BR112017003462B1 - Coronavírus bovino atenuado e vacina - Google Patents

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Abstract

CORONAVÍRUS BOVINO ATENUADO, VACINA, E, MÉTODO DE VACINAÇÃO DE UM BOVINO. A presente invenção descreve novos isolados de coronavírus bovino atenuado, composições compreendendo esses isolados, e métodos de uso de tais composições em vacinas, incluindo em vacinas vivas. A presente invenção descreve adicionalmente a administração de tais vacinas, incluindo a administração intranasal de tais vacinas, para auxiliar na prevenção de doença respiratória causada por coronavírus bovino.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) de pedidos provisórios número de série U.S. 62/045.183 depositado em 3 de setembro de 2014, e número de série U.S. 62/073.263 depositado em 31 de outubro de 2014, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a novos isolados de coronavírus bovino atenuado, a composições compreendendo esses isolados, e a métodos de uso de tais composições em vacinas, incluindo em vacinas vivas que ajudam na proteção contra doenças respiratórias causadas por coronavírus. A presente invenção refere-se adicionalmente à administração de tais vacinas, incluindo a administração intranasal de tais vacinas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] Um membro da família CORONAVIRIDAE, ordem NIDOVIRALES e gênero CORONAVIRUS, de coronavírus bovino (BCoV) é um vírus de RNA senso positivo, envelopado, de fita única, não segmentado, que codifica: (i) uma proteína espicular (proteína S), que é uma glicoproteína de superfície grande que compreende um domínio S1 e uma domínio S2; (ii) uma proteína hemaglutinina-esterase (HE), (iii) uma proteína de membrana integral (M); (iv) uma proteína de membrana pequena (E); e (v) uma proteína de nucleocapsídeo (N) [Fulton ET AL., VACINA 31:886-892 (2013)]. BCoV foi inicialmente associado com uma doença entérica neonatal em bezerros, assim como disenteria de inverno em gado adulto [Fulton ET AL., VACINA 31:886-892 (2013)]. Subsequentemente, BCoV foi implicado em infecções respiratórias tanto em bezerros recentemente desmamados como em bezerros confinados [Plummer ET AL., JAVMA 225(5):726-731 (2004)]. Consequentemente, BCoV foi verificado como sendo um vírus pneumoentérico que pode infectar o intestino e o trato respiratório superior e inferior do gado bovino, com o coronavírus entérico bovino e o coronavírus respiratório bovino sendo relatados como compreendendo apenas pequenas diferenças genéticas. De modo consistente, existe uma ausência de quaisquer marcadores antigênicos ou genéticos consistentes que distinguem os isolados de BCoV de acordo com suas diferentes síndromes clínicas, bem como um relato de um elevado nível de proteção cruzada entre coronavírus entérico bovino e isolados de coronavírus respiratório bovino após um desafio in vivo [Saif, Vet.Clin.North Am Food Anim Pract. 210(26):349-364 (2010)].
[004] Além disso, existe um número significante de outros vírus e bactérias que podem infectar o gado. Vírus incluem vírus de diarreia viral bovina tipos 1 e 2, (BVDV1 ou, alternativamente, BVD1; e BVDV2 ou, alternativamente, BVD2), vírus da rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR), vírus de parainfluenza tipo 3 (PI3), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV), e vírus da febre do vale rift (RVFV). As bactérias que podem infectar gado incluem Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, e Mycoplasma bovis.
[005] É agora amplamente aceito que o melhor modo de prevenir doenças devido às infecções bacterianas ou virais em bovinos consiste em vacinar os mesmos contra esses patógenos. Além disso, vacina de vírus ou bactérias vivas atenuadas multivalentes podem ser administradas com segurança as quais limitam o número de injeções de vacina necessárias. Consequentemente, vacinas de vírus vivos multivalentes, que protegem contra BVDV1 e BVDV2, IBR, PI3 e/ou BRSV são comercialmente disponíveis. Surpreendentemente, no entanto, até agora, nenhuma vacina comercial continha um coronavirus bovino vivo atenuado que tenha demonstrado auxiliar na proteção contra doença respiratória e doença entérica causadas por coronavírus. Portanto, permanece uma necessidade de se obter um coronavirus bovino apropriado para uma vacina (ou vacina multivalente) para ajudar na proteção de bezerros e gado contra as infecções respiratórias e infecções entéricas devido ao BCoV.
[006] A citação de qualquer referência aqui não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como "técnica anterior" ao presente pedido.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] A presente invenção fornece coronavírus bovinos atenuados (BCoV). Em determinadas modalidades, o BCoV atenuado codifica uma ou mais das seguintes: uma proteína espicular que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (ou SEQ ID NO: 22), uma glicoproteína hemaglutinina-esterase (HE) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 24), uma proteína de membrana integral (M) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma proteína de membrana pequena (E) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma proteína de nucleocapsídeo (N) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma proteína Orf 1 ab que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, um proteína Orf 2a que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma proteína de 4,9 kDa que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, ou uma proteína de 4,8 kDa que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[008] Em modalidades particulares, o BCoV atenuado codifica uma ou mais das seguintes: uma proteína espicular que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (ou SEQ ID NO: 22), a glicoproteína hemaglutinina-esterase (HE) que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 24), uma proteína de membrana integral (M) que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma proteína de membrana pequena (E) que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma proteína de nucleocapsídeo (N) que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma proteína Orf 1 ab que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma proteína Orf 2a que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma proteína de 4,9 kDa que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, ou uma proteína de 4,8 kDa que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[009] Em ainda outras modalidades, o BCoV atenuado codifica uma ou mais das seguintes: uma proteína espicular que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (ou SEQ ID NO: 22), uma glicoproteína hemaglutinina-esterase (HE) que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 24), uma proteína de membrana integral (M) que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma proteína de membrana pequena (E) que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma proteína de nucleocapsídeo (N) que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma proteína Orf 1 ab que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma proteína Orf 2a que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma proteína de 4,9 kDa que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, ou uma proteína de 4,8 kDa que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[0010] Em ainda outras modalidades, o BCoV atenuado codifica uma ou mais das seguintes: uma proteína espicular que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (ou SEQ ID NO: 22), uma glicoproteína hemaglutinina-esterase (HE) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (ou SEQ ID NO: 24), uma proteína de membrana integral (M) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma proteína de membrana pequena (E) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma proteína de nucleocapsídeo (N) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma proteína Orf 1 ab que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma proteína Orf 2a que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma proteína de 4,9 kDa que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, ou uma proteína de 4,8 kDa que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade mais específica, o BCoV atenuado compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 25.
[0011] Desta maneira, em determinadas modalidades, o BCoV atenuado codifica uma proteína espicular que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em modalidades particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína espicular que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em modalidades mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína espicular que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em modalidades ainda mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína espicular que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em modalidades ainda mais particulares, uma proteína espicular do BCoV atenuado é codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
[0012] Em determinadas modalidades, o BCoV atenuado codifica uma glicoproteína hemaglutinina-esterase (HE) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em modalidades particulares, o BCoV atenuado codifica uma glicoproteína hemaglutinina- esterase que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em modalidades mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma glicoproteína hemaglutinina-esterase que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em modalidades ainda mais particulares, o BCoV atenuado codifica a glicoproteína hemaglutinina-esterase que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em modalidades ainda mais particulares, a glicoproteína hemaglutinina-esterase do BCoV atenuado é codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3.
[0013] Em determinadas modalidades, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana integral (M) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em modalidades particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana integral que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em modalidades mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana integral que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em modalidades ainda mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana integral que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em modalidades ainda mais particulares, a proteína de membrana integral do BCoV atenuado é codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5.
[0014] Em determinadas modalidades, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana pequena (E) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em modalidades particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana pequena que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em modalidades mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana pequena que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em modalidades ainda mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de membrana pequena que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em modalidades ainda mais particulares, a proteína de membrana pequena do BCoV atenuado é codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7.
[0015] Em determinadas modalidades, o BCoV atenuado codifica uma proteína de nucleocapsídeo (N) que tem identidade de 95% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em modalidades particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de nucleocapsídeo que tem identidade de 98% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em modalidades mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de nucleocapsídeo que tem identidade de 99% ou maior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em modalidades ainda mais particulares, o BCoV atenuado codifica uma proteína de nucleocapsídeo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em modalidades ainda mais particulares, a proteína de nucleocapsídeo do BCoV atenuado é codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9.
[0016] Em modalidades específicas, o BCoV atenuado compreende as características imunogênicas e/ou físicas e/ou genéticas do coronavírus bovino atenuado tendo o número de depósito ATCC PTA-121515. Em modalidades relacionadas, o BCoV atenuado é derivado de um isolado tendo o número de depósito ATCC PTA-121515. Em outras modalidades relacionadas, o BCoV atenuado é a progênie de um isolado tendo o número de depósito ATCC PTA-121515. Em modalidades mais específicas, o BCoV atenuado é um isolado tendo o número de depósito ATCC PTA-121515. Todos os coronavírus bovinos atenuados (BCoVs) da presente invenção são também previstos como BCoVs isolados.
[0017] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece composições imunogênicas e vacinas compreendendo um ou mais dos BCoVs atenuados da presente invenção. Em modalidades particulares, as composições imunogênicas e vacinas compreende um BCoV vivo atenuado. Em determinadas modalidades, a vacina auxilia na prevenção de doença respiratória causada por BCoV. Em modalidades particulares, a vacina auxilia na prevenção de doença entérica causada por BCoV. Em ainda outras modalidades, a vacina auxilia na prevenção de tanto a doença respiratória como a doença entérica causadas por BCoV. Em determinadas modalidades, a vacina é armazenada congelada antes de descongelamento antes do uso. Em modalidades alternativas, a vacina é liofilizada, que é reidratada antes da administração. Em outras modalidades, a vacina é armazenada como uma vacina estável líquida.
[0018] A presente invenção fornece adicionalmente vacinas multivalentes. Em modalidades particulares, a vacina multivalente compreende um BCoV atenuado da presente invenção junto com um ou mais vírus adicionais como vírus de diarreia viral bovina (BVDV), vírus de rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR), vírus de parainfluenza tipo 3 (PI3), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV), vírus da febre do vale rift (RVFV), ou qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, a vacina multivalente compreende BVDV1. Em outras modalidades, a vacina multivalente compreende BVDV2. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende tanto BVDV1 como BVDV2. Em determinadas modalidades, a vacina compreende tanto um BCoV vivo atenuado da presente invenção como um ou mais dos vírus vivos atenuados adicionais, por exemplo, um vírus de diarreia viral bovina vivo atenuado (BVDV), um vírus de rinotraqueíte bovina infecciosa vivo atenuado (IBR), um vírus de parainfluenza tipo 3 vivo atenuado (PI3), um vírus sincicial respiratório bovino vivo atenuado (BRSV), um vírus da febre do vale rift vivo atenuado (RVFV), ou qualquer combinação dos mesmos.
[0019] A vacina da presente invenção pode compreender adicionalmente um ou mais antígenos bacterianos. Em determinadas modalidades, o antígeno bacteriano é um Pasteurella multocida. Em modalidades particulares, o antígeno bacteriano é um Mannheimia haemolytica. Em outras modalidades, o antígeno bacteriano é um Histophilus somni. Em ainda outras modalidades, o antígeno bacteriano é um Mycoplasma bovis. Em ainda outras modalidades, a vacina compreende dois ou mais desses antígenos bacterianos. Em ainda outras modalidades, um ou mais dos antígenos bacterianos da vacina é uma bactéria viva atenuada. Em determinadas modalidades, um ou mais dos antígenos bacterianos da vacina é uma bactéria morta.
[0020] A presente invenção fornece adicionalmente métodos de vacinação de um bovino (por exemplo, um bezerro) com uma vacina da presente invenção. Em modalidades particulares, o método de vacinação do bovino compreende a administração da vacina intranasalmente. Em determinadas modalidades alternativas, o método de vacinação do bovino compreende a administração da vacina oralmente.
[0021] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um antígeno de proteína isolado e/ou recombinante obtido a partir dos isolados de coronavírus bovino atenuado da presente invenção. Estão incluídos na presente invenção os novos fragmentos antigênicos de tais proteínas da invenção. Em um aspecto relacionado, são fornecidos ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes codificando as proteínas e/ou codificando fragmentos antigênicos das proteínas. Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece vetores recombinantes, incluindo vetores virais recombinantes que compreendem e/ou expressam tais ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem estes vetores ou que foram geneticamente modificados para codificar os ácidos nucleicos da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0022] A figura 1 é uma representação esquemática do mapa de genoma de BCoV como anotado no Exemplo 2 abaixo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0023] A presente invenção fornece coronavírus bovinos atenuados (BCoVs). Em um aspecto da presente invenção, todos os BCoV atenuados são também fornecidos como BCoVs isolados. Um BCoV atenuado da presente invenção pode ser incluído em vacinas seguras e eficazes para bovinos (incluindo vacinas multivalentes para bovinos). De modo surpreendente, tais vacinas de BCoV proveem proteção cruzada tanto contra doença entérica quanto respiratória. Desta maneira, a presente invenção fornece vacinas que auxiliam na proteção de bezerros e gado de infecções por coronavírus tanto entéricas como respiratórias.
[0024] Em um aspecto particular da invenção, as vacinas para bovinos de BCoV seguras e eficazes são para administração intranasal. A administração de uma vacina intranasalmente tem várias vantagens sobre outras vias. Por exemplo, tanto os anticorpos maternos como os anticorpos de exposição anterior a um patógeno podem neutralizar uma vacina de vírus vivo modificada se a vacina for administrada por via parental para o sujeito animal. No entanto, administração intranasal pode contornar os anticorpos maternos e estimular uma resposta imune em um animal naive. Além disso, ele pode reforçar a resposta imune em um animal com anticorpos de exposição anterior. Portanto, a presente invenção ainda fornece métodos de administração de vacinas para bovinos de BCoV seguras e eficazes por uma via intranasal.
[0025] O uso de termos no singular por conveniência na descrição não pretende de modo algum ser tão limitativo. Desta maneira, por exemplo, referência a um "vírus" inclui a referência a um ou mais desses vírus, salvo indicação em contrário. O uso de termos no plural também não pretende ser limitativo, salvo especificado ao contrário.
[0026] Como aqui usado, o termo "aproximadamente" é usado de modo interpermutável com o termo "cerca de" e geralmente significa que um valor está dentro de uma porcentagem de vinte e cinco por cento do valor indicado, salvo se indicado de outro modo, por exemplo, uma concentração de "cerca de” 2 mM EDTA pode ser de 1,5 mM a 2,5 mM EDTA.
[0027] Como aqui usado, uma "vacina" é uma composição que é apropriada para aplicação a um animal (por exemplo, gado) que, após administração ao animal, induz uma resposta imune forte o suficiente para ajudar minimamente na proteção de uma doença clínica decorrente de uma infecção com um microrganismo de tipo selvagem, isto é, forte o suficiente para ajudar na prevenção da doença clínica e/ou prevenir, melhorar ou curar a doença clínica. Salvo expressamente indicado ao contrário, o uso do termo vacina inclui vacinas multivalentes.
[0028] Como aqui usado, uma "vacina multivalente" é uma vacina que compreende dois ou mais antígenos diferentes. Em uma modalidade particular deste tipo, a vacina multivalente estimula o sistema imune do receptor contra dois ou mais patógenos diferentes.
[0029] Como aqui usado, uma vacina "estável em líquido" é uma vacina mantida como um líquido (incluindo uma vacina multivalente líquida) que permanece eficaz durante pelo menos um ano quando armazenada a ou a 7°C (por exemplo, em uma geladeira padrão e/ou a 0°C - 7°C). Em modalidades particulares, uma vacina estável líquida continua eficaz quando armazenada a ou abaixo de 7°C durante pelo menos 1,5 anos. Em modalidades mais particulares, uma vacina estável em líquido permanece eficaz quando armazenada em ou abaixo de 7°C durante pelo menos 2 anos. Em modalidades ainda mais particulares, uma vacina estável líquida permanece eficaz quando armazenada a ou abaixo de 7°C durante pelo menos 2,5 a 3 anos. Exemplos de vacinas estáveis líquidas são dados no Pedido US No. 14/202.454 depositado em 10 de março de 2014, e no Pedido US No. 14/202.194 depositado em 10 de março de 2014, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
[0030] Como aqui usado, os termos "proteger", "protegendo", "prover proteção para", "provendo proteção" e "auxilia na proteção" não requerem proteção completa contra qualquer indicação de infecção. Por exemplo, "auxilia na proteção" pode significar que a proteção é suficiente de modo que, após o desafio, sintomas da infecção subjacente sejam pelo menos reduzidos e/ou que uma ou mais das causas celulares, fisiológicas ou bioquímicas subjacentes ou mecanismos que causam os sintomas são reduzidos e/ou eliminados. Entende-se que “reduzido”, como usado neste contexto, significa relativo ao estado da infecção, incluindo o estado molecular da infecção, não apenas o estado fisiológico da infecção.
[0031] O termo "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se à quantidade de uma composição que, quando administrada a bovinos, reduz significativamente a probabilidade e/ou a extensão de uma infecção/infestação devido a um dado patógeno.
[0032] "Metafilaxia" é a medicação em massa em um momento dado de um grupo completo de animais para eliminar ou minimizar um surto esperado de doença, por exemplo, em um ou mais animais em alto risco de infecção/infestação. Em uma modalidade particular, os bezerros de alto risco são gado de peso leve, misturado, que percorreu longas distâncias com histórico de saúde desconhecido.
[0033] O termo "quimioprofilaxia" refere-se à administração de um medicamento/tratamento, por exemplo, uma ou mais composições profiláticas, com o objetivo de prevenir ou reduzir a infecção/infestação viral, bacteriana e/ou parasitária; e/ou prevenir ou reduzir doenças e/ou sintomas relacionados com essa infecção/infestação.
[0034] O termo "composição profilática" refere-se a qualquer agente usado de modo singular ou em combinação com outros agentes que reduz significativamente a probabilidade e/ou extensão de uma infecção/infestação devido a um dado patógeno em bovinos. Em uma destas modalidades, os bovinos estão em alto risco de desenvolver doença respiratória bovina, após serem misturados, transportados, devido a mudanças no clima, alterações em nutrição e/ou outros fatores estressantes que podem iniciar um sintoma e/ou uma doença relacionada com a presença dos patógenos virais, bacterianos ou parasitários comumente associados com bovinos, alvo-marcados pelo agente ou combinação de agentes.
[0035] Como aqui usado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade de um dado antígeno, por exemplo, um vírus bovino vivo atenuado, que é suficiente para prover proteção e/ou auxiliar na proteção contra o patógeno que o antígeno está sendo administrado para proteger contra, quando fornecida em uma administração única, e/ou quando desejado, fornecida como uma administração inicial com uma ou mais administração(ões) de reforço subsequente(s).
[0036] Como aqui usado, uma vacina "eficaz" compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dado antígeno. Uma vacina "eficaz" retém título suficiente para um dado antígeno atender às exigências regulatórias para esse antígeno para a jurisdição onde a vacina é administrada, por exemplo, a administração de uma vacina nos Estados Unidos é regida pelo Departamento Americano de Agricultura (USDA).
[0037] Como aqui usado, uma "resposta imune" refere-se à imunidade ativa do sujeito animal devido a ter recebido uma ou mais vacinas. A resposta imune pode incluir a produção de anticorpos para o antígeno ou imunogene presente na vacina. "Resposta imune" em um indivíduo refere-se ao desenvolvimento de uma resposta imune humoral, uma resposta imune celular ou uma resposta imune humoral e celular a um antígeno. Respostas imunes podem ser medidas usando imunotestes padronizados e testes de neutralização que são conhecidos na técnica.
[0038] Como aqui usado, o termo "farmaceuticamente aceitável" é usado como adjetivo para significar que o substantivo modificado é apropriado para uso em um produto farmacêutico. Quando é usado, por exemplo, para descrever um excipiente em uma vacina farmacêutica, ele caracteriza o excipiente como sendo compatível com os outros ingredientes da composição e não deletério de modo desvantajoso para o destinatário pretendido.
[0039] O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, como água e/ou óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e similares. Água ou soluções aquosas ou solução salina e açúcar aquoso, por exemplo, soluções de dextrose e/ou glicerol podem ser empregadas como carreadores particularmente para soluções injetáveis. Além disso, o carreador pode ser e/ou compreender um hidrocolóide e/ou solução de polímero, por exemplo, para espessar as vacinas para bovinos que devem ser pulverizadas sobre o gado, por exemplo, bezerros.
[0040] Como aqui usado, um "adjuvante" é uma substância que é capaz de favorecer ou amplificar a cascata de eventos imunológicos, conduzindo por fim a uma melhor resposta imunológica, isto é, a resposta corporal integrada a um antígeno. Em geral, um adjuvante não é requerido para que ocorra a resposta imunológica, mas favorece ou amplifica esta resposta.
[0041] Como aqui usado, "administração sistêmica" é a administração no sistema circulatório do corpo (compreendendo o sistema cardiovascular e linfático), assim afetando o corpo como um todo, em vez de um locus específico, como o trato gastro-intestinal (via, por exemplo, administração oral ou retal) e o sistema respiratório (via, por exemplo, administração intranasal). Administração sistêmica pode ser realizada, por exemplo, por administração no tecido muscular (intramuscular), na derme (intradérmica, transdérmica ou supradérmica), embaixo da pele (subcutânea), embaixo da mucosa (submucosal), nas veias (intravenosa) etc.
[0042] "Administração parenteral" inclui injeções subcutâneas, injeções submucosais, injeções intravenosas, injeções intramusculares, injeções intradérmicas e infusão.
[0043] Como aqui usado, "administração intranasal" de uma vacina a um sujeito animal ou "administrando intranasalmente" uma vacina a um sujeito animal refere-se à aplicação ou administração dessa vacina para/através do nariz e/ou da cavidade nasal.
[0044] Como aqui usado, uma sequência de aminoácidos é 100% "idêntica" a uma segunda sequência de aminoácidos quando os resíduos de aminoácidos de ambas as sequências são idênticos. Desta maneira, uma sequência de aminoácidos é 50% "idêntica" a uma segunda sequência de aminoácidos quando 50% dos resíduos de aminoácidos das duas sequências de aminoácidos são idênticos. A comparação de sequências é realizada sobre um bloco contíguo de resíduos de aminoácidos constituído por uma dada proteína, por exemplo, uma proteína ou uma porção do polipeptídeo sendo comparada. Em uma modalidade particular, são levadas em consideração deleções ou inserções selecionadas que poderiam alterar, de outra forma, a correspondência entre as duas sequências de aminoácidos.
[0045] Como aqui usado, identidade percentual de sequências de nucleotídeos e aminoácidos pode ser determinada usando C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Grupo de PLC (1996) e o algoritmo Clustal W com os parâmetros de default de alinhamento e os parâmetros de default para identidade. Estes programas comercialmente disponíveis também podem ser usados para determinar similaridade de sequência usando os mesmos ou análogos parâmetros de default. Alternativamente, uma busca Advanced Blast sob as condições de filtro de default pode ser usada, por exemplo, usando o programa pileup GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versão 7, Madison, Wisconsin) usando os parâmetros de default.
Vacinas multivalentes:
[0046] A presente invenção fornece vacinas monovalentes e multivalentes para bovinos que compreendem o BCoV atenuado da presente invenção. Desta maneira, as vacinas para bovinos multivalentes da presente invenção compreendem um BCoV atenuado e ainda incluem um ou mais vírus bovinos adicionais tais como BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV e/ou RVFV. Como notado acima, uma vacina multivalente que compreende um BCoV vivo atenuado da presente invenção também pode incluir um ou mais dos seguintes vírus vivos atenuados: BVDV1, BVDV2, PI3, IBR, BRSV e/ou RVFV, junto com um ou mais vírus bovinos mortos.
[0047] Além disso, qualquer vacina multivalente para bovinos que compreende BCoV atenuado da presente invenção pode ainda incluir um ou mais antígenos bacterianos vivos atenuados ou mortos. Em certas modalidades, apenas o antígeno viral em tais vacinas multivalentes para bovinos é BCoV. Em modalidades relacionadas, uma vacina de vírus bovinos, que compreende o BCoV atenuado da vacina da presente invenção, pode ser combinada com um ou mais antígenos bacterianos vivos atenuados ou mortos e/ou antígenos virais. Em modalidades particulares deste tipo, a combinação da vacina de vírus bovino com um ou mais antígenos bacterianos vivos atenuados ou mortos e/ou antígenos virais é feita algum tempo antes da administração, mas subsequente ao armazenamento. Em modalidades específicas deste tipo, o(s) antígeno(s) bacteriano(s) é(são) constituído(s) por uma vacina (monovalente ou multivalente) e a vacina de bactéria bovina é combinada com uma vacina de vírus bovino vivo atenuado da presente invenção antes da administração. Em uma modalidade mais específica, a vacina de vírus bovino vivo atenuado pode ser usada para liquefazer/solubilizar uma vacina de bactéria bovina secada por congelamento antes da administração da vacina combinada ao sujeito animal. Em uma modalidade específica alternativa, uma vacina de bactéria bovina pode ser usada para liquefazer/solubilizar uma vacina de vírus bovino vivo atenuado secada por congelamento (por exemplo, uma vacina de BCoV) antes da administração da vacina combinada ao sujeito animal. Ainda em outras modalidades, a vacina de vírus bovino vivo atenuado e a vacina de bactéria bovina atenuada e/ou morta são administradas sequencialmente. Em modalidades específicas, a vacina de vírus bovino vivo atenuado é uma vacina estável líquida. Em modalidades alternativas, a vacina de vírus bovino vivo atenuado (por exemplo, uma vacina de BCoV) é uma vacina liofilizada.
[0048] Consequentemente, uma vacina de vírus bovino que compreende um BCoV vivo atenuado da presente invenção pode ser combinada com uma ou mais vacinas de bactérias vivas atenuadas ou mortas compreendendo um antígeno como Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni e Mycoplasma bovis antes da administração ao sujeito animal. Desta maneira, em certas modalidades, a vacina de bactéria atenuada compreende uma Mannheimia hemolytica atenuada. Em modalidades particulares deste tipo, a Mannheimia hemolytica atenuada é um deletante de leucotoxina. Em uma modalidade específica deste tipo, a Mannheimia hemolytica atenuada é uma Manemheimia haemolytica viva avirulenta na qual o gene que codifica a leucotoxina A foi modificado para estar faltando a sequência de nucleotídeos que codifica aminoácidos 34-378 da proteína leucotoxina A [ver, US 6 331 303 B1, aqui incorporado por referência em sua totalidade].
[0049] Ainda em outras modalidades, a vacina de bactéria atenuada compreende uma Pasteurella multocida atenuada. Em modalidades mais particulares, a Pasteurella multocida compreende uma deleção em seu gene hyaE. Em uma modalidade específica deste tipo, a Pasteurella multocida atenuada é uma Pasteurella multocida viva, avirulenta, na qual o gene que codifica a proteína hyaE foi modificada para estar faltando a sequência de nucleotídeos que codifica aminoácidos 239-359 da proteína hyaE e/ou nucleotídeos faltando 718-1084 [ver, US 7.351.416 B2, aqui incorporado por referência em sua totalidade]. Em ainda outras modalidades, a vacina de bactéria atenuada compreende uma Histophilus somni atenuada. Em modalidades mais particulares, a Histophilus somni é Histophilus somni viva, avirulenta, que é um mutante aroA.
[0050] Em modalidades particulares dos métodos da presente invenção, a vacina de bactéria atenuada compreende tanto uma Mannheimia hemolytica atenuada como uma Pasteurella multocida atenuada. Em uma modalidade mais específica, a composição antibacteriana é uma vacina de bactéria atenuada compreendendo uma Mannheimia haemolytica viva avirulenta em que o gene codificando leucotoxina A foi modificado para estar faltando a sequência de nucleotídeos que codifica aminoácidos 34-378 da proteína de leucotoxina A, e uma Pasteurella multocida viva avirulenta em que o gene codificando a proteína hyaE foi modificado para estar faltando a sequência de nucleotídeos que codifica aminoácidos 239-359 da proteína hyaE e/ou nucleotídeos faltando 718-1084. Em modalidades mais particulares dos métodos da presente invenção, a vacina de bactéria atenuada compreende uma Mannheimia hemolytica atenuada, uma Pasteurella multocida atenuada e uma Histophilus somni avirulenta. Administração de vacina:
[0051] As vacinas de vírus bovino da presente invenção podem ser administradas por quaisquer meios convencionais, por exemplo, por administração sistêmica, incluindo por administração parenteral como, sem limitação, administração subcutânea ou intramuscular. As vacinas de vírus bovino da presente invenção também podem ser administradas por administração pela mucosa, como por administração intranasal, oral, intratraqueal, retal e/ou ocular. Alternativamente, as vacinas podem ser administradas através de um adesivo de pele, um implante de liberação retardada, escarificação ou administração tópica. Está contemplado que uma vacina de vírus bovino da presente invenção também pode ser administrada via água potável e/ou ração do bovino receptor. Em uma modalidade preferida, uma vacina de vírus bovino da presente invenção compreendendo um BCoV vivo atenuado da presente invenção é administrada por via intranasal.
[0052] As vacinas (incluindo vacinas multivalentes) da presente invenção também podem ser administradas como parte de uma terapia de combinação, isto é, uma terapia que inclui, além da própria vacina, a administração de um ou mais agentes ativos, terapias, etc. Por exemplo, deve ser reconhecido que a quantidade de vacina que constitui uma quantidade "terapeuticamente eficaz" pode ser maior ou menor do que a quantidade de vacina que constituiria uma quantidade "terapeuticamente eficaz" se a vacina fosse administrada sozinha. Outras terapias podem incluir as conhecidas na arte, como, por exemplo, analgésicos, medicamentos para reduzir febre, expectorantes, medicamentos anti-inflamatórios, anti-histamínicos e/ou administração de fluidos.
[0053] Em determinadas modalidades dos métodos da presente invenção, uma vacina de vírus bovino compreendendo um BCoV vivo atenuado da presente invenção que é apropriado para administração intranasal compreende ainda o IBR atenuado. Em modalidades mais particulares, a vacina de vírus bovino compreendendo um BCoV vivo atenuado da presente invenção, que é apropriado para administração intranasal, compreende um ou mais, ou todos dos seguintes: um IBR vivo atenuado, um BVDV1 vivo atenuado, um BVDV2 vivo atenuado, um PI3 vivo atenuado e um BRSV vivo atenuado.
[0054] O nível de imunogenicidade pode ser determinado experimentalmente por titulação de dose de vacina e técnicas de estudo de desafio geralmente conhecidas na técnica. Essas técnicas incluem tipicamente vacinação de vários sujeitos animais com a vacina em diferentes dosagens e, então, desafiando os sujeitos animais com o vírus virulento para determinar a dose protetora mínima.
[0055] Fatores que afetam o regime de dosagem preferido podem incluir, por exemplo, a raça de um bovino, idade, peso, sexo, dieta, atividade, tamanho do pulmão e condição do indivíduo; a via de administração; os perfis de eficácia, segurança e duração da imunidade da vacina particular usada; se um sistema de distribuição é usado; e se a vacina é administrada como parte de uma combinação de fármaco e/ou vacina. Desta maneira, a dosagem efetivamente empregada pode variar para animais específicos e, portanto, pode se desviar das dosagens típicas acima especificadas. A determinação de tais ajustes de dosagem está geralmente dentro da competência dos versados na técnica de desenvolvimento de vacinas usando meios convencionais.
[0056] Similarmente, o volume com que tal dose pode ser administrada situa-se tipicamente entre 0,1 mL (típico para aplicação intradérmica ou transdérmica) e 5,0 mL. Uma faixa típica para o volume de administração está entre 0,2 e 2,0 mL. Em modalidades específicas, uma faixa para o volume de administração é de cerca de 1,0 a 2,0 mL para administração intramuscular ou subcutânea. Em modalidades específicas alternativas, uma faixa para o volume de administração é de cerca de 0,5 a 2,0 para administração intranasal.
[0057] Está contemplado que a vacina pode ser administrada ao recipiente da vacina de uma vez ou, alternativamente, duas ou mais vezes ao longo de dias, semanas, meses ou anos. Em algumas modalidades, a vacina é administrada pelo menos duas vezes. Em determinadas de tais modalidades, por exemplo, a vacina é administrada duas vezes, sendo a segunda dose (por exemplo, um reforço) sendo administrada pelo menos 2 semanas após a primeira dose. Em modalidades particulares, a vacina é administrada duas vezes, sendo a segunda dose administrada não mais do que 8 semanas após a primeira dose. Em outras modalidades, a segunda dose é administrada de 1 semana a 2 anos após a primeira dose, de 1,5 semanas a 8 semanas após a primeira dose, ou de 2 a 4 semanas após a primeira dose. Em outras modalidades, a segunda dose é administrada cerca de 3 semanas após a primeira dose.
[0058] Nas modalidades acima, a primeira e dosagens subsequentes podem variar, como em quantidade e/ou forma. Com frequência, no entanto, as dosagens são as mesmas em quantidade e forma. Quando apenas uma dose única é administrada, a quantidade de vacina nessa dose sozinha geralmente compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina. Quando, no entanto, mais de uma dose é administrada, as quantidades de vacina nestas doses juntas podem constituir uma quantidade terapeuticamente eficaz. Além disso, uma vacina pode ser inicialmente administrada e, então, um reforço pode ser administrado de 2 a 12 semanas depois, como discutido acima. No entanto, administrações subsequentes da vacina podem ser feitas em uma base anual (1 ano) ou bianual (2 anos), sem levar em conta se foi administrado um reforço ou não. Adjuvantes e imunoestimulantes
[0059] Um adjuvante em geral é uma substância que reforça a resposta imune do alvo de um modo não específico. Muitos adjuvantes diferentes são conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de adjuvantes que podem ser usados na formulação de uma vacina obtida com material de acordo com a presente invenção incluem sais de alumínio (por exemplo, alúmen, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, óxido de alumínio), colesterol, adjuvantes de monofosforil lipídio A, Amphigen, tocofenóis, monofosfenil lipídio A, muramil dipeptídio, emulsões de óleo, glucanos, carbômeros, copolímeros em bloco, adjuvante Avridine lipídio-amina, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante ou não), toxina de cólera, murail dipeptídio, adjuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros em blocos não iônicos e poliaminas como dextrano sulfato, carbopol, pirano, saponinas e derivados de saponina, co-polímeros em bloco, e adjuvantes como os identificados nas Patentes US 4.578.269, 4.744.983, 5.254.339, todas sendo aqui totalmente incorporadas por referência. Exemplos não limitativos de peptídeos que podem servir como adjuvantes incluem muramil dipeptídeos, dimetil glicina ou tuftsina. Exemplos não limitativos de óleos que podem servir como adjuvantes incluem óleos minerais, óleos vegetais, óleos animais e emulsões dos mesmos.
[0060] Vacinas feitas a partir de material de acordo com a presente invenção podem ser formuladas como emulsões óleo-em água, como emulsões água-em-óleo ou como emulsões água-em-óleo-em-água. Exemplos não limitativos de emulsões óleo-em-água incluem emulsões óleo-em-água de parafina ou emulsões feitas a partir de um ou mais de esqualeno, copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, tensoativos de polissorbato e/ou análogos treonil de muramil dipeptídio.
[0061] Óleos usados como adjuvantes podem ser metabolizáveis pelo indivíduo recebendo a vacina, como óleos vegetais ou animais. Tais óleos tipicamente consistem, em grande parte, de misturas de triacilgliceróis, também conhecidos como triglicerídeos ou gorduras neutras. Estas substâncias não polares, insolúveis em água, são triésteres de ácidos graxos de glicerol. Triacilgliceróis diferem de acordo com a identidade e colocação de seus três resíduos de ácidos graxos.
[0062] Adjuvantes podem também consistir de componentes que não podem ser metabolizados pelo corpo do sujeito animal ao qual a emulsão é administrada. Os óleos não metabolizáveis apropriados para uso nas emulsões da presente invenção incluem alcanos, alcenos, alcinos e seus ácidos e álcoois correspondentes, os éteres e ésteres dos mesmos, e as misturas os mesmos. Os compostos individuais do óleo podem ser compostos de hidrocarboneto leve, por exemplo, compostos tendo 6 a 30 átomos de carbono. O óleo pode ser preparado sinteticamente ou purificado a partir de produtos de petróleo. Exemplos não limitativos de óleos não metabolizáveis para uso na preparação de vacinas com base no material cultivado de acordo com a presente invenção incluem óleo mineral, óleo de parafina e cicloparafinas, por exemplo. O termo "óleo mineral" refere-se a um óleo adjuvante não metabolizável que é uma mistura de hidrocarbonetos líquidos obtidos a partir de petrolato via uma técnica de destilação. O termo é sinônimo de "parafina liquefeita", "petrolato líquido" e "óleo mineral branco". O termo também se destina a incluir "óleo mineral leve", isto é, óleo que é obtido similarmente por destilação de petrolato, mas que tem uma densidade aparente levemente menor do que o óleo mineral branco.
[0063] Outros compostos capazes de aumentar uma resposta de imunidade humoral que podem ser usados na formulação de vacinas com base no material cultivado de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação, copolímero de etileno-anidrido maleico (EMA), emulsões de látex de um copolímero de estireno com uma mistura de ácido acrílico e ácido metacrílico.
[0064] Além do adjuvante, uma vacina com base no material cultivado de acordo com a presente invenção pode incluir agentes imunomoduladores como, por exemplo, interleucinas, interferons ou outras citocinas (por exemplo, citocinas relacionadas com Th1, como interleucina-12 (IL-12), interleucina-18 (IL-18) ou interferon gama). A quantidade de adjuvante ou imunoestimulante adicionada em uma formulação de vacina com base no material cultivado de acordo com a presente invenção depende da natureza do adjuvante ou do próprio imunoestimulante. O versado na técnica é capaz de selecionar uma quantidade que é suficiente para aumentar uma resposta imune ao agente imunizante bacteriano.
Carreadores
[0065] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis apropriados para uso em vacinas compreendendo material de acordo com a presente invenção podem ser qualquer carreador líquido convencional apropriado para composições farmacêuticas veterinárias, incluindo soluções salinas balanceadas apropriadas para uso em meios de cultura de tecidos. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são entendidos como sendo compostos que não afetam negativamente a saúde do animal a ser vacinado, pelo menos não na medida em que o efeito adverso seja pior do que os efeitos observados quando o animal não está vacinado. Os carreadores apropriados incluem também água estéril, solução salina, tampões aquosos como PBS, solventes, diluentes, agentes isotônicos, agentes tampão, dextrose, etanol, manitol, sorbitol, lactose e glicerol e similares.
Veículo
[0066] Vacinas formuladas a partir de material de acordo com a presente invenção podem também compreender um veículo. Um veículo é um composto ao qual as células hospedeiras, células bacterianas ou proteínas, fragmentos de proteína, ácidos nucleicos ou partes dos mesmos aderem, sem estar covalentemente ligados ao mesmo. Exemplos não limitativos de tais veículos incluem bio-microcápsulas, micro-alginatos, lipossomas e macrosóis. Alguns materiais que servem como adjuvantes também podem servir como veículos como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio ou óxido de alumínio, sílica, caulim e bentonita, todos conhecidos na técnica.
Estabilizadores
[0067] Com frequência, uma vacina é misturada com estabilizadores, por exemplo, para proteger componentes propensos à degradação de serem degradados, para aumentar a vida útil da vacina ou para melhorar a eficiência de secagem por congelamento. Exemplos não limitativos de estabilizadores que podem ser adicionados às formulações de vacinas com base no material cultivado de acordo com a presente invenção incluem SPGA, leite desnatado, gelatinas, albumina de soro bovino, carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glicose), proteínas (por exemplo, albumina, caseína ou produtos de degradação da mesma), estabilizadores de origem não animal e tampões (por exemplo, fosfatos de metal alcalino).
Secagem por congelamento/reconstituição
[0068] Por razões de estabilidade ou economia, vacinas com base no material cultivado de acordo com a presente invenção podem secadas por congelamento. Em geral, isto irá permitir um armazenamento prolongado em temperaturas acima de 0°C, por exemplo, a 4°C. Procedimentos para a secagem por congelamento são conhecidos dos versados na técnica. Equipamento para a secagem por congelamento em diferentes escalas está disponível comercialmente. Para reconstituir a vacina secada por congelamento, ela pode ser colocada em suspensão em um diluente fisiologicamente aceitável. Tais diluentes podem ser tão simples como água estéril, uma solução salina fisiológica ou outro carreador, como discutido acima.
DEPÓSITO BIOLÓGICO
[0069] Culturas do seguinte material biológico foram depositadas no seguinte depósito internacional: American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., sob condições que atendem às exigências do Tratado de Budapeste. Organismo No. de acesso Coronavírus bovino PTA-121515 (BCV-Des MSV Lote # 9068110M01) TABELA 1 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
Figure img0001
AA é uma sequência de aminoácidos; NA é uma sequência de ácido nucleico. # Sequências que são dadas sem a sequência de sinal.
[0070] A presente invenção pode ser melhor compreendida por referência aos seguintes Exemplos não limitativos, que são dados como exemplo da invenção. Os seguintes exemplos são apresentados de modo a ilustrar de modo mais completo as modalidades preferidas da invenção. No entanto, eles não devem de modo algum ser interpretados como limitativos do escopo amplo da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 VACINAS DE CORONAVÍRUS BOVINO ATENUADO SEGURAS E EFICAZES Origem e isolamento de um isolado de BCoV:
[0071] Uma amostra fecal foi obtida de um bezerro em Idaho que tinha diarreia. O material fecal foi centrifugado a 6500 rpm durante 20 minutos. O sobrenadante foi então colocado em camadas sobre uma almofada de sacarose e centrifugado a 28.000 rpm durante 1,5 horas. O grânulo foi recolocado em suspensão em meio de cultura celular e inoculado em recipientes de cultura contendo uma monocamada de células de rim bovino. As células que mostraram evidência de efeito citopático foram reagidas com um anticorpo monoclonal específico de BCoV permitindo que as células que eram positivas para BCoV fossem identificadas.
Processo de atenuação:
[0072] Um isolado de BCoV identificado nas células de rim bovino foi submetido a 56 passagens em células de rim bovino para atenuar o vírus. Clonagem de diluição limitante foi feita em passagens 4, 5, 10, 15 e 25, para obter um isolado de vírus puro. O material de BCoV obtido a partir da passagem anterior foi inoculado sobre uma monocamada de células de rim bovino para cada passagem. Os fluidos de vírus foram coletados em cada passagem quando foi observado um efeito citopático nas células. A quantidade de BCoV nos fluidos foi determinada por titulação em um teste de cultura de células e o vírus foi detectado por coloração com um anticorpo monoclonal específico para BCoV. Passagem 56 foi usada para fazer uma carga padrão do BCoV vivo atenuado modificado, isto é, BCV-Des MSV Lote # 9068110M01, que foi depositado junto a ATCC em 28 de agosto de 2014. Todos os estudos relativos ao BCoV vivo atenuado modificado abaixo foram realizados com BCoV a partir desta carga padrão.
Estudo de vacinação/desafio, a avaliação da eficácia do BCoV vivo modificado:
[0073] Uma vacina liofilizada composta pelo BCoV vivo modificado foi reidratada com diluente estéril e usada para vacinar vinte e dois (22) bezerros, que tinham três a cinco dias de idade e que foram privados de colostro. Cada bezerro foi vacinado uma vez com uma dose de 2 mL de vacina pela via intranasal. Um segundo grupo de vinte e dois (22) bezerros, também com três a cinco dias de idade e que foram privados de colostro, foram vacinados uma vez com uma dose de 2 mL de uma vacina placebo. Dezenove a vinte e um dias após a vacinação, todos os bezerros foram desafiados com uma cepa virulenta heteróloga de BCoV que causa tanto doença respiratória como entérica. Os bezerros foram monitorados durante 14 dias após o desafio para sinais de doença respiratória que incluíam descarga nasal, tosse e descarga ocular. Os bezerros também foram monitorados durante 14 dias após desafio para sinais de doença entérica (como avaliado pela gravidade da diarreia). Os bezerros foram ainda observados para depressão, desidratação e inapetência. Amostras nasais e fecais foram coletadas para testar excreção de vírus. Sangue para avaliação sorológica foi coletado antes e após a vacinação, e novamente após o desafio.
[0074] Visto que, 86% (19 em 22) dos bezerros de controle vacinados com placebo foram afetados com doença respiratória moderada ou grave, apenas 25% (5 em 20) dos vacinados com a vacina de BCoV exibiram tais sintomas. A gravidade da doença respiratória foi reduzida nos vacinados (p = 0,0001) em comparação com os controles placebo e a duração da doença respiratória foi reduzida nos vacinados (p = 0,0066) em comparação com os controles placebo. No caso de doença respiratória, a fração prevenida foi 0,71 com um intervalo de confiança de 95% (0,41, 0,89). Portanto, esses resultados, no mínimo, suportam uma reivindicação de que "auxilia na prevenção" de doenças respiratórias causadas por BCoV [ver Tabela 2 abaixo]. Também foi notada uma redução na gravidade e duração de excreção nasal em vacinados (p = 0,0063 para ambos) em comparação com os controles placebo. TABELA 2 Proteção contra doença respiratória
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* Dois bezerros não foram admitidos no estudo devido a razões de saúde anteriores.
[0075] Dezesseis dos vinte e dois bezerros de controle vacinados com placebo, isto é, 73%, foram afetados com doença entérica moderada ou severa em comparação com oito dos vinte bezerros vacinados com a vacina de BCoV, isto é, 40%. A gravidade da doença entérica foi reduzida nos vacinados (p = 0,0009) em comparação com os controles placebo e a duração da doença entérica foi reduzida nos vacinados (p = 0,0017) em comparação com os controles placebo. No caso de doença entérica, a fração prevenida foi 0,45 com um intervalo de confiança de 95% (0,01, 0,73). Portanto, esses resultados, no mínimo, suportam uma reivindicação de que "auxilia na prevenção" de doença entérica causada pelo BCoV [ver, tabela 3 abaixo]. Além disso, os dados demonstram que a vacina de BCoV vivo modificado é protetora tanto para doenças respiratórias como entéricas após um desafio com BCoV virulento heterólogo. TABELA 3 Proteção contra doença entérica
Figure img0003
* Dois bezerros não foram admitidos no estudo devido a razões de saúde anteriores. BCoV vivo modificado não reverte em virulência quando passado através do animal hospedeiro e retém um fenótipo estável:
[0076] Bezerros recém-nascidos privados de colostro na primeira passagem foram inoculados com BCoV vivo modificado, igualmente administrado pelas vias oral e intranasal. Um bezerro recém-nascido privado de colostro foi usado como controle sentinela em cada passagem. Os bezerros foram observados diariamente durante 14 dias para doença respiratória e entérica. Amostras nasais e fecais foram coletadas após a inoculação. Todos os bezerros permaneceram saudáveis durante o período de observação de 14 dias e não foram notadas descobertas anormais na necropsia no dia 14. BCoV não foi recuperado por cultura de amostras fecais de qualquer um dos bezerros em passagem 1, mas foi recuperado em amostras nasais de dois bezerros (um para um dia cada). O material de amostra nasal original dos dois bezerros foi reunido e administrado a três bezerros recém-nascidos privados de colostro para a segunda passagem. Todos os bezerros permaneceram saudáveis durante o período de observação de 14 dias e não foram notadas descobertas anormais na necropsia em dia 14. BCoV não foi recuperado a partir de amostras nasais ou fecais de qualquer um dos bezerros em passagem 2. Uma passagem de confirmação foi conduzida em que 10 dos bezerros recém-nascidos privados de colostro foram inoculados com o pool do material nasal original dos dois bezerros em passagem 1. Os bezerros foram observados durante vinte e um dias. Todos os bezerros permaneceram saudáveis durante o período de observação de vinte e um dias. BCoV não foi recuperado de amostras nasais ou fecais de qualquer um dos bezerros na passagem de confirmação. Pequenas lesões foram detectadas em dois bezerros inoculados e o bezerro de controle sentinela na necropsia, mas BCoV não foi recuperado por cultura. Estes dados indicam que BCoV vivo modificado não causa sinais clínicos de doença respiratória ou entérica consistente com a infecção por BCoV quando passado através do animal hospedeiro. Além disso, BCoV vivo modificado é fenotipicamente estável. Avaliação de excreção, espalhamento e disseminação de BCoV vivo modificado quando administrado a bezerros recém-nascidos a uma dose que é maior do que o nível de liberação final esperado em uma vacina.
[0077] Treze bezerros recém-nascidos e privados de colostro foram inoculados pela via intranasal com uma dose de BCoV vivo modificado que é >10X o nível de liberação esperado em uma vacina e era >100X o nível de BCoV usado no estudo de vacinação/desafio. Seis bezerros recém-nascidos, privados de colostro, foram usados como controles não inoculados. Os bezerros foram observados para doenças respiratória e entérica causadas por BCoV. Amostras nasais e fecais foram coletadas de todos os bezerros. Uma necropsia foi realizada em sete dos bezerros inoculados após sete dias de observação e uma necropsia foi realizada nos restantes seis bezerros inoculados após uma observação de 14 dias. Uma necropsia foi realizada em todos os bezerros de controle após observação de 14 dias. Na necropsia, amostras da traqueia, linfonodos mesentéricos, amígdalas intestinais, cornetos e pulmão foram coletadas e testadas para BCoV. Não foram observados sinais clínicos de doenças respiratória ou entérica causadas por BCoV em nenhum dos bezerros inoculados ou controlados. O BCoV foi isolado em 4 de 13 bezerros inoculados em um ou dois dias, mas BCoV não foi isolado em amostras fecais de nenhum dos bezerros. BCoV foi detectado por PCR em uma ou mais amostras de tecidos coletados de 11 dentre 13 bezerros inoculados, mas não em nenhum dos bezerros de controle. Esses dados demonstraram que BCoV vivo modificado é excretado dos bezerros inoculados e se dissemina em tecidos de bezerros inoculados, o que é um bom aspecto, porque o vírus vai para os tecidos necessários para elicitar a resposta imune apropriada, mas não se espalha para bezerros de controle não inoculados. Este estudo confirmou, desta maneira, a segurança do BCoV vivo modificado. Portanto, BCoV vivo modificado protege os bezerros de doenças tanto respiratórias como entéricas e, além disso, reduz substancialmente excreção de vírus.
EXEMPLO 2 ANÁLISE GENÉTICA DE BCoV
[0078] O mapa de genoma do BCoV atenuado descrito no Exemplo 1 acima é mostrado na Figura 1 e anotado na Tabela 2 abaixo. TABELA 2 MAPA DO GENOMA
Figure img0004
#SEQ ID NOs. Para sequência de aminoácidos (AA) e sequências de nucleotídeos (NA) que são ainda delineadas na Tabela 1 acima.
[0079] As sequências de nucleotídeos e aminoácidos para o BCoV são apresentadas abaixo: Genoma completo de BCoV (31.028 nucleotídeos): SEQ ID NO: 25 NNNNNNGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCTCTGATCTCTTGTTAGATCTTTTTATAATCTAAACTTT ATAAAAACATCCACTCCCTGTATTCTATGCTTGTGGGCGTAGATTTTTCATAGTGGTGTCTATATTCATTTCT GCTGTTAACAGCTTTCAGCCAGGGACGTGTTGTATCCTAGGCAGTGGCCCACCCATAGGTCACAATGTCGAAG ATCAACAAATACGGTCTCGAACTACACTGGGCTCCAGAATTTCCATGGATGTTTGAGGACGCAGAGGAGAAGT TGGATAACCCTAGTAGTTCAGAGGTGGATATAGTATGCTCCACCACTGCGCAAAAGCTGGAAACAGGCGGAAT TTGTCCTGAAAATCATGTGATGGTGGATTGTCGCCGACTTCTTAAACAAGAGTGTTGTGTGCAGTCTAGCCTA ATACGTGAAATTGTTATGAATACACGTCCATATGATTTGGAGGTGCTACTTCAAGATGCTTTGCAGTCCTGCG AAGCAGTTTTGGTTACACCCCCTCTAGGTATGTCTCTGGAGGCATGCTATGTGAGAGGTTGTAATCCTAATGG ATGGACCATGGGTTTGTTTCGGCGTAGAAGTGTGTGTAACACTGGTCGTTGCGCTGTTAACAAGCATGTGGCC TATCAGCTATATATGATTGATCCTGCGGGTGTCTGTTTTGGTGCAGGTCAATTTGTGGGTTGGGTTATACCCT TAGCCTTTATGCCTGTGCAATCCCGGAAATTTATTGTTCCTAGGGTTATGTACTTGCGTAAGTGTGGCGAAAA GGGTGCCTACAATAAAGATCATAAACGTGGCGGTTTTGAACACGTTTATAATTTTAAAGTTGAGGATGCTTAC GACCTGGTTCATGATGAGCCTAAGGGTAAGTTTTCTAAGAAGGCTTATGCTTTAATTAGAGGATACCGTGGTG TTAAACCGCTTCTCTATGTAGACCAGTATGGTTGTGATTATACTGGTGGTCTTGCAGATGGCTTAGAGGCTTA TGCTGATAAGACATTGCAAGAAATGAAGGCATTATTTCCTATTTGGAGCCAGGAACTCCCTTTTGATGTAACT GTGGCATGGCACGTTGTGCGTGATCCACGTTATGTTATGAGACTGCAGAGTGCTTCTACTATACGTAGTGTTG CATATGTTGCTAACCCTACTGAAGACTTGTGTGATGGTTCTGTTGTTATAAAGGAACCTGTGCATGTTTATGC GGATGACTCTATTATTTTACGTCAACATAATTTAGTTGACATTATGAGTTGTTTTTATATGGAGGCAGATGCA GTTGTAAATGCTTTTTATGGTGTTGATTTGAAAGATTGTGGTTTTGTTATGCAGTTTGGTTATATTGACTGCG AACAAGACTTGTGTGATTTTAAAGGTTGGGTTCCTGGTAATATGATAGATGGTTTTGCTTGCACTACTTGTGG TCATGTTTATGAGACAGGTGATTTGCTAGCACAATCTTCAGGTGTTTTGCCTGTTAATCCTGTATTGCATACT AAGAGTGCAGCAGGTTATGGTGGTTTTGGTTGTAAGGATTCTTTTACCCTGTATGGCCAAACTGTAGTTTATT TTGGAGGTTGTGTGTATTGGAGTCCAGCACGTAATATATGGATTCCTATATTAAAATCTTCTGTTAAGTCTTA TGACGGTTTGGTTTATACTGGAGTTGTAGGTTGCAAGGCTATTGTAAAGGAAACAAATCTCATTTGCAAAGCG 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AGGAGAAGTTGGATAACCCTAGTAGTTCAGAGGTGGATATAGTATGCTCCACCACTGCGCAAAAGCTGGAAAC AGGCGGAATTTGTCCTGAAAATCATGTGATGGTGGATTGTCGCCGACTTCTTAAACAAGAGTGTTGTGTGCAG TCTAGCCTAATACGTGAAATTGTTATGAATACACGTCCATATGATTTGGAGGTGCTACTTCAAGATGCTTTGC AGTCCTGCGAAGCAGTTTTGGTTACACCCCCTCTAGGTATGTCTCTGGAGGCATGCTATGTGAGAGGTTGTAA TCCTAATGGATGGACCATGGGTTTGTTTCGGCGTAGAAGTGTGTGTAACACTGGTCGTTGCGCTGTTAACAAG CATGTGGCCTATCAGCTATATATGATTGATCCTGCGGGTGTCTGTTTTGGTGCAGGTCAATTTGTGGGTTGGG TTATACCCTTAGCCTTTATGCCTGTGCAATCCCGGAAATTTATTGTTCCTAGGGTTATGTACTTGCGTAAGTG TGGCGAAAAGGGTGCCTACAATAAAGATCATAAACGTGGCGGTTTTGAACACGTTTATAATTTTAAAGTTGAG GATGCTTACGACCTGGTTCATGATGAGCCTAAGGGTAAGTTTTCTAAGAAGGCTTATGCTTTAATTAGAGGAT ACCGTGGTGTTAAACCGCTTCTCTATGTAGACCAGTATGGTTGTGATTATACTGGTGGTCTTGCAGATGGCTT AGAGGCTTATGCTGATAAGACATTGCAAGAAATGAAGGCATTATTTCCTATTTGGAGCCAGGAACTCCCTTTT GATGTAACTGTGGCATGGCACGTTGTGCGTGATCCACGTTATGTTATGAGACTGCAGAGTGCTTCTACTATAC GTAGTGTTGCATATGTTGCTAACCCTACTGAAGACTTGTGTGATGGTTCTGTTGTTATAAAGGAACCTGTGCA 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CATTTCTTTAAGACTTTTACTACTAGCACTGCTCTTGCATTTGCATGGGTTTTATTTCATGTTTTGCATGGTG CTTATATAGTAGTGGAGAGTGATATATATTTTGTTAAAAACATTCCTCGTTATGCTAGTGCTGTTGCACAAGC ATTTCGGAGTGTTGCTAAAGTTGTACTGGACTCTTTAAGAGTTACTTTTATTGATGGCCTTTCTTGTTTTAAG ATTGGACGTAGAAGAATTTGTCTTTCAGGCAGTAAAATTTATGAAGTTGAGCGTGGCTTGTTACATTCATCTC AATTGCCATTAGATGTTTATGATTTAACCATGCCTAGTCAAGTTCAGAAAACCAAGCAAAAACCTATTTATTT AAAAGGTTCTGGTTCTGATTTTTCATTAGCGGATAGTGTAGTTGAAGTTGTTACAACTTCACTTACACCATGT GGTTATTCTGAACCACCTAAAGTTGCAGATAAAATTTGCATTGTGGATAATGTTTATATGGCCAAGGCTGGTG ACAAATATTACCCTGTTGTGGTTGATGGTCATGTTGGACTTTTGGATCAAGCATGGAGGGTTCCTTGTGCTGG AAGGCGTGTTACATTTAAGGAACAGCCTACAGTAAATGAGATTGCAAGCACGCCTAAGACTATTAAAGTTTTT TATGAGCTTGACAAAGATTTTAATACTATTTTAAACACTGCATGTGGAGTGTTTGAAGTGGATGATACTGTGG ATATGGAGGAATTTTATGCTGTGGTGATTGATGCCATAGAAGAGAAACTTTCTCCATGTAAGGAGCTTGAAGG TGTAGGTGCTAAAGTTAGTGCCTTTTTACAGAAATTAGAGGATAATTCCCTATTTTTATTTGATGAGGCTGGT GAGGAAGTTCTTGCTCCTAAATTGTATTGTGCTTTTACAGCTCCTGAAGATGATGACTTTCTTGAAGAAAGTG 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WNCNVDKYPPNAVVCRFDTRVLNNLNLPGCNGGSLYVNKHAFHTKPFSRAAFEHLKPMPFFYYSDTPCVYMDG MDAKQVDYVPLKSATCITRCNLGGAVCLKHAEEYREYLESYNTATTAGFTFWVYKTFDFYNLWNTFTKLQSLE NVVYNLVKTGHYTGQAGEMPCAIINDKVVAKIDKEDVVIFINNTTYPTNVAVELFAKRSIRHHPELKLFRNLN IDVCWKHVIWDYARESIFCSNTYGVCMYTDLKFIDKLNVLFDGRDNGALEAFKRSNNGVYISTTKVKSLSMIR GPPRAELNGVVVDKVGDTDCVFYFAVRKEGQDVIFSQFDSLRVSSNQSPQGNLGSNEPGNVGGNDALATSTIF TQSRVISSFTCRTDMEKDFIALDQDVFIQKYGLEDYAFEHIVYGNFNQKIIGGLHLLIGLYRRQQTSNLVIQE FVSYDSSIHSYFITDEKSGGSKSVCTVIDILLDDFVALVKSLNLNCVSKVVNVNVDFKDFQFMLWCNDEKVMT FYPRLQAASDWKPGYSMPVLYKYLNSPMERVSLWNYGKPVTLPTGCMMNVAKYTQLCQYLNTTTLAVPVNMRV LHLGAGSEKGVAPGSAVLRQWLPAGTILVDNDLYPFVSDSVATYFGDCITLPFDCQWDLIISDMYDPITKNIG EYNVSKDGFFTYICHMIRDKLALGGSVAIKITEFSWNAELYKLMGYFAFWTVFCTNANASSSEGFLIGINYLG KPKVEIDGNVMHANYLFWRNSTVWNGGAYSLFDMAKFPLKLAGTAVINLRADQINDMVYSLLEKGKLLVRDTN KEVFVGDSMVNVI Gene 32 kDa (837 nucleotídeos): SEQ ID NO:13 ATGGCAGTTGCTTATGCAAACAAGCCTAATCACTTTATTAATTTTCCACTTACCCAGTTTGAGGGTTTTGTGT TAAATTATAAAGGTTTACAATTTCAACTTCTCGATGAAGGAGTGGATTGTAAAATACAAACAGCGCCGCACAT TAGTCTTGTTATGCTGGATATTCAGCCTGAAGACTATAGAAGTGTTGATGTTGCTATTCAAGAAGTTATTGAT GACATGCATTGGGGTGAGGGCTTTCAGATTAAATTTGATAACCCCCATATCCTAGGAAGATGCATAGTTTTAG ATGTTAAAGGTGTAGAAGAATTGCATGATGATTTAGTTAATTACATTCGTGATAAAGGTTGTGTTGCTGACCA ATCCAGGAAATGGATTGGACATTGCACCATAGCCCAACTCACGGATGCTGCACTTTCCATTAAGGAAAATGTT GATTTCATAAACAGCATGCAATTCAATTATAAAATCACTATCAACCCCTCATCACCGGCTAGACTTGAAATAG TTAAGCTTGGTGCTGAAAAGAAAGATGGTTTTTATGAAACCATAGTTAGCCACTGGATGGGAATTCGTTTTGA ATATAATCCACCCACTGATAAGCTAGCTATGATTATGGGTTATTGTTGTTTAGAAGTGGTGCGTAAAGAGCTA GAAGAAGGTGATCTTCCCGAGAATGATGATGATGCTTGGTTTAAGCTATCGTACCATTATGAAAACAATTCTT GGTTCTTTCGACATGTCTACAGGAAAAGTTCTTATTTCCGTAAGTCTTGTCAAAATTTAGATTGTAATTGTTT GGGGTTTTATGAATCTCCAGTTGAAGAAGACTAA Proteína 32 kDa (278 aminoácidos) SEQ ID NO:14 MAVAYANKPNHFINFPLTQFEGFVLNYKGLQFQLLDEGVDCKIQTAPHISLVMLDIQPEDYRSVDVAIQEVID DMHWGEGFQIKFDNPHILGRCIVLDVKGVEELHDDLVNYIRDKGCVADQSRKWIGHCTIAQLTDAALSIKENV DFINSMQFNYKITINPSSPARLEIVKLGAEKKDGFYETIVSHWMGIRFEYNPPTDKLAMIMGYCCLEVVRKEL EEGDLPENDDDAWFKLSYHYENNSWFFRHVYRKSSYFRKSCQNLDCNCLGFYESPVEED Gene precursor de hemaglutinina-esterase (HE: 1275 nucleotídeos) SEQ ID NO:3 sem sequência de sinal; SEQ ID NO:23 com a sequência de sinal; a sequência de sinal está em negrito: ATGTTTTTGCTTCTTAGATTTGTTCTAGTTAGCTGCATAATTGGTAGCCTAGGTTTTGATAACCCTCCTACCA ATGTTGTTTCGCATTTAAATGGAGATTGGTTTTTATTTGGTGACAGTCGTTCAGATTGTAATCATGTTGTTAA TACCAACCCCCGTAATTATTCTTATATGGACCTTAATCCTGCCCTGTGTGATTCTGGTAAAATATCATCTAAA GCTGGCAACTCCATTTTTAGGAGTTTTCACTTTACCGATTTTTATAATTACACAGGCGAAGGTCAACAAATTA TTTTTTATGAGGGTGTTAATTTTACGCCTTATCATGCCTTTAAATGCACCACTTCTGGTAGTAATGATATTTG GATGCAGAATAAAGGCTTGTTTTACACTCAGGTTTATAAGAATATGGCTGTGTATCGCAGCCTTACTTTTGTT AATGTACCATATGTTTATAATGGCTCTGCACAATCTACAGCTCTTTGTAAATCTGGTAGTTTAGTTCTTAATA ACCCTGCATATATAGCTCGTGAAGCTAATTTTGGGGATTATTATTATAAGGTTGAAGCTGACTTTTATTTGTC AGGTTGTGACGAGTATATCGTACCACTTTGTATTTTTAACGGCAAGTTTTTGTCGAATACAAAGTATTATGAT GATAGTCAATATTATTTTAATAAAGACACTGGTGTTATTTATGGTCTCAATTCTACTGAAACCATTACCACTG GTTTTGATTTTAATTGTCATTATTTAGTTTTACCCTCTGGTAATTATTTAGCCATTTCAAATGAGCTATTGTT AACTGTTCCTACGAAAGCAATCTGTCTTAACAAGCGTAAGGATTTTACGCCTGTACAGGTTGTTGATTCACGG TGGAACAATGCCAGGCAGTCTGATAACATGACGGCGGTTGCTTGTCAACCCCCGTACTGTTATTTTCGTAATT CTACTACCAACTATGTTGGTGTTTATGATATCAATCATGGGGATGCTGGTTTTACTAGCATACTCAGTGGTTT GTTATATGATTCACCTTGTTTTTCGCAGCAAGGTGTTTTTAGGTATGATAATGTTAGCAGTGTCTGGCCTCTC TATTCCTATGGCAGATGCCCTACTGCTGCTGGTATTAATACCCCTGATGTACCTATTTGTGTGTATGATCCGC TACCACTTATTTTGCTTGGCATCCTTTTGGGTGTTGCGGTCATAATTATTGTAGTTTTGTTGTTATATTTTAT GGTGGATAATGGTACTAGGCTGCATGATGCTTAG Proteína precursora de hemaglutinina-esterase (HE: 424 aminoácidos) SEQ ID NO: 4 sem sequência de sinal; SEQ ID NO: 24 com a sequência de sinal; a sequência de sinal está em negrito: MFLLLRFVLVSCIIGSLGFDNPPTNVVSHLNGDWFLFGDSRSDCNHVVNTNPRNYSYMDLNPALCDSGKISSK AGNSIFRSFHFTDFYNYTGEGQQIIFYEGVNFTPYHAFKCTTSGSNDIWMQNKGLFYTQVYKNMAVYRSLTFV NVPYVYNGSAQSTALCKSGSLVLNNPAYIAREANFGDYYYKVEADFYLSGCDEYIVPLCIFNGKFLSNTKYYD DSQYYFNKDTGVIYGLNSTETITTGFDFNCHYLVLPSGNYLAISNELLLTVPTKAICLNKRKDFTPVQVVDSR WNNARQSDNMTAVACQPPYCYFRNSTTNYVGVYDINHGDAGFTSILSGLLYDSPCFSQQGVFRYDNVSSVWPL YSYGRCPTAAGINTPDVPICVYDPLPLILLGILLGVAVIIIVVLLLYFMVDNGTRLHDA Gene precursor de proteína espicular (4092 nucleotídeos) SEQ ID NO:1 sem sequência de sinal; SEQ ID NO:21 com a sequência de sinal; a sequência de sinal está em negrito: ATGTTTTTGATACTTTTAATTTCCTTACCAATGGCTTTTGCTGTTATAGGAGATTTAAAGTGTACTACGGTTG CCATTAATGATGTTGACACCGGTCCTCCTTCTATTAGCACTGATATTGTCGATGTTACTAATGGTTTAGGTAC TTATTATGTTTTAGATCGTGTGTATTTAAATACTACGTTGTTGCTTAATGGTTACTACCCTACTTCAGGTTCT ACATATCGTAATATGGCACTGAAGGGAACTTTACTATTGAGCAGACTATGGTTTAAACCACCTTTTCTTTCTG ATTTTATTAATGGTATTTTTGCTAAGGTCAAAAATACCAAGGTTATTAAAAAGGGTGTAATGTATAGTGAGTT TCCTGCTATAACTATAGGTAGTACTTTTGTAAATACATCCTATAGTGTGGTAGTACAACCACATACTACCAAT TTGGATAATAAATTACAAGGTCTCTTAGAGATCTCTGTTTGCCAGTATACTATGTGCGAGTACCCACATACGA TTTGTCATCCTAATCTGGGTAATCGACGCGTAGAACTATGGCATTGGGATACAGGTGTTGTTTCCTGTTTATA TAAGCGTAATTTCACATATGATGTGAATGCTGATTACTTGTATTTCCATTTTTATCAAGAAGGTGGTACTTTT TATGCATATTTTACAGACACTGGTGTTGTTACTAAGTTTCTGTTTAATGTTTATTTAGGCACGGTGCTTTCAC ATTATTATGTCCTGCCTTTGACTTGTTCTAGTGCTATGACTTTAGAATATTGGGTTACACCTCTCACTTCTAA ACAATATTTACTAGCTTTCAATCAAGATGGTGTTATTTTTAATGCTGTTGATTGTAAGAGTGATTTTATGAGT GAGATTAAGTGTAAAACACTATCTATAGCACCATCTACTGGTGTTTATGAATTAAACGGTTACACTGTTCAGC CAATTGCAGATGTTTACCGACGTATACCTAATCTTCCCGATTGTAATATAGAGGCTTGGCTTAATGATAAGTC GGTGCCCTCTCCATTAAATTGGGAACGTAAGACCTTTTCAAATTGTAATTTTAATATGAGCAGCCTGATGTCT TTTATTCAGGCAGACTCATTTACTTGTAATAATATTGATGCTGCTAAGATATATGGTATGTGTTTTTCCAGCA TAACTATAGATAAGTTTGCTATACCCAATGGTAGGAAGGTTGACCTACAATTGGGCAATTTGGGCTATTTGCA GTCTTTTAACTATAGAATTGATACTACTGCTACAAGTTGTCAGTTGTATTATAATTTACCTGCTGCTAATGTT TCTGTTAGCAGGTTTAATCCTTCTACTTGGAATAGGAGATTTGGTTTTACAGAACAATCTGTTTTTAAGCCTC AACCTGCAGGTGTTTTTACTCATCATGATGTTGTTTATGCACAACATTGTTTTAAAGCTCCCACAAATTTCTG TCCGTGTAAATTGGATGGGTCTTTGTGTGTAGGTAATGGTCCTGGTATAGATGCTGGTTATAAAAATAGTGGT ATAGGCACTTGTCCTGCAGGTACTAATTATTTAACTTGCCATAATGCTGCCCAATGTGATTGTTTGTGCACTC CCGACCCCATTACATCTAAATCTACAGGGCCTTACAAGTGCCCCCAAACTAAATACTTAGTTGGCATAGGTGA GCACTGTTCGGGTCTTGCTATTAAAAGTGATTATTGTGGAGGTAATCCTTGTACTTGCCAACCACAAGCATTT TTGGGTTGGTCTGCTGACTCTTGTTTACAAGGGGATAGGTGTAATATTTTTGCTAATTTTATTTTTCATGATG TTAATAGTGGTACTACTTGTTCTACTGATTTACAAAAATCAAACACAGACATAATTCTTGGTGTTTGTGTTAA TTATGATCTTTATGGTATTATAGGCCAAGGTGTTTTTGTTGAGGTTAATGCGACTTATTATAATAGTTGGCAG AACCTTTTATATGATTCTAATGGTAATCTCTATGGTTTTAGAGACTACTTAACAAACAGAACTTTTATGATTC GTAGTTGCTATAGCGGTCGTGTTTCAGCGGCCTTTCATGCTAACTCTTCCGAACCAGCATTGCTATTTCGGAA TATTAAATGCAATTACGTTTTTAATAATATTCTTTCACGACAGCTGCAACCTATTAACTATTTTGATAGTTAT CTTGGTTGTGTTGTCAATGCTGATAATAGTACTTCTAGTGTTGTTCAAACATGTGATCTCACAGTAGGTAGTG GTTACTGTGTGGATTACTCTACAAAAAGACGAAGTCGTAGAGCGATTACCACTGGTTATCGGTTTACTAATTT TGAGCCATTTACTGTTAATTCAGTAAATGATAGTTTAGAACCTGTAGGTGGTTTGTATGAAATTCAAATACCT TCAGAGTTTACTATAGGTAATATGGAGGAGTTTATTCAAACAAGCTCTCCTAAAGTTACTATTGATTGTTCTG CTTTTGTCTGTGGTGATTATGCAGCATGTAAATCACAGTTGGTTGAATATGGTAGCTTCTGTGACAATATTAA TGCTATACTCACAGAAGTAAATGAACTACTTGACACTACACAGTTGCAAGTAGCTAATAGTTTAATGAATGGT GTCACTCTTAGCACTAAGCTTAAAGATGGCGTTAATTTCAATGTAGACGACATCAATTTTTCCCCTGTATTAG GTTGTTTAGGAAGCGGTTGTAATAAAGGTTCCAGTAGATCTGCTATAGAGGATTTACTTTTTTCTAAAGTAAA GTTATCTGATGTCGGTTTCGTTGAGGCTTATAATAATTGTACTGGAGGTGCCGAAATTAGGGACCTCATTTGT GTGCAAAGTTATAATGGTATCAAAGTGTTGCCTCCACTGCTCTCAGTAAATCAGATCAGTGGATACACTTTGG CTGCCACCTCTGCTAGTCTGTTTCCTCCTTGGTCAGCAGCAGCAGGTGTACCATTTTATTTAAATGTTCAGTA TCGTATTAATGGGCTTGGTGTTACCATGGATGTGTTAAGTCAAAATCAAAAGCTTATTGCTAATGCATTTAAC AATGCTCTTGATGCTATTCAGGAAGGGTTTGATGCTACCAATTCTGCTTTAGTTAAAATTCAAGCTGTTGTTA ATGCAAATGCTGAAGCTCTTAATAACTTATTGCAACAACTCTCTAATAGATTTGGTGCTATAAGTTCTTCTTT ACAAGAAATTCTATCTAGACTGGATGCTCTTGAAGCGCAAGCTCAGATAGACAGACTTATTAATGGGCGTCTT ACCGCTCTTAATGCTTATGTTTCTCAACAGCTTAGTGATTCTACACTAGTAAAATTTAGTGCAGCACAAGCTA TGGAGAAGGTTAATGAATGTGTCAAAAGCCAATCATCTAGGATAAATTTTTGTGGTAATGGTAATCATATTAT ATCATTAGTGCAGAATGCTCCATATGGTTTGTATTTTATCCACTTTAGCTATGTCCCTACTAAGTATGTCACT GCGAAGGTTAGTCCCGGTCTGTGCATTGCTGGTGATAGAGGTATAGCCCCTAAGAGTGGTTATTTTGTTAATG TAAATAATACTTGGATGTTCACTGGTAGTGGTTATTACTACCCTGAACCCATAACTGGAAATAATGTTGTTGT TATGAGTACCTGTGCTGTTAACTATACTAAAGCGCCGGATGTAATGCTGAACATTTCAACACCCAACCTCCAT GATTTTAAGGAAGAGTTGGATCAATGGTTTAAAAACCAAACATCAGTGGCACCAGATTTGTCACTTGATTATA TAAATGTTACATTCTTGGACCTACAAGATGAAATGAATAGGTTACAGGAGGCAATAAAAGTTTTAAATCAGAG CTACATCAATCTCAAGGACATTGGTACATATGAGTATTATGTAAAATGGCCTTGGTATGTATGGCTTTTAATT GGCTTTGCTGGTGTAGCTATGCTTGTTTTACTATTCTTCATATGCTGTTGTACAGGATGTGGGACTAGTTGTT TTAAGATATGTGGTGGTTGTTGTGATGATTATACTGGACACCAGGAGTTAGTAATTAAAACATTACATGACGA CTAA Proteína precursora de proteína espicular (1363 aminoácidos) SEQ ID NO:2 sem sequência de sinal; SEQ ID NO: 22 com a sequência de sinal; a sequência de sinal está em negrito: MFLILLISLPMAFAVIGDLKCTTVAINDVDTGPPSISTDIVDVTNGLGTYYVLDRVYLNTTLLLNGYYPTSGS TYRNMALKGTLLLSRLWFKPPFLSDFINGIFAKVKNTKVIKKGVMYSEFPAITIGSTFVNTSYSVVVQPHTTN LDNKLQGLLEISVCQYTMCEYPHTICHPNLGNRRVELWHWDTGVVSCLYKRNFTYDVNADYLYFHFYQEGGTF YAYFTDTGVVTKFLFNVYLGTVLSHYYVLPLTCSSAMTLEYWVTPLTSKQYLLAFNQDGVIFNAVDCKSDFMS EIKCKTLSIAPSTGVYELNGYTVQPIADVYRRIPNLPDCNIEAWLNDKSVPSPLNWERKTFSNCNFNMSSLMS FIQADSFTCNNIDAAKIYGMCFSSITIDKFAIPNGRKVDLQLGNLGYLQSFNYRIDTTATSCQLYYNLPAANV SVSRFNPSTWNRRFGFTEQSVFKPQPAGVFTHHDVVYAQHCFKAPTNFCPCKLDGSLCVGNGPGIDAGYKNSG IGTCPAGTNYLTCHNAAQCDCLCTPDPITSKSTGPYKCPQTKYLVGIGEHCSGLAIKSDYCGGNPCTCQPQAF LGWSADSCLQGDRCNIFANFIFHDVNSGTTCSTDLQKSNTDIILGVCVNYDLYGIIGQGVFVEVNATYYNSWQ NLLYDSNGNLYGFRDYLTNRTFMIRSCYSGRVSAAFHANSSEPALLFRNIKCNYVFNNILSRQLQPINYFDSY LGCVVNADNSTSSVVQTCDLTVGSGYCVDYSTKRRSRRAITTGYRFTNFEPFTVNSVNDSLEPVGGLYEIQIP SEFTIGNMEEFIQTSSPKVTIDCSAFVCGDYAACKSQLVEYGSFCDNINAILTEVNELLDTTQLQVANSLMNG VTLSTKLKDGVNFNVDDINFSPVLGCLGSGCNKGSSRSAIEDLLFSKVKLSDVGFVEAYNNCTGGAEIRDLIC VQSYNGIKVLPPLLSVNQISGYTLAATSASLFPPWSAAAGVPFYLNVQYRINGLGVTMDVLSQNQKLIANAFN NALDAIQEGFDATNSALVKIQAVVNANAEALNNLLQQLSNRFGAISSSLQEILSRLDALEAQAQIDRLINGRL TALNAYVSQQLSDSTLVKFSAAQAMEKVNECVKSQSSRINFCGNGNHIISLVQNAPYGLYFIHFSYVPTKYVT AKVSPGLCIAGDRGIAPKSGYFVNVNNTWMFTGSGYYYPEPITGNNVVVMSTCAVNYTKAPDVMLNISTPNLH DFKEELDQWFKNQTSVAPDLSLDYINVTFLDLQDEMNRLQEAIKVLNQSYINLKDIGTYEYYVKWPWYVWLLI GFAGVAMLVLLFFICCCTGCGTSCFKICGGCCDDYTGHQELVIKTLHDD Gene 4,9 kDA (132 nucleotídeos) SEQ ID NO:15 ATGACGACTAAGTTCGTCTTTGATTTATTGGCTCCTGACGATATATTACATCCCTTCAATCATGTGAAGCTAA TTATAAGACCCATTGAGGTCGAGCATATTATAATAGCTACCACAATGCCTGCTGTTTAG Proteína 4,9 kDA (43 aminoácidos) SEQ ID NO:16 MTTKFVFDLLAPDDILHPFNHVKLIIRPIEVEHIIIATTMPAV Gene 4,8 kDA (138 nucleotídeos) SEQ ID NO:17 ATGCCAATGGCTACAACCATTGACGGTACAGATTATACTAATATTATGCCTAGTACTGTTTCTACAACAGTTT ATTTAGGCTGTTCTATAGGTATTGACACTAGCACCACTGGTTTTACCTGTTTTTCACGGTACTAG Proteína 4,8 kDA (45 aminoácidos) SEQ ID NO:18 MPMATTIDGTDYTNIMPSTVSTTVYLGCSIGIDTSTTGFTCFSRY Gene 12,7 kDa (330 nucleotídeos) SEQ ID NO:19 ATGGACATCTGGAGACCTGAGATTAAATATCTCCGTTATATTAACGGTTTTAATGTCTCAGAATTAGAAGATG CTTGTTTTAAATTTAACTATAAATTTCCTAAAGTAGGATATTGTAGAGTTCCTAGTCATGCTTGGTGCCGTAA TCAAGGTAGCTTTTGTGCTACACTCACTCTTTATGGCAAATCCAAACATTATGATAAATATTTTGGAGTAATA ACTGGTTTTACAGCATTCGCTAATACTGTAGAGGAGGCTGTTAACAAACTGGTTTTCTTAGCTGTTGACTTTA TTACCTGGCGGAGACAGGAGTTAAATGTTTATGGCTGA Proteína 12,7 kDa (109 aminoácidos) SEQ ID NO:20 MDIWRPEIKYLRYINGFNVSELEDACFKFNYKFPKVGYCRVPSHAWCRNQGSFCATLTLYGKSKHYDKYFGVI TGFTAFANTVEEAVNKLVFLAVDFITWRRQELNVYG Proteína de envelope pequeno (gene E) (255 nucleotídeos) SEQ ID NO:7 ATGTTTATGGCTGATGCTTATTTTGCAGACACTGTGTGGTATGTGGGGCAAATAATTTTTATAGTTGCCATTT GTTTATTGGTTATAATAGTTGTAGTGGCATTTTTGGCAACTTTTAAATTGTGTATTCAACTTTGCGGTATGTG TAATACCTTAGTACTGTCCCCTTCTATTTATGTGTTTAATAGAGGTAGGCAGTTTTATGAGTTTTACAACGAT GTAAAACCACCAGTTCTTGATGTGGATGACGTTTAG Proteína de envelope pequeno (gene E) (84 aminoácidos) SEQ ID NO:8 MFMADAYFADTVWYVGQIIFIVAICLLVIIVVVAFLATFKLCIQLCGMCNTLVLSPSIYVFNRGRQFYEFYND VKPPVLDVDDV Proteína de envelope multiexpansível (gene M) (693 nucleotídeos) SEQ ID NO:5 ATGAGTAGTGTAACTACACCAGCACCAGTTTACACCTGGACTGCTGATGAAGCTATTAAATTCCTAAAGGAAT GGAACTTTTCTTTGGGTATTATACTACTTTTTATTACAATCATATTGCAATTTGGATATACAAGTCGCAGTAT GTTTGTTTATGTTATTAAGATGATCATTTTGTGGCTTATGTGGCCCCTTACTATCATCTTAACTATTTTCAAT TGCGTGTATGCGTTGAATAATGTGTATCTTGGCTTTTCTATAGTTTTCACTATAGTGGCCATTATCATGTGGA TTGTGTATTTTGTGAATAGTATCAGGTTGTTTATTAGAACTGGAAGTTGGTGGAGTTTCAACCCAGAAACAAA CAACTTGATGTGTATAGATATGAAGGGAAGGATGTATGTTAGGCCGATAATTGAGGACTACCATACCCTTACG GTCACAATAATACGTGGTCATCTTTACATGCAAGGTATAAAACTAGGTACTGGCTATTCTTTGTCAGATTTGC CAGCTTATGTGACTGTTGCTAAGGTCTCACACCTGCTCACGTATAAGCGTGGTTTTCTTGACAAGATAGGCGA TACTAGTGGTTTTGCTGTTTATGTTAAGTCCAAAGTCGGTAATTACCGACTGCCATCAACCCAAAAGGGTTCT GGCATGGACACCGCATTGTTGAGAAATATAATCTAA Proteína de envelope multiexpansível (gene M) (230 aminoácidos) SEQ ID NO:6 MSSVTTPAPVYTWTADEAIKFLKEWNFSLGIILLFITIILQFGYTSRSMFVYVIKMIILWLMWPLTIILTIFN CVYALNNVYLGFSIVFTIVAIIMWIVYFVNSIRLFIRTGSWWSFNPETNNLMCIDMKGRMYVRPIIEDYHTLT VTIIRGHLYMQGIKLGTGYSLSDLPAYVTVAKVSHLLTYKRGFLDKIGDTSGFAVYVKSKVGNYRLPSTQKGS GMDTALLRNII Proteína nucleocapsídeo (gene N) (1347 nucleotídeos) SEQ ID NO:9 ATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCAATCCAGTAGTAGAGCGTCCTCTGGAAATCGTTCTGGTAATGGCATCCTTA AGTGGGCCGATCAGTCCGACCAATCTAGAAATGTTCAAACCAGGGGTAGAAGAGCTCAACCCAAGCAAACTGC TACTTCTCAGCTACCATCAGGAGGGAATGTTGTACCCTACTATTCTTGGTTCTCTGGAATTACTCAGTTTCAA AAAGGAAAGGAGTTTGAATTTGCAGAGGGACAAGGTGTGCCTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACTGAAGCTA AGGGGTACTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTTTAAAACAGCCGATGGCAACCAGCGTCAACTGCTGCCACG ATGGTATTTTTACTATCTTGGAACAGGACCGCATGCCAAAGACCAGTATGGCACCGATATTGACGGTGTCTTC TGGGTCGCTAGTAACCAGGCTGATGTCAATACCCCGGCTGACATTCTCGATCGGGACCCAAGTAGCGATGAGG CTATTCCGACTAGGTTTCCGCCTGGCACGGTACTCCCTCAGGGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGC TCCTAATTCCAGATCTACTTCACGCGCATCCAGTAGAGCCTCTAGTGCAGGATCGCGTAGTAGAGCCAATTCT GGCAACAGAACCCCTACCTCTGGTGTAACACCTGATATGGCTGATCAAATTGCTAGTCTTGTTCTGGCAAAAC TTGGCAAGGATGCCACTAAGCCACAGCAAGTAACTAAGCAGACTGCCAAAGAAATCAGACAGAAAATTTTGAA TAAGCCCCGCCAGAAGAGGAGCCCCAATAAACAATGCACTGTTCAGCAGTGTTTTGGGAAGAGAGGCCCCAAT CAGAATTTTGGTGGTGGAGAAATGTTAAAACTTGGAACTAGTGACCCACAGTTCCCCATTCTTGCAGAACTCG CACCCACAGCTGGTGCGTTTTTCTTTGGATCAAGATTAGAGTTGGCCAAAGTGCAGAATTTGTCTGGGAATCT TGACGAGCCCCAGAAGGATGTTTATGAATTGCGCTATAATGGTGCAATTAGATTTGACAGTACACTTTCAGGT TTTGAGACCATAATGAAGGTGTTGAATGAGAATTTGAATGCATATCAACAACAAGATGGTATGATGAATATGA GTCCAAAACCACAGCGTCAGCGTGGTCAGAAGAATGGACAAGGAGAAAATGATAATATAAGTGTTGCAGCGCC TAAAAGCCGTGTGCAGCAAAATAAGAGTAGAGAGTTGACTGCAGAGGACATCAGCCTTCTTAAGAAGATGGAT GAGCCCTATACTGAAGACACCTCAGAAATATAA Proteína nucleocapsídeo (gene N) (448 aminoácidos) SEQ ID NO:10 MSFTPGKQSSSRASSGNRSGNGILKWADQSDQSRNVQTRGRRAQPKQTATSQLPSGGNVVPYYSWFSGITQFQ KGKEFEFAEGQGVPIAPGVPATEAKGYWYRHNRRSFKTADGNQRQLLPRWYFYYLGTGPHAKDQYGTDIDGVF WVASNQADVNTPADILDRDPSSDEAIPTRFPPGTVLPQGYYIEGSGRSAPNSRSTSRASSRASSAGSRSRANS GNRTPTSGVTPDMADQIASLVLAKLGKDATKPQQVTKQTAKEIRQKILNKPRQKRSPNKQCTVQQCFGKRGPN QNFGGGEMLKLGTSDPQFPILAELAPTAGAFFFGSRLELAKVQNLSGNLDEPQKDVYELRYNGAIRFDSTLSG FETIMKVLNENLNAYQQQDGMMNMSPKPQRQRGQKNGQGENDNISVAAPKSRVQQNKSRELTAEDISLLKKMD EPYTEDTSEI
EXEMPLO 3 DETECÇÃO DE CORONAVÍRUS BOVINO EM TECIDOS RESPIRATÓRIOS E ENTÉRICOS
[0080] Um estudo foi realizado usando dezenove (19) bezerros privados de colostro, três a quatro dias de idade. Dois (2) dos bezerros foram necropsiados antes do desafio para coletar os tecidos de controle negativo. No mesmo dia, os restantes 17 bezerros foram desafiados pela via oral e intranasal com a cepa virulenta de BCV MN-1988. Os bezerros foram novamente estimulados no dia seguinte com a mesma dose de vírus de desafio, mas somente pela via intranasal. Os bezerros foram observados diariamente, para sinais clínicos associados com a infecção por BCV. Foram coletados diariamente esfregaços nasais e fecais e amostras de sangue para sorologia foram coletadas antes do desafio e no dia de necropsia. Em cada um dos dias de estudo 4, 6, 8, 11 e 13 após-desafio, bezerros selecionados foram submetidos a eutanásia e realizada uma necropsia. Os bezerros foram examinados em patologia grosseira e tecidos respiratórios e entéricos foram coletados. Os tecidos foram enviados para um laboratório independente para histopatologia e imuno-histoquímica (IHC), e para testes por PCR quantitativa em tempo real para a presença de BCV.
[0081] A descarga nasal moderada e grave foi observada em 13 dos 17 bezerros após o desafio com BCV. O período de pico da doença foi de três a oito dias após desafio, e BCV foi detectado em esfregaços nasais durante este período de pico de sinais clínicos. BCV foi detectado por PCR nos tecidos respiratórios superiores das conchas nasais, traqueia, amígdala, brônquios e linfonodos brônquicos de 12 de 17 bezerros após o desafio, mas foi detectado em tecidos pulmonares de apenas 4 dos 17 bezerros. O período de pico de detecção de BCV nos tecidos respiratórios foi de quatro a seis dias após o desafio, mas BCV não foi detectado após o dia oito. Foram observadas pequenas lesões grosseiras e histopatológicas em tecidos respiratórios de 7 dos 17 bezerros, mas tecido respiratório de apenas um destes 7 bezerros foi IHC positivo para BCV. Diarreia moderada e grave foi observada em 11 de 17 bezerros nos dias três a seis após o desafio. BCV foi detectado por PCR em esfregaços fecais e tecidos intestinais durante estes mesmos dias e persistiu nestas amostras até o dia 11 após o desafio. Lesões grosseiras e microscópicas e histopatologia foram observadas nos tecidos intestinais de 7 dos 17 bezerros em dias 4 e 6 após o desafio e estes tecidos foram positivos por IHC. Este estudo demonstrou que BCV é detectado primariamente nos tecidos respiratórios superiores, comparado com tecidos respiratórios inferiores, e a detecção de BCV está correlacionada com doença respiratória. BCV coloniza tecidos respiratórios superiores, mas causa pouca ou nenhuma patologia. Conclusões: • BCV coloniza principalmente os tecidos respiratórios superiores em comparação com os tecidos respiratórios inferiores, como detectado por PCR, e é detectado de modo ótimo dentro de seis dias após o desafio de BCV. • Infecção dos tecidos respiratórios por BCV produz pouca ou nenhuma lesão grosseira ou microscópica sendo pouco detectado nos tecidos respiratórios por IHC. • BCV é detectado de modo ótimo por PCR em tecidos intestinais até dia 11 após o desafio com BCV. • Infecção por BCV de tecidos intestinais por BCV produz lesões grosseiras e microscópicas e BCV é associado a lesões e histopatologia de tecidos entéricos, como determinado por IHC.
[0082] Deve ser entendido que todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para descrever ácidos nucleicos e polipeptídeos, de acordo com a invenção, são aproximados dentro de variações de medição convencionais.

Claims (11)

1. Coronavirus bovino atenuado (BCoV), caracterizado pelo fato de que codifica um ou mais de: - uma proteína espicular que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; - uma glicoproteína hemaglutinina-esterase (HE) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; - uma proteína de membrana integral (M) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou - uma proteína de nucleocapsídeo (N) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
2. Coronavírus bovino atenuado (BCoV) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o BCoV é um isolado tendo o número de depósito ATCC PTA-121515 ou progênie ou derivados do mesmo.
3. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o BCoV como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o BCoV atenuado é vivo.
5. Vacina de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que é armazenada congelada antes de descongelamento antes do uso.
6. Vacina de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que é armazenada liofilizada antes da reidratação.
7. Vacina de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que é armazenada como uma vacina estável líquida.
8. Vacina de acordo com a reivindicação 3, 4, 5, 6, ou 7, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais vírus adicionais selecionados dentre o grupo consistindo em um vírus de diarreia viral bovina (BVDV), vírus de rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR), vírus de parainfluenza tipo 3 (PI3), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV), vírus da febre do vale rift (RVFV) e qualquer combinação dos mesmos.
9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que os referidos um ou mais dos vírus adicionais é um BVDV selecionado dentre o grupo consistindo em BVDV1, BVDV2, e a combinação de BVDV1 e BVDV2.
10. Vacina de acordo com a reivindicação 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais bactérias selecionadas dentre o grupo consistindo em uma Pasteurella multocida, uma Mannheimia haemolytica, uma Histophilus somni, uma Mycoplasma bovis e qualquer combinação das mesmas.
11. Coronavírus bovino atenuado (BCoV) de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para o uso como uma vacina para auxiliar na prevenção de doença respiratória causada por BCoV, na prevenção de doença entérica causada por BCoV, ou na prevenção de ambas as doenças respiratória e entérica causada por BCoV.
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