ES2788393T3 - Coronavirus de bovino atenuado y vacunas relacionadas - Google Patents

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Abstract

Un coronavirus de bovino atenuado (BCoV) que codifica uno o más de los siguientes: - una proteína espicular que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, - una glicoproteína de hemaglutinina-esterasa (HE) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, - una proteína de membrana integral (M) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o - una proteína de la nucleocápsida (N) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Description

DESCRIPCIÓN
Coronavirus de bovino atenuado y vacunas relacionadas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a novedosos aislados de coronavirus de bovino atenuados, a las composiciones que comprenden estos aislados y a los métodos de utilizar dichas composiciones en vacunas, incluyendo vacunas en vivo que ayudan en la protección contra la enfermedad respiratoria producida por coronavirus. La presente invención se refiere además a la administración de dichas vacunas, incluyendo la administración intranasal de dichas vacunas.
Antecedentes de la invención
Un miembro de la familia Coronaviridae, del orden Nidovirales, y del género Coronavirus, el coronavirus de bovino (BCoV) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo con una envoltura no segmentada que codifica: (i) una proteína espicular (proteína S), que es una glicoproteína superficial grande que comprende un dominio S1 y un dominio S2; (ii) una proteína de hemaglutinina-esterasa (HE), (iii) una proteína de membrana integral (M); (iv) una proteína de membrana pequeña (E); y (v) una proteína de nucleocápsida (N) [Fulton et al., Vaccine 31:886-892 (2013)]. BCoV se asoció inicialmente con una enfermedad entérica neonatal en terneros, así como con disentería de invierno en ganado vacuno adulto [Fulton et al., Vaccine 31:886-892 (2013)]. Posteriormente, se implicó a BCoV en las infecciones respiratorias tanto de terneros destetados recientemente como de en terneros de cebo [Plummer et al., JAVMA 225(5):726-731 (2004)]. En consecuencia, se ha descubierto que BCoV es un virus pneumoentérico que puede infectar el intestino y el tracto respiratorio superior e inferior del ganado vacuno, notificándose que el coronavirus entérico de bovino y el coronavirus respiratorio de bovino comprenden solo diferencias genéticas poco importantes. De forma consistente, existe una ausencia de cualesquiera marcadores antigénicos o genéticos consistentes que distingan los aislados de BCoV en función de sus diferentes síndromes clínicos, así como una notificación de alto nivel de protección cruzada entre los aislados de coronavirus entérico de bovino y coronavirus respiratorio de bovino tras un estímulo in vivo [Saif, Vet.Clin.North Am Food Anim Pract. 210(26):349-364 (2010)].
Además, existe un número significativo de otros virus y bacterias diferentes que pueden infectar el ganado vacuno. Los virus incluyen los virus de la diarrea vírica de bovino de tipos 1 y 2, (BVDV1, o alternativamente BVD1; y BVDV2, o alternativamente BVD2), el virus de la rinotraqueitis infecciosa de bovino (IBR), el virus paragripal de tipo 3 (PI3), el virus sincitial respiratorio de bovino (BRSV), y el virus de la fiebre del valle del Rift (RVFV). Las bacterias que pueden infectar el ganado vacuno incluyen la Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, y Mycoplasma bovis.
Se acepta ahora de manera amplia que el mejor modo de prevenir una enfermedad debida a infecciones bacterianas o víricas en bovinos es vacunarlos contra estos patógenos. Además, se pueden administrar de forma segura vacunas víricas o bacterianas atenuadas multivalentes vivas que limiten el número de inyecciones de vacunas requerido. En consecuencia, están comercialmente disponibles vacunas víricas multivalentes vivas que protegen contra BVDV1 y BVDV2, IBR, PI3, y/o BRSV. Sorprendentemente, sin embargo, hasta ahora, las vacunas comerciales no habían contenido un coronavirus de bovino atenuado vivo que se ha comprobado que ayuda contra la enfermedad respiratoria y la enfermedad entérica producidas por coronavirus. Por tanto, sigue existiendo necesidad de obtener un coronavirus de bovino adecuado para una vacuna (o una vacuna multivalente) para ayudar en la protección de los terneros y el ganado vacuno de las infecciones respiratorias e infecciones entéricas debidas a BCoV.
n.° de reg. EMBL. EF424616 describe un BCoV que tiene 95 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con algunas de las proteínas estructurales del BCoV de la invención. El n.° de reg. ADV96528 de Geneseq describe un BCoV que tiene la SEQ ID NO. 7 y 8, y que tiene un 99 % de identidad de la secuencia de aminoácidos con algunas de las proteínas estructurales del BCoV de la invención. El WO 98/40097 describe un aislado de un Coronavirus respiratorio de bovino, sin embargo, no divulga su atenuación.
Sumario de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona coronavirus de bovino atenuados (BCoV) como se enumera en las reivindicaciones.
El BCoV atenuado codifica uno o más de los siguientes: una proteína espicular que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (o SEQ ID NO: 22), una glicoproteína de hemaglutinina-esterasa (HE) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (o SEQ ID NO: 24), una proteína de membrana (M) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una proteína de la nucleocápsida (N) que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
En otras realizaciones más particulares, el BCoV atenuado codifica una proteína espicular que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En realizaciones aún más particulares, la proteína espicular del BCoV atenuado está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
En otras realizaciones más particulares, el BCoV atenuado codifica una glicoproteína de hemaglutinina-esterasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En realizaciones aún más particulares, la glicoproteína de hemaglutinina-esterasa del BCoV atenuado está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones más particulares, el BCoV atenuado codifica una proteína de membrana integral que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En realizaciones aún más particulares, la proteína de membrana integral del BCoV atenuado está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.
En otras realizaciones más particulares, el BCoV atenuado codifica una proteína de la nucleocápsida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En realizaciones aún más particulares, la proteína espicular del BCoV atenuado está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9.
En realizaciones relacionadas, el BCoV atenuado es como se define en las reivindicaciones y se deriva de un aislado que tiene el número de depósito PTA-121515 de la ATCC. En otras realizaciones relacionadas el BCoV atenuado es como se define en las reivindicaciones y es la progenie de un aislado que tiene el número de depósito PTA-121515 de la ATCC. En realizaciones más específicas, el BCoV atenuado es un aislado que tiene el número de depósito PTA-121515 de la ATCC. Todos los coronavirus de bovino atenuados (BCoV) de la presente invención se proporcionan también como BCoV aislados.
En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona composiciones y vacunas inmunógenas que comprenden uno o más de los BCoV atenuados de la presente invención. En realizaciones concretas, las composiciones y vacunas inmunógenas comprenden un BCoV atenuado vivo. En determinadas realizaciones, la vacuna ayuda en la prevención de la enfermedad respiratoria producida por BCoV. En realizaciones concretas, la vacuna ayuda en la prevención de la enfermedad entérica producida por BCoV. En otras realizaciones la vacuna ayuda en la prevención de la enfermedad respiratoria y la enfermedad entérica producidas por BCoV. En determinadas realizaciones, la vacuna se almacena congelada de forma previa a la descongelación antes de su uso. En realizaciones alternativas, la vacuna se liofiliza, rehidratándose antes de la administración. En otras realizaciones, la vacuna se almacena como una vacuna estable líquida.
La presente invención proporciona además vacunas multivalentes. En realizaciones concretas, una vacuna multivalente comprende un BCoV atenuado de la presente invención junto con uno o más virus adicionales tales como el virus de la diarrea vírica de bovino (BVDV), virus de la rinotraqueitis infecciosa de bovino (IBR), virus paragripal de tipo 3 (PI3), virus sincitial respiratorio de bovino (BRSV), virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV), o cualquier combinación de los mismos. En realizaciones específicas, la vacuna multivalente comprende BVDV1. En otras realizaciones, la vacuna multivalente comprende BVDV2. En otras realizaciones más la vacuna multivalente comprende BVDV1 y BVDV2. En determinadas realizaciones la vacuna comprende un BCoV atenuado vivo de la presente invención y uno o más de los virus atenuados vivos adicionales, por ejemplo, un virus de la diarrea vírica de bovino atenuado vivo (BVDV), un virus de la rinotraqueitis infecciosa de bovino atenuado vivo (IBR), un virus paragripal de tipo 3 atenuado vivo (PI3), un virus sincitial respiratorio de bovino atenuado vivo (BRSV), un virus de la fiebre del Valle del Rift atenuado vivo (RVFV), o cualquier combinación de los mismos.
Una vacuna de la presente invención puede comprender además uno o más antígenos bacterianos. En determinadas realizaciones, el antígeno bacteriano es una Pasteurella multocida. En realizaciones particulares, el antígeno bacteriano es una Mannheimia haemolytica. En otras realizaciones, el antígeno bacteriano es un Histophilus somni. En otras realizaciones adicionales, el antígeno bacteriano es un Mycoplasma bovis. En otras realizaciones más, la vacuna comprende dos o más de estos antígenos bacterianos. En otras realizaciones adicionales, uno o más de los antígenos bacterianos de la vacuna es una bacteria atenuada viva. En determinadas realizaciones, uno o más de los antígenos bacterianos de la vacuna es una bacteria muerta.
La presente invención proporciona además métodos para vacunar un bovino (por ejemplo, un ternero) con una vacuna de la presente invención. En realizaciones concretas, el método de vacunar al bovino comprende administrar la vacuna por vía intranasal. En determinadas realizaciones alternativas, el método de vacunar al bovino comprende administrar la vacuna por vía oral.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan un aislado y/o un antígeno de una proteína recombinante obtenidos a partir de aislados de coronavirus de bovino atenuados de la presente invención. Incluidos en la presente divulgación están novedosos fragmentos antigénicos de dichas proteínas de la divulgación. En un aspecto relacionado, se proporcionan los aislados y/o los ácidos nucleicos recombinantes que codifican las proteínas y/o los fragmentos antigénicos codificantes de las proteínas. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona vectores recombinantes, incluyendo vectores víricos recombinantes que comprenden y/o expresan dichos ácidos nucleicos y células hospedadoras que comprenden dichos vectores o que se han modificado genéticamente para codificar los ácidos nucleicos de la presente divulgación.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación esquemática de la cartografía del genoma de BCoV como se anota en el Ejemplo 2.
Descripción detallada de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona coronavirus de bovino atenuados (BCoV) como se define en las reivindicaciones. En un aspecto de la presente invención, todos los BCoV atenuados se proporciona también como BCoV aislados. Un BCoV atenuado de la presente invención puede estar incluido en vacunas de bovino seguras y eficaces (incluyendo vacunas de bovino multivalentes). De forma sorprendente, dichas vacunas BCoV proporcionan protección cruzada contra las enfermedades entérica y respiratoria. En consecuencia, la presente invención proporciona vacunas que ayudan en la protección de los terneros y el ganado vacuno procedentes de infecciones de coronavirus entéricas y respiratorias.
En un aspecto particular de la invención, las vacunas de bovino BCoV seguras y eficaces son para la administración intranasal. Administrar una vacuna por vía intranasal tiene algunas ventajas sobre otras rutas. Por ejemplo, los anticuerpos maternos y los anticuerpos procedentes de una exposición previa a un patógeno pueden neutralizar una vacuna de un virus vivo modificado si la vacuna se administra por una ruta parenteral al sujeto animal. Sin embargo, la administración intranasal puede derivar los anticuerpos maternos y estimular una respuesta inmunitaria en un animal no expuesto a tratamiento anteriormente. Asimismo, puede reforzarse la respuesta inmunitaria en un animal con anticuerpos procedentes de la exposición previa. Por tanto, la presente invención proporciona además métodos para administrar las vacunas de bovino de BCoV seguras y eficaces mediante una ruta intranasal.
No está previsto que el uso de términos en singular por comodidad en la descripción sea limitante en forma alguna. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un "virus" incluye la referencia a uno o más de dichos virus, salvo que se especifique otra cosa. Tampoco se pretende que el uso de términos en plural que sea limitante, salvo que se especifique otra cosa.
Como se usa en el presente documento, el término, "aproximadamente", se usa indistintamente con el término "alrededor de" y significa que un valor está dentro del veinticinco por ciento del valor indicado, salvo que se indique otra cosa, por ejemplo, una concentración de "aproximadamente" EDTA 2mM puede ser de EDTA 1,5 mM a 2,5 mM.
Como se usa en el presente documento, una "vacuna" es una composición que es adecuada para su aplicación a un animal (por ejemplo, ganado vacuno) que, tras administrarse al animal, induce una respuesta inmunitaria suficientemente fuerte como para ayudar mínimamente en la protección frente a una enfermedad clínica que surge de una infección con un microorganismo natural, es decir, lo suficientemente intensa como para ayudar en la prevención de la enfermedad clínica, y/o prevenir, mejorar, o curar la enfermedad clínica. Salvo que se indique específicamente otra cosa, el uso del término vacuna incluye vacunas multivalentes.
Como se usa en el presente documento, una "vacuna multivalente" es una vacuna que comprende dos o más antígenos diferentes. En una realización particular de este tipo, la vacuna multivalente estimula el sistema inmunitario del receptor frente a dos o más agentes patógenos diferentes.
Como se usa en el presente documento, una vacuna "líquida estable" es una vacuna mantenida como un líquido (incluida una vacuna líquida multivalente) que sigue siendo eficaz durante al menos un año cuando se almacena a/o por debajo de 7 °C (por ejemplo, en un refrigerador convencional, y/o a 0 °C - 7 °C). En realizaciones concretas, una vacuna líquida estable sigue siendo eficaz cuando se almacena a/o por debajo de 7 °C durante al menos 1,5 años. En realizaciones más concretas, una vacuna líquida estable sigue siendo eficaz cuando se almacena a/o por debajo de 7 °C durante al menos 2 años. En otras realizaciones más concretas una vacuna líquida estable sigue siendo eficaz cuando se almacena a/o por debajo de 7 °C durante al menos 2,5 a 3 años. Se proporcionan ejemplos de vacunas líquidas estables en la solicitud estadounidense n.° 14/202.454 presentada el 10 de marzo de 2014, y la solicitud estadounidense n.° 14/202.194, presentada el 10 de marzo de 2014.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "proteger", "protegiendo", "proporcionar protección a", "proporcionando protección a", y "ayudas en la protección" no requiere una protección completa de cualquier indicación de infección. Por ejemplo, "ayudas en la protección" puede significar que la protección es suficiente para que, tras el estímulo, los síntomas de la infección subyacente son al menos reducidos, y/o al menos una o más de las causas o mecanismos celulares, fisiológicos, o bioquímicos subyacentes que hacen que los síntomas se reduzcan y/o eliminen. Se comprende que "reducido", tal como se usa en este contexto, significa en relación con el estado de la infección, incluido el estado molecular de la infección, no solo el estado fisiológico de la infección.
La expresión "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una composición que, cuando se administra a un bóvido, reduce significativamente la probabilidad y/o la extensión de una infección/infestación debida a un patógeno dado.
"Metafilaxis" es la medicación masiva oportuna de un grupo completo de animales para eliminar o minimizar un brote esperado de enfermedad, por ejemplo, en uno o más animales en alto riesgo de infección/infestación. En una realización concreta, los terneros de alto riesgo son ganado vacuno liviano, mezclado, preparado para viajes largos, con antecedentes sanitarios desconocidos.
El término "quimioprofilaxis" se refiere a la administración de una medicación/tratamiento, por ejemplo, una o más composiciones profilácticas, con el fin de prevenir o reducir la infección/infestación vírica, bacteriana, y/o parasítica; y/o prevenir o reducir la enfermedad y/o los síntomas relacionados con esta infección/infestación.
La expresión "composición profiláctica" se refiere a cualquier agente usado individualmente o en combinación con otros agentes que reduce significativamente la probabilidad y/o la extensión de una infección/infestación debida a un patógeno dado en un bovino. En una de dichas realizaciones, el bovino está en alto riesgo de desarrollar una enfermedad respiratoria de bovinos, tras el mezclado, transporte, cambios en la climatología, cambios en la nutrición, y/u otros estresores que pueden iniciar un síntoma y/o una enfermedad relacionada con la presencia de patógenos víricos, bacterianos, o parasíticos comúnmente asociados con los bovinos, que suponen la diana del agente o la combinación de agentes.
Como se usa en el presente documento, la expresión " cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de un antígeno dado, por ejemplo, un virus de bovino atenuado vivo, que es suficiente para proporcionar protección y/o ayuda en la protección del patógeno del que se está administrando el antígeno para protegerlo, cuando se proporciona en una administración individual y/o cuando se pretende, proporcionar como una administración inicial con una o más administraciones de refuerzo posteriores.
Como se usa en el presente documento, una vacuna "eficaz" comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno dado. Una vacuna "eficaz" retiene suficientes títulos de un antígeno dado para satisfacer los requisitos reguladores de dicho antígeno para la jurisdicción donde se administra la vacuna, por ejemplo, la administración de una vacuna en los Estados Unidos está controlada por el United States Department of Agriculture (USDA).
Como se usa en el presente documento, una "respuesta inmunitaria" se refiere a la inmunidad activa de un sujeto animal debida a haber recibido una o más vacunas. La respuesta inmunitaria puede incluir la producción de anticuerpos contra el antígeno o el inmunógeno presente en la vacuna. "Respuesta inmunitaria" en un sujeto se refiere al desarrollo de una respuesta inmunohumoral, una respuesta inmunocelular, o una respuesta inmunohumoral e inmunocelular a un antígeno. Se pueden medir las respuestas inmunitarias usando inmunoensayos convencionales y ensayos de neutralización, que se conocen en la técnica.
Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se usa adjetivamente para significar que el nombre modificado es adecuado para su uso en un producto farmacéutico. Cuando se usa, por ejemplo, para describir un excipiente en una vacuna farmacéutica, caracteriza al excipiente como compatible con los otros ingredientes de la composición y no desventajosamente perjudicial para el receptor deseado.
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Los transportadores farmacéuticos aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y/o aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Agua o soluciones acuosas, soluciones salinas y soluciones acuosas azucaradas, por ejemplo, se pueden emplear soluciones de dextrosa y/o glicerol como transportadores, particularmente para soluciones inyectables. Además, el transportador puede ser y/o comprender un hidrocoloide y/o una solución polimérica por ejemplo, para espesar las vacunas bovinas que se van a pulverizar sobre el ganado, por ejemplo, terneros.
Como se usa en el presente documento, un "adyuvante" es una sustancia que puede favorecer o amplificar la cascada de eventos inmunológicos, lo que lleva en última instancia a una mejor respuesta inmunitaria, es decir, la respuesta corporal integrada a un antígeno. En general, no se requiere un adyuvante para que se produzca la respuesta inmunitaria, pero favorece o amplifica esta respuesta.
Como se usa en el presente documento, "administración sistémica" es la administración en el sistema circulatorio del cuerpo (que comprende el sistema cardiovascular y linfático), afectando al cuerpo en su totalidad más bien que un locus específico tal como el tracto gastrointestinal (mediante por ejemplo, administración oral o rectal) y el sistema respiratorio (mediante por ejemplo, administración intranasal). La administración sistémica se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la administración en el tejido muscular (intramuscular), en la dermis (intradérmica, transdérmica, o supradérmica), debajo de la piel (subcutánea), debajo de la mucosa (submucosa), en las venas (intravenosa), etc.
La "administración parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones submucosales, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones intradérmicas e infusiones.
Como se usa en el presente documento, la "administración intranasal" de una vacuna a un sujeto animal o "administrar intranasalmente" una vacuna a un sujeto animal se refiere a aplicar o administrar la vacuna a/a través de la nariz y/o la cavidad nasal.
Como se usa en el presente documento, una secuencia de aminoácidos es 100% "idéntica" a una segunda secuencia de aminoácidos cuando los restos de aminoácidos de ambas secuencias son idénticos. En consecuencia, una secuencia de aminoácidos es un 50 % "idéntica" a una segunda secuencia de aminoácidos cuando el 50 % de los restos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son idénticos. La comparación de la secuencia se lleva a cabo sobre un bloque contiguo de restos de aminoácidos comprendido por una proteína dada, por ejemplo, una proteína, o una porción del polipéptido que se está comparando. En una realización particular, se tienen en cuenta las deleciones o inserciones seleccionadas que podrían alterar de otra manera la correspondencia entre las dos secuencias de aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad del nucleótido y la secuencia de aminoácidos se puede determinar usando C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) y el algoritmo Clustal W con los parámetros por defecto de la alineación, y los parámetros por defecto para la identidad. Estos programas comercialmente disponibles también se pueden usar para determinar la similitud de secuencia usando los mismos o análogos parámetros por defecto. Alternativamente, se puede usar una búsqueda Advanced Blast bajo las condiciones de filtro por defecto, por ejemplo, usando el GCG (Manual del Programa Genetics Computer Group, para el paquete de GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin) usando los parámetros por defecto del programa de acumulación.
Vacunas multivalentes:
La presente invención proporciona vacunas de bovino monovalentes y multivalentes que comprenden el BCoV atenuado de la presente invención. En consecuencia, Las vacunas de bovino multivalentes de la presente invención comprende un BCoV atenuado e incluyen además uno o más virus de bovino adicionales tales como BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV, y/o RVFV. Como se ha indicado anteriormente, una vacuna multivalente que comprende un BCoV atenuado vivo de la presente invención también puede incluir uno o más de los siguientes virus atenuados vivos: BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV, y/o RVFV, junto con uno o más virus de bovino muertos.
Además, cualquier vacuna de bovino multivalente que comprende el BCoV atenuado de la presente invención puede incluir además uno o más antígenos bacterianos vivos atenuados o muertos. En determinadas realizaciones en el que el único antígeno vírico en dichas vacunas de bovino multivalentes es BCoV. En realizaciones relacionadas, la vacuna de bovino multivalente que comprende el BCoV atenuado de la presente vacuna de la invención puede incluir además uno o más antígenos bacterianos vivos atenuados o muertos. En realizaciones particulares de este tipo, la combinación de la vacuna de virus de bovino con uno o más antígenos bacterianos y/o antígenos víricos atenuados vivos o muertos se realiza algunas veces antes de la administración, pero posteriormente al almacenamiento. En realizaciones específicas de este tipo, el(los) antígeno(s) bacteriano(s) está(n) comprendido(s) por una vacuna (tanto monovalente como multivalente) y esta vacuna bacteriana de bovino está combinada con una vacuna de virus de bovino atenuada viva de la presente invención antes de la administración. En una realización más específica, La vacuna de virus de bovino atenuada viva se puede usar para licuar/solubilizar una vacuna bacteriana de bovino liofilizada antes de la administración de la vacuna combinada al sujeto animal. En una realización específica alternativa, se puede usar una vacuna bacteriana de bovino para licuar/solubilizar una vacuna de virus de bovino atenuada viva liofilizada, (por ejemplo, una vacuna de BCoV) antes de la administración de la vacuna combinada al sujeto animal. En otras realizaciones más, la vacuna vírica de bovino atenuada viva y la vacuna bacteriana de bovino atenuada y/o muerta se administran secuencialmente. En realizaciones específicas, La vacuna vírica de bovino atenuada viva es una vacuna líquida estable. En realizaciones alternativas, la vacuna vírica de bovino atenuada viva (por ejemplo, una vacuna de BCoV) es una vacuna liofilizada.
En consecuencia, una vacuna vírica de bovino que comprende un BCoV atenuado vivo de la presente invención puede combinarse con una o más vacunas bacterianas atenuadas vivas o muertas que comprenden un antígeno tal como Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, y Mycoplasma bovis antes de la administración al sujeto animal. Por tanto, en determinadas realizaciones la vacuna bacteriana atenuada comprende una Mannheimia hemolyticaatenuada. En realizaciones particulares de este tipo, la Mannheimia hemolytica atenuada es una leucotoxina eliminadora. En una realización específica de este tipo, la Mannheimia hemolytica atenuada es una Mannheimia haemolytica avirulenta viva en la que se ha modificado el gen que codifica la leucotoxina A para perder la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 34-378 de la proteína leucotoxina A [véase, documento U.S 6.331.303 B1].
En otras realizaciones más, la vacuna bacteriana atenuada comprende una Pasteurella multocidaatenuada. En realizaciones más concretas, la Pasteurella multocida comprende una deleción en su gen hyaE. En una realización específica de este tipo, la Pasteurella multocida atenuada es una Pasteurella multocida avirulenta viva, en la que el gen que codifica la proteína hyaE se ha modificado para perder la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 239-359 de la proteína hyaE, y/o perder los nucleótidos 718-1084 [véase, el documento U.S. 7.351.416 B2]. En otras realizaciones más, la vacuna bacteriana atenuada comprende una Histophilus somni atenuada. En realizaciones más concretas la Histophilus somni es una Histophilus somni avirulenta viva, es decir, un mutante aroA.
En realizaciones particulares de los métodos de la presente invención, la vacuna bacteriana atenuada comprende una Mannheimia hemolytica atenuada y una Pasteurella multocida atenuada. En una realización más específica, la composición antibacteriana es una vacuna bacteriana atenuada que comprende una Mannheimia haemolytica avirulenta viva en la que se ha modificado el gen que codificaba la leucotoxina A para perder la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 34-378 de la proteína leucotoxina A y una Pasteurella multocida avirulenta viva en la que el gen que codificaba la proteína hyaE se ha modificado para perder la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 239-359 de la proteína hyaE y/o perder los nucleótidos 718-1084. En realizaciones más concretas de los métodos de la presente invención, la vacuna bacteriana atenuada comprende una Mannheimia hemolyticaatenuada, una Pasteurella multocida atenuada y una Histophilus somni avirulenta.
Administración de vacunas:
Las vacunas de virus de bovino de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier medio convencional, por ejemplo, mediante administración sistémica, incluyendo mediante administración parenteral tal como, sin limitación, administración subcutánea o intramuscular. Las vacunas de virus de bovinos de la presente invención se pueden administrar también mediante administración mucosal, tal como mediante administración intranasal, oral, intratraqueal, rectal y/o ocular. Alternativamente, las vacunas pueden administrarse mediante un parche en la piel, en un implante de liberación retardada, escarificación, o administración tópica. Se contempla que una vacuna de virus de bovino de la presente invención también puede administrarse mediante el agua y/o los alimentos corrientes del bovino receptor. En una realización preferida, una vacuna de virus de bovino de la presente invención que comprende un BCoV atenuado vivo de la presente invención se administra por vía intranasal.
Las vacunas (incluyendo las vacunas multivalentes) de la presente invención se pueden administrar también como parte de un tratamiento combinado, es decir, una tratamiento que incluye, además de la propia vacuna, administrar uno o más agentes activos adicionales, tratamientos, etc. En este caso, debe reconocerse que la cantidad de vacuna que constituye una cantidad "terapéuticamente eficaz" puede ser más o menos que la cantidad de vacuna que constituiría una cantidad "terapéuticamente eficaz" si la vacuna fuera a administrarse sola. Otras terapias pueden incluir aquellas conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, analgésicos, medicaciones reductoras de la fiebre, expectorantes, medicaciones antiinflamatorias, antihistaminas, y/o administración de fluidos.
En determinadas realizaciones de los métodos de la presente invención, una vacuna de virus de bovino que comprende un BCoV atenuado vivo de la presente invención que es adecuada para la administración intranasal comprende además un IBR atenuado. En realizaciones más concretas, la vacuna del virus de bovino que comprende un BCoV atenuado vivo de la presente invención que es adecuada para la administración intranasal comprende uno o más, o todos de los siguientes; un IBR atenuado vivo, un BVDV1 atenuado vivo, un BVDV2 atenuado vivo, un PI3 atenuado vivo y un BRSV atenuado vivo.
El nivel de inmunogenicidad puede determinarse experimentalmente por la titulación de la dosis de vacuna, y por las técnicas de estudio del estímulo generalmente conocidas en la materia. Dichas técnicas incluyen normalmente la vacunación de numerosos sujetos animales con la vacuna en diferentes dosificaciones y a continuación estimular los sujetos animales con el virus virulento para determinar la dosis protectora mínima.
Los factores que afectan el régimen de dosificación preferido pueden incluir, por ejemplo, la raza de un bovino, la edad, el peso, el sexo, la dieta, la actividad, el tamaño del pulmón y la dolencia del sujeto; la ruta de administración; la eficacia, la seguridad, y los perfiles de duración de la inmunidad de la vacuna concreta utilizada; cualquiera que sea el sistema de administración utilizado; y cualquiera que sea la vacuna administrada como parte de una combinación de fármacos y/o vacunas. Por tanto, la dosificación realmente empleada puede variar para animales específicos, y, por lo tanto, puede desviarse de las dosificaciones típicas que se muestran anteriormente. Determinar dichos ajustes de la dosificación está generalmente comprendido en los conocimientos de los expertos en la técnica del desarrollo de vacunas usando medios convencionales.
De forma similar, el volumen con el cual se puede administrar dicha dosis normalmente se encuentra entre 0,1 ml (típico para la aplicación intradérmica o transdérmica) y 5,0 ml. Un intervalo típico para el volumen de administración es entre 0,2 y 2,0 ml. En realizaciones específicas, un intervalo para el volumen de administración es aproximadamente 1,0 a 2,0 ml para la administración intramuscular o subcutánea. En realizaciones específicas alternativas, un intervalo para el volumen de administración es aproximadamente 0,5 a 2,0 para la administración intranasal.
Se contempla que la vacuna puede administrarse a la vacuna receptora como en una única vez o, como alternativa, dos o más veces durante días, semanas, meses o años. En algunas realizaciones, la vacuna se administra al menos dos veces. En determinadas realizaciones similares, por ejemplo, la vacuna se administra dos veces, administrándose con la segunda dosis (por ejemplo, un refuerzo) al menos 2 semanas después de la primera dosis. En realizaciones concretas, la vacuna se administra dos veces, administrándose la segunda dosis de forma no superior a 8 semanas después de la primera dosis. En otras realizaciones, la segunda dosis se administra desde 1 semana a 2 años después de la primera dosis, desde 1,5 semanas a 8 semanas después de la primera dosis, o desde 2 a 4 semanas después de la primera dosis. En otras realizaciones, la segunda dosis se administra aproximadamente 3 semanas tras la primera dosis. En las realizaciones anteriores, la primera y las posteriores dosificaciones pueden variar, tal como en una cantidad y/o forma. A menudo, sin embargo, las dosificaciones son iguales en cantidad y forma. Cuando solo se administra una única dosis, la cantidad de vacuna en la dosis comprende generalmente solo una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna. Cuando, sin embargo, se administra más de una dosis, las cantidades de vacunas en aquellas dosis juntas pueden constituir una cantidad terapéuticamente eficaz. Además, se puede administrar una vacuna inicialmente, y a continuación se puede administrar un refuerzo de 2 a 12 semanas después, como se ha analizado anteriormente. Sin embargo, las administraciones posteriores de la vacuna pueden realizarse sobre una base anual (1 año) o bianual (2 años), con respecto a si se administró un refuerzo no.
Adyuvantes e inmunoestimulantes
Un adyuvante en general es una sustancia que refuerza el sistema inmunitario de la diana de una manera no específica. Se conocen en la técnica muchos adyuvantes diferentes. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes que se pueden usar en la formulación de una vacuna realizada con material de acuerdo con la presente invención incluyen sales de aluminio (por ejemplo, alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio), colesterol, adjuvantes de monofosforil lípido A, anfígeno, tocoferoles, monofosfenil lípido A, dipéptido de muramilo, emulsiones oleosas, glucanos, carbómeros, copolímeros en bloque, adyuvante de amina lipoidal Avridine, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o no), toxina colérica, dipéptido de muramilo, adyuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros y poliaminas en bloque no iónicos tales como dextranosulfato, carbopol, pirano, saponinas y derivados de saponinas, copolímeros en bloque, y adyuvantes tales como los identificados en las patentes de Estados Unidos números 4.578.269, 4.744.983, 5254339. Los ejemplos no limitantes de péptidos que pueden servir como adyuvantes incluyen dipéptidos de muramilo, dimetilglicina, o tuftsina. Los ejemplos no limitantes de aceites que pueden servir como adyuvantes incluyen aceites minerales, aceites vegetales, aceites animales y emulsiones de los mismos.
Las vacunas realizadas de materiales de acuerdo con la presente invención pueden formularse como emulsiones de aceite en agua, como emulsiones de agua en aceite o como emulsiones de agua en aceite en agua. Los ejemplos no limitantes de emulsiones de aceite en agua incluyen emulsiones de aceite de parafina en agua, o emulsiones preparadas a partir de uno o más de escualeno, copolímeros en bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, tensioactivos de polisorbato, y/o análogos de treonilo de dipéptido de muramilo.
Los aceites usados como adyuvantes pueden ser metabolizables por el sujeto que recibe la vacuna tales como aceites vegetales o animales. Dichos aceites consisten normalmente en última instancia de mezclas de triacilgliceroles, conocidas también como triglicéridos o grasas neutras. Estas sustancias no polares, insolubles en agua son triésteres de ácidos grasos de glicerol. Los triacilgliceroles difieren de acuerdo con la identidad y la colocación de sus tres restos de ácidos grasos.
Los adyuvantes pueden consistir también en componentes que el cuerpo del sujeto animal al cual se administra la emulsión no puede metabolizar. Los aceites no metabolizables adecuados para su uso en las emulsiones de la presente invención incluyen alcanos, alquenos, alquinos, y sus correspondientes ácidos y alcoholes, los éteres y ésteres de los mismos, y las mezclas de los mismos. Los compuestos individuales del aceite pueden ser compuestos de hidrocarburos ligeros, por ejemplo, compuestos que tienen 6 a 30 átomos de carbono. El aceite puede prepararse sintéticamente o purificarse a partir de producto del petróleo. Los ejemplos no limitante de aceites no metabolizables para su uso en la preparación de vacunas basadas en materiales cultivados de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, aceite mineral, aceite de parafina, y cicloparafinas. La expresión "aceite mineral" se refiere a un aceite adyuvante no metabolizable que es una mezcla de hidrocarburos líquidos obtenida de vaselina mediante una técnica de destilación. La expresión es sinónima con "parafina licuada", "vaselina líquida" y "aceite mineral blanco". Se pretende también que la expresión incluya "aceite mineral ligero", es decir, el aceite que se obtiene de forma similar mediante destilación de la vaselina, pero que tiene una gravedad específica ligeramente inferior que la del aceite mineral blanco.
Otros compuestos capaces de potenciar la respuesta inmunohumoral que se pueden usar en la formulación de las vacunas basadas en material cultivado de acuerdo con la presente invención incluyen, sin limitación, copolímero de anhidrato etileno maleico (EMA), emulsiones de látex de un copolímero de estireno con una mezcla de ácido acrílico y ácido metacrílico.
Además del adyuvante, una vacuna de material cultivado de acuerdo con la presente invención puede incluir agentes inmunomoduladores tales como, por ejemplo, interleuquinas, interferones, u otras citoquinas (por ejemplo, citoquinas relacionadas con Thl, tales como interleuquina-12 (IL-12), interleuquina-18 (IL-18), o interferón gamma ). La cantidad de adyuvante o inmunoestimulante añadido en una formulación de vacuna basada en el material cultivado de acuerdo con la presente invención, depende de la naturaleza del adyuvante o del propio inmunoestimulante. El técnico experto es capaz de seleccionar una cantidad que es suficiente para potenciar una respuesta inmunitaria al agente inmunizante bacteriano.
Transportadores
Los transportadores farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en vacunas que comprenden material de acuerdo con la presente invención pueden ser cualquier transportador líquido convencional adecuado para composiciones farmacéuticas veterinarias, incluyendo soluciones salinas desequilibradas adecuadas para su uso en medio de cultivo de tejidos. Se entiende que los transportadores farmacéuticamente aceptables son compuestos que no afectan de forma adversa la salud del animal que se va a vacunar, al menos no en la extensión en que el efecto adverso es peor que los efectos observados cuando el animal no está vacunado. Los transportadores adecuados incluyen también agua estéril, solución salina, tampones acuosos tales como PBS, disolventes, diluyentes, agentes isotónicos, agentes tamponantes, dextrosa, etanol, manitol, sorbitol, lactosa y glicerol, y similares.
Vehículo
Las vacunas formuladas a partir de material de acuerdo con la presente invención pueden comprender también un vehículo. Un vehículo es un compuesto al cual se adhieren células hospedadoras, células bacterianas, o proteínas, fragmentos de proteínas, ácidos nucleicos o partes de los mismos, sin estar covalentemente unidos a este. Los ejemplos no limitantes de dichos vehículos incluyen biomicrocápsulas, microalginatos, liposomas y macrosoles. Algunos materiales que sirven como adyuvantes pueden servir también como vehículos tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio u óxido de aluminio), sílice, caolín, y bentonita, conocidas todas en la materia.
Estabilizantes
A menudo, la vacuna se mezcla con estabilizantes, por ejemplo, para proteger los componentes propensos a la degradación de degradarse, para potenciar la semivida de la vacuna, o para mejorar la eficacia de la liofilización. Los ejemplos no limitantes de estabilizantes que se pueden añadir a las formulaciones de vacunas basadas en el material cultivado de acuerdo con la presente invención incluyen SPGA, leche desnatada, gelatinas, albúmina de suero de bovino, carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa), proteínas (por ejemplo, albúmina, caseína o productos de degradación de la misma), estabilizantes de origen no animal, y tampones (por ejemplo, fosfatos de metales alcalinos).
Liofilización/Reconstitución
Por motivos de estabilidad o economía, se pueden liofilizar las vacunas basadas en material cultivado de acuerdo con la presente invención. En general, esto permitirá un almacenamiento prolongado a temperaturas por encima de 0 °C, por ejemplo, a 4 °C. Las personas expertas en la materia conocen procedimientos de liofilización. Está comercialmente disponible equipo para la liofilización a diferentes escalas. Para reconstituir la vacuna liofilizada, puede suspenderse en un diluyente fisiológicamente aceptable. Dichos diluyentes pueden ser tan simples como agua estéril, una solución salina fisiológica u otro transportador, como se ha descrito anteriormente.
DEPÓSITO BIOLÓGICO
Se han depositado cultivos del siguiente material biológico con el siguiente depositario internacional: American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, EE.UU., en condiciones que satisfacen los requerimientos del Tratado de Budapest Organismo________________________________________ n.° de registro Fecha de depósito Coronavirus bovino (BCV-Des MSV Lote n.° 9068110M01) PTA-121515 28 de agosto, 2014
TABLA 1
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continuación
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La presente invención puede entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se proporcionan como ilustrativos de la presente invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de forma más completa las realizaciones preferidas de la invención. No deben interpretarse de ningún modo, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
VACUNAS DE CORONAVIRUS BOVINO ATENUADAS SEGURAS Y EFICACES
Origen y aislamiento de un aislado de BCoV:
Se obtuvo una muestra fecal de un ternero de Idaho que tenía diarrea. La materia fecal se centrifugó a 6.500 rpm durante 20 minutos. A continuación, el sobrenadante se distribuyó en capas sobre un lecho de sacarosa y se centrifugó a 28.000 rpm durante 1,5 horas. El aglomerado se resuspendió en medio de cultivo celular y se inoculó en recipientes de cultivo que contenían una monocapa de células de riñón de bovino. Las células que mostraron evidencias de efecto citopático se hicieron reaccionar con anticuerpo monoclonal específico de BCoV que permitió identificar que las células eran positivas para BCoV.
Proceso de atenuación:
Se sometió un aislado de BCoV en células de riñón de bovino a 56 pases en células de riñón de bovino para atenuar el virus. Se llevó a cabo la clonación mediante dilución limitante en los pases 4, 5, 10, 15, y 25, para obtener un aislado de virus puro. El material de BCoV obtenido del pase previo se inoculó sobre una monocapa de células de riñón de bovino para cada pase. Se recogieron los fluidos víricos en cada pase cuando se observó un efecto citopático en las células. Se determinó la cantidad de BCoV en los fluidos mediante titulación en un ensayo de cultivo celular y se detectó el virus tiñendo con un anticuerpo monoclonal específico de BCoV. Se usó el pase 56 para preparar un depósito maestro del BCoV atenuado vivo modificado es decir, BCV-Des MSV Lote n.° 9068110M01, que se depositó en la ATCC el 28 de agosto de 2014. Todos los estudios relativos al BCoV atenuado modificado vivo se llevaron a cabo a continuación con BCoV procedente del depósito maestro.
Estudio de vacunación/estímulo, evaluación de la eficacia del BCoV modificado vivo:
Se rehidrató una vacuna liofilizada compuesta por el BCoV modificado vivo con diluyente estéril y se usó para vacunar veintidós (22) terneros, que tenían de tres a cinco días de edad y a los que se había privado de calostro. Cada ternero se vacunó una vez con una dosis de 2 ml de vacuna mediante la ruta intranasal. Un segundo grupo de veintidós (22) terneros, también de tres a cinco días de edad y a los que se había privado de calostro, se vacunaron una vez con una dosis de 2 ml de una vacuna de placebo. Diecinueve a veintiún días después de la vacunación, se estimularon todos los terneros con una cepa virulenta heteróloga de BCoV que produce enfermedad respiratoria y entérica. Se controlaron los terneros durante 14 días después de estímulo para determinar los signos de enfermedad respiratoria que incluían secreción nasal, tos, y secreción ocular. Se controlaron también los terneros durante 14 días después del estímulo para determinar los signos de enfermedad entérica (como se evaluó por la gravedad de la diarrea). Se observaron los terneros adicionalmente para determinar la depresión, la deshidratación, y la inapetencia. Se recogieron muestras nasales y fecales para ensayar la excreción del virus. Se recogió sangre para la evaluación serológica antes y después de la vacunación, y de nuevo después del estímulo.
Mientras tanto, 86% (19 de 22) de los terneros del control vacunados con placebo estuvieron afectados con enfermedad respiratoria moderada o grave, solo un 25 % (5 de 20) de los vacunados con la vacuna de BCoV presentaron dichos síntomas. La gravedad de la enfermedad respiratoria se redujo en los vacunados (p=0,0001) en comparación con los controles con placebo y la duración de la enfermedad respiratoria se redujo en los vacunados (p=0,0066) en comparación con los controles con placebo. En el caso de la enfermedad respiratoria, la fracción de prevención era de 0,71 con un intervalo de confianza del 95% (0,41, 0,89). por tanto, estos resultados, como mínimo, apoyan la reivindicación de "ayudas en la prevención" de la enfermedad respiratoria producida por BCoV[véase, la Tabla 2 siguiente]. Hubo una reducción en la gravedad y la duración de la excreción nasal en los vacunados (p=0,0063 para ambos) en comparación con los controles con placebo.
TABLA 2
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Dieciséis de los veintidós terneros del control vacunados con placebo, es decir, 73 %, estuvieron afectados con enfermedad entérica moderada o grave en comparación con ocho de los veinte terneros vacunados con la vacuna de BCoV, es decir, el 40 %. La gravedad de la enfermedad entérica se redujo en los vacunados (p=0,0009) en comparación con los controles con placebo y la duración de la enfermedad entérica se redujo en los vacunados (p=0,0017) en comparación con los controles con placebo. En el caso de la enfermedad entérica, la fracción de prevención era de 0,45 con un intervalo de confianza del 95% (0,01, 0,73). por tanto, estos resultados, como mínimo, apoyan al reivindicación de "ayudas en la prevención" de la enfermedad entérica producida por BCoV [véase, la Tabla 3 siguiente]. Además, los datos demuestran que la vacuna de BCoV modificado vivo es protectora para la enfermedad respiratoria y la enfermedad entérica tras un estímulo con BCoV virulento heterólogo.
TABLA
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El BCoV modificado vivo no revierte a virulencia cuando pasa a través del animal hospedador y retiene un fenotipo estable:
Se inocularon terneros recién nacidos privados de calostro en el primer pase con el BCoV modificado vivo, a los que se administró igualmente por las rutas oral e intranasal. Se utilizó un ternero recién nacido privado de calostro como control de vigilancia en cada pase. Se observaron los terneros diariamente durante 14 días para determinar la enfermedad respiratoria y entérica. Se recogieron muestras nasales y fecales tras la inoculación. Todos los terneros permanecieron sanos durante el periodo de observación de 14 días y no se notificaron hallazgos anómalos en la necropsia en el día 14. No se recuperó el BCoV en el cultivo de muestras fecales de ninguno de los terneros en el pase 1, pero se recuperó en las muestras nasales de dos terneros (uno para cada día). El material de la muestra nasal original procedente de los dos terneros se combinó y administró a tres terneros recién nacidos privados de calostro para el segundo pase. Todos los terneros permanecieron sanos durante el periodo de observación de 14 días y no se notificaron hallazgos anómalos en la necropsia en el día 14. No se recuperó BCoV de las muestras nasales o fecales de ninguno de los terneros en el pase 2. Se llevó a cabo un pase de confirmación en el que 10 terneros recién nacidos privados de calostro fueron inoculados con el combinado del material nasal original procedente de los dos terneros en el pase 1. Se observaron los terneros durante veintiún días. Todos los terneros permanecieron sanos durante el periodo de observación de veintiún días. No se recuperó BCoV de las muestras nasales o fecales procedentes de ninguno de los terneros en el pase de confirmación. Se detectaron pequeñas lesiones en dos terneros inoculados y el ternero del control de vigilancia en la necropsia, pero no se recuperó BCoV en el cultivo. Estos datos indican que el BCoV modificado vivo no produce signos clínicos de enfermedad respiratoria o entérica consistente con la infección de BCoV cuando pasa a través del animal. Además, el BCoV modificado vivo es fenotípicamente estable.
Evaluación del desprendimiento, difusión y diseminación del BCoV modificado vivo cuando se administra a terneros recién nacidos a una dosis que es mayor que el nivel de liberación final esperado en una vacuna:
Trece terneros recién nacidos privados de calostro se inocularon mediante la ruta intranasal con una dosis del BCoV modificado vivo que es >10X el nivel de liberación esperado en una vacuna y era >100X el nivel del BCoV usado en el estudio de vacunación/estímulo. Se utilizaron seis terneros recién nacidos privados de calostro como controles sin inocular. Se observaron los terneros para determinar la enfermedad respiratoria y entérica producidas por el BCoV. Se recogieron muestras nasales y fecales de todos los terneros. Se llevó a cabo la necropsia en siete de los terneros inoculados después de siete días de observación y se llevó a cabo la necropsia en los seis terneros inoculados restantes tras una observación de 14 días. Se llevó a cabo la necropsia sobre los terneros del control después de 14 días de observación. En la necropsia, se recogieron muestras de la tráquea, ganglios linfáticos mesentéricos, amígdala intestinal cornetes, y pulmón y se ensayaron para la determinación del BCoV. No se observaron signos clínicos de enfermedad respiratoria o entérica producida por BCoV en ninguno de los terneros inoculados o del control. Se aisló el BCoV en 4 de los 13 terneros inoculados en uno o dos días, pero no se aisló el BCoV en muestras fecales de ninguno de los terneros. Se detectó BCoV mediante la PCR en una o más muestras de tejidos recogidos de 11 de 13 terneros inoculados, pero no en ninguno de los terneros del control. Estos datos demostraron que el BCoV modificado vivo se desprende de los terneros inoculados y se disemina en los tejidos de terneros inoculados, lo cual es bueno porque el virus va a los tejidos necesarios para estimular la respuesta inmunitaria adecuada, pero no se difunde a terneros del control sin inocular. Este estudio confirmó por tanto la seguridad del BCoV modificado vivo. Por tanto, el BCoV modificado vivo protege a los terneros de la enfermedad respiratoria y la enfermedad entérica, y además, reduce sustancialmente la excreción del virus.
Ejemplo 2
ANÁLISIS GENÉTICO DEL BCoV
En la Figura 1 se representa gráficamente la cartografía del genoma del BCoV atenuado descrita en el Ejemplo 1 y se anota en la Tabla 2 siguiente.
TABLA 2
Figure imgf000012_0001
(continuación)
Figure imgf000013_0001
A continuación, se proporcionan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para el BCoV:
genoma completo de BCoV (31.028 nucleótidos): SEQ ID NO: 25
nnnnnnGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCTCTGATCTCTTGTGAGATCTTTTTATAATCTAAACTTTATAAAAA
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ATAGTGGCCATTATCATGTGGA.TTGTGTATTCTGTGAATAGTATCAGGTTGTTTATTAGAACTGGAAGTTGGTGGAGTTT CAACCCAGAAACAAACAACTTGATGTGTATAGATATGAAGGGAAGGATGTATGTTAGGCCGATAArTGAGGACTACCATA CCCTTACGGTCACAATAATACGTGGTCATCTCTACATGCAAGGTATAAAACTAGGTACTGGCTATTCTTTGTCAGATTTG CCAGCTTATGTGACTGTTGCTAAGGTCTCACACCTGCTCACGTATAAGCGTGGTTTTCTTGACAAGATAGGCGATACTAG TGGTTTTGCTGTTTATGTTAAGTCCAAAGTCGGTAATTACCGACTGCCATCAACCCAAAAGGGTTCTGGCATGGACACCG CATTGTTGAGAAATATAATCTAAACTTTAAGGATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCAATCCAGTAGTAGAGCGTCCTCTGGA AATCGTTCTGGTAATGGCATCCTTAAGTGGGCCGATCAGTCCGACCAATCTAGAAATGTTCAAACCAGGGGTAGAAGAGC TCAACCCAAGCAAACTGCTACTTCTCAGCTACCATCAGGAGGGAATGTTGTACCCTACTATTCTTGGTTCTCTGGAATTA CTCAGTTTCAAAAAGGAAAGGAGTTTGAATTTGCAGAGGGACAAGGTGTGCCTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACTGAA GCTAAGGGGTACTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTTTAAAACAGCCGATGGCAACCAGCGTCAACTGCTGCCACGATG GTATTTTTACTATCTTGGAACAGGACCGCATGCCAAAGACCAGTATGGCACCGATATTGACGGTGTCTTCTGGGTCGCTA GTAACCAGGCTGATGTCAATACCCCGGCTGACATTCTCGATCGGGACCCAAGTAGCGATGAGGCTATTCCGACTAGGTTT CCGCCTGGCACGGTACTCCCTCAGGGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTCCTAATTCCAGATCTACTTCACG CGCATCCAGTAGAGCCTCTAGTGCAGGATCGCGTAGTAGAGCCAATTCTGGCAACAGAACCCCTACCTCTGGTGTAACAC CTGATATGGCTGATCAAATTGCTAGTCTTGTTCTGGCAAAACTTGGCAAGGATGCCACTAAGCCACAGCAAGTAACTAAG CAGACTGCCAAAGAAATCAGACAGAAAATTT^GAATAAGCCCCGCCAGAAGAGGAGCCCCAATAAACAATGCACTGTTCA GCAGTGTTTTGGGAAGAGAGGCCCCAATCAGAATTTTGGTGGTGGAGAAATGTTAAAACTTGGAACTAGTGACCCACAGT TCCCCATTCTTGCAGAACTCGCACCCACAGCTGGTGCGTTTTTCTTTGGATCAAGATTAGAGTTGGCCAAAGTGCAGAAT TTGTCTSGGAATCTTGACGAGCCCCAGAAGGATGTTTATGAATTGCGCTATAATGGTGCAATTAGATTTGACAGTACACT TTCAGGTTTTGAGACCATAATGAAGGTGTTGAATGAGAATTTGAATGCATATCAACAACAAGATGGTATGATGAATATGA GTCCAAAACCACAGCGTCAGCGTGGTCAGAAGAATGGACAAGGAGAAAATGATAATATAAGTGTTGCAGCGCCTAAAAGC CGTGTGCAGCAAAATAAGAGTAGAGAGTTGACTGCAGAGGACATCAGCCTTCTTAAGAAGATGGATGAGCCCTATACTGA AGACACG TCAGAAATATAAGAGAATGAA.ee T GATGTCGGCA.CC TGGTGGTAAGCCCTCGCAGGAAAGTCGGGATAAGGCA CTCTCTATCAGAATGGATGTCTTGCTGCTATAATAGATAGAGAAGGTTATAGCAGACTATAGATTAATTAGTTGAAAGTT TTGTGTGGTAATGTATAGTGTTGGAGAAAGTGAAAGACTTGCGGAAGTAATTGCCGACAAGTGCCCAAGGGGAAGAGCCA GCATGTTAAGTTACCACCCAGTAATTAGTAAATGAATGAAGTTAATTATGGCCAATTGGAAGAATCAC
gen Orf1 ab (21.284 nucleótidos) SEQ ID NO: 11
ATGTCGAAGATCAACAAATACGGTCTCGAACTACACTGGGCTCCAGAATTTCCATGGATGTTTGAGGACGCAGAGGAGAA GTTGGATAACCCTAGTAGTTCAGAGGTGGATATAGTATGCTCCACCACTGCGCAAAAGCTGGAAACAGGCGGAATTTGTC CTGAAAATCATGTGATGGTGGATTGTCGCCGACTTCTTAAACAAGAGTGTTGTGTGCAGTCTAGCCTAATACGTGAAATT GTTATGAATACACGTCCATATGATTTGGAGGTGCTACTTCAAGATGCTTTGCAGTCCTGCGAAGCAGTTTTGGTTACACC CCCTCTAGGTATGTCTCTGGAGGCATGCTATGTGAGAGGTTGTAATCC7AATGGATGGACCATGGGTTTGTTTCGGCGTA GAAGTGTGTGTAACACTGGTCGTTGCGCTGTTAACAAGCATGTGGCCTATCAGCTATATATGATTGATCCTGCGGGTGTC TGTTTT3GTGCAGGTCAATTTGTGGGTTGGGTTATACCCTTAGCCTTTATGCCTGTGCAATCCCGGAAATTTATTGTTCC TAGGGTTATGTACTTGCGTAAGTGTGGCGAAAAGGGTGCCTACAATAAAGATCATAAACGTGGCGGTTTTGAACACGTTT ATAATTTTAAAGTTGAGGATGCTTACGACCTGGTTCATGATGAGCCTAAGGGTAAGTTTTCTAAGAAGGC.TTATGCTTTA ATTAGAGGATACCGTGGTGTTAAACCGCTTCTCTATGTAGACCAGTATGGTTGTGATTATACTGGTGGTCTTGCAGATGG CTTAGAGGCTTATGCTGATAAGACATTGCAAGAAATGAAGGCATTATTTCCTATTTGGAGCCAGGAACTCCCTTTTGATG TAACTGTGGCATGGCACGTTGTGCGTGATCCACGTTATGTTATGAGACGGCAGAGTGCTTCTACTATACGTAGTGTTGCA TATGTT3CTAACCCTACTGAAGACTTGTGTGATGGTTCTGTTGTTATAAAGGAACCTGTGCATGTTTATGCGGATGACTC TATTATTTTACGTCAACATAATTTAGTTGACATTATGAGTTGTTTTTATATGGAGGCAGATGCAGTTGTAAATGCTTTTT ATGGTGTTGATTTGAAAGATTGTGGTTTTGTTATGCAGTTTGGTTATATTGACTGCGAACAAGACTTGTGTGATTTTAAA GGTTGGGTTCCTGGTAATA.TGATAGATGGTTTTGCTTGCACTACTTGTGGTCATGTTTATGAGACAGGTGATTTGCTAGC ACAATCTTCAGGTGTTTTGCCTGTTAATCCTGTATTGCATACTAAGAG'TGCAGCAGGTTATGGTGGTTTTGGTTGTAAGG ATTCTTTTACCCTGTATGGCCAAACTGTAGTTTATTTTGGAGGTTGTGGGTATTGGAGTCCAGCACGTAATATATGGATT CCTATATTAAAATCTTCTGTTAAGTCTTATGACGGTTTGGTTTATACTGGAGTTGTAGGTTGCAAGGCTATTGTAAAGGA AACAAATCTCATTTGCAAAGCGTTGTACCTTGATTATGTTCAACACAAGTGTGGCAATTTACACCAGCGGGAGTTGCTAG GTGTGTCAGATGTGTGGCATAAACAATTGTTATTAAATAGAGGTGTGTACAAACCTCTTTTAGAGAATATTGATTATTTT AATATGCGGCGCGCTAAATTTAGTTTAGAAACTTTTACTGTTTGTGCAGATGGTTTTATGCCTTTTCTTTTAGATGATTT GGTTCCGCGCGCATATTATTTGGCAGTAAGTGGTCAA.GCATTTTGTGACTACGCAGGTAAAATCTGCCATGCTGTTGTGT CTAAGAGTAAAGAGTTACTTGATGTGTCTCTGGATTCTTTAGGTGCAGCTATACATTATTTGAATTCTAAAATTGTTGAT 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AAAGGTGATATAATTAAAGTTTCTAAGCGTGTTAAAGCAGAAGTCGTTGTAAATCCTGCTAATGGCCATATGGCACATGG TGGTGGTGTTGCAAAGGCTATTGCAGTAGCAGCTGGACAGCAGTTTGTGAAAGAGACCACCGATATGGTTAAGTCTAAAG GAGTTT3TGCTACTGGAGATTGTTATGTCTCTACAGGGGGCAAATTATGTAAAACTGTGCTTAATGTTGTTGGACCTGAT GCGAGGACACAGGGTAAACAAAGTTATGCATTGTTAGAGCGTGTTTATAAACATCTTAACAAATATGATTGTGTTGTTAC AACTTTGATCTCAGCTGGTATATTTAGTGTGCCTTCTGATGTGTCTTTAACATATCTACTTGGTACTGCTAAGAAACAAG TTGTTCTTGTTAGCAATAATCAAGAGGATTTTGATCTTATTTCTAAGTGTCAGATAACTGCCGTTGAGGGCACTAAGAAA TTGGCAGAGCGTCTTTCTTTTAATGTTGGGCGTTCTATCGTTTACGAAACAGATGCTAATAAGTTGATTTTAAGCAATGA CGTTGCATTTGTTTCGACA.TTTAATGTCTTACAGGATGTTTTATCCTTAAGACATGATATAGCACTTGATGATGA.TGCAC GAACCTTTGTTCAGAGCAATGTTGATGTTGTACCTGAGGGTTGGCGTGTTGTCAATAAGTTTTATCAAATTAATGGTGTT AGAACC3TTAAGTATTTTGAGTGTCCCGGGGGCATAGATATATGCAGCCAGGATAAAGTTTTTGGTTATGTACAGCAGGG TAGTTTTAATAAGGCTACTGTTGCTCAAATTAAAGCCTTGTTTTTGGATAAAGTGGACATCTTGCTAACTGTTGATGGTG TTAATTTCACTAACAGGTTTGTGCCTGTAGGTGAAAGTTTTGGTAAGAGTCTAGGAAATGTGTTTTGTGATGGAGTTAAT GTCACGAAACATAAGTGTGATATAAATTA.TAAAGGTAAAGTCTTTTTCCAGTTTGATAATCTTTCTAGTGAAGATTTAAA GGCTGTAAGAAGTTCTTTTAATTTTGATCAGAAGGAATTGCTTGCCTACTACAACATGCTTGTTAATTGTTCTAAGTGGC AGGTTGTTTTTAATGGTAAGTATTTCACTTTTAAGCAAGCTAATAACAATTGTTTTGTTAATGTTTCTTGCTTAATGCTC CAGAGTTTGAATCTGAAATTTAAAATTGTTCAATGGCAGGAGGCGTGGCTTGAATTTCGTTCTGGCCGCCCTGCTAGATT TGTATCTTTGGTTTTGGCTAAAGGTGGGTTTAAATTTGGGGATCCTGCGGATTCTAGAGATTTCTTGCGTGTTGTGTTTA GTCAAGTTGATTTGACAGGGGCAATATGTGATTTTGAAATTGCATGTAAATGTGGTGTAAAGCAGGAACAGCGTACTGGT GTGGACGCTGTTATGCATTTTGGTACATTGAGTCGTGAAGATCTTGAGATTGGTTACACCGTGGATTGTTCTTGCGGTAA AAAGCTAATTCATTGTGTACGATTTGATGTACCATTTTTAATTTGCAG7AATACACCTGCTAGTGTAAAATTACCTAAGG GTGTAGGAAGTGCAAATATTTTTAAAGGTGATAAGGTTGGTCATTATGTTCATGTTAAGTGTGAACAGTCTTATCAGCTT TATGATSCTTCTAATGTTAAGAAGGTTACAGACGTTACTGGCAATTTGTCAGATTGTTTGTATCTTAAAAATTTGAAACA AACTTTTAAATCGGTGTTAACCACCTATTATTTGGATGATGTTAAGAAAATTGAGTATAAACCTGACTTGTCACAATATT ATTGTGACGGAGGTAAGTATTATACTCAGCGTATTATTAAAGCCCAATGTAAAACATTTGAGAAAGTAGATGGTGTGTAT ACTAATTTTAAATTGATAGGA.CACACCGTCTGTGATATTCTTAATGCTAAGTTGGGTTTTGATAGCTCTAAAGAGTTTGT TGAATATAAGGTTACTGAGTGGCCAACAGCTACAGGTGATGTGGTGTTGGCTACTGATGATTTGTATGTTAAGAGATATG AAAGGGGTTGTATTACTTTTGGTAAACCTGTTATATGGTTAAGCCATGAGCAAGCTTCCCTCAATTCTTTAACATATTTT AATAGACCTTTATTGGTTGATGAGAATAAATTTGATGTTTTAAAAGTGGATGATGTTGACGATGGTGGTGATATCTCAGA GAGTGATGCTAAAGAACCCAAAGAAATCAACATTATTAAGTTAAGTGGTGTTAAAAAACCATTTAAGGTTGAAGATAGTG TCATTGTTAATGATGATACTAGTGAAATCAAATATGTTAAGAGTTTGTCTATAGTTGATGTGTATGATATGTGGCTTACA GGTTGTAGGTGTGTTGTTAGGACTGCTAATGCTTTGAGCAGAGCAGTTAACGTACCTACAArACGTAAGTTTATAAAATT TGGTAT3ACTCTTGTTAGTATACCAATTGATTTGTTAAATTTAAGAGAGATTAAGCCTGTTTTTAATGTGGTTAAAGCTG TGCGAAATAAAATTTCTGCATGCTTTAATTTTATTAAATGGCTTTTTGTCTTATTATTTGGCTGGATTAAAATATCCGCT GATAATAAAGTAATTTACACCACAGAAGTTGCATCAAAGCTTACGTGTAAGCTTGTAGCTTTAGCTTTTAAAAATGCATT TTTGACATTTAAGTGGAGTGTGGTTGCTAGAGGTGCTTGCATTATAGCGACTATATTTCTATTGTGGTTTAATTTTATAT ATGCCAATGTAATTTTTAGTGA.TTTTTATTTGCCTAAAATCGGTTTCT'rGCCGACTTTTGTTGGTAAGATCGCACAGTGG ATTAAGAACACTTTTAGTCTTGTAACTATTTGTGATCTATATTCCATTCAGGATGTGGGTTTTAAGAATCAGTATTGTAA TGGAAGTATCGCATGTCAGTTCTGCTTGGCAGGATTTGATATGTTAGAGAATTATAAAGCCATTGATGTAGTACAGTATG AAGCTGATAGGCGAGCATTTGTTGATTATACAGGTGTGTTAAAGATTG-CATTGAATTGATAGTTAGTTACGCCCTGTAT ACGGCATGGTTTTACCCATTGTTTGCTCTTATTAGTATTCAGATCTTGACCACTTGGCTGCCTGAGCTTTTTATGCTTAG TACATTACATTGGAGTGTTAGGTTGCTGGTGTCTTTA.GCTAATATGTTACCAGCACATGTGTTTATGAGGTTTTATATTA TTATTGCCTCTTTTATTAAGCTGTTTAGCTTGTTTAGGCATGTTGCCTATGGTTGTAGTAAATCTGGTTGTTTGTTTTGT TACAAGAGGAATCGTAGTCTACGTGTTAAATGTAGTACTATTGTTGGTGGCATGATACGCTATTACGATGTTATGGCTAA TGGTGGCACTGGCTTTTGTTCAAAACATCAATGGAATTGCATTGATTGGGATTCTTATAAACCAGGTAATACTTTTATTA CTGTTGAGGCCGCTCTTGATTTATCTAAGGAATTGAAACGGCCTATTCAGCCTACAGATGTTGCTTATCATACGGTTACG GATGTTAAGCAAGTTGGTTGTTATATGCGCTTGTTCTATGATCGTGATGGACAGCGCACATATGATGATGTTAATGCTAG TTTGTTTGTGGATTATAGTAATTTGCTACATTCTAAGGTTAAGAGTGTGCCTAATATGCATGTTGTGGTAGTGGAAAATG ATGCCGATAAAGCTAATTTTCTTAATGCTGCTGTATTTTATGCACAGTCTTTGTTTAGACCTATTTTAATGGTTGATAAA AATCTGATAACTACTGCTAATACTGGTACGTCTGTTACAGAAACTATGGTTGATGTTTATGTGGATACATTTTTGTCTAT GTTTGATGTGGATAAAAAGAGTCTTAATGCTTTAATAGCAACTGCGCAGTCTTCTATAAAACAGGGTACGCAGATCTGTA AAGTTTTGGATACCTTTTTAAGCTGTGCTCGTAAAAGTTGTTCTATTGATTCAGATGTTGATACTAAGTGTTTAGCTGAT TCTGTCATGTCTGCTGTATCGGCAGGCCTTGAATTGACGGATGAAAGTTGTAATAACTTGGTGCCAACATATTTGAAGGG TGATAACATTGTGGCAGCTGATTTAGGTGTTCTGATTCAAAATTCTGCTAAGCATGTGCAGGGTAATGTTGCTAAAATAG CCGGTGTTTCCTGTATATGGTCTGTGGATGCTTTTAATCAGCTTAGTTCTGATTTCCAGCArAAATTGAAGAAAGCATGT TGTAAAACTAGTTTGAAACTGAAGCTTACTTATAATAAGCAGATGGCTAATGTCTCTGTTTTAACTACACCCTTTAGTCT TAAAGGGGGTGCAGTTTTTAGTTATTTTGTTTATGTATGTTTTGTGTTGAGTTTGGTTTGTTTTATTGGATTGTGGTGCT TAATGCGCACTTACACAGTACACAAATCAGATTTTCAGCTTCCCGTTTATGCCAGTTATAAAGTTTTAGATAATGGTGTT ATTAGA3ATGTTAGCGTTGAAGATGTTTGTTTCGCTAACAAATTTGAACAATTTGATCAATGGTATGAGTCTACATTTGG TCTAAGTTATTATAGTAACAGTATGGCTTGTCCCATTGTTGTTGCTGTAGTAGACCAGGATTTTGGCTCTACTGTGTTTA ATGTCCCTACCAAAGTGTTACGATATGGTTACCATGTGTTGCACTTTATTACACATGCACTTTCTGCTGATGGAGTGCAG 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GTTTAT3CTATACTTAGTGATGTTGATGGTCTTAAGTATACAAAAATTCTTAAAGATGATGGCAATTTTGTTGTTTTGGA GTTAGATCCTCCTTGTAAATTTACTGTTCAAGATGTTAAAGGTCTTAAAATTAAGTACCTTTATTrTGTAAAAGGTTGTA ACACACTAGCAAGAGGCTGGGTTGTTGGTACAATTTCTTCTACAGTTAGATTGCAAGCTGGAACTGCTACTGAGTATGCT TCCAACTCATCTATATTATCTTTATGTGCGT'TTTCTGTAGATCCTAAGAAAACGTATTTAGATTTTATACAACAGGGAGG AACACCTATTGCCAATTGTGTTAAAATGTTG-GTGACCATGCTGGTACCGGTATGGCCATTACTGTTAAACCCGATGCTA CCACTAGTCAGGATTCATATGGTGGTGCGTC-GTTTGTATATATTGCCGCGCACGAGTTGAACACCCAGATGTTGATGGG TTGTGCAAATTACGCGGCAAGTTTGTACAAG'TGCCTGTAGGTATAAAAGATCCTGTGTCTTATGTTTTGACACATGATGT TTGTCAAGTTTGTGGATTTTGGCGGGATGGAAGCTGTTCATGTGTTAGCACTGACACTACTGTTCAGTCAAAAGATACTA ATTTTTTAAACGGGTTCGGGGTACGAGTGTAGATGCCCGTCTCGTACCCTGTGCCAGTGGTTTATCTACTGATGTACAAT TAAGGGCATTTGATATTTGCAATGCTAGTGTTGCTGGCATTGGTTTACATTTAAAAGTTAATTGCTGCCGTTTTCAGCGT GTTGATGAGAACGGTGATAAATTAGATCAGTTCTTTGTTGTTAAGAGGACAGATCTGACTATATArAATAGAGAGATGGA ATGCTATGAGCGTGTAAAAGATTGTAAGTTTGTGGCTGAACACGATTTCTTTACATTTGATGTAGAAGGTAGTCGTGTGC CACACATTGTACGCAAGGATTTAACAAAGTATACTATGTTGGATCTTTGCTATGCATTGCGACATTTTGATCGCAATGAT TGCATGCTGCTTTGTGACATTCTCTCTATATATGCTGGTTGTGAACAA7CCTACTTTACTAAGAAGGATTGGTATGATTT TGTTGAAAATCCTGATATTATTAATGTTTATAAAAAGCTAGGACCTATGTTTAATAGAGCCCTAGTTAGCGCTACTGAGT TTGCAGACAAATTGGTGGAGGTAGGCTTAGTAGGCATTTTAACACTTGATAACCAAGATTTAAATGGTAAATGGTATGAT TTTGGT3ACTATGTTATTGCAGCCCCAGGGTGTGGTGTTGCTATAGCAGACTCTTATTATTCTTATATGATGCCTATGCT GACCATGTGTCATGCATTGGA.TTGTGAATTGTATGTGAATAATGCTTATAGACTATTTGATCTTGTACAGTATGATTTTA CTGATTACAAGCTCGAATTGTTTAATAAGTATTTTAAGCACTGGAGTAmGCCATACCATCCrAACACGGTTGATTGTCAG GATGATCGGTGTATCATACATTGTGCTAATTTTAACATACTTTTTAGTATGGTTTTACCTAATACATGTTTTGGGCCTCT TGTTAGGCAAATTTTTGTGGATGGTGTGCCTTTTGTTGTTTCAATTGGCTACCATTATAAAGAACTTGGTATTGTGATGA ACATGGATGTGGATACACATCGTTATCGCTTGTCTTTAAAAGACTTGCrTTTATATGCTGCTGATCCAGCTTTGCATGTA GCTTCT3CTAGTGCATTGTATGATTTACGCACTTGCTGTTTTAGTGTTGCGGCTATAACAAGCGGTGTAAAATTTCAAAC AGTTAAACCTGGTAATTTTAATCAGGATTTTTATGATTTTATTTTAAGTAAGGGCCTGCTTAAAGAGGGTAGTTCAGTTG ATCTGAAGCACTTTTTCTTTACGCAGGATGGTAATGCTGCTATTACTGATTATAATTATTATAAGTACAATTTGCCCACC ATGGTG3ACATTAAGCAGTTGTTGTTTGTTTGGGAAGTTGTTTATAAGGATTTTGAGATTTATGATGGTGGGTGTATACC GGCATCACAAGTCATTGTTAATAATTATGATAAGAGTGCTGGCTATCCATTTAATAAATTTGGAAAAGCCAGGCTCTATT ATGAAGCATTATCATTTGAGGAGCAGGATGAAATTTACGCCTATACTAAGCGCAATGTCCTGCCAACACTTACTCAAATG AATTTGAAATATGCTATTAGTGCTAAGAATAGAGCCCGCACTGTTGCTGGTGTTTCCATACTTAGTACTATGACTGGCAG AATGTTTCATCAAAAATGTTTGAAAAGTA.TAGCAGCTACACGTGGTGTGCCTGTTGTTATAGGCACCACTAAGTTTTATG GCGGCTGGGATGATATGTTACGTCGCCTTATTAAAGATGTTGATAATCCTGTACTTATGGGTTGGGATTATCCTAAGTGT GATCGTGCTATGCCAAACATACTACGTATTGTTAGTAGTCTGGTCTTGGCCCGAAAACATGAGGCATGTTGTTCGCAAAG CGATAGGTTTTATCGACTTGCGAATGAATGCGCACAAGTTCTGAGTGAAATTGTTATGTGTGGTGGCTGTTATTATGTTA AGCCTG3TGGCACTAGTAGTGGTGATGCAACTACTGCTTTTGCTAATTCAGTTTTTAACATATGTCAAGCTGTTTCAGCC AATGTATGTGCTTTAATGTCATGCAATGGTAATAAGATTGAAGATTTGAGTATACGTGCTCrTCAGAAGCGCTTATACTC ACATGTSTATAGAAGTGATATGGTTGATTCAACCTTTGTCACAGAATATTATGAATTTTTAAATAAGCATTTTAGTATGA TGATTTTGAGTGATGATGGCGTTGTGTGTTATAATTCTGATTATGCGTCCAAAGGGTATATTGCTAATATAAGTGCCTTT CAACAGGTATTGTATTATCAAAATAACGTTTTTATGTCAGAATCCAAAGGTTGGGTTGAAAATGACATAAACAATGGACC TCATGAATTTTGTTCACAACATACAATGCTTGTAAAGATGGATGGGGACGATGTCTATCTTCCATATCCTGATCCTAGTC GTATATTAGGAGCTGGATGTTTTGTAGATGATTTGTTAAAGACTGATAGTGTTCTTTTAATAGAACGATTTGTAAGTCTT GCAATAGATGCTTATCCACTTGTGTACCACGAAAATGAAGAATACCAAAAGGTTTTTCGTGTTTATTTGGAGTATATAAA GAAGTTGTACAATGACCTGGGTAATCAGATCGTGGATAGCTACAGTGTGATTTTAAGTACTrGTGATGGACAAAAGTTTA CTGATGAGTCCTTTTACAAGAACATGTATTTAAGAAGTGCAGTTATGCAGAGTGTTGGAGCTTGCGTGGTCTGCTCTTCC CAAACATCATTACGTTGTGGCAGTTGCATCAGAAAGCCTCTTCTTTGCGGCAAGTGTTGTTACGATCATGTTATGGCAAC TGATCATAAATATGTTTTGAGTGTTTCACCATATGTGTGTAACGCACCAGGATGTGATGTAAATGATGTTACCAAATTGT ATCTAGGTGGTATGTCATATTATTGTGAAGATCATAAGCCACAATATTCGTTTAAGTTGGTAATGAATGGTATGGTTTTT GGTCTATATAAACAATCTTGTACAGGATCTCCGTACATAGATGATTTTAATCGTATAGCTAGTTGTAAATGGACTGATGT TGATGATTACATACTGGCTAATGAATGTACAGAGCGCTTGAAATTGTTGGCTGCAGAAACGCAAAAGGCGACTGAGGAAG CCTTTAAGCAGAGTTATGCATCAGCAACAATACAAGAGATTGTTAGTGAGCGCGAATTGATCCTCTCTTGGGAGATTGGA AAAGTGAAGCCACCACTTAATAAAAATTATGTTTTTACTGGCTACCATGTTACTAAAAATGGCAAGACAGTTTTAGGTGA GTATGTTTTTGATAAGAGTGA.GTTGACTAATGGTGTGTATTATCGCGCCACAACCACTTATAAGCTATCTGTAGGAGATG TTTTTGTTTTAACCTCTCATTCAGTAGCTAATTTAAGTGCTCCTACGCmTGTGCCGCAGGAGAATTATAGTAGTATTAGA TTTGCTAGTGTTTATAGTGTGCTTGAGACATTTCAGAACAATGTTGTGAACTATCAACACATTGGTATGAAACGTTATTG CACCGTGCAAGGACCTCCTGGTACAGGAAAGTCACATCTTGCTATTGGGCTTGCTGTATATTATTGTACAGCACGTGTAG TATACACTGCGGCCAGCCATGCAGCTGTTGACGCATTGTGTGAAAAAGCATACAAATTTTTGAATATAAATGATTGCACT CGTATT3TTCCTGCCAAGGTCAGGGTGGAGTGCTATGATAAGTTTAAAATTAATGACACCACTCGTAAGTATGTGTTTAC TACTATAAATGCATTACCTGAGATGGTGACTGATATTGTTGTTGTAGATGAAGTTAGTATGCTTACCAATTATGAGCTTT CTGTTATTAATGCTCGTATTCGCGCTAAGCATTATGTTTATATTGGTGATCCTGCTCAATTGCCAGCACCACGTGTGTTA TTGAGCAAGGGTACACTTGAACCTAAATATTTTAACACTGTTACTAAGCTTATGTGTTGCTTAGGGCCAGACATTTTTCT TGGTACATGTTATAGATGTCCTAAGGAAATCGTTGATACAGTGTCTGCCTTGGTTTATGAAAATAAGCTTAAGGCTAAGA ATGAAAGTAGTTCATTGTGTTTTAAGGTCTATTATAAAGGCGTTACAACACATGAAAGTTCTAGTGCTGTAAATATGCAG CAGATTTATTTGATTAATAAGTTTTTGAAGGTTAACCCTTTGTGGCATAAAGCCGTTTTTATTAGCCCATATAATAGTCA GAACTTTGCAGCTAAGCGCGTTTTGGGTTTGCAAACCCAAACCGTGGAGTCTGCGCAAGGTTCTGAATATGATTATGTTA TATATTCACAGACTGCAGAAACAGCGCATTCTGTAAATGTTAATCGCTGCAATGTTGCTATTACTCGAGCCAAGAAAGGT ATTCTTTGCGTTATGAGTAATATGCAGTTGTTTGAAGCATTACAGTTTACTACATTGACCGTAGATAAAGTGCCACAGGC CGTTGAAACGAGAGTTCAATGTAGTACCAATTTATTTAAAGATTGTAGCAAGAGTTATAGTGGTTACCACCCAGCTCATG CTCCTTCATTTTTGGCAGTAGATGACAAATATAAGGCAACTGGCGATTTAGCCGTGTGTCTTGGTATTGGAGATTCTGCT GTTACATATTCAAGATTAATATCACTCATGGGTTTTAAACTGGATGTTACCCTTGATGGGTATTGTAAGCTTTTTATAAC TAAAGAAGAAGCTGTTAAACGCGTGCGTGCTTGGGTTGGCTTTGATGCTGAAGGTGCTCATGCCACGCGTGATAGCATTG GGACAAATTTCCCACTTCAATTAGGGTTTTCCACAGGAATTGATTTTGTTGTGGAAGCCACTGGTTTGTTTGCTGATAGA GATGGTTACAGCTTTAAAAAGGCTGTGGCTAAAGCTCCTCCTGGTGAACAATTTAAGCATCTCATCCCTTTGATGACGAG AGGTCAGCGCTGGGATGTTGTTAGACCTAGAATAGTACAAATGTTTGCAGATCATTTAATTGATCTGTCTGATTGTGTTG TGCTAGTTACATGGGCAGCCAACTTTGAGCTCACTTGTCTCCGCTACTGTGCAAAAGTAGGTCGTGAGATCTCTTGTAAT GTGTGCACTAAACGTGCCACAGCTTACAATTCTAGAACTGGTTACTATGGTTGTTGGCGCCATAGTGTTACATGTGATTA CTTGTATAATCCACTTATTGTTGATATTCAACAGTGGGGATATATTGGGTCTTTATCAAGTAATCATGATTTATATTGTA GTGTCCATAAAGGAGCACATGTTGCCTCCTCTGATGCTATAATGACACGGTGTTTGGCCGTTTATGATTGTTTTTGCAAT AATATTAATTGGAATGTGGAGTATCCCATCATTTCAAATGAGTTAAGTATTAATACCTCTTGTAGGGTCTTGCAGCGTGT TATGCTTAAAGCTGCCATGCTCTGCAACAGATATACTTTGTGTTATGATATTGGCAATCCAAAAGCGATTGCCTGTGTCA AAGATTTTGATTTTAAGTTCTATGATGCCCAACCAATTGTTAAGTCTGTCAAGACTCTTTTGTATTTTTTTGAGGCACAT AAGGACTCTTTTAAAGATGGTTTGTGTATGTTTTGGAACTGTAATGTGGATAAGTATCCACCGAATGCAGTTGTATGTAG ATTTGACACGAGAGTGTTGAATAATTTAAATCTTCCTGGCTGTAATGGAGGTAGTTTGTATGTTAACAAACATGCATTCC ACACTAAACCCTTTTCTAGGGCAGCCTTTGAGCATTTGAAGCCTATGCCATTTTTCTATTATTCAGATACGCCTTGCGTG TATATGGATGGCATGGATGCTAAGCAGGTTGATTATGTACCTTTGAAAGCCGCCACTTGCArCACAAGATGCAATTTAGG TGGTGCAGTTTGTTTAAAACATGCTGAAGAGTATCGTGAGTACCTAGAGTCTTACAATACAGCTACTACAGCAGGTTTTA CT'ITT’TGGGTCTATAAGACATTTGATTTTTATAATTTGTGGAATACGTTCACCAAGCT'ACAñAGCTTGGAGAATGTTGTA TATAATTTAGTCAAGACTGGTCATTATACAGGACAGGCTGGTGAAATGCCTTGTGCCATTATAAATGATAAAGTTGTGGC TAAGATCGATAAGGAGGATGTTGTCATTTTTATTAATAATACAACATATCCTACTAATGTGGCTGTTGAATTATTTGCCA AGCGCA3TATTCGACACCATCCAGAGCTTAAGCTCTTTAGAAATTTGAATATAGACGTGTGCTGGAAGCACGTCATTTGG GATTAT3CTAGAGAAAGTATATTTTGCAGTAATACCTATGGTGTCTGCATGTATACAGATTTAAAGTTCATTGATAAATT GAATGTCCTTTTTGATGGTCGTGATAATGGTGCTCTTGAAGCTTTTAAACGCTCTAATAATGGCGTTTACATTTCCACGA CAAAAGTTAAGAGTCTTTCGATGATAAGAGGTCCACCGCGTGCTGAATTAAATGGCGTAGTGGTGGACAAGGTTGGAGAC ACAGATTGTGTGTTTTATTTTGCTGTGCGTAAAGAGGGTCAGGATGTCATCTTCAGCCAATTCGACAGCCTGAGAGTCAG CTCTAACCAGAGCCCACAAGGTAATCTGGGGAGTAATGAACCCGGTAAGGTCGGTGGTAATGATGCTCTGGCAACCTCCA CTATCTTTACACAAAGCCGTGTTATTAGCTCTTTTACATGTCGTACTGATATGGAAAAAGATTTTATAGCTTTAGATCAA GATGTGTTTATTCAGAAGTATGGTTTGGAGGACTATGCCTTTGAACACATTGTTTATGGTAATTTCAACCAGAAGATTAT TGGTGGTTTGCATTTGTTAATAGGCTTGTACCGAAGACAGCAAACTTCCAATTTGGTTATTCAGGAGTTTGTTTCATACG ACTCCAGCATACACTCTTATTTTATCACTGATGAGAAGAGTGGTGGTAGTAAGAGTGTTTGCACTGTTATAGATATTTTG TTGGATGATTTTGTGGCTCTTGTCAAGTCACTTAATCTTAACTGTGTGAGTAAGGTTGTTAATGTTAATGTTGATTTTAA AGATTTTCAGTTCATGCTTTGGTGTAACGATGAGAAAGTTATGACTTTCTATCCTCGTTTGCAAGCTGCATCTGACTGGA AGCCTGGTTATTCTATGCCTGTATTATATAAGTATTTGAATTCCCCAAGGGAAAGAGTTAGTCTCTGGAATTATGGGAAG CCAGTTACTTTGCCTACAGGCTGTATGATGAATGTTGCTAAGTATACTCAGTTATGTCAATATCTGAATACTACAACATT AGCTGTACCTGTTAATATGCGAGTTTTGCATTTAGGTGCAGGTTCAGAAAAAGGAGTAGCACCGGGTTCTGCAGTTCTTA GGCAGTGGTTGCCTGCTGGTACTATTCTTGTAGATAATGATTTATACCCATTTGTGAGTGACAGTGTCGCTACATATTTT GGGGATTGTATAACCTTACCCTTTGATTGTCAATGGGATTTGATAATCTCTGATATGTATGACCCTATTACTAAGAACAT AGGGGA3TACAATGTAAGTAAAGATGGTTTCTTTACATACATTTGTCAGATGATTCGCGACAAGTTAGCTCTGGGTGGCA GTGTTGCTATAAAAATAACAGAGTTTTCTTGGAATGCAGAATTATATAAGTTAATGGGGTATTTTGCATTTTGGACGGTT TTCTGCACAAATGCAAATGCTTCTTCTAGTGAAGGGTTTTTAATTGGCATAAATTATTTGGGTAAGCCCAAGGTTGAGAT AGATGGAAATGTTATGCATGCCAATTATTTGTTTTGGAGAAATTCCACAGTTTGGAACGGGGGTGCTTATAGCCTGTTTG ATATGGCTAAATTCCCGCTTAAGTTGGCTGGTACTGCCGTAATAAATTGAAGAGCAGACCAGATTAATGATATGGTTTAT TCCCTTCTTGAAAAGGGTAAACTACTTGTTAGAGATACAAATAAAGAAGTTTTTGTTGGTGACAGTATGGTTAATGTAAT CTAA
poliproteína Orflab (7094 aminoácidos) SEQ ID NO: 12
MSKINKYGLELHWAPEFPWMFEDAEEKLDNPSS SEVDIVCSTTAQKLEFGGICPENHVMVDCRRLLKQECCVQSSLIREI VMNTRPYDLEVLLQDALQSCEAVLVTPPLGMSLEACYVRGCNPNGWTMGLFRRRSVCNTGRCAVNKHVAYQLYKIDPAGV CFGAGQFVGWVIPLAFMPVQSRKFIVPRVMYLRKCGEKGAYNKDHKRGGFEHVYNFKVEDAYDLVHDEPKGKFSKKAYAL IRGYRGVKPLLYVDQYGCDYTGGLADGLEAYADKTLQEMKALFPIWSQELPFDVTVAWHWRDPRYVMR1QSASTIRSVA YVANPTEDLCDGSWIKEPVHVYADDSIILRQHNLVDIMSCFYMEADAWNAFYGVDLKDCGFVMQFGYIDCEQDLCDFK GWVPGNMIDGFACTTCGHVYETGDLLAQSSGVLPVNPVLHTKSAAGYGGFGCKDSFTLYGQTWYFGGCVYHSPARNIWI PILKSGVKSYDGLVYTGWGCKAIVKETNLICKALYLDYVQIIKCGNLIIQRELLGVSDVWIIKQLLLNRGVYKPL1ENI DYF NMRRAKFSLETFTVCADGFMPFLLDDLVPRAYYLAVSGQAFCDYAGKICHAWSKSKELLDVSLDSLGAA1HYLNSKIVD LAQHFSDFGTSFVSKIVHFFKTFTTSTALAFAWVLFHVLHGAYIWESDIYFVKNIPRYASAVAQAFRSVAKWLDSLRV TFIDGLSCFKIGRRRICLSGSKIYEVERGLLHS SQLPLDVYDLTMPSQVQKTKQKPIYLKGSGSDFSLADSWEYA/TTSL TPCGYSEPPKVADKICIVDNVYMAKAGDKYYPVWDGHVGLLDQAWRVPCAGRRVTFKEQPTVNEIASTPKTIKVFYELD KDFNTILNTACGVFEVDDTVDMEEFYAWIDAIEEKLSPCKELEGVGAKVSAFLQKLEDNSLFLFDEAGEEVLAPKLYCA FTAPEDDDFLEESGVEEDDVEGEETDLTVTSAGEPCVASEQEESSEILEDTLDDGPCVETSDSQVEEDVQMSDFVDLESV IQDYENVCFEFYTTEPEFVKVLDLYVPKATRNNCWLRSVLAVMQXLPCQFKDKNLQDLWVLYKQQYSQLFVDT1VNKIPA NIWPQGGYVADFAYWFLTLCDWQCVAYWKCIKCDLALKLKGLDAMFFYGDWSHVCKCGESMVLIDVDVPFTAHFALKD KLFCAFITKRSVYKAACWAVNDSHSMAWDGKQIDDHCITSITSDKFDFIIGHGMSFSMTTFEIAQLYGSCITPNVCFV KGDIIKVSKRVKAEVWNPANGHMAHGGGVAKAIAVAAGQQFVKETTDMVKSKGVCATGDCYVSTGGKLCKTVLNWGPD ARTQGKQS YALLERVYKHLNKYDCWTTLI SAGIFSVPSDVSLTYLLGFAKKQWLVSNNQEDFDLI SKCQITAVEGTKK LAERLSFNVGRSIVYETDANKLILSNDVAFVSTFNVLQDVLSLRHDIALDDDARTFVQSNVDWPEGWRVVNKFYQINGV RTVKYFECPGGIDICSQDKVFGYVQQGSFNKATVAQIKALFLDKVDILLTVDGVNFTNRFVPVGESFGKSLGNVFCDGVN VTKHKCDINYKGKVFFQFDNLS SEDLKAVRSSFNFDQKELLAYYNMLVNCSKWQVVFNGKYFTFKQANNNCFVNVSCLML QSLNLKFKIVQWQEAWLEFRSGRPARFVSLVLAKGGFKFGDPADSRDFLRVVFSQVDLTGAICDFEIACKCGVKQEQRTG VDAVMHFGTLSREDLEIGYTVDCSCGKKLIHCVRFDVPFLICSNTPASVKLPKGVGSANIFKGDKVGHYVHVKCEQSYQL YDASNVKKVTDVTGNLSDCLYLKNLKQTFKSVLTTYYLDDVKKIEYKPDLSQYYCDGGKYYTQRIIKAQFKTFEKVDGVY TNFKLIGHTVCDILNAKLGFDSSKEFVEYKVEEWPTATGDWLATDDLYVKRYERGCITFGKPVIWLSHEQAS1NSLTYF NRPLLVDENKFDVLKVDDVDDGGDISESDAKEPKEIWIIKLSGVKKPFKVEDSVIVNDDTSEIKYVKSLSIVDVYDMWLT GCRCVVRTANALSRAVWVPTIRKFIKFGMTLVSIPIDLLNLREIKPVFHWKAVRNKISACFNFIKWLFVLLFGWIKISA DNKVIYTTEVASKLTCKLVALAFKNAFLTFKWSVVARGACIIATIFLLWFNFIYANVIFSDFYLPKIGFLPTFVGKIAQW IKNTFSLVTICDLYSIQDVGFKNQYCNGSIACQFCLAGFDMLDNYKAIDWQYEADRRAFVDYTGVLKIVIELIVSYALY TAWFYPLFALISIQILTTKLPELFMLSTLHWSVRLLVSLANMLPAHVFMRFYIIIASFIKLFSLFRHVAYGCSKSGCLFC YKRNRSLRVKCSTIVGGMIRYYDVMANGGTGFCSKHQWNCIDCDSYKPGNTFITVEAALDLSKELKRPIQPTDVAYHTVT DVKQVGCYMRLFYDRDGQRTYDDVNASLFVDYSNLLHSKVKSVPNMHVWVENDADKANFLNAAVFYAQSLFRPILMVDK NLITTANTGTSVTETMFDVYVDTFLSMFDVDKKSLKALIATAHSSIKQGTQICKVLDTFLSCARKSCSIDSDVDTKCLAD SVMSAVSAGLELTDESCNKLVPTYLKGDNIVAADLGVLIQNSAKHVQGNVAKIAGVSCIWSVDAFNQLSSDFQHKLKKAC CKTSLKLKLTYNKQMANVSVLTTPFSLKGGAVFSYFVYVCFVLSLVCFIGLWCLMPTYTVHKSDFQLPVYASYKv’LDNGV IRDVSVEDVC FANKFEQFDQWYESTFGLSYYSNSMACPIWAWDQDFGSTVFNVPTKVLRYGYHVLHFITHALSADGVQ CYTPHSQISYSNFYASGCVLSSACTMFAMADGSPQPYCYTDGLMQNASLYSSLVPHVRYNLANAKGFIRFPEVLREGLVR IVKTRSMS YCRVGLCEEADEGlCfc'NFNGSWVLNNDYYRSLPGTFCGRDVFDLIYQLFKGLAQPVDFLALTASS1AGA1LA VIWLVFYYLIKLKRAFGDYTSIVFVNVIVWCVNFMMLFVFQVYPTLSCVYAICYFYATLYFPSEISVIMHLQWLVMYGT IMPLWFCLLYISWVSNHAFWVFSYCRQLGTSVRSDGTFEEMALTTFMITKDSYCKLKNSLSDVAFNRYLSLYNKYRYYS GKMDTAAYREAACSQLAKAMDTFTNNNGSDVLYQPPTASVSTSFLQSGIVKMVNPTSKVEPCIVSVTYGNMTLNGLMLDD KVYCPRHVICSASDMTYPDYTNLLCRVTSSDFTVLFDRLSLTYMSYQMQGCMLVLTVTLQNSRTPKYTFGWKPGETFTV LAAYNGKPQGAFHVTMRSSYTIKGSFLCGSCGSVGYVIMGDCVKFVYMHQLELSTGCHTGTDFNGDFYGPYKDAQVVQLP VQDYIQ3VWFVAWLYAAILNNCNWFVQSDKCSVEDFNVWALSNGFSQVKSDLVIDALASMTGVSLETLLAAIKRLKNGFQ GRQIMGSCSFEDELTPSDVYQQLAGIKLQSKRTRLVKGIVCHIMASTFLFSCIITAFVKWTMFMYVTTNMLSITFCALCV ISLAMLLVKHKHLYLTMYIIPVLFTLLYNNYLWYKQTFRGYVYAWLSYYVPSVEYTYTDEVIYGMLLLIGMVFVTLRSI NHDLFSFIMFVGRVISVVSLWYMGSNLEEEILLMLASLFGTYTWTTALSMAAAKVIAKWVAVNVLYFTDIPQIKIVLVCY LFIGYIISCYWGLFSLMNSLFRMPLGVYNYKISVQELRYMNANGLRPPKNSFEALMLNFKLLGIGGVPIIEVSCFQSKLT DVKCANWLLNCLQHLHVASNSKLWQYCSTLHNEILATSDLGVAFEKLAQLLIVLFANPAAVDSKCLTSIEEVCDDYAKD NTVLQALQSEFVNMASFVEYEVAKKNLDEACSSGSANRQQLKQLEKACNIAKSAYERDRAVARKLERMADLALTNMYKEA RINDKKSKWSALQTMLFSMVRKLDNQALNSILDNAVKGCVPLNAIPSLAANTLTIIVPDKSVYDQWDNVYVTYAGNVW QIQTIQDSDGTNKQLNEISDDCNWPLVIIANRHNEVSATVLQNNSLMPAKLKTQWNSGPDQTCNTPTQCYYNNSYNGKI VYAILSDVDGLKYTKILKDDGNFWLELDPPCKFTVQDVKGLKIKYLYFVKGCNTLARGWVVGTISSTVRLQAGTATEYA SNSS TT.STiCAFSVDPKKTYLDFTQQGGTPT ANCVKMT.CRHAGTGMATTVKPDATTSQDSYGGASVCT YCRARVFHPDVDG LCKLRGKFVQVPVGIKDPVSYVLTHDVCQVCGFWRDGSCSCVSTDTTVQSKDTNFLNRVRGTSVDARLVPCASGLSTDVQ LRAFDICNASVAGIGLHLKVNCCRFQRVDENGDKLDQFFWKRTDLTIYNREMECYERVKDCKFVAEHDFFTFDVEGSRV PHIVRKDLTKYTMLDLCYA.LRHFDRNDCMLLCD1LSIYAGCEQSYFTKKDWYDFVENPD11NVYKKLGPIFNRALVSATE FADKLVEVGLVGILTLDNQDLNGKWYDFGDYVIAAPGCGVAIADSYYSYMMPMLTMCHALDCELYVNNAYRLFELVQYDF TDYKLELFWKYFKHWSMPYHPNTVDCQDDRCIIHCA.NFNILFSMVLPWFCFGPLVRQIFVDGVPFVVSIGYHYKELGIVM NMDVDTHRYRLSLKDLLLYAADPALHVASASALYDLRTCCFSVAAITSGVKFQTVKPGNFNQDFYDFILSKGLLKEGSSV DLKHFFFTQDGNAAITDYKYYKYNLPTMVDIKQLLFVLEVVYKYFEIYDGGCIPASQVIVNNYDKSAGYPFNKFGKARLY YEALSFEEQDEIYAYTKRKVLPTLTQMNLKYAISAKNRARTVAGVSILSTMTGRMFHQKCLKSIAATRGVPVVIGTTKFY GGWDDMLRRLIKDVDNPVLMGWDYPKCDRAMPNILRIVS SLVLARKHEACC SQSDRFYRLANECAQVLSEIVMCGGCYYV KPGGTSSGDATTAFANSVFNICQAVSANVCALMSCKGNKIEDLSIRALQKRLYSHVYRSDMVDSTFVTEYYEFLNKHFSM MILSDDGVVCYNSDYASKGYIANISAFQQVLYYQNKVFMSESKCWVENDINNGPHEFCSQHTMLVKMDGDDVYLPYPDPS RILGAGCFVDDLLKTDSVLLIERFVSLAIDAYPLVYHENEEYQKVFRVYLEYIKKLYNDLGNQILDSYSVILSTCDGQKF TDESFYKNMYLRSAVMQSVGACWCSSQTSLRCGSCIRKPLLCCKCCYDHVMATDHKYVLSVSPYVCNAPGCDVNDVTKL YLGGMSYYCEDHKPQYSFKLVMNGMVFGLYKQSCTGSPYIDDFNRIASCKWTDVDDYILANECTERLKLFAAETQKATEE AFKQSYASATIQEIVSERELILSWEIGKVKPPLNKKYVFTGYHFTKNGKTVLGEYVFDKSELTNGVYYRATTTYKLSVGD VFVLTSHSVA.NLSAPTLVPQENYS SIRFA.SVYSVLETFQNNVVNYQHIGMKRYCTVQGPPGTGKSHLA.IGLAVYYCTARV VYTAASHAAVDALCEKAYKFLNINDCTRIVPAKVRVECYDKFKINDTTRKYVFTTINALPEMVTDIWVDEVSMLTNYEL SVINARIRAKHYVYIGDPAQLPAPRVLLSKGTLEPKYFNTVTKLMCCLGPDIFLGTCYRCPKEIVDTVSALVYENKLKAK NESSSLCFKVYYKGVTTHESS SAVNMQQIYLINKFLKVWPLWHKAVFISPYNSQNFAAKRVLGLQTQTVDSAQGSEYDYV IYSQTAETAHSVI'TVNRFNVAITRAKKGILCVMSNMQLFEALQFTTLTVDKVPQAVETRVQCSTNLFKDCSKSYSGYHPAH APSFLAVDDKYKATGDLAVCLGIGDSAVTYSRLISLMGFKLDVTLDGYCKLFITKEEAVKRVRAWVGFDAEGAHATRDSI GTNFPLQLGFSTGIDFVVEATGLFADRDGYSFKKAVAKAPPGEQFKHLIPLMTRGQRWDWRPRIVQMFADHLIDLSDCV VLVTVíAANFELTCLRYFAKVGREISCNVCTKRATAYNSRTGYYGCWRHSVTCDYLYNPLIVDIQQWGYIGSLSSNHDLYC SVHKGAHVASSDAIMTRCLAVYDCFCNNINWNVEYPIISNELSINTSCRVLQRVMLKAAMLCNRYTLCYDIGNPKAIACV KDFDFKFYDAQPIVKSVKTLLYFFEAHKDSFKDGLCMFWNCNVDKYPPNAVVCRFDTRVLNNLNLPGCNGGñLYVNKHAF HTKPFSRAAFEHLKPMPFFYYSDTPCVYMDGMDAKQVDYVPLKSATCITRCNLGGAVCLKHAEEYREYLESYNTATTAGF TFWVYKTFDFYNLWNTFTKLQSLENWYNLVKTGHYTGQAGEMPCAIINDKWAKIDKEDVVIFINNTTYPTNVAVELFA KRSIRHHPELKLFRNLNIDVCWKHVIWDYARESIFCSNTYGVCMYTDLKFIDKLNVLFDGRDNGALEAFKRSNNGVYIST TKVKSLSMIRGPPRAELNGVWDKVGDTDCVFYFA.VRKEGQDVIFSQFDSLRVSSNQS PQGNLGSNEPGNVGGNDA.LATS TIFTQSRVISSFTCRTDMEKDFIALDQDVFIQKYGLEDYAFEHIVYGNFNQKIIGGLHLLIGLYRRQQTSNLVIQEFVSY DSS1HSYFITDEKSGGSKSVCTVIDILLDDFVALVKSLNLNCVSKVVNVNVDFKDFQFMLWCNDEKVMTFYPRLQAASDW KPGYSMPVLYKYLNSPMERVSLWNYGKPVTLPTGCMMNVAKYTQLCQYLNTTTLAVPVNMRVLHLGAGSEKGVAPGSAVL RQWLPAGTILVDNDLYPFVSDSVATYFGDCITLPFDCQWDLIISDMYDPITKNIGEYNVSKDGFFTYICHMIREKLALGG SVAIKITEFSWKAELYKLMGYFAFWTVFCTNANASSSEGFLIGINYLGKPKVEIDGNVMHANYLFWRNSTVWNGGAYSLF DMAKFPLKLAGTAVINLRADQINDMVYSLLEKGKLLVRDTNKEVFVGDSMVNVI
gen de 32 kDa (837 nucleótidos): SEQ ID NO: 13
ATGGCASTTGCTTATGCAAACAAGCCTAATCACTTTATTAATTTTCCACTTACCCAGTTTGAGGGTTTTGTGTTAAATTA TAAAGGTTTACAATTTCAACTTCTCGATGAAGGAGTGGATTGTAñAATACAAACAGCGCCGCACATTAGTCTTGTTATGC TGGATATTCAGCCTGAAGACTATAGAAGTGTFGATGTTGCTATTCAAGAAGTTATTGATGACATGCATTGGGGTGAGGGC TTTCAGATTAAATTTGATAACCCCCATATCCFAGGAAGATGCATAGTTTTAGATGTTAAAGGTGTAGAAGAATTGCATGA TGATTTAGTTAATTACATTCGTGATAAAGGTTGTGTTGCTGACCAATCCAGGAAATGGATTGGACATTGCACCATAGCCC AACTCACGGATGCTGCACTTTCCATTAAGGAAAATGTTGATTTCATAAACAGCATGCAATTCAATTATAAAATCACTATC
AACCCCTCATCACCGGCTAGACTTGAAATAGPTAAGCTTGGTGCTGAAAAGAAAGATGGTTTTTATGAAACCATAGTTAG CCACTGGATGGGAATTCGTTTTGAATATAATCCACCCACTGATAAGCTAGCTATGATTATGGGTTATTGTTGTTTAGAAG TGGTGCGTAAAGAGCTAGAAGAAGGTGATCTFCCCGAGAATGATGATGATGCTTGGTTTAAGCTArCGTACCATTATGAA AACAATTCTTGGTTCTTTCGACATGTCTACAGGAAAAGTTCTTATTTCCGTAAGTCTTGTCAAAATTTAGATTGTñATTG TTTGGGGTTTTATGAATCTCCAGTTGAAGAAGACTAA
proteína de 32 kDa (278 aminoácidos) SEQ ID NO: 14
MAVAYANKPNHFINFPLTQFEGFVLNYKGLQFQLLDEGVDCKIQTAPHISLVMLDIQPEDYRSVDVAIQEVIDDMHWGEG FQIKFDNPHILGRCIVLDVKGVEELHDDLVNYIRDKGCVADQSRKWIGHCTIAQLTDAALSIKENVDFINSMQFNYKITI NPSSPARLEIVKLGAEKKDGFYETIVSHWMGIRFEYNPPTDKLAMIMGYCCLEWRKELEEGDLPENDDDAWFKLSYHYE NNSWFFRHVYRKSSYFRKSCQNLDCNCLGFYESPVEED
gen precursor de la Hemaglutinina-esterasa (HE: 1275 nucleótidos) SEQ ID NO: 3 sin secuencia de señalización; SEQ ID NO: 23 con la secuencia de señalización; la secuencia de señalización está en negrita:
ATGTTTTTGCTTCTTAGATTTGTTCTAGTTAGCTGCATAATTGGTAGCCTAGGTTTTGATAACCCTCCTACCAATGTTGT TTCGCATTTAAATGGAGATTGGTTTTTATTTGGTGACAGTCGTTCAGATTGTAATCATGTTGTTAATACCAACCCCCGTA ATTATTCTTATATGGACCTTAATCCTGCCCTGTGTGATTCTGGTAAAATATCATCTAAAGCTGGCAACTCCATTTTTAGG AGTTTTCACTTTACCGATTTTTATAATTACACAGGCGAAGGTCAACAAATTATTTTTTATGAGGGTGTTAATTTTACGCC TTATCATGCCTTTAAATGCACCACTTCTGGTAGTAATGATATTTGGATGCAGAATAAAGGCTTGTTTTACACTCAGGTTT ATAAGAATATGGCTGTGTATCGCAGCCTTACTTTTGTTAATGTACCATATGTTTATAATGGCTCTGCACAATCTACAGCT CTTTGTAAATCTGGTAGTTTAGTTCTTAATAACCCTGCATATATAGCTCGTGAAGCTAATTTTGGGGATTATTATTATAA GGTTGAAGCTGACTTTTATTTGTCAGGTTGTGACGAGTATATCGTACCACTTTGTATTTTTAACGGCAAGTTTTTGTCGA ATACAAAGTATTATGATGATAGTCAATATTATTTTAATAAAGACACTGGTGTTATTTATGGTCTCAATTCTACTGAAACC ATTACCACTGGTTTTGATTTTAATTGTCATTATTTAGTTTTACCCTCTGGTAATTATTTAGCCATTTCAAATGAGCTATT GTTAACTGTTCCTACGAAAGCAATCTGTCTTAACAAGCGTAAGGATTTTACGCCTGTACAGGTTGTTGATTCACGGTGGA ACAATGCCAGGCAGTCTGATAACATGACGGCGGTTGCTTGTCAACCCCCGTACTGTTATTTTCGTAATTCTACTACCAAC TATGTTGGTGTTTATGATATCAATCATGGGGATGCTGGTTTTACTAGCATACTCAGTGGTTTGTTATATGATTCACCTTG TTTTTCGCAGCAAGGTGTTTTTAGGTATGATAATGTTAGCAGTGTCTGGCCTCTCTATTCCTATGGCAGATGCCCTACTG CTGCTGGTATTAATACCCCTGATGTACCTATTTGTGTGTATGATCCGCTACCACTTATTTTGCTTGGCATCCTTTTGGGT GTTGCGGTCATAATTATTGTAGTTTTGTTGTTATATTTTATGGTGGATAATGGTACTAGGCTGCATGATGCTTAG
proteína precursora de la Hemaglutinina-esterasa (HE: 424 aminoácidos) SEQ ID NO: 4 sin secuencia de señalización; SEQ ID NO: 24 con la secuencia de señalización; la secuencia de señalización está en negrita:
MFLLLRFVLVSCIIGSLGFDNPPTNWSHLNGDWFLFGDSRSDCNHWNTNPRNYSYMDLNPALCDSGKISSKAGNSIFR SFHFTDFYNYTGEGQQIIFYEGVNFTPYHAFKCTTSGSNDIWMQNKGLFYTQVYKNMAVYRSLTFVNVPYVYNGSAQSTA LCKSGSLiVLNN PAY 1AREANEGDY Y YKVEADFYLSGCDE Y i VPLC IFNGKELSNI'KY YDDSQY Y FNKDTGVi YGLNSTET ITTGFDFNCHYLVLPSGNYLAISNELLLTVPTKAICLNKRKDFTPVQVVDSRWNNARQSDNMTAVACQPFYCYFRNSTTN YVGVYDINHGDAGFTSILSGLLYDSPCFSQQGVFRYDNVSSVWPLYSYGRCPTAAGINTPDVPICVYDPLPLILLGILLG V A V I I I W L L L YFMVDNGTRLHDA
Gen precursor de la proteína espicular (4092 nucleótidos) SEQ ID NO: 1 sin secuencia de señalización; SEQ ID NO: 21 con la secuencia de señalización; la secuencia de señalización está en negrita: ATGTTTTTGATACTTTTñATTTCCTTACCAArGGCTTTTGCTGTTATAGGAGATTTAAAGTGTACTACGGTTGCCATTAA TGATGTTGACACCGGTCCTCCTTCTATTAGCACTGATATTGTCGATGTTACTAATGGTTTAGGTACTTATTATGTTTTAG ATCGTGTGTATTTAAATACTACGTTGTTGCTTAATGGTTACTACCCTACTTCAGGTTCTACATATCGTAATATGGCACTG AAGGGAACTTTACTATTGAGCAGACTATGGTTTAAACCACCTTTTCTTTCTGATTTTATTAATGGGATTTTTGCTAAGGT CAAAAATACCAAGGGTATTAAAAAGGGTGTAATGTATAGTGAGTTTCCTGCTATAACTATAGGTAGTACTTTTGTAAATA CATCCTATAGTGTGGTAGTACZvACCACATACTACCAATTTGGATAATAAATTACAAGGTCTCTTAGAGATCTCTGTTTGC CAGTATACTATGTGCGAGTACCCACATACGATT TGTCATCCTAAT CTGGGTAATCGACGCG i'AGAAC TATGGCATTGGGA TACAGGTGTTGTTTCCTGTTTATATAAGCGTAATTTCACATATGATGTGAATGCTGATTACTTGTATTTCCATTTTTArC AAGAAGGTGGTACTTTTTATGCATATTTTACAGACACTGGTGTTGTTACTAAGTTTCTGTTTAATGTTTATTTAGGCACG GTGCTTTCACATTAGTATGTCCTGCCTTTGACTTGTTCTAGTGCTATGACTTTAGAATATTGGGTTACACCTCTCACTrC TAAACAATATTTACGAGCTTTCAATCAAGATGGTGTTATTTTTAATGCTGTTGATTGTAAGAGTGATTTTATGAGTGAGA TTAAGTGTAAAACACTATCTATAGCACCATCTACTGGTGTTTATGAATTAAACGGTTACACTGTTCAGCCAATTGCAGAT GTTTACCGACGTATACCTAATCTTCCCGATTGTAATATAGA.GGCTTGGCTTAATGATAAGTCGGTGCCCTCTCCATTAAA TTGGGAACGTAAGACCTTTTCAAATTGTAATTTTAATATGAGCAGCCTGATGTCTTTTATTCAGGCAGACTCATTTACTT GTAATAATATTGATGCTGCTAAGATATATGGTATGTGTTTTTCCAGCATAACTATAGATAAGTTTGCTATACCCAATGGT AGGAAGGTTGACCTACAATTGGGCAATTTGGGCTATTTGCAGTCTTTTAACTATAGAATTGATACTACTGCTACAAGTTG TCAGTTGTATTATAATTTACCTGCTGCTAATGTTTCTGTTAGCAGGTTTAATCCTTCTACTIGGAATAGGAGATTTGGrT TTACAGAACAATCTGTTTTTAAGCCTCAACCTGCAGGTGTTTTTACTCATCATGATGTTGTTTATGCACAACATTGTTrT AAAGCTCCCACAAATTTCTGTCCGTGTAAATTGGATGGGTCTTTGTGTGTAGGTAATGGTCCTGGTATAGATGCTGGTTA TAAAAATAGTGGTATAGGCACTTGTCCTGCAGGTACTAATTATTTAACTTGCCATAATGCTGCCCAATGTGATTGTTTGT GCACT CCCGACCCCATTACATC TAAATCTACAGGGCCTTACAAGTGCC CCCAAACTAAATAC TTAGT TGGCATAGGTGAG CACTÜTTCGGGTCTTGCTATTAAAAGTGATTATTGTGGAGGTAATCCTTGTACTTGCCAACCACAAGCATTTTTGGGTIG GTCTGCTGACTCTTGTTTACAAGGGGATAGGTGTAATATTTTTGCTAATTTTATTTTTCATGATGTTAATAGTGGTACrA CTTGTTCTACTGATGTACAAAAATCAAACACAGACATAATTCTTGGTGTTTGTGTTAATTATGATCTTTATGGTATTArA GGCCAAGGTGTTTTTGTTGAGGTTAATGCGACTTATTATAATAGTTGGCAGAACCTTTTATATGATTCTAATGGTAATCT CTATGGTTTTAGAGACTACTTAACAAACAGAACTTTTATGATTCGTAGTTGCTATAGCGGTCGTGTTTCAGCGGCCTTTC ATGCTAACTCTTCCGAACCAGCArTGCTATTTCGGAATATTAAATGCAATTACGTTTTTAATAATATTCTTTCACGACAG CTGCAACCTATTAACTATTTTGArAGTTATCTTGGTTGTGTTGTCAATGCTGATAATAGTACTTCTAGTGTTGTTCAAAC ATGTGATCTCACAGTAGGTAGTGGTTACTGTGTGGATTACTCTACAAAAAGACGAAGTCGTAGAGCGATTACCACTGGTT ATCGGTTTACTAATTTTGAGCCArTTACTGTTAATTCAGTAAATGATAGTTTAGAACCTGTAGGTGGTTTGTATGAAATT CAAATACCTTCAGAGTTTACTATAGGTAATATGGAGGAGTTTATTCAAACAAGCTCTCCTAAAGTTACTATTGATTGTTC TGCTTTTGTCTGTGGTGATTATGCAGCATGTAAATCACAGTTGGTTGAATATGGTAGCTTCTGTGACAATATTAATGCTA TACTCACAGAAGTAAATGAACTACTTGACACTACACAGTTGCAAGTAGCTAATAGTTTAATGAATGGTGTCACTCTTAGC ACTAAGCTTAAAGATGGCGTTAArTTCAATGTAGACGACATCAATTTTTCCCCTGTArTAGGTTGTTTAGGAAGCGGTTG TAATAAAGGTTCCAGTAGATCTGCTATAGAGGATTTACTTTTTTCTAAAGTAAAGTTATCTGATGTCGGTTTCGTTGAGG CTTATAATAATTGTACTGGAGGTGCCGAAATTAGGGACCTCATTTGTGTGCAAAGTTATAATGGTATCAAAGTGTTGCCT CCACTGCTCTCAGTAAATCAGATCAGTGGATACACTTTGGCTGCCACCTCTGCTAGTCTGTTTCCTCCTTGGTCAGCAGC AGCAGGrGTACCATTTTATTTAAATGTTCAGTATCGTATTAATGGGCTTGGTGTTACCATGGATGTGTTAAGTCAAAATC AAAAGCrTATTGCTAATGCATTTAACAATGCTCTTGATGCTATTCAGGAAGGGTTTGATGCTACCAATTCTGCTTTAGTT AAAATTCAAGCTGTTGTTAATGCAAATGCTGAAGCTCTTAATAACTTATTGCAACAACTCTCTAATAGATTTGGTGCTAT AAGTTCrTCTTTACAAGAAATTCTATCTAGACTGGATGCTCTTGAAGCGCAAGCTCAGATAGACAGACTTATTAATGGGC GTCTTACCGCTCTTAATGCTTATGTTTCTCAACAGCTTAGTGATTCTACACTAGTAAAATTTAGTGCAGCACAAGCTATG GAGAAGGTTAATGAATGTGTCAAAAGCCAATCATCTAGGATAAATTTTTGTGGTAATGGTAATCATATTATATCATTAGT GCAGAArGCTCCATATGGTTTGTATTTTATCCACTTTAGCTATGTCCCTACTAAGTArGTCACTGCGAAGGTTAGTCCCG GTCTGTGCATTGCTGGTGATAGAGGTATAGCCCCTAAGAGTGGTTATTTTGTTAATGTAAATAATACTTGGATGTTCACT GGTAGTGGTTATTACTACCCTGAACCCATAACTGGAAATAATGTTGTTGTTATGAGTACCTGTGCTGTTAACTATACTAA AGCGCCGGATGTAATGCTGAACArTTCAACACCCAACCTCCATGATTTTAAGGAAGAGTTGGATCAATGGTTTAAAAACC AAACATCAGTGGCACCAGATTTGTCACTTGATTATATAAATGTTACATTCTTGGACCTACAAGATGAAATGAATAGGTTA CAGGAGGCAATAAAAGTTTTAAArCAGAGCTACATCAATCTCAAGGACATTGGTACATATGAGTATTATGTAAAATGGCC TTGGTATGTATGGCTTTTAATTGGCTTTGCTGGTGTAGCTATGCTTGTTTTACTATTCTTCATATGCTGTTGTACAGGAT GTGGGACTAGTTGTTTTAAGATArGTGGTGGTTGTTGTGATGATTATACTGGACACCAGGAGTTAGTAATTAAAACATTA CATGACGACTAA
Proteína precursora de la proteína espicular (1363 aminoácidos) SEQ ID NO: 2 sin secuencia de señalización; SEQ ID NO: 22 con la secuencia de señalización; la secuencia de señalización está en negrita:
MFLILLISLPMAFAVIGDLKCTTVAINDVDTGPPSISTDIVDVTNGLGTYYVLDRVYLNTTLLLNGYYPTSGSTYRNMAL KGTLLLSRLWFKPPFLSDFINGIFAKVKNTKVIKKGVMYSEFPAITIGSTFVNTSYSVWQPHTTNLDNKLQGLLEISVC QYTMCEYPHT’ICHPNLGNRRVELWHWDTGVVSCLYKRNFTYDVNADYLYFHFYQEGGTFYAYFTDTGWTKFLFNVYLGT VLSHYYVLPLTCSSAMTLEYWVTPLTSKQYLLAFNQDGVIFNAVDCKSDFMSEIKCKTLSIAPSTGVYELNGYTVQPIAD VYRRIPNLPDCNIEAWLNDKSVPSPLNWERKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKIYGMCFSSITIDKFAIPNG RKVDLQLGNLGYLQSFNYRIDTTATSCQLYYNLPAANVSVSRFNPSTWNRRFGFTEQSVFKPQPAGVFTHHDWYAQHCF KAPTNFCPCKLDGSLCVGNGPGIDAGYKNSGIGTCPAGTNYLTCHNAAQCDCLCTPDPITSKSTGPYKCPQTKYLVGIGE HCSGLAIKSDYCGGNPCTCQPQAFLGWSADSCLQGDRCNIFANFIFHDVNSGTTCSTDLQKSNTDIILGVCVNYDLYGII GQGVFVEVNATYYNSWQNLLYDSNGNLYGFRDYLTNRTFMIRSCYSGRVSAAFHANSSEPALLFRNIKCNYVFNNILSRQ LQPINYFDSYLGCWNADNSTSSVVQTCDLTVGSGYCVDYSTKRRSRRAITTGYRFTNFEPFTVNSVNDSLEPVGGLYEI QIPSEFTIGNMEEFIQTSSPKVTIDCSAFVCGDYAACKSQLVEYGSFCDNINAILTEVNELLDTTQLQVANSLMNGVTLS TKLKDGVNFNVDDINFSPVLGCLGSGCNKGSSRSAIEDLLFSKVKLSDVGFVEAYNNCTGGAEIRDLICVQSYNGIKVLP PLLSVNQISGYTLAATSASLFPPWSAAAGVPFYLNVQYRINGLGVTMDVLSQNQKLIANAFNNALDAIQEGFDATNSALV KIQAVVNANAEALNNLLQQLSNRFGAISSSLQEILSRLDALEAQAQIDRLINGRLTALNAYVSQQLSDSTLVKFSAAQAM EKVNECVKSQSSRIKFCGNGNHIISLVQNAPYGLYFIHFSYVPTKYVTAKVSPGLCIAGDRGIAPKSGYFVNVNNTWMFT GSGYYYPEPITGNNVWMSTCAVNYTKAPDVMLNISTPNLHDFKEELDQWFKNQTSVAPDLSLDYINVTFLDLQDEMNRL QEAIKVLNQSYINLKDIGTYEYYVKWPWYVWLLIGFAGVAMLVLLFFICCCTGCGTSCFKICGGCCDDYTGHQE1VIKTL HDD
gen de 4,9 kDA (132 nucleótidos) SEQ ID NO: 15
ATGACGACTAAGTTCGTCTTTGATTTATTGGCTCCTGACGATATATTACATCCCTTCAATCATGTGAAGCTAATTATAAG ACCCATTGAGGTCGAGCATATTATAATAGCTACCACAATGCCTGCTGTTTAG
proteína de 4,9 kDA (43 aminoácidos) SEQ ID NO: 16
MTTKFVFDLLAPDDILHPFNHVKLNRPIEVEHINATTMPAV
gen de 4,8 kDA (138 nucleótidos) SEQ ID NO: 17
ATGCCAATGGCTACAACCATTC-ACGGTACAGATTATACTAATATTATGCCTAGTACTGTTTCTACAACAGTTTATTTAGG CTGTTCTATAGGTATTGACACTAGCACCACTGGTTTTACCTGTTTTTCACGGTACTAG
proteína de 4,8 kDA (45 aminoácidos) SEQ ID NO: 18
MPMATTIDGTDYTNIMPSTVSTTVYLGCSIGIDTSTTGFTCFSRY
gen de 12,7 kDa (330 nucleótidos) SEQ ID NO: 19
ATGGACATCFGGAGACCTGAGATTAAATATCTCCGTTATATTAACGGTTTTAATGTCTCAGAATTAGAAGATGCTTGTTT TAAATTTAACTATAAATTTCCTAAAGTAGGATATTGTAGAGTTCCTAGTCATGCTTGGTGCCGTAATCAAGGTAGCTTTT GTGCTACACFCACTCTTTATGGCAAATCCAAACAT'TATGATAAATATTTTGGAGTAATAACTGGTTTTACAGCATTCGCT
AATACTGTAGAGGAGGCTGTTAACAAACTGGTTTTCTTAGCTGTTGACTTTATTACCTGGCGGAGACAGGAGTTAAATGT TTATGGCTGA
proteína de 12,7 kDa (109 aminoácidos) SEQ ID NO: 20
MDIWRPEIKYLRYINGFNVSELEDACFKFNYKFPKVGYCRVPSHAWCRNQGSFCATLTLYGKSKHYDKYFGVITGFTAFA NTVEEAVNKLVFLAVDFITWRRQELNVYG
Proteína de envoltura pequeña (gen E) (255 nucleótidos) SEQ ID NO: 7
ATGTTTATGGCTGATGCTTATTTTGCAGACACTGTGTGGTATGTGGGGCAAATAATTTTTATAGTTGCCATTTGTTTArT GGTTATAATAGTTGTAGTGGCATTTTTGGCAACTTTTAAATTGTGTATTCAACTTTGCGGTATGTGTAATACCTTAGTAC TGTCCCCTTCTATTTATGTGTTTAATAGAGGGAGGCAGTTTTATGAGTGTTACAACGATGTAAAACCACCAGTTCTTGAT
G T G G A T G A C G TT TA G
Proteína de envoltura pequeña (gen E) (84 aminoácidos) SEQ ID NO: 8
MFMADAYFADTVWYVGQIIFIVAICLLVIIVVVAFLATFKLCIQLCGMCNTLVLSPSIYVFNRGRQFYEFYNDVKPPVLD VDDV
Proteína de envoltura de múltiples segmentos (gen M) (693 nucleótidos) SEQ ID NO: 5
ATGAGTAGTGTAACTACACCAGCACCAGTTTACACCTGGACTGCTGATGAAGCTATTAAATTCCTAAAGGAATGGAACTT TTCTTTGGGTATTATACTACTTTTTATTACAATCATATTGCAATTTGGATATACAAGTCGCAGTATGTTTGTTTATGTTA TTAAGATGATCATTTTGTGGCTTATGTGGCCCCTTACTATCATCTTAACTATTTTCAATTGCGTGTATGCGTTGAATAAT GTGTATCTTGGCTTTTCTATAGTTTTCACTATAGTGGCCATTATC.ATGTGGATTGTGTATTTTGTGAATAGTATCAGGTT GTTTATTAGAACTGGAAGTTGGTGGAGTTTCAACCCAGAAACAAACAACTrGATGTGTATAGATATGAAGGGAAGGATGT ATGTTAGGCCGATAATTGAGGACTACCATACCCTTACGGTCACAATAATACGTGGTCAFCTTTACATGCAAGGTATAAAA CTAGGTACTGGCTATTCTTTGTCAGATTTGCCAGCTTATGTGACTGTTGCrAAGGTCTCACACCTGCTCACGTATAAGCG TGGTTTTCTTGACAAGATAGGCGATACTAGTGGTTTTGCTGTTTATGTTAAGTCCAAAGTCGGTAATTACCGACTGCCAT CAACCCAAAAGGGTTCTGGCATGGACACCGCATTGTTGAGAAATATAATCTAA
Proteína de envoltura de múltiples segmentos (gen M) (230 aminoácidos) SEQ ID NO: 6
MSSVTTPAPVYTWTADEAIKFLKEWNFSLGIILLFITIILQFGYTSRSMFVYVIKMIILWLMWPLTIILTIFNCVYALNN VYLGFSIVFTIVAIIMWIVYFVNSIRLFIRTGSWWSFNPETNNLMCIDMKGRMYVRPIIEDYHTLTVTIIRGHLYMQGIK LGTGYSLSDLPAYVTVAKVSHLLTYKRGFLDKIGDTSGFAVYVKSKVGNYRLPSTQKGSGMDTALLRNII
Proteína de la nucleocápsida (gen N) (1347 nucleótidos) SEQ ID NO: 9
ATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCAATCCAGTAGTAGAGCGTCCTCTGGAAATCGTTCTGGTAATGGCATCCTTAAGTGGGC CGATCAGTCCGACCAATCTAGAAATGTTCAAACCAGGGGTAGAAGAGCGCAACCCAAGCAAACTGCTACTTCTCAGCTAC CATCAG3AGGGAATGTTGTACCCTACTATTCTTGGTTCTCTGGAATTACTCAGTTTCAAAAAGGAAAGGAGTTTGAATTT GCAGAGGGACAAGGTGTGCCTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACTGAAGCTAAGGGGTACTGGTACAGACACAACAGACG TTCTTTTAAAACAGCCGATGGCAACCAGCGTCAACTGCTGCCACGATGGTATTTTTACTATCTTGGAACAGGACCGCATG CCAAAGACCAGTATGGCACCGATATTGACGGTGTCTTCTGGGTCGCTAGTAACCAGGCTGATGTCAATACCCCGGCTGAC ATTCTCGATCGGGACCCAAGTAGCGATGAGGCTATTCCGACTAGGTTTCCGCCTGGCACGGrACTCCCTCAGGGTTACTA TATTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTCCTAATTCCAGATCTACTTCACGCGCATCCAGTAGAGCCTCTAGTGCAGGATCGC GTAGTA3AGCCAATTCTGGCAACAGAACCCCTACCTCTGGTGTAACACCTGATATGGCTGATCAAATTGCTAGTCTTGTT CTGGCAAAACTTGGCAAGGATGCCACTAAGCCACAGCAAGTAACTAAGCAGACTGCCAAAGAAATCAGACAGAAAATTTT GAATAAGCCCCGCCAGAAGAGGAGCCCCAATAAACAATGCACTGTTCAGCAGTGTTTTGGGAAGAGAGGCCCCAATCAGA ATTTTGGTGGTGGAGAAATGTTAAAACTTGGAACTAGTGACCCACAGTTCCCCATTCTTGCAGAACTCGCACCCACAGCT GGTGCGTTTTTCTTTGGATCAAGATTAGAGTTGGCCAAAGTGCAGAATTTGTCTGGGAATCTTGACGAGCCCCAGAAGGA TGTTTATGAATTGCGCTATAATGGTGCAATTAGATTTGACAGTACACTTTCAGGTTTTGAGACCATAATGAAGGTGTTGA ATGAGAATTTGAATGCATATCAACAACAAGATGGTATGATGAATATGAGTCCAAAACCACAGCGTCAGCGTGGTCAGAAG AATGGACAAGGAGAAAATGATAATATAAGTGTTGCAGCGCCTAAAAGCCGTGTGCAGCAAAATAAGAGTAGAGAGTTGAC TGCAGA3GACATCAGCCTTCTTAAGAAGATGGATGAGCCCTATACTGAAGACACCTCAGAAATATAA
Proteína de la nucleocápsida (gen N) (448 aminoácidos) SEQ ID NO: 10 MSFTPGKQSSSRASSGNRSGNGILKWADQSDQSRNVQTRGRRAQPKQTATSQLPSGGNWPYYSWFSGITQFQKGKEFEF AEGQGVPIAPGVPATEAKGYWYRHNRRSFKTADGWQRQLLPRÍJYFYYLGTGPHAKDQYGTDIDGVFWVASNQADVNTPAD
ILDRDPSSDEAIPTRFPPGTVLPQGYYIEGSGRSAPNSRSTSRASSRASSAGSRSRANSGNRYPTSGVTPDMADQIASLV
LAKLGKDATKPQQVTKQTAKEIRQKILNKPRQKRSPNKQCTVQQCFGKRGPNQNFGGGEMLKLGTSDPQFPILAELAPTA
GAFFFGSRLELAKVQNLSGNLEEPQKDVYELRYNGAIRFDSTLSGFETIMKVLNENLNAYQQQDGMMNMSPKPQRQRGQK NGQGENDNISVAAPKSRVQQNKSRELTAEDISLLKKMDEPYTEDTSEI
Ejemplo 3
DETECCIÓN DE CORONAVIRUS BOVINO EN TEJIDOS RESPIRATORIOS Y ENTÉRICOS
Se llevó a cabo un estudio utilizando diecinueve (19) terneros privados de calostro, de tres a cuatro días de edad. Dos (2) de los terneros se sometieron a necropsia antes del estímulo para recoger los tejidos del control negativo. El mismo día, los diecisiete (17) terneros restantes fueron estimulados por la ruta oral es intranasal con la cepa MN-1988 virulenta de BCV. Los terneros fueron estimulados de nuevo al siguiente día con la misma dosis de virus de estímulo, pero solo por la ruta intranasal. Se observaron los terneros diariamente, para determinar los signos clínicos asociados con la infección de BCV. Se recogieron diariamente hisopos nasales y fecales, y se recogieron muestras de sangre para serología antes del estímulo y en el día de la necropsia. En cada uno de los días del estudio 4, 6, 8, 11, y 13 después del estímulo, los terneros seleccionados se sometieron a eutanasia y se llevó a cabo la necropsia. Se examinaron los terneros para determinar la patología grave, y se recogieron los tejidos respiratorios y entéricos. Los tejidos se enviaron a un laboratorio independiente para la realizar la histopatología y la inmunohistoquímica (IHC) y para ensayar la PCR cuantitativa en tiempo real para la determinación de la presencia del BCV.
Se observaron secreciones nasales moderadas y graves en 13 de los 17 terneros después del estímulo con BCV. El período máximo de la enfermedad era en tres a ocho días después del estímulo, y se detectó BCV en los hisopos nasales durante este período máximo de signos clínicos. Se detectó BCV mediante la PCR en los tejidos respiratorios superiores de los cornetes, tráquea, la amígdala, los bronquios, y los ganglios linfáticos bronquiales de 12 de 17 terneros después del estímulo, pero se detectó en tejidos pulmonares de solo 4 de los 17 terneros. El periodo máximo de detección del BCV en tejidos respiratorios fue de cuatro a seis días después del estímulo, pero no se detectó BCV después del día ocho. Se observaron lesiones e histopatologías graves menores en tejidos respiratorios de 7 de 17 terneros, pero el tejido respiratorio de solo uno de estos 7 terneros fue IHC positivo para BCV. Se observó diarrea moderada y grave en 11 de 17 terneros en los días tres a seis después del estímulo. Se detectó BCV mediante la PCR en hisopos fecales y tejidos intestinales durante estos mismos días y persistió en

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un coronavirus de bovino atenuado (BCoV) que codifica uno o más de los siguientes:
- una proteína espicular que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,
- una glicoproteína de hemaglutinina-esterasa (HE) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,
- una proteína de membrana integral (M) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o - una proteína de la nucleocápsida (N) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
2. El BCoV atenuado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el BCoV es un aislado que tiene el número de depósito PTA-121515 de la ATCC o la progenie o los derivados del mismo.
3. Una vacuna que comprende el BCoV de las reivindicaciones 1 o 2.
4. La vacuna de la reivindicación 3, en la que el BCoV está vivo.
5. La vacuna de las reivindicaciones 3 o 4, que se almacena congelada de forma previa a la descongelación antes de su uso.
6. La vacuna de las reivindicaciones 3 o 4, que se almacena liofilizada antes de la rehidratación.
7. La vacuna de las reivindicaciones 3 o 4, que se almacena como vacuna líquida estable.
8. La vacuna de las reivindicaciones 3, 4, 5, 6 o 7, que comprende además uno o más virus adicionales seleccionados entre el grupo que consiste en un virus de la diarrea vírica de bovino (BVDV), virus de la rinotraqueitis infecciosa de bovino (IBR), virus paragripal de tipo 3 (PI3), virus sincitial respiratorio de bovino (BRSV), virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) y cualquier combinación de los mismos.
9. La vacuna de la reivindicación 8 en la que dichos uno o más de los virus adicionales son un BVDV seleccionado entre el grupo que consiste en BVDV1, BVDV2 y la combinación de BVDV1 y BVDV2.
10. La vacuna de las reivindicaciones 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9, que comprende además una o más bacterias seleccionadas entre el grupo que consiste en una Pasteurella multocida, una Mannheimia haemolytica, una Histophilus somni, un Mycoplasma bovis y cualquier combinación de las mismas.
11. Un coronavirus de bovino atenuado (BCoV) de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 para su uso como vacuna para ayudar a la prevención de la enfermedad respiratoria producida por BCoV, en la prevención de la enfermedad entérica producida por BCoV o en la prevención tanto de la enfermedad respiratoria como de la enfermedad entérica producidas por BCoV.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2694558C1 (ru) * 2018-01-16 2019-07-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота
RU2694499C1 (ru) * 2018-01-16 2019-07-15 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
KR102089655B1 (ko) * 2018-08-17 2020-03-16 전남대학교 산학협력단 소 코로나바이러스 감염증 예방용 kwd20v-102 주의 약독화 생백신 조성물
WO2021045870A1 (en) * 2019-09-06 2021-03-11 Iowa State University Research Foundation, Inc. Mirtazapine as a pre-shipping inhibitor of bovine respiratory disease
RU2741887C1 (ru) * 2020-08-11 2021-01-29 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов
RU2740097C1 (ru) * 2020-08-11 2021-01-11 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов
JP2024502837A (ja) * 2021-01-14 2024-01-23 ラファエル ポール ヴィスシディ， 高病原性コロナウイルスに対する細胞傷害性ｔ細胞免疫療法
WO2023038961A2 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 La Jolla Institute For Immunology Common cold coronavirus t cell epitopes, methods and uses thereof
GB2624391A (en) * 2022-11-15 2024-05-22 Univ Cape Town Recombinant LSDV vectored bovine coronavirus antigen constructs
CN116559439A (zh) * 2023-04-24 2023-08-08 江苏省农业科学院 一种牛冠状病毒间接elisa抗体检测试剂盒及应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3873422A (en) * 1972-10-30 1975-03-25 Univ Nebraska Vaccine for neonatal calf diarrhea
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
SE8405493D0 (sv) 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
WO1998040097A2 (en) 1997-03-10 1998-09-17 Bayer Corporation Bovine respiratory and enteric coronavirus as a vaccine
ATE344326T1 (de) 1997-09-25 2006-11-15 Biotechnology Res & Dev Lkta deletionsmutanten in p. haemolytica
US6974577B2 (en) 2001-02-04 2005-12-13 Novartris Ag Inactivated bovine scours vaccines, processes and method of preventing bovine scours
CA2530779C (en) 2003-07-02 2012-06-05 Biotechnology Research And Development Corporation Acapsular p. multocida hyae deletion mutants
EP1533370A1 (en) * 2003-11-18 2005-05-25 ViroNovative B.V. Novel atypical pneumonia-causing virus
US8440203B2 (en) 2009-11-06 2013-05-14 Intervet Inc. Methods of immunizing pregnant heifers at three months of gestation
DK3269386T3 (da) * 2011-12-06 2022-10-24 Valneva Austria Gmbh Aluminiumforbindelser til anvendelse inden for behandling og i vacciner
US9480739B2 (en) 2013-03-15 2016-11-01 Intervet Inc. Bovine virus vaccines that are liquid stable
US9393298B2 (en) 2013-03-15 2016-07-19 Intervet Inc. Liquid stable bovine virus vaccines

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