有用性顯著提高。
[試驗例18]利用候選株2進行之組織損傷性評價(實施例)
將4週齡雄性敍利亞倉鼠(n=4)餵養一週後，於麻醉條件下將SARS-CoV-2 B-1株[比較例]、溫度敏感性株A50-18株[參考例]或候選株2[實施例](1×10
5TCID50)以20μL之劑量經鼻投予。該投予量以使用由倉鼠無有害作用量外推人類無有害作用量之除數30之人類等效劑量計，相當於4×10
4PFU/dose。於麻醉條件下將相同劑量之培養基經鼻投予至非感染組(naive)。又，作為陽性對照組，於麻醉條件下將SARS-CoV-2 B-1株(1×10
5TCID50)以100μL之劑量經鼻投予。藉由以20μL之劑量經鼻投予，病毒液到達倉鼠之上呼吸道，藉由以100μL之劑量經鼻投予，病毒液到達倉鼠之下呼吸道。於投予後3天時點，使其安樂死後將頭部及肺進行福馬林固定，藉由HE染色評價組織損傷性，並且藉由使用兔抗棘蛋白RBD抗體(Rabbit anti-spike RBD antibody)(Sinobiological(40592-T62))之IHC染色檢測病毒抗原。將各個體之鼻腔、肺部中之病變以及藉由IHC進行之病毒抗原之檢測之得分示於表6。本表之Level1表示鼻腔之前端部，Level2表示鼻腔之中部，Level3表示鼻腔之裏側。又，對於各病毒感染倉鼠之各部位中之代表例，將Level1示於圖41，將Level2示於圖42，將Level3示於圖43，將肺示於圖44。
根據圖41～圖44，於投予了SARS-CoV-2 B-1株(比較例)之系統中，不僅將病毒液經鼻投予至下呼吸道之陽性對照組，而且於將病毒液經鼻投予至上呼吸道之倉鼠中，於鼻腔之前端部至深部以及肺中檢測到組織損傷及病毒之抗原。於將A50-18株(參考例)或候選株2(實施例)經鼻投予至上呼吸道之倉鼠中，僅於鼻腔前端部檢測到輕度之組織損傷及病毒抗原，另一方面，於鼻腔深部及肺中未檢測到組織損傷及病毒抗原。該等結果強烈表明，候選株2(實施例)及溫度敏感性株A50-18株(參考例)於接近外部氣溫之鼻腔前端部中，產生病毒之增殖或伴隨於其之組織損傷，另一方面，於靠近體溫之鼻腔深部或肺中，病毒增殖及伴隨於其之組織損傷受到抑制，並且，候選株2(實施例)之病毒之增殖及伴隨於其之組織損傷之抑制效果更高，進一步發生嗅覺障礙之風險較低。
[表6]
| 器官 結果 | 初始N.C. | WT P.C. | WT上呼吸道 | A50-18上呼吸道 | 候選株2上呼吸道 | |||||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 鼻腔 (Level 1) | ||||||||||||||||||||
| 炎症 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 1 | 0 | 2 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 2 | 2 |
| 壞死，上皮 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 2 | 0 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 |
| SARS-CoV-2棘蛋白陽性細胞 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 0 | 2 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 |
| 鼻腔 (Level 2) | ||||||||||||||||||||
| 炎症 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 壞死，上皮 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 脫落，上皮 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 壞死，鮑氏腺 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 壞死，鼻腺 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| SARS-CoV-2棘蛋白陽性細胞 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 鼻腔 (Level 3) | ||||||||||||||||||||
| 炎症 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 壞死，上皮 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 脫落，上皮 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 壞死，鮑氏腺 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| SARS-CoV-2棘蛋白陽性細胞 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 肺 | ||||||||||||||||||||
| 炎症，細支氣管肺泡 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 出血，肺泡 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 壞死，支氣管上皮 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| SARS-CoV-2棘蛋白陽性細胞 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0：無顯著變化 1：輕微(病變部位或抗原檢測部位為10%以下) 2：輕度(病變部位或抗原檢測部位為10%～50%) 3：中等度(病變部位或抗原檢測部位為50%～70%) |
[試驗例19]利用候選株2之免疫原性評價(利用異型株進行之攻擊試驗)
對經候選株2誘導之免疫是否有助於SARS-CoV-2 omicron變異株之感染防禦進行評價。將4週齡雄性敍利亞倉鼠餵養一週後，於麻醉條件下以20μL之劑量經鼻投予候選株2(1×10
3PFU)。於投予後4週之時點，藉由局部採血採集血清。將所獲得之血清於56℃熱處理30分鐘，藉此進行非活化。將100TCID50之B-1株(D614G型：pre-alpha歐洲株)或TY41-702株(omicron變異株：BA.5)與經連續稀釋之非活化血清混合，於37℃反應1小時。將反應後之培養液接種於Vero細胞並於37℃培養之後，對CPE進行觀察，藉此對病毒之中和活性進行評價。以不產生CPE之最低之稀釋倍率作為中和抗體效價(Neutralizing antibody titer)。將其結果示於圖45。又，於投予後4週之時點，對於候選株2投予倉鼠與初始倉鼠，於麻醉條件下以100μL之劑量經鼻投予TY41-702株(3×10
5PFU)，藉此實施攻擊試驗。經時性地測定體重，於攻擊試驗之實施後4天之時點，將倉鼠安樂死後，對肺內及鼻腔洗淨液中之感染性病毒進行定量。將此時之體重變動示於圖46。
根據圖45可知，中和抗體效價之測定之結果為，藉由投予候選株2，不僅針對B-1株之中和抗體，而且針對omicron變異株BA.5之中和抗體亦有一定程度地誘導。進一步地，對投予了該等候選株2之倉鼠實施利用omicron變異株BA.5進行之攻擊試驗，結果根據圖46，與初始倉鼠相比，可見體重較快恢復之傾向。又，對感染後4天之肺內、鼻腔洗淨液中之病毒量進行定量，結果表明，與初始倉鼠相比，於投予了候選株2之倉鼠中，體內病毒量較少。
[試驗例20]利用候選株2之免疫原性評價(利用異型株進行之中和活性評價)
對經候選株2誘導之免疫對SARS-CoV-2 δ變異體及γ變異體是否有效進行評價。測定試驗例13中所獲得之候選株2免疫血清對γ變異體及δ變異體之中和活性。將100TCID50之BK325株(δ變異體)或TY7-501株(γ變異體)與經連續稀釋之非活化血清混合，於37℃反應1小時。將反應後之培養液接種於Vero細胞並於37℃培養之後，對CPE進行觀察，藉此對病毒之中和活性進行評價。以不產生CPE之最低之稀釋倍率作為中和抗體效價(Neutralizing antibody titer)。將其結果與試驗例13中對野生株之中和活性評價一起示於圖47。圖47中，低(Low)為經鼻投予1×10
3TCID50之候選株20μL之結果，高(High)為經鼻投予1×10
4TCID50之候選株20μL之結果。
圖47表明，由候選株2誘導之免疫對γ變異體及δ變異體表現出中和活性而有效。該等結果表明，藉由候選株2之投予所誘導之免疫對異型株之變異體亦表現出有效性。
(無)
圖1表示SARS-CoV-2之溫度敏感性化方法。
圖2表示SARS-CoV-2之溫度敏感性之確認結果(CPE圖像)。
圖3A表示各病毒株之變異解析結果。
圖3B表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])之具有回覆變異之可能性的株之CPE圖像。
圖3C表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])之具有回覆變異之可能性的株之CPE圖像。
圖3D表示導入有溫度敏感性株(A50-18[參考例])中之變異之重組病毒之溫度敏感性的確認結果。
圖3E表示導入有溫度敏感性株(A50-18[參考例])中之變異之重組病毒之溫度敏感性的確認結果。
圖4A表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])之增殖性解析結果。
圖4B表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])之增殖性解析結果。
圖5表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染倉鼠之體重變動。
圖6表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染倉鼠之體重變動。
圖7表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染倉鼠之肺內或鼻腔洗淨液之病毒量。
圖8表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染倉鼠之肺影像。
圖9表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染倉鼠之肺組織學解析結果。
圖10表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染倉鼠之肺組織學解析(HE染色及IHC染色)。
圖11表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])再感染倉鼠之體重變動。
圖12表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染後倉鼠之體重變動。
圖13表示溫度敏感性株(A50-18[參考例])感染後恢復倉鼠血清之中和抗體效價。
圖14表示SARS-CoV-2之溫度敏感性化方法(G～L50系列[實施例])。
圖15表示SARS-CoV-2(G～L50系列[實施例])之溫度敏感性之確認結果(CPE圖像)。
圖16A表示追加分離株(H50-11、L50-33、L50-40[實施例])之變異解析結果。
圖16B表示溫度敏感性株(H50-11[實施例])之具有回覆變異之可能性的株之CPE圖像。
圖16C表示溫度敏感性株(L50-33、L50-40[實施例])之具有回覆變異之可能性的株之CPE圖像。
圖17表示與溫度敏感性株(H50-11、L50-33、L50-40[實施例])相關而發現之鹼基序列之缺失。
圖18表示圖17所示之鹼基序列之缺失及由其編碼之胺基酸序列之缺失之概要圖。
圖19表示溫度敏感性株(H50-11、L50-33、L50-40[實施例])之增殖性解析結果。
圖20表示溫度敏感性株(A50-18[參考例]、及H50-11、L50-33、L50-40[實施例])感染倉鼠之體重變動。
圖21表示溫度敏感性株(A50-18[參考例]、及H50-11、L50-33、L50-40[實施例])感染倉鼠之肺重量。
圖22表示溫度敏感性株(A50-18[參考例]、及H50-11、L50-33、L50-40[實施例])感染倉鼠之肺內或鼻腔洗淨液之病毒量。
圖23表示溫度敏感性株(A50-18[參考例]、及H50-11、L50-33、L50-40[實施例])再感染倉鼠之體重變動。
圖24表示溫度敏感性株(A50-18[參考例]、及H50-11、L50-33、L50-40[實施例])感染後倉鼠血清之中和抗體效價。
圖25表示溫度敏感性株(A50-18株[參考例])對SARS-CoV-2變異株之中和活性評價。
圖26表示由溫度敏感性株(A50-18株[參考例])之投予路徑獲得之免疫誘導能力之比較。
圖27表示由溫度敏感性株(A50-18株[參考例])之投予量獲得之免疫誘導能力之比較。
圖28表示溫度敏感性株(A50-18株[參考例])對SARS-CoV-2變異株之中和活性評價。
圖29表示溫度敏感性株(A50-18株[參考例])對SARS-CoV-2變異株之中和活性評價。
圖30表示製作疫苗候選株1～7[實施例]後，恢復培養時之CPE圖像。
圖31A表示疫苗候選株1～7[實施例]之溫度敏感性評價。
圖31B表示rTs-all株[實施例]之溫度敏感性評價。
圖32表示疫苗候選株1、3、4、6、7[實施例]之低效價、低劑量投予時之中和抗體誘導能力。
圖33表示疫苗候選株7[實施例]之低效價、低劑量投予免疫後之感染防禦試驗之結果。
圖34表示疫苗候選株2、5[實施例]之高效價、高劑量投予時之中和抗體誘導能力。
圖35表示疫苗候選株2[實施例]之各溫度下之增殖性評價。
圖36表示藉由疫苗候選株2[實施例]之投予所誘導之體液免疫之持續性試驗結果。
圖37表示藉由疫苗候選株2[實施例]之投予所獲得之感染防禦試驗結果(感染倉鼠之體重變動)。
圖38表示疫苗候選株2[實施例]之活體內(in vivo)繼代時之毒力回覆探討結果(CPE有無)。
圖39表示疫苗候選株2[實施例]之活體內繼代時之毒力回覆探討結果(自各鼻腔洗淨液提取之病毒RNA之序列)。
圖40表示疫苗候選株2[實施例]之活體內繼代時之毒力回覆探討結果(體重變動)。
圖41表示利用疫苗候選株2[實施例]進行之組織損傷性評價(鼻腔level1)。
圖42表示利用疫苗候選株2[實施例]進行之組織損傷性評價(鼻腔level2)。
圖43表示利用疫苗候選株2[實施例]進行之組織損傷性評價(鼻腔level3)。
圖44表示利用疫苗候選株2[實施例]進行之組織損傷性評價(肺)。
圖45表示藉由疫苗候選株2[實施例]之投予所誘導之中和抗體效價。
圖46表示藉由疫苗候選株2[實施例]之投予進行之感染防禦試驗結果(感染倉鼠之體重變動)。
圖47表示藉由疫苗候選株2[實施例]之投予所誘導之中和抗體效價。
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(無)
Claims (12)
- 一種β冠狀病毒減毒株，包含： 具有以下(b)之變異、(e)及(f)之變異之組合、及/或(h)之變異之非結構蛋白；以及 具有以下(n)、(o)及/或(r)之變異之結構蛋白、附屬蛋白及/或非結構蛋白： (b)NSP3中，相當於序列編號1所示胺基酸序列第445位白胺酸之胺基酸殘基之變異、 (e)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第248位甘胺酸之胺基酸殘基之變異、 (f)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第416位甘胺酸之胺基酸殘基之變異、 (h)NSP16中，相當於序列編號3所示胺基酸序列第67位纈胺酸之胺基酸殘基之變異、 (n)ORF8之功能缺失變異、 (o)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第681位～第684位之胺基酸序列之缺失、 (r)NSP1中，相當於序列編號8所示胺基酸序列第32位～第39位之胺基酸序列之缺失。
- 如請求項1之病毒減毒株，其中前述(b)之變異、前述(e)及(f)之變異之組合、前述(h)之變異、前述(n)之變異、前述(o)之變異、及前述(r)之變異之6種變異或變異之組合中，選擇4種變異或變異之組合。
- 如請求項1之病毒減毒株，其中前述(b)之變異、前述(e)及(f)之變異之組合、前述(h)之變異之3種之變異或變異之組合中，選擇1～2種變異或變異之組合。
- 如請求項1之病毒減毒株，其中前述結構蛋白進一步包含以下(p)及/或(q)之變異： (p)棘蛋白中，包含相當於序列編號4所示胺基酸序列第679位～第680位及第685～686位之胺基酸序列之缺失的變異、 (q)棘蛋白中，相當於序列編號4所示胺基酸序列第687位纈胺酸之胺基酸殘基之變異。
- 如請求項4之病毒減毒株，其包含前述(e)及(f)之變異之組合與以下(g)之變異： (g)NSP14中，相當於序列編號2所示胺基酸序列第504位丙胺酸之胺基酸殘基之變異。
- 如請求項4之β冠狀病毒減毒株，其中前述(n)之變異為相當於由序列編號7所示鹼基序列編碼之胺基酸序列的胺基酸序列之缺失。
- 如請求項1之病毒減毒株，其中前述(b)之變異為向苯丙胺酸之置換，前述(e)之變異為向纈胺酸之置換，前述(f)之變異為向絲胺酸之置換，前述(h)之變異為向異白胺酸之置換。
- 如請求項4之病毒減毒株，其中前述(q)之變異為向異白胺酸之置換。
- 如請求項1之病毒減毒株，其中前述β冠狀病毒為SARS-CoV-2病毒。
- 一種減毒活疫苗，包含如請求項1之病毒減毒株。
- 如請求項10之減毒活疫苗，其係經鼻投予。
- 如請求項10之減毒活疫苗，其係肌內投予、皮下投予或皮內投予。
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