TW202221012A - 減毒之豬流行性下痢病毒 - Google Patents
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Abstract
本揭示案提供PEDV之C末端截短之刺突蛋白。亦提供包括該刺突蛋白之核酸序列及包含該刺突蛋白之病毒,以及使用方法。
Description
本發明係關於減毒之豬流行性下痢病毒。
豬流行性下痢(Porcine epidemic diarrhea;PED)具有高度傳染性且以豬、尤其是乳仔豬之脫水、下痢以及高死亡率為特徵。病原體豬流行性下痢病毒(PEDV)係單股正義RNA病毒,屬於冠狀病毒科(
Coronaviridae)之α冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)。PEDV具有約28 kb之總基因體大小且含有7個開放閱讀框架。PEDV感染之症狀通常與由傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及豬δ冠狀病毒(PDCoV)引起之感染之症狀類似,該兩種病毒亦係冠狀病毒科之成員,應注意,一般未觀察到PEDV與TGEV之間之交叉保護,其總體病毒核苷酸序列有至多約60%類似。
PED可能係在1970年前後於歐洲首次觀察到,且隨後,該致病性病毒得以表徵(參見例如M. Pensaert等人, 《病毒學檔案(Arch. Virol)》, 第58卷, 第243-247頁, 1978;及D. Chasey等人, 《獸醫科學研究(Res. Vet Sci)》, 第25卷, 第255-256頁, 1978)。在北美洲,PEDV直至2013年才鑑別出來,此時開始大規模爆發,且導致養豬業出現嚴重經濟損失。病毒在數天內出現在多個廣泛分佈的母豬群中,且其已擴散到至少32個國家。生產商預計未處理之新生仔豬可能會出現高達100%損失。提出的管控感染之建議包括實施嚴格的生物安保及/或有意使整個豬群暴露於PEDV以獲得免疫。
在1970年代及1980年代期間,PEDV在歐洲若干個國家引起大規模流行;但自1990年代起,PED在歐洲已變得罕見,僅偶有爆發。此經典PEDV病毒株隨後擴散至亞洲國家,諸如日本、中國、南韓等。自2010年起,已報導在中國出現嚴重PED流行性爆發且自此等爆發所回收的PEDV在基因上不同於經典PEDV病毒株。在美國出現的初始PED爆發與在中國觀察到的PED爆發具有類似的臨床表現。序列分析揭露,原始的美國PEDV(下文稱為美國PEDV原型病毒株)在基因上與2011-2102年間在中國流行的一些PEDV最為類似。2014年1月,在美國豬群中鑑別出PEDV變異病毒株,相較於美國PEDV原型病毒株,該PEDV變異病毒株在刺突蛋白基因中具有插入及缺失(insertions and deletions;INDEL)。此變異病毒株命名為U.S. PEDV S-INDEL變異病毒株。PED在美國爆發之後,已報導在加拿大、墨西哥、臺灣、南韓及日本偵測到美國原型樣PEDV;已報導在南韓、日本、德國、比利時、法國及葡萄牙偵測到U.S. S-INDEL變異型樣PEDV。當前,PEDV仍為全球養豬業的重大威脅。仍特別需要針對PEDV之減毒活疫苗,尤其是當經口投予時可有效之疫苗。
在一個態樣中,本發明提供一種豬流行性下痢病毒(PEDV)之C末端截短之刺突蛋白,其缺乏SEQ ID NO:1(YEVFEKVHVQ)或包含SEQ ID NO:1之序列且包含與SEQ ID NO:2至少90%一致之胺基酸序列或其C末端截短之變異體,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1200個胺基酸長。
根據此態樣之不同實施例,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白可為至少1250個胺基酸長,或至少1300個胺基酸長,或至少1370個胺基酸長。
根據此態樣之不同實施例,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白可與SEQ ID NO:2至少至少95%一致,或與SEQ ID NO:2至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%一致或100%一致)。在某些實施例中,SEQ ID NO:2及與其至少90%一致(亦即,至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致)之序列之間不同的胺基酸係保守取代物。
在第二態樣中,揭示一種核酸序列,該核酸序列包含編碼根據本發明第一態樣之任何實施例的PEDV之C截短之刺突蛋白的聚核苷酸序列。
在第三態樣中,本揭示案提供一種病毒,其包含根據本發明第一態樣之任何實施例的PEDV之C末端截短之刺突蛋白,或該病毒包含根據本發明第二態樣之任何實施例的核酸序列。
在第四態樣中,本發明提供一種包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。
在第五態樣中,本發明提供包含根據本發明第四態樣之胺基酸序列的PEDV。
在第六態樣中,本發明提供一種PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其中該C末端截短之刺突蛋白與SEQ ID NO:3至少90%一致,其限制條件為,此PEDV之C末端截短之刺突蛋白包含SEQ ID NO:4。在此第五態樣之不同實施例中,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白可與SEQ ID NO:3至少至少95%一致,或與SEQ ID NO:3至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%一致或100%一致)。在某些實施例中,SEQ ID NO:2及與其至少90%一致(亦即,至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致)之序列之間不同的胺基酸係保守取代物。
在第七態樣中,本發明提供一種包含ORF-2及ORF 3之PEDV,其限制條件為,該病毒在該ORF2/ORF3中包含第一缺失,其中該第一缺失係SEQ ID NO: 6之缺失或包含SEQ ID NO: 6之核酸序列之缺失,其限制條件為,該病毒表現包含SEQ ID NO:3或與其至少90%一致之序列的胺基酸序列,其另一限制條件為,該SEQ ID NO:3之C末端胺基酸係QPLAL(SEQ ID NO: 4)。
根據此第七態樣中之某些實施例,本發明之PEDV進一步在該ORF-3中包含第二缺失,其中該第二缺失係SEQ ID NO: 7之缺失或包含SEQ ID NO: 7之核酸序列之缺失。在某些實施例中,第一缺失與第二缺失不同。
在某些實施例中,該PEDV包含編碼E、M及N蛋白質之野生型ORF。在某些實施例中,本發明之PEDV缺乏由ORF-3表現之功能蛋白。
在某些實施例中,該病毒具有根據SEQ ID NO: 10或與其至少90%一致之序列的基因體。
在一些實施例中,該病毒係來源於PEDV病毒株DJ。
在第八態樣中,本發明提供一種疫苗,其中該疫苗包含根據本發明第三態樣、第五態樣及/或第七態樣之任何實施例的病毒。
在此第八態樣之某些實施例中,該病毒係減毒病毒。
在第九態樣中,本發明提供一種預防豬動物感染PEDV之方法,其包含向該豬投予根據本發明第八態樣之任何實施例的疫苗。
在某些實施例中,該疫苗係經口投予。
在某些實施例中,該豬動物係母豬,其中該疫苗係在分娩之前約28-42天投予且其中另外,該疫苗係在分娩之前約17-21天投予。在某些實施例中,第一次疫苗接種及/或第二次疫苗接種係經口投予。
在第十態樣中,本發明提供保護仔豬免於感染PEDV之方法,其包含向該仔豬投予來自用根據本發明第八態樣之任何實施例的疫苗進行疫苗接種之母豬的初乳,其中該母豬係在分娩之前約28-42天(例如35天)進行疫苗接種且其中另外,該疫苗係在分娩之前約7-21天(例如14天)投予。在某些實施例中,第一次疫苗接種及/或第二次疫苗接種係經口投予。
在某些實施例中,該仔豬係至少3天大。在其他實施例中,該仔豬係至少五天大。
為了更好地理解本發明,提供以下定義:
如應用於參考數字之術語「約」係指該值之參考數字±10。
術語「佐劑」係指增強疫苗之有效性且可添加至包括免疫藥劑之調配物中的化合物。佐劑提供增強的免疫反應,甚至在僅投予單次劑量之疫苗之後亦如此。佐劑可包括例如胞壁醯基二肽、吡啶、氫氧化鋁、溴化二甲基二(十八烷基)銨(dimethyldioctadecyl ammonium bromide;DDA)、油類、水包油型乳液、皂素、細胞介素及此項技術中已知的其他物質。適合佐劑之實例描述於美國專利申請公開案第US2004/0213817 A1號中。「有佐劑」係指併入佐劑或與佐劑組合的組成物。
如本文所使用,「減毒」PEDV係指能夠在易感宿主中感染及/或複製,但對於易感宿主無致病性或致病性較弱的PEDV。舉例而言,相較於相關領域分離之病毒株,減毒病毒不會引起可觀察/可偵測的臨床表現,或引起較少的臨床表現或較少的嚴重臨床表現,或展現病毒複製效率及/或感染性降低。PEDV感染之臨床表現可包括不限於臨床下痢、嘔吐、嗜睡、體質衰弱及脫水。
術語「保守取代」係指一個胺基酸經具有類似特性之另一個胺基酸置換。熟習此項技術者將進一步瞭解,引起所編碼之蛋白質胺基酸序列之修飾的核酸序列之改變可對所得到的蛋白質之三維結構具有極小(若有的話)影響。舉例而言,胺基酸丙胺酸(一種疏水性胺基酸)之密碼子可經編碼諸如甘胺酸之類另一個疏水性較低之殘基,或諸如纈胺酸、白胺酸或異白胺酸之類疏水性較高之殘基的密碼子取代。類似地,預期使一個帶負電殘基取代另一個殘基,諸如天冬胺酸取代麩胺酸;或一個帶正電殘基取代另一個殘基,諸如離胺酸取代精胺酸的變化亦可產生具有實質上相同之功能活性的蛋白質。
以下六組各自含有互為典型保守取代之胺基酸:[1]丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T);[2]天冬胺酸(D)、麩胺酸(E);[3]天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q);[4]精胺酸(R)、離胺酸(K)、組胺酸(H);[5]異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V);及[6]苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)(參見例如美國專利公開案20100291549)。
「抗原決定基」係具有免疫活性的抗原決定子,亦即,在投予宿主後,其能夠引起體液型(B細胞)及/或細胞型(T細胞)免疫反應。其係在分子層面上具有抗原性的特定化學基團或肽序列。抗體特異性結合多肽上的特定抗原性抗原決定基。在動物中,大部分抗原將同時呈現若干個或甚至許多個抗原決定子。此類多肽亦可適合作為免疫原性多肽且可如另外所描述來鑑別抗原決定基。
如本文所使用,術語「免疫原性片段」係指多肽或多肽片段,或編碼其之核苷酸序列,其包含對偶基因特異性模體、抗原決定基或其他序列,由此使該多肽或該片段將結合MHC分子且誘導針對作為免疫原性多肽或免疫片段來源之抗原的細胞毒性T淋巴球(「CTL」)反應,及/或B細胞反應(例如產生抗體),及/或T輔助淋巴球反應,及/或延遲型過敏(DTH)反應。DTH反應係一種免疫反應,在該免疫反應中,T細胞依賴性巨噬細胞活化及發炎引起組織損傷。針對抗原皮下注射的DTH反應通常用作細胞介導之免疫的分析。
術語「誘導免疫保護性反應」意謂一種(體液型及/或細胞型)免疫反應,相較於健康對照,其減少或消除受感染個體之一或多種疾病症狀,亦即,臨床徵象、病變、組織中之細菌分泌及細菌複製。較佳地,相較於對照,該症狀減少具有統計學顯著性。
「醫藥學上可接受之載劑」意謂在此項技術中用於製造及投予疫苗的任何習知之醫藥學上可接受之載劑、媒劑或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑典型地為無毒的惰性固體或液體載劑。
術語「豬(Porcine)」及「豬(swine)」在本文中可互換使用且指作為豬科成員的任何動物,諸如豬(pig)。
如本文所使用,「易感」宿主係指可被PEDV感染的細胞或動物。當引入易感動物時,減毒PEDV亦可誘導針對PEDV或其抗原的免疫反應,且由此使動物具有針對PEDV感染之免疫力。
「治療有效量」係指將在接受抗原或疫苗之個體體內誘導免疫反應之抗原或疫苗之量,該量足以預防或減少由諸如感染病毒或細菌之類病原體所引起之疾病的徵象或症狀,包括不良健康影響或其併發症。可以誘導體液免疫性或細胞介導之免疫性、或體液及細胞介導之免疫性兩者。動物針對疫苗之免疫原性反應可以例如經由量測抗體效價、淋巴球增殖分析間接評估,或經由監測在用野生型病毒株攻擊之後的徵象及症狀直接評估。由疫苗賦予之保護性免疫可以藉由量測例如臨床徵象之減少來評估,該等臨床徵象諸如個體之死亡率、發病率、溫度數、總體身體狀況以及總體健康狀況及效能。疫苗之治療有效量可以取決於所用特定佐劑、所用特定抗原或個體之狀況而改變,且可以由熟習此項技術者確定。
「治療」係指預防此術語所適用之病症、病況或疾病,或預防或減少此類病症、病況或疾病之一或多種症狀。
術語「疫苗」係指一種抗原製劑,其用於產生針對疾病之免疫力,以便預防或改善感染之影響。疫苗典型地使用免疫有效量之免疫原與有效增強經疫苗接種之個體針對免疫原之免疫反應之佐劑的組合來製備。
PEDV係具有約28 kb之正義單股RNA基因體的包膜病毒,具有5'帽及3'聚腺苷酸化尾。(Pensaert及De Bouck P. 1978)。該基因體包含5'非轉譯區(UTR)、3'UTR及至少七個開放閱讀框架(ORF),該等ORF編碼四種結構蛋白(刺突(S)、包膜(E)、膜(M)及核衣殼(N))及三種非結構蛋白(複製酶1a及1b以及ORF3);此等ORF在基因體上按以下次序佈置:5'-複製酶(1a/1b)-ORF2(又稱為S)-ORF3-E-M-N-3'(Oldham J. 1972;及Bridgen等人, 1993)。最先表徵的三個突然出現之北美PEDV基因體序列,即Minnesota MN (GenBank:KF468752.1)、Iowa IA1(GenBank:KF468753.1)及Iowa IA2(GenBank:KF468754.1),具有28,038個核苷酸(nt)之相同大小,不包括聚腺苷尾,且與原型PEDV CV777病毒株(GenBank:AF353511.1)共有基因體組織。此三個北美PEDV序列共有99.8至99.9%核苷酸一致性。確切地說,病毒株MN及IA2在整個基因體內僅具有11個核苷酸差異。
出於本申請案之目的,該等序列係以DNA型式提供。一般熟習此項技術者可毫無困難地將此等序列轉譯成包含病毒基因體之RNA序列。
本發明人意外地發現,在ORF-2/ORF-3之區域中具有第一缺失之PEDV產生減毒且具有免疫原性(亦即,針對野生型PED產生保護性反應)的病毒。在某些實施例中,第一缺失包含SEQ ID NO: 6。此序列開始於ORF-2且跨越包括ORF-3起始密碼子在內的ORF3之近端部分。第一缺失不僅僅限於SEQ ID NO: 6且可包括在SEQ ID NO: 6上游或下游之序列。然而,應注意,由於由ORF2編碼之刺突蛋白係PED之主要免疫原,故第一缺失不可延伸至SEQ ID NO: 6之上游以免損害該刺突蛋白。
因此,本發明提供刺突蛋白之片段。刺突蛋白之片段缺乏SEQ ID NO:1。該片段可進一步在C末端截短,但其應當一般為至少1200個胺基酸長,較佳地為至少1300個胺基酸長,且更佳地為至少1370個胺基酸長。在某些實施例中,該刺突蛋白之片段包含SEQ ID NO:2,或與其至少90%(或至少95%、96%、97%、98%)一致之序列。較佳地,在與SEQ ID NO:2至少90%一致之序列及SEQ ID NO:2本身之間不同的胺基酸係保守取代。
一般熟習此項技術者可瞭解,第一缺失引起ORF-2之框移且因此改變野生型刺突蛋白之C末端胺基酸序列。根據本發明之刺突蛋白片段缺乏SEQ ID NO:1。實際上,在最佳實施例中,刺突蛋白片段以QPLAL(SEQ ID NO: 4)結束。
在一組最佳實施例中,本文所描述之刺突蛋白片段包含SEQ ID NO:3,或與其至少90%一致之序列,其限制條件為,SEQ ID NO:4存在於該刺突蛋白片段之C末端或與SEQ ID NO:3至少90%一致之序列。該序列一致性可較高(例如至少95%、96%、97%、98%或99%)且不同胺基酸係保守取代。
獲得根據本發明之多肽的技術係此項技術中熟知的。舉例而言,可使用基因工程改造技術及重組DNA表現系統。
在另一態樣中,本發明提供一種核酸序列,其編碼根據以上描述之任何實施例的刺突蛋白片段。編碼根據本發明第一態樣之任何實施例之胺基酸序列的核酸分子亦可插入載體(例如重組載體)中,諸如一或多種非病毒載體及/或病毒載體中。非病毒載體可包括例如質體載體(例如與細菌、昆蟲及/或哺乳動物宿主細胞相容)。例示性載體可包括例如PCR-ii、PCR3及pcDNA3.1(加利福尼亞州聖地亞哥(San Diego, Calif.)之Invitrogen)、pBSii(加利福尼亞州拉霍亞(La Jolla, Calif.)之Stratagene)、pet15(威斯康星州麥迪遜(Madison, Wis.)之Novagen)、pGEX(新澤西州皮斯卡塔威(Piscataway, N.J.)之Pharmacia Biotech)、pEGFp-n2(加利福尼亞州帕羅奧圖(Palo Alto, Calif.)之Clontech)、pET1((Bluebacii,Invitrogen))、pDSR-α(PCT公開案第WO 90/14363號)及pFASTBACdual(紐約州格蘭德島(Grand island, NY)之Gibco-BRL),以及Bluescript質體衍生物(高拷貝數的基於COLe1之噬菌質體,加利福尼亞州拉霍亞之Stratagene Cloning Systems)、設計用於選殖TAQ擴增之PCR產物的PCR選殖質體(例如TOPO
TMTA Cloning
®套組,PCR2.1
®質體衍生物,加利福尼亞州喀斯巴德(Carlsbad, Calif.)之Invitrogen)。亦可使用細菌載體,包括例如志賀桿菌(
Shigella)、霍亂弧菌(
Vibrio cholerae)、乳酸桿菌(
Lactobacillus)、卡介苗(
Bacille Calmette Guerin;BCG)及鏈球菌(
Streptococcus)(參見例如WO 88/6626;WO 90/0594;WO 91/13157;WO 92/1796;及WO 92/21376)。載體可使用熟習此項技術者廣泛可用之標準重組技術構築。許多其他非病毒質體表現載體及系統係此項技術中已知的且均可使用。
在第三態樣中,本發明提供一種載體,其包含根據本發明第二態樣之核酸序列。已成功用於將核酸引入宿主之各種病毒載體尤其包括反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、疱疹病毒及痘病毒。病毒載體可使用熟習此項技術者廣泛可用之標準重組技術構築。參見例如《分子選殖實驗指南(
Molecular cloning : a laboratory manual)》(Sambrook及Russell: 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN: 0879695773);及《現代分子生物學實驗指南(
Current protocols in molecular biology)》(Ausubel等人, 1988+更新, Greene Publishing Assoc., 紐約(New York); ISBN: 0471625949)。
在某些實施例中,載體係病毒載體,且病毒係PEDV。
因此,本發明提供一種PEDV,其包含以上描述之第一缺失及/或刺突蛋白片段。吾人可瞭解,第一缺失包括在ORF-3上之起始密碼子,由此除去該ORF。因此,本發明之PEDV缺乏由野生型ORF-3表現之功能蛋白。
然而,歸因於該缺失,產生新ORF,稱為「新ORF」或「新產生之ORF」或其類似表述。自NCBI網站公開獲得的ORF Finder軟體對此新ORF(SEQ ID NO: 9)進行之概念性轉譯揭露,SEQ ID NO:5係此新ORF之表現產物。因此,在另一態樣中,本發明提供一種PEDV,其表現SEQ ID NO:5之胺基酸序列且在某些實施例中,包含SEQ ID NO: 9之ORF。
以上描述之蛋白質及/或核酸序列一致性方法適用於本文所描述之所有蛋白質及/或核酸。用於評估序列一致性及/或相似性之多序列比較演算法及程式係此項技術中已知的。對於序列比較,典型地一個序列充當參照序列(例如本文所揭示之序列),以供與測試序列相比較。序列比較演算法接著基於程式參數來計算測試序列相對於參照序列之序列一致性百分比。
兩個胺基酸或兩個核酸序列之一致性百分比可例如藉由使用電腦程式GAP比較序列資訊來測定,該電腦程式GAP係Genetics Computer Group(GCG;威斯康星州麥迪遜(Madison, WI))Wisconsin套裝軟體10.0版程式,GAP(Devereux等人(1984), 《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》 12: 387-95)。在計算一致性百分比時,典型地以在序列之間得到最大匹配之方式比對所比較之序列。GAP程式之較佳預設參數包括:(1)用於核苷酸之一元比較矩陣的GCG實施方案(對於一致性,含有值1且對於非一致性含有值0),以及如《多肽序列及結構圖譜(
Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)》, Schwartz及Dayhoff編, National Biomedical Research Foundation, 第353-358頁(1979)中所描述的Gribskov及Burgess((1986)《核酸研究》14:6745)之加權胺基酸比較矩陣或其他類似的比較矩陣;(2)每個空位之罰分為8且胺基酸序列每個空位中之每個符號的額外罰分為2,或每個空位之罰分為50且核苷酸序列每個空位中之每個符號的額外罰分為3;(3)末端空位無罰分;及(4)較長空位無最大罰分。
序列一致性及/或相似性亦可藉由使用Smith及Waterman, 1981, 《應用數學進展(
Adv . Appl . Math .)》 2:482之局部序列一致性演算法;Needleman及Wunsch, 1970, 《分子生物學雜誌(
J . Mol . Biol .)》 48:443之序列一致性比對演算法;Pearson及Lipman, 1988, 《美國國家科學院院刊(
Proc . Nat . Acad . Sci . U . S . A .)》 85:2444之搜索相似性方法;此等演算法之電腦化實施方案(Wisconsin遺傳學套裝軟體中之BESTFIT、FASTA及TFASTA;Genetics Computer Group, 威斯康星州麥迪遜科學大道575號(575 Science Dr.))來測定。
有用演算法之另一實例係PILEUP。PILEUP使用漸進式逐對比對來產生一組相關序列之多序列比對。其亦可繪製顯示用於產生比對之叢集關係的樹形圖。PILEUP使用Feng及Doolittle, 1987, 《分子進化雜誌(
J . Mol . Evol .)》 35:351-360之漸進式比對方法之簡化形式;該方法類似於Higgins及Sharp, 1989,
CABIOS5:151-153所描述之方法。有用的PILEUP參數包括預設空位權重3.00、預設空位長度權重0.10及加權之末端空位。
有用演算法之另一實例係以下中描述之BLAST演算法:Altschul等人, 1990, 《分子生物學雜誌》215:403-410;Altschul等人, 1997, 《核酸研究》25:3389-3402;及Karin等人, 1993, 《美國國家科學院院刊》90:5873-5787。特別有用之BLAST程式係自Altschul等人, 1996, 《酶學方法(
Methods in Enzymology)》 266:460-480獲得的WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2使用若干搜索參數,其中大部分設定成預設值。可調參數係使用以下值設定:重疊間隔=1、重疊分數=0.125、字臨限值(T)=II。HSP S及HSP S2參數係動態值且由程式本身根據特定序列之組成及用於搜索所關注序列之特定資料庫之組成來確定;不過,該等值可經調整以增加靈敏度。
另一種有用演算法係如Altschul等人, 1993, 《核酸研究》 25:3389-3402所報導之帶空位BLAST。帶空位BLAST使用BLOSUM-62取代分數;設定為9之臨限值T參數;用於觸發無空位之延伸部分之兩次命中法(two-hit method),加入空位長度k,代價為10+k;X
u設定為16,且X
g在資料庫搜索階段設定為40,且在演算法輸出階段設定為67。帶空位之比對係藉由對應於約22個位元之分數觸發。
在某些實施例中,根據本發明之病毒亦在序列中包含第二缺失作為野生型ORF 3之一部分。較佳地,此第二缺失包含SEQ ID NO: 7(或由其組成)。
在某些較佳實施例中,提供PEDV,其中該病毒包含由SEQ ID NO: 6組成之第一缺失及由SEQ ID NO: 7組成之第二缺失。在一組更佳之實施例中,該病毒之基因體序列包含SEQ ID NO: 10或與其具有90%(例如95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高百分比)一致性之序列。較佳地,不同核苷酸不會在所表現之胺基酸序列中產生顯著(或任何)變化且為密碼子最佳化之結果。本發明PEDV之E、M及N蛋白質之胺基酸序列較佳地相較於野生型病毒沒有改變,該野生型病毒可屬於基因型1或基因型2。PEDV基因型1之非限制性實例係CV777(Genbank寄存編號AF353511),且基因型2之非限制性實例係DJ病毒株以及AJ1102病毒株(Genbank寄存編號JX188454)。基因型2病毒株之額外非限制性實例包括病毒株CH/ZJCS03/2012、CH/JXZS03/2014、CH/JXFX01/2014、CH/JXJJ08/2015、CH/JXGZ04/2015、CH/JXJA89/2015、CH/JXDX119/2016、CH/JXJGS11/2016、CH/JXWN13/2016、CH/JXJJ18/2017、CH/JXNC38/2017、CH/JX/01、CH/JX-1/2013、CH/JX-2/2013、AH2012、GD-B、BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011、AJ1102、GD-A、CH/GDGZ/2012、CH/ZJCX-1/2012、CH/FJZZ-9/2012。基因型2係2010年至2020年間中國及相鄰國家在該領域之主要基因型。根據本發明之病毒可由此等及其他親本病毒株,藉由傳代培養或藉由利用基因工程改造技術引入以上描述之突變得到。在其他實施例中,以上描述之病毒可藉由細胞傳代培養進一步減毒。因此,在其他實施例中,該進一步減毒之病毒係基因體序列包含SEQ ID NO: 10或與其90%一致之序列的病毒之子代。
本發明較佳地包括疫苗組成物,其包含本發明之減毒活變異型PEDV及醫藥學上可接受之載劑。如本文所使用,表述「本發明之減毒活PEDV」涵蓋任何減毒活PEDV病毒株,其包括本文所述之一或多種變異。醫藥學上可接受之載劑可為例如水、穩定劑、防腐劑、培養基或緩衝液。包含本發明之減毒PEDV的疫苗調配物可以懸浮液形式或以凍乾形式或以冷凍形式製備。若冷凍,則可添加甘油或其他類似試劑以在冷凍時增強穩定性。一般而言,減毒活疫苗之優勢包括感染物之所有相關免疫原性決定子以其天然形式呈現給宿主免疫系統,及由於免疫藥劑能夠在經疫苗接種之宿主中倍增而需要相對較少量之該藥劑。
使用於活疫苗之病毒減毒以使其致病性不足以實質上傷害經疫苗接種之目標動物可藉由已知程序,較佳地包括連續傳代實現。以下參考文獻提供用於冠狀病毒減毒的各種通用方法,且適合使可用於實施本發明之任何病毒株減毒或進一步減毒:B.Neuman等人, 《病毒學雜誌(Journal of Virology)》, 第79卷, 第15號, 第9665-9676頁, 2005;J. Netland等人, 《病毒學(Virology)》, 第399(1)卷, 第120-128頁, 2010;Y-P Huang等人,「在受精卵減毒傳代之後感染性支氣管炎病毒分離株在基因體3' 7.3 kb之序列變化(Sequence changes of infectious bronchitis virus isolates in the3'7.3 kb of the genome after attenuating passage in embryonated eggs)」,《禽類病理學(Avian Pathology)》, 第36(1)卷,(摘要), 2007;及S. Hingley等人, 《病毒學》, 第200(1)卷1994, 第1-10頁;參見美國專利第3,914,408號;以及Ortego等人, 《病毒學》, 第308(1)卷, 第13-22頁, 2003。
本發明中需要的額外經基因工程改造之疫苗係藉由此項技術中已知之技術製造。此類技術包括但不限於重組DNA之進一步操縱、重組蛋白質之胺基酸序列的修飾或取代及其類似技術。
基於重組DNA技術的經基因工程改造之疫苗係例如藉由鑑別編碼負責在豬體內誘導較強免疫或保護性反應之蛋白質(例如來源於M、GP2、GP3、GP4或GP5之蛋白質等)之病毒基因的替代性部分來製備。病毒蛋白質基因之各種亞型或分離株可經歷DNA改組方法。所得異質嵌合病毒蛋白質可廣泛用於保護性次單位疫苗中。或者,可將此類嵌合病毒基因或免疫顯性片段選殖至標準蛋白質表現載體,諸如桿狀病毒載體中,並用於感染適當宿主細胞(參見例如O'Reilly等人, 「桿狀病毒表現載體實驗室手冊(Baculovirus Expression Vectors:A Lab Manual)」, Freeman & Co., 1992)。培養宿主細胞,由此表現所需疫苗蛋白質,該等蛋白質可純化至所需程度且調配成適合疫苗產物。
若純系保持任何非所需之天然致病能力,則亦可正確定出病毒基因體中引起任何殘餘毒力之核苷酸序列且經由例如定點突變誘發對病毒進行基因工程改造而使其變成無毒的。定點突變誘發能夠進行一或多個核苷酸之添加、缺失或變化(參見例如Zoller等人, DNA 3:479-488, 1984)。合成含有所需突變的寡核苷酸且將其與單股病毒DNA之一部分黏接。使用由該程序產生之雜交分子對細菌進行轉型。接著,使用經分離的含有適當突變之雙股DNA,藉由將其與全長DNA之限制性片段連接,隨後轉染至適合細胞培養物中來產生該全長DNA。基因體連接至適於轉移之載體中可經由一般熟習此項技術者已知的任何標準技術實現。將載體轉染至宿主細胞中以產生病毒子代可使用任何習知方法進行,諸如磷酸鈣或DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、電穿孔、原生質體融合及其他熟知技術(例如Sambrook等人,「分子選殖實驗指南」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。接著,所選殖之病毒展現所需突變。或者,可合成含有適當突變的兩種寡核苷酸。可黏接此等寡核苷酸以形成雙股DNA,該雙股DNA可插入病毒DNA中以產生全長DNA。
將免疫有效量的本發明疫苗投予需要防止病毒感染之豬。接種豬之免疫有效量或免疫原性量可藉由常規測試容易地確定或容易地滴定。有效量係針對疫苗之免疫反應足以保護暴露於PEDV之豬的量。較佳地,保護豬達到病毒疾病之一種或所有不良生理學症狀或影響顯著減少、改善或得到完全預防的程度。
本發明之疫苗可遵循公認之慣例調配以包括動物可接受之載劑,諸如標準緩衝液、穩定劑、稀釋劑、防腐劑及/或增溶劑,且亦可經調配以促進持續釋放。稀釋劑包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張性添加劑尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白。其他適合疫苗媒劑及添加劑,包括特別適用於調配經改良活疫苗之媒劑及添加劑,係熟習此項技術者已知或顯而易見的。參見例如《雷明頓氏藥學大全(Remington's Pharmaceutical Science)》, 第18版, 1990, Mack Publishing,其以引用的方式併入本文中。
根據本發明之疫苗可藉由多種方式投予,包括不限於經口、皮下、肌肉內、皮內、靜脈內及其類似方式。
調配用於黏膜投予(經口、鼻內、經直腸)的本發明之疫苗可用黏膜黏附劑,諸如殼聚醣調配。
調配成藉由注射或輸注投予的本發明之疫苗可進一步包含一或多種額外免疫調節組分,諸如佐劑或細胞介素等。可用於本發明疫苗中的佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統(蒙大拿州漢密爾頓(Hamilton, Mont.)之Ribi公司);明礬;礦物凝膠,諸如氫氧化鋁凝膠;水包油型乳液、油包水型乳液,例如弗氏完全及不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvants);嵌段共聚物(喬治亞州亞特蘭大(Atlanta, Ga.)之CytRx);QS-21(馬薩諸塞州劍橋(Cambridge Mass.)之Cambridge Biotech公司);SAF-M(加利福尼亞州愛莫利維爾(Emeryville Calif.)之Chiron);AMPHIGEN
®佐劑;皂素、Quil A或其他皂素級分;單磷醯基脂質A;離子性多醣;以及阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑。可用於本發明疫苗中的水包油型乳液之非限制性實例包括經改良之SEAM
®62及SEAM
®1/2調配物。經改良之SEAM
®62係一種水包油型乳液,其含有5%(v/v)角鯊烯(Sigma)、1%(v/v)SPAN
®85清潔劑(ICI Surfactants)、0.7%(v/v)TWEEN
®80清潔劑(ICI Surfactants)、2.5%(v/v)乙醇、200 µg/ml Quil A、100 µg/ml膽固醇以及0.5%(v/v)卵磷脂。經改良之SEAM 1/2係一種水包油型乳液,其包含5%(v/v)角鯊烯、1%(v/v)SPAN
®85清潔劑、0.7%(v/v) TWEEN
®80清潔劑、2.5%(v/v)乙醇、100 μg/ml Quil A以及50 μg/ml膽固醇。可包括在疫苗中的其他免疫調節劑包括例如一或多種介白素、干擾素或其他已知之細胞介素。
額外佐劑系統允許組合T輔助細胞與B細胞抗原決定基,產生一或多種類型的共價T-B抗原決定基連接結構,其可另外進行脂質化,諸如WO2006/084319、WO2004/014957及WO2004/014956中所述者。
在本發明之某些實施例中,ORFI PEDV蛋白質、或其他PEDV蛋白質或其片段係用5% AMPHIGEN
®調配,如下文中所論述。
較佳的佐劑可以於緩衝溶液中之2 ML劑量提供,該緩衝溶液進一步包含約5%(v/v)REHYDRAGEL
®(氫氧化鋁凝膠)及約25%(v/v)最終濃度之「20% AMPHIGEN」
®。AMPHIGEN
®大體上描述於美國專利第5,084,269號中且提供溶解於輕質油中之脫油卵磷脂(較佳為大豆卵磷脂),接著將其分散於抗原之水溶液或懸浮液中呈水包油型乳液形式。AMPHIGEN已根據美國專利第6,814,971號(參見其第8-9列)之方案改良,由此提供用於本發明之最終有佐劑疫苗組成物中的所謂「20% AMPHIGEN」組分。因此,10%卵磷脂及90%載體油(DRAKEOL
®,賓夕法尼亞州卡恩斯市(Karns City, PA)之Penreco)之儲備混合物用0.63%磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液以1:4稀釋,由此將卵磷脂及DRAKEOL
®組分分別減少至2%及18%(亦即,其初始濃度之20%)。向組成物中添加TWEEN
®80及SPAN
®80界面活性劑,其中代表性且較佳之最終量為5.6%(v/v)TWEEN
®80及2.4%(v/v)SPAN
®80,其中Span最初提供於儲備DRAKEOL
®組分中且SPAN
®最初自緩衝生理食鹽水組分提供,由此使生理食鹽水及DRAKEOL
®組分之混合物產生最終所需之界面活性劑濃度。DRAKEOL
®/卵磷脂與生理食鹽水溶液之混合物可使用美國紐約州哈帕克市(Hauppauge, N.Y., USA)之Charles Ross and Son的405型In-Line Slim乳化設備獲得。
疫苗組成物亦可包括REHYDRAGEL
®LV(儲備物中約2%氫氧化鋁含量)作為額外佐劑組分(可獲自美國新澤西州之Reheis及美國ChemTrade Logistics)。在使用0.63% PBS進一步稀釋的情況下,最終疫苗組成物每2 ML劑量含有以下組成量;5%(v/v)REHYDRAGEL
®LV;25%(v/v) 「20% AMPHIGEN」,亦即,其進一步進行4倍稀釋);及0.01%(w/v)硫柳汞(merthiolate)。
此項技術中應理解,可改變組分之添加次序以提供等效的最終疫苗組成物。舉例而言,可製備病毒於緩衝液中之適當稀釋液。接著,可以在共混合之情況下添加適量REHYDRAGEL
®LV(約2%氫氧化鋁含量)儲備溶液,以便允許實際最終產物中所需的5%(v/v)REHYDRAGEL
®LV濃度。一經製備,即將此中間儲備物與適量的「20% AMPHIGEN」儲備液(如上文大體上描述,且已含有必要量之TWEEN
®80及SPAN
®80)組合,由此再次獲得具有25%(v/v)「20% AMPHIGEN」之最終產物。最後,可添加適量的10%硫柳汞。
本發明之疫苗組成物允許改變所有成分,由此使抗原之總劑量相較於上述抗原劑量較佳可改變100倍(更高或更低),且最佳改變10倍或更低倍數(更高或更低)。類似地,界面活性劑濃度(不論Tween抑或Span)可彼此獨立地改變至多10倍,或其可完全缺失,且用適當濃度之類似物質替代,此係此項技術中充分理解的。
最終產物中之REHYDRAGEL
®濃度可首先藉由使用可獲自許多其他製造商(亦即,ALHYDROGEL
®, Brenntag;丹麥(Denmark))之等效物質,或藉由使用REHYDRAGEL
®產品系列之額外變化,諸如CG、HPA或HS而變化。使用LV作為實例,其最終有用濃度包括0%至20%,其中2-12%更佳且4-8%最佳,類似地,雖然AMPHIGEN
®之最終濃度(以「20% AMPHIGEN」之百分比表示)較佳為25%,但此量可以在5-50%、較佳地20-30%間變化且最佳為約24-26%。
本發明之免疫原性組成物及疫苗組成物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑(參見例如《雷明頓:藥學實踐與技術(Remington: The Science and practice of Pharmacy)》, 2005 Lippincott Williams),其呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在該等劑量及濃度下對接受者無毒,且可包含緩衝劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如汞((鄰羧基苯基)硫基)乙基鈉鹽(THIOMERSAL
®)、氯化十八烷基二甲基苯甲基銨;氯化六羥季銨;苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride);苯酚、丁醇或苯甲醇;對羥苯甲酸烷基酯,諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;及間甲酚);蛋白質,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮;胺基酸,諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、雙醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽相對離子,諸如鈉;金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物);及/或非離子型界面活性劑,諸如聚乙二醇(PEG)、TWEEN
®或PLURONICS
®。
本發明之疫苗,無論調配成藉由注射投予抑或投予黏膜表面(經口、鼻內、經直腸及其類似途徑),均可視情況經調配用於持續釋放本發明之病毒、感染性DNA分子、質體或病毒載體。此類持續釋放調配物之實例包括病毒、感染性DNA分子、質體或病毒載體與生物相容性聚合物之複合物的組合,該等生物相容性聚合物諸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纖維素、玻糖醛酸、膠原蛋白及其類似物。藥物遞送媒劑中可降解聚合物之結構、選擇及使用已評述於若干出版物中,包括A. Domb等人, 1992, 《先進技術聚合物(Polymers for Advanced Technologies)》3: 279-292,該文獻以引用的方式併入本文中。關於在醫藥調配物中選擇及使用聚合物之額外指導可見於此項技術中已知之文本中,例如M. Chasin及R. Langer(編), 1990, 「作為藥物遞送系統之可生物降解聚合物(Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems)」,《藥物與製藥科學(Drugs and the Pharmaceutical Sciences)》, 第45卷, M. Dekker, 紐約,該文獻亦以引用的方式併入本文中。替代地或另外,病毒、質體或病毒載體可經歷微囊封以改良投藥及功效。用於微囊封抗原之方法係此項技術中熟知的,且包括例如以下文獻中所描述之技術:美國專利第3,137,631號;美國專利第3,959,457號;美國專利第4,205,060號;美國專利第4,606,940號;美國專利第4,744,933號;美國專利第5,132,117號;及國際專利公開案WO 95/28227,該等文獻皆以引用的方式併入本文中。
脂質體亦可用於實現病毒、質體、病毒蛋白質或病毒載體之持續釋放。關於如何製備及使用脂質體調配物的詳情尤其可見於美國專利第4,016,100號;美國專利第4,452,747號;美國專利第4,921,706號;美國專利第4,927,637號;美國專利第4,944,948號;美國專利第5,008,050號;以及美國專利第5,009,956號中,該等文獻皆以引用的方式併入本文中。
上述疫苗中任一種之有效量可藉由習知方式確定,初始為低劑量的病毒、病毒蛋白質質體或病毒載體,且接著增加劑量,同時監測效果。可在單次投予疫苗之後或在多次投予疫苗之後獲得有效量。當確定每種動物之最佳劑量時,可考慮已知因素。此等因素包括動物之物種、體型、年齡以及一般狀況、動物體內其他藥物之存在及其類似因素。實際劑量較佳係在考慮其他動物研究之結果之後選擇。
偵測是否已達成適當免疫反應的一種方法係在疫苗接種之後測定動物體內的血清轉化及抗體效價。疫苗接種的時機及增強免疫之次數(若存在)較佳由醫生或獸醫基於所有相關因素之分析來確定,其中一些因素已於上文描述。
本發明之病毒、蛋白質、感染性核苷酸分子、質體或病毒載體的有效劑量可考慮可由一般熟習此項技術者確定之因素,諸如待疫苗接種之動物的體重,使用已知技術確定。本發明疫苗中本發明病毒之劑量較佳在約10
1pfu至約10
9pfu(空斑形成單位)範圍內,更佳在約10
2pfu至約10
8pfu範圍內,且最佳在約10
3pfu至約10
7pfu範圍內。本發明疫苗中本發明質體之劑量較佳在約0.1 µg至約100 mg範圍內,更佳在約1 µg至約10 mg範圍內,甚至更佳在約10 µg至約1 mg範圍內。本發明疫苗中本發明感染性DNA分子之劑量較佳在約0.1 µg至約100 mg範圍內,更佳在約1 µg至約10 mg範圍內,甚至更佳在約10 µg至約1 mg範圍內。本發明疫苗中本發明病毒載體之劑量較佳在約10
1pfu至約10
9pfu範圍內,更佳在約10
2pfu至約10
8pfu範圍內,且甚至更佳在約10
3pfu至約10
7pfu範圍內。適合劑量大小在約0.5 ml至約10 ml範圍內,且更佳在約1 ml至約5 ml範圍內。
如可藉由標準方法所確定,根據本發明實踐之病毒蛋白或肽疫苗(例如上文所論述之刺突蛋白片段)的適合劑量範圍一般為每劑1至50微克或更高劑量,其中佐劑之量係藉由公認的關於各種此類物質之方法測定。在關於豬疫苗接種的本發明之一個較佳實例中,動物之最佳年齡目標在約1天與21天之間,在斷奶之前,亦可相應地執行其他預定之疫苗接種,諸如針對豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae)之疫苗接種。另外,育種母豬之較佳疫苗接種時程包括類似劑量,及每年再疫苗接種時程。
給藥
較佳臨床指標係在分娩前育種母豬與新母豬之治療、控制及預防,隨後為仔豬之疫苗接種。在一個代表性實例(適用於母豬與新母豬)中,使用兩次2 ML劑量之疫苗,不過,當然,實際劑量體積與疫苗如何調配有關,其中亦考慮動物體型,實際給藥量範圍為0.1 ML至5 ML。單次劑量之疫苗接種亦為適當的。
第一次劑量可早在育種前至分娩前5週投予,且第二次劑量較佳在分娩前約1-3週投予。如此項技術中所公認的,疫苗劑量較佳使病毒物質之量對應於在約10
6與10
8之間、更佳在約10
7與10
7.5之間之TCID
50(組織培養物感染性劑量),且可進一步改變。增強免疫之劑量可在任何後續分娩之前兩週至四週給予。肌肉內疫苗接種(所有劑量)係較佳的,不過,亦可皮下給予一或多次劑量。經口投予亦較佳。如藉由計劃或天然感染所實現,疫苗接種亦可有效地用於初始動物及非初始動物。
在另一個較佳實例中,母豬或新母豬在分娩前約8週且接著在分娩前2週經歷肌肉內或經口疫苗接種。在此等條件下,在經疫苗接種之PEDV陰性母豬中可展示保護性免疫反應,因為其產生具有中和活性之抗體(經由血清樣品中之螢光焦點中和效價量測),且此等抗體被動地轉移至其仔豬。本發明之方案亦適用於治療已呈血清反應陽性之母豬及新母豬以及仔豬及公豬。亦可給予增強免疫之疫苗接種且此等疫苗接種可經由相同或不同投予途徑進行。雖然在任何後續分娩之前對母豬進行再疫苗接種係較佳的,但本發明之疫苗組成物仍然可經由抗體之持續被動轉移而為仔豬提供保護,即使該母豬僅在前一次分娩時進行疫苗接種。
應注意,仔豬接著可早在生命第1天進行疫苗接種。舉例而言,仔豬可在第1天進行疫苗接種,在3週齡時投予或不投予增強免疫之劑量,尤其是親本母豬雖然在育種前已進行疫苗接種,但在分娩前未進行疫苗接種時。若親本母豬先前由於天然或計劃感染而不為初始動物,則仔豬疫苗接種亦可為有效的。當母親先前既未暴露於病毒,亦未在分娩前進行疫苗接種時,對仔豬疫苗接種亦可為有效的。公豬(典型地出於育種目的而飼養)應每6個月進行一次疫苗接種。劑量之變化剛好在此項技術之實務範圍內。應注意,本發明之疫苗可安全用於懷孕動物(所有三月期)及新生豬。本發明之疫苗減毒至甚至對於包括新生豬在內之最敏感動物亦為可接受的安全水準(亦即,無死亡、新生豬僅有短暫的輕度臨床徵象或正常徵象)。當然,就保護豬群免於發生PEDV流行及持續低水準PEDV發生率的觀點看,持續母豬疫苗接種計劃非常重要。應瞭解,經PEDV MLV免疫之母豬或新母豬將免疫力被動地轉移至仔豬,包括PEDV特異性IgA,由此將保護仔豬免於發生PEDV相關疾病及死亡。另外,一般而言,經PEDV MLV免疫之豬在其糞便中的脫落PEDV之量及/或持續時間將減少,或將受到保護而免於脫落PEDV,且另外,經PEDV MLV免疫之豬受到保護而不會因PEDV導致體重減輕及無法增加體重,且此外,PEDV MLV將有助於停止或控制PEDV傳播週期。
亦應注意,用本發明疫苗進行疫苗接種之動物對於人類消費亦為即時安全的,而無任何顯著的屠宰延遲,諸如21天或更短時間。
當提供用於治療時,在偵測到實際感染徵象後,提供有效量的疫苗。適用於治療現有感染之劑量包括每次劑量在約10
6與約10
9TCID
50或更高之間的病毒(疫苗釋放的最低免疫劑量)。若投予組成物可為接受者所耐受,則該組成物稱為「醫藥學上可接受的」。若投予量係生理學上顯著的,則將此類組成物稱為以「治療或預防有效量」投予。
至少一種本發明疫苗或免疫組成物可藉由達成預定目的之任何方式,使用如本文所描述之醫藥組成物投予。舉例而言,此類組成物之投予途徑可為非經腸、經口、口鼻、鼻內、氣管內、表面、皮下、肌肉內、經皮、皮內、腹膜內、眼內及靜脈內投予。在本發明之一個實施例中,該組成物係藉由肌肉內投予。非經腸投予可為彈丸注射或隨時間逐漸灌注。可使用任何適合裝置投予該等組成物,包括注射器、滴管、無針注射裝置、貼片及其類似裝置。選用的途徑及裝置將取決於佐劑之組成、抗原及個體,且此係熟習此項技術者熟知的。較佳為經口或者皮下投予。經口投藥可為直接投予、經由水或經由飼料(固體或液體飼料)投予。當以液體形式提供時,疫苗可經凍乾及復原,或以糊狀物提供,以便直接添加至飼料中(混入飼料或頂部追加)或以其他方式添加至水或液體飼料中。
在另一態樣中,本發明之蛋白質、核酸序列及病毒將使一般熟習此項技術者能夠區別先前感染之動物與用以上描述之疫苗進行疫苗接種之動物。舉例而言,可製備出結合根據本發明之截短之S蛋白片段(例如藉由靶向SEQ ID NO:4)但不結合野生型S蛋白的抗體。亦可製備出針對由新ORF表現之胺基酸序列(SEQ ID NO: 5)的抗體。製備抗體之方法係此項技術中熟知的且一般熟習此項技術者將不必參與過多實驗,即製備出適於本發明之多株抗體或單株抗體。亦可製備出根據本發明之經分離之蛋白質。舉例而言,SEQ ID NO:5與來自測試動物之血液樣品的抗體反應將表明動物經疫苗接種。
在其他實施例中,來自測試動物之樣品中根據本發明之病毒的存在可使用靶向第一缺失或第二缺失之引子偵測。舉例而言,若引子設計成擴增第一缺失內之區域,則不存在PCR反應產物可指示樣品中根據本發明之病毒的存在。
本揭示案亦提供以下
項目:
項目1. 一種豬流行性下痢(PED)病毒之C末端截短之刺突蛋白,其缺乏SEQ ID NO:1(YEVFEKVHVQ)或包含SEQ ID NO:1之序列且包含與SEQ ID NO:2至少90%一致之胺基酸序列或其C末端截短之變異體,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1200個胺基酸長。
項目2. 根據項目1之PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1250個胺基酸長。
項目3. 根據項目1之PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1300個胺基酸長。
項目4. 根據項目1之PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1370個胺基酸長。
項目5. 根據項目1至4中任一項之C末端截短之刺突蛋白,其包含與SEQ ID NO:2至少95%一致之胺基酸序列。
項目6. 根據項目1至4中任一項之C末端截短之刺突蛋白,其包含與SEQ ID NO:2至少99%一致之胺基酸序列。
項目7. 根據項目4至6中任一項之C末端截短之刺突蛋白,其係SEQ ID NO:2之保守取代變異體。
項目8. 一種核酸序列,其編碼根據項目1至7中任一項之C末端截短之刺突蛋白。
項目9. 一種病毒,其包含如請求項1至7中任一項之C末端截短之刺突蛋白或如項目8之核酸序列。
項目10. 一種胺基酸序列,其包含SEQ ID NO:3或與其至少90%一致之序列,其限制條件為,該SEQ ID NO:3之C末端胺基酸係QPLAL(SEQ ID NO: 4)。
項目11. 根據項目10之胺基酸序列,其中該序列與SEQ ID NO:3至少95%一致。
項目12. 根據項目10之胺基酸序列,其中該序列與SEQ ID NO:3至少99%一致。
項目13. 根據項目10至12中任一項之胺基酸序列,其係SEQ ID NO:3之保守取代變異體。
項目14. 一種核酸序列,其編碼根據項目10至13中任一項之胺基酸序列。
項目15. 一種病毒,其具有包含ORF之基因體,該ORF編碼根據項目10至13中任一項之胺基酸序列。
項目16. 一種包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。
項目17. 一種病毒,其具有包含ORF之基因體,該ORF包含編碼根據項目16之胺基酸序列的ORF。
項目18. 根據項目9、15、17中任一項之病毒,其係PEDV。
項目19. 一種包含ORF-2及ORF 3之PEDV,其限制條件為,該病毒在該ORF2/ORF3中包含第一缺失,其中該第一缺失係SEQ ID NO: 6之缺失或包含SEQ ID NO: 6之核酸序列之缺失,其限制條件為,該病毒表現包含SEQ ID NO:3或與其至少90%一致之序列的胺基酸序列,其另一限制條件為,該SEQ ID NO:3之C末端胺基酸係QPLAL(SEQ ID NO: 4)。
項目20. 根據項目20之PEDV,其進一步在該ORF-3中包含第二缺失,其中該第二缺失係SEQ ID NO: 7之缺失或包含SEQ ID NO: 7之核酸序列之缺失。
項目21. 根據項目19或20之PEDV,其中該病毒包含編碼E、M及N蛋白質之野生型ORF。
項目22. 根據項目19至21中任一項之PEDV,其中該第一缺失與該第二缺失不同。
項目23. 根據項目18至22中任一項之PEDV,其缺乏由ORF-3表現之功能蛋白。
項目24. 根據項目18至23中任一項之PEDV,其具有根據SEQ ID NO: 10或與其至少90%一致之序列之基因體。
項目25. 根據項目18至24中任一項之PEDV,其係來源於選自由以下組成之群之PEDV病毒株:病毒株DJ、AJ1102、CH/ZJCS03/2012、CH/JXZS03/2014、CH/JXFX01/2014、CH/JXJJ08/2015、CH/JXGZ04/2015、CH/JXJA89/2015、CH/JXDX119/2016、CH/JXJGS11/2016、CH/JXWN13/2016、CH/JXJJ18/2017、CH/JXNC38/2017、CH/JX/01、CH/JX-1/2013、CH/JX-2/2013、AH2012、GD-B、BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011、AJ1102、GD-A、CH/GDGZ/2012、CH/ZJCX-1/2012、CH/FJZZ-9/2012。
項目26. 根據項目18至24之PEDV,其係來源於PED病毒株DJ。
項目27. 一種另外的減毒PEDV,其係如請求項24之親本PEDV的子代。
項目28. 根據請求項27之另外的減毒PEDV,其中該親本PEDV具有根據SEQ ID NO: 10之基因體。
項目29. 一種疫苗,其包含根據項目18至26中任一項之PEDV或根據項目27或28之另外的減毒PEDV。
項目30. 根據項目29之疫苗,其中根據項目18至26中任一項之PEDV係減毒的。
項目31. 一種預防豬動物感染PEDV之方法,其包含向該豬投予根據項目29或30之疫苗。
項目32. 根據項目31之方法,其中該疫苗係經口投予。
項目33. 根據項目31或32之方法,其中該豬動物係母豬,其中該疫苗係在分娩之前約28-42天第一次投予且其中另外,該疫苗係在分娩之前約7-21天第二次投予。
項目34. 一種保護仔豬免於感染PEDV之方法,其包含向該仔豬投予來自用根據項目29之疫苗進行疫苗接種之母豬的初乳。
項目35. 根據項目34之方法,其中該第一次疫苗接種及/或該第二次疫苗接種係經口進行的。
項目36. 根據項目34或35之方法,其中該仔豬係至少3天大。
項目37. 根據項目36之方法,其中該仔豬係至少五天大。
項目38. 根據項目34至37中任一項之方法,其中該母豬係距分娩約35天進行疫苗接種。
項目39. 根據項目34至38中任一項之方法,其中該母豬係距分娩約14天進行疫苗接種。
以下實例係作為例示性實施例呈現,但不應將其視為限制本發明之範圍。本發明之許多改變、變化、修改以及其他用途及應用對於熟習此項技術者將為顯而易見的。
實例 實例 1 - PEDV 疫苗之安全性
使來自中國南部的屬於G2a組之有毒大流行性PEDV病毒株PEDV-DJ在Vero細胞中連續繁殖至多57代。對不同代病毒之ORF2-ORF3區定序以監測毒力相關突變及遺傳穩定性。定序時使用的引子係:
ORF3 24655-F:5'-TCA TTA CTA GTG TTC TGC TGC ATT TC-3' (SEQ ID NO: 11);
ORF3 25541-R:5'- CAC AGA TTA ACC AAT TGG ACG AAG GT-3' (SEQ ID NO: 12);
連續傳代之病毒的電泳圖提供於圖1中。不同代細胞適應性PEDV病毒株之ORF2-ORF3區。在P49處(箭頭)標識出在ORF2-ORF3區中具有較大片段缺失之突變體。
為驗證疫苗病毒株之安全性,對5-7天大的乳仔豬經口接種PEDV疫苗病毒株(10
7TCID
50/豬)。評估臨床徵象(總體行為、食慾),特別是消化系統之臨床表現。對糞便形態評分,並對接種後死亡/存活仔豬之數量進行計數。
兩組仔豬均存活。用根據本發明之PEDV進行疫苗接種之仔豬與未進行疫苗接種之仔豬的小腸無明顯可見之差異。相比之下,接種有毒PEDV病毒株之仔豬的小腸擴張且積累有黃色流體,並由於絨毛萎縮而具有薄透明壁。
根據以下標準評估糞便堅實度分數:1分-正常糞便(固體);2分-糊狀半固體;3分-淡黃色的水樣。未進行疫苗接種之仔豬與用本發明之PEDV病毒株進行疫苗接種之仔豬的糞便堅實度分數之間未發現差異。
實例 2 - 毒力無回復
對5-7天齡之乳仔豬經口接種10
7TCID
50之PEDV疫苗病毒株。評估臨床徵象(總體精神狀態、食慾),特別是消化系統之臨床表現。對糞便形態評分,並對死亡/存活動物之數量進行計數以全面地評估病毒株之安全性。在接種後3天,對感染仔豬實施安樂死。收集小腸以及小腸內容物並作為抗原用於接種下一輪仔豬。重複此接種模式5次以完成毒力回復研究。使用來自每一輪接種之臨床樣品分離疫苗病毒株,並對每輪接種的疫苗病毒株之基因標記物區域定序。使用兩個標準,即遺傳穩定性及仔豬之發病率,評估疫苗病毒株之毒力。
圖2係5次連續傳代之病毒之核酸的電泳圖,展示該病毒在遺傳上穩定。在實驗結束時,所有仔豬均存活。
此等動物研究揭露,基於每一代仔豬之臨床徵象及存活率,疫苗病毒株之毒力已明顯降低,同時ORF2-ORF3區中之基因標記物在5次傳代之後於仔豬中保持穩定。總體而言,PEDV疫苗病毒株在表型及基因型方面均穩定。
實例 3 - 免疫原性
分別在分娩之前60天及14天,對六隻初始母豬經口免疫接種及增強免疫。每劑疫苗含有1×10
5TCID
50/ml根據實例1之病毒。用10
2TCID
50/ml PEDV TM病毒株經口攻擊5-7天齡的來自母豬之仔豬,並在攻擊之後10天觀察臨床症狀及死亡/存活情況。
此外,收集來自母豬(第一次免疫接種當天及分娩時)及乳仔豬(在5-7天齡及攻擊後10天)之血清樣品並經由ELISA(IDEXX PEDV-IgA ELISA套組)及SN分析(經驗證的自建分析)進行評估。
經免疫母豬所產仔豬之存活率係100%,而來自陰性對照之仔豬在攻擊之後無一存活。經免疫母豬及仔豬在攻擊之後係乾淨且精力充沛的,並主動地吸食乳汁,且無下痢之臨床徵象。
圖3顯示在免疫前一天及分娩當天(第二次免疫之後14天)母豬之PEDV抗體水準。母豬C因免疫失敗而排除在進一步分析之外,母豬D係用僅PBS代替PEDV抗原進行經口免疫之對照母豬。在其餘六隻母豬中,抗體水準達到保護性效價。
圖4顯示3-5天大之乳仔豬體內的抗體水準。此等係母體之抗體經如上文所描述預先進行疫苗接種之母親之初乳轉移至仔豬。
綜合而言,此等資料顯示,對分娩前母豬經口投予根據本發明之病毒足以將保護性免疫轉移至乳仔豬以保護該等仔豬抵禦有毒病毒株PEDV之攻擊。
本說明書中所引用之所有公開案,即專利公開案及非專利公開案均指示熟習本發明所屬領域之技術者的技能水準。所有此等公開案均以引用之方式完全併入本文中,其引用程度如同特定且個別地指示每一個別公開案係以引用之方式併入一般。
儘管本文中已參考特定實施例描述本發明,但應理解,此等實施例僅僅說明本發明之原理及應用。因此,應理解,在不脫離如由所附申請專利範圍所界定的本發明之精神及範圍的情況下,可對示例性實施例作出諸多修改且可設計出其他佈置。
[圖1]係連續傳代之病毒之核酸的電泳圖。
[圖2]係5次連續傳代之病毒之核酸的電泳圖。
[圖3]係在分娩時經疫苗接種之母豬體內抗PEDV抗體水準之圖解說明。
[圖4]係用來自經疫苗接種之母豬之初乳飼餵的3-5天大仔豬體內抗PEDV抗體水準之圖解說明。
<![CDATA[<110> 美商碩騰服務公司(Zoetis Services LLC)]]> <![CDATA[<120> 減毒之豬流行性下痢病毒]]> <![CDATA[<130> ZP000356]]> <![CDATA[<140> TW 110135848]]> <![CDATA[<141> 2021-9-27]]> <![CDATA[<150> CN 202011048314.0]]> <![CDATA[<151> 2020-9-29]]> <![CDATA[<160> 12 ]]> <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]> <![CDATA[<210> 1]]> <![CDATA[<211> 10]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 刺突蛋白之片段]]> <![CDATA[<400> 1]]> Tyr Glu Val Phe Glu Lys Val His Val Gln 1 5 10 <![CDATA[<210> 2]]> <![CDATA[<211> 1376]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人工]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> PEDV刺突蛋白之片段]]> <![CDATA[<400> 2]]> Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe 20 25 30 Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val 35 40 45 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr 50 55 60 Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile 65 70 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Claims (39)
- 一種PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其缺乏SEQ ID NO:1(YEVFEKVHVQ)或包含SEQ ID NO:1之序列且包含與SEQ ID NO:2至少90%一致之胺基酸序列或其C末端截短之變異體,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1200個胺基酸長。
- 如請求項1之PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1250個胺基酸長。
- 如請求項1之PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1300個胺基酸長。
- 如請求項1之PEDV之C末端截短之刺突蛋白,其限制條件為,該PEDV之C末端截短之刺突蛋白係至少1370個胺基酸長。
- 如請求項1至4中任一項之C末端截短之刺突蛋白,其包含與SEQ ID NO:2至少95%一致之胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項之C末端截短之刺突蛋白,其包含與SEQ ID NO:2至少99%一致之胺基酸序列。
- 如請求項4至6中任一項之C末端截短之刺突蛋白,其係SEQ ID NO:2之保守取代變異體。
- 一種核酸序列,其編碼如請求項1至7中任一項之C末端截短之刺突蛋白。
- 一種病毒,其包含如請求項1至7中任一項之C末端截短之刺突蛋白或如請求項8之核酸序列。
- 一種胺基酸序列,其包含SEQ ID NO:3或與其至少90%一致之序列,其限制條件為,該SEQ ID NO:3之C末端胺基酸係QPLAL(SEQ ID NO: 4)。
- 如請求項10之胺基酸序列,其中該序列與SEQ ID NO: 3至少95%一致。
- 如請求項10之胺基酸序列,其中該序列與SEQ ID NO: 3至少99%一致。
- 如請求項10至12中任一項之胺基酸序列,其係SEQ ID NO:3之保守取代變異體。
- 一種核酸序列,其編碼如請求項10至13中任一項之胺基酸序列。
- 一種病毒,其具有包含ORF之基因體,該ORF編碼如請求項10至13中任一項之胺基酸序列。
- 一種包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。
- 一種病毒,其具有包含ORF之基因體,該ORF編碼如請求項16之胺基酸序列。
- 如請求項9、15、17中任一項之病毒,其係PEDV。
- 一種包含ORF-2及ORF 3之PEDV,其限制條件為,該病毒在該ORF2/ORF3中包含第一缺失,其中該第一缺失係SEQ ID NO: 6之缺失或包含SEQ ID NO: 6之核酸序列之缺失,其限制條件為,該病毒表現包含SEQ ID NO:3或與其至少90%一致之序列的胺基酸序列,其另一限制條件為,該SEQ ID NO:3之C末端胺基酸係QPLAL(SEQ ID NO: 4)。
- 如請求項20之PEDV,其進一步在該ORF-3中包含第二缺失,其中該第二缺失係SEQ ID NO: 7之缺失或包含SEQ ID NO: 7之核酸序列之缺失。
- 如請求項19或20之PEDV,其中該病毒包含編碼E、M及N蛋白質之野生型ORF。
- 如請求項19至21中任一項之PEDV,其中該第一缺失與該第二缺失不同。
- 如請求項18至22中任一項之PEDV,其缺乏由ORF-3表現之功能蛋白。
- 如請求項18至23中任一項之PEDV,其具有根據SEQ ID NO: 10或與其至少90%一致之序列的基因體。
- 如請求項18至24中任一項之PEDV,其係來源於選自由以下組成之群之PEDV病毒株:病毒株DJ、AJ1102、CH/ZJCS03/2012、CH/JXZS03/2014、CH/JXFX01/2014、CH/JXJJ08/2015、CH/JXGZ04/2015、CH/JXJA89/2015、CH/JXDX119/2016、CH/JXJGS11/2016、CH/JXWN13/2016、CH/JXJJ18/2017、CH/JXNC38/2017、CH/JX/01、CH/JX-1/2013、CH/JX-2/2013、AH2012、GD-B、BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011、AJ1102、GD-A、CH/GDGZ/2012、CH/ZJCX-1/2012、CH/FJZZ-9/2012。
- 如請求項18至24之PEDV,其係來源於PED病毒株DJ。
- 一種另外的減毒PEDV,其係如請求項24之親本PEDV的子代。
- 如請求項27之另外的減毒PEDV,其中該親本PEDV具有根據SEQ ID NO: 10之基因體。
- 一種疫苗,其包含如請求項18至26中任一項之PEDV,或如請求項27或請求項28之另外的減毒PEDV。
- 如請求項29之疫苗,其中如請求項18至26中任一項之PEDV係減毒的。
- 一種預防豬動物感染PEDV之方法,其包含向該豬投予如請求項29或30之疫苗。
- 如請求項31之方法,其中該疫苗係經口投予。
- 如請求項31或32之方法,其中該豬動物係母豬,其中該疫苗係在分娩之前約28-42天第一次投予且其中另外,該疫苗係在分娩之前約7-21天第二次投予。
- 一種保護仔豬免於感染PEDV之方法,其包含向該仔豬投予來自用如請求項29或30之疫苗進行疫苗接種之母豬的初乳。
- 如請求項34之方法,其中該第一次疫苗接種及/或該第二次疫苗接種係經口進行的。
- 如請求項34或35之方法,其中該仔豬係至少3天大。
- 如請求項36之方法,其中該仔豬係至少五天大。
- 如請求項34至37中任一項之方法,其中該母豬係在距分娩約35天進行疫苗接種。
- 如請求項34至38中任一項之方法,其中該母豬係在距分娩約14天進行疫苗接種。
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