BR0006291B1 - Bactéria do gênero salmonella, e, vacina para a aproteção de animais contra a salmonelose - Google Patents

Description

"BACTÉRIA DO GÊNERO SALMONELLA, E, VACINA PARA A PROTEÇÃO DE ANIMAIS CONTRA A SALMONELOSE". A presente invenção diz respeito a bactérias de Salmonella para uso em uma vacina, a vacinas com base nestas bactérias, ao uso de tais bactérias para a fabricação de uma vacina, e a processos para a preparação de tais vacinas.

As bactérias do gênero Salmonella são notórias quanto à sua patogenicidade tanto no homem quanto nos animais. Somente nos Estados Unidos, em uma base anual, o número de seres humanos que sofrem de infecções pela Salmonella excede os dois milhões de casos. Na maioria dos casos, a infecção é causada por alimento contaminado. Fontes bem conhecidas de infecção são os ovos (tanto de patos quanto de galinhas), os produtos contendo ovos e carnes não suficientemente cozidas de aves domésticas e de porco. Especialmente em bebês, crianças jovens, pessoas idosas e pacientes imunocomprometidos, a capacidade de lutar contra tais infecções é baixa. Especialmente nestes grupos, o índice anual de mortes devidas às infecções de Salmonella é elevado. Durante as últimas poucas décadas, a criação eficiente de animais em larga escala conduziu a um aumento enorme na densidade de animais. Como resultado, observa-se um aumento do número de infecções nos animais e subsequentes infecções de r seres humanos causadas por alimento infectado. E claro que os animais são a principal fonte de infecção por Salmonella. Esta fonte é muito difícil de se controlar. Antes de mais nada, as infecções de Salmonella, na maioria dos casos, não causam nenhuma doença séria em animais adultos saudáveis; estes animais podem carregar a bactéria por um período prolongado. Durante esse tempo, eles estão espalhando a bactéria em seus excrementos. Isto toma praticamente impossível evitar a infecção nos animais jovens mais vulneráveis. Em segundo lugar, muitas espécies de Salmonella estabelecem colônias em várias espécies diferentes de animais hospedeiros. Algumas das espécies de Salmonella causam infecções primárias em hospedeiros específicos, enquanto outras espécies de Salmonella não são absolutamente restritivas. Como um infectuoso primário, S. typhi e S. paratyphi são frequentemente associados com a infecção no homem. A 5. typhi causa diarréia e, como resultado, desidratação. Esta infecção é muito frequentemente encontrada em áreas tropicais. A S. dublin é associada com o gado vacum, especificamente com animais jovens, em que ela causa infecções letais em mais do que 50% dos casos. A S. abortus-equi causa aborto em cavalos. A S. abortus-ovi causa aborto em ovelhas. A S. choleraesuis é a causa de diarréia letal em porcos jovens. A S. typhimurium e a S. enteritidis causa salmonelose em aves domésticas, porcos, gado vacum e roedores. A 5. arizonae também causa doença em perus. Igualmente os animais não utilizáveis para alimentação, tais como os répteis, sofrem de infecções pela Salmonella, tais como a S. arizonae.

Existe claramente a necessidade de vacinas de Salmonella eficientes. As vacinas são necessárias para proteger os seres humanos contra as infecções de Salmonella transmitidas de homem para homem. Igualmente, as vacinas são necessárias para proteger os seres humanos das infecções de Salmonella transportadas pelo alimento. E, finalmente, as vacinas sao necessárias para proteger os animais contra infecções de Salmonella.

Presentemente, várias vacinas contra as várias espécies de Salmonella acham-se comercialmente disponíveis. Estas vacinas, embora algumas vezes eficazes de um ponto de vista da vacina, no entanto compartilham de uma série de desvantagens. Elas geralmente induzem uma população de anticorpos que é igual àquela de uma infecção com as bactérias do tipo selvagem, porque elas possuem a mesma carga antigênica que a dita bactéria do tipo selvagem. Portanto, uma análise dos anticorpos no soro de um animal positivo quanto à Salmonella não revela por que o animal é positivo. Isto pode ser devido à vacinação, mas pode igualmente bem ser causado por infecção com uma cepa de campo virulenta. Portanto, se um animal for positivo quanto à Salmonella, ele é considerado como sendo infectado. Por conseguinte, ele deveria ter uma assim chamada vacina marcadora. Uma vacina marcadora é uma vacina que pode ser discriminada contra a infecção do tipo selvagem, por exemplo na base de um painel característico de anticorpos, diferente do painel de anticorpos induzido pela infecção do tipo selvagem. Um painel de anticorpos diferente é induzido, por exemplo, quando uma proteína imunogênica presente em uma bactéria do tipo selvagem não está presente em um mutante que é usado para vacinação: o hospedeiro, então, não produzirá anticorpos contra aquela proteína após a vacinação.

Um antígeno marcador tem pelo menos as características seguintes: => ele pode ser deletado sem prejudicar severamente a viabilidade da bactéria. => ele induz anticorpos, quando presente. => ele, quando presente, não contribui para a imunogenicidade da bactéria => sua ausência preferivelmente contribui para a atenuação.

Quando da pesquisa quanto a antígenos marcadores adequados, todos os antígenos conhecidos de Salmonella devem ser considerados. Um antígeno conhecido encontrado com todas as espécies de Salmonella do tipo selvagem, com exceção de algumas subespécies de S. pullorum e S. gallinarum, é o flagelo. Exemplos de espécies de Salmonella que carregam flagelos quando na sua forma de tipo selvagem, são as S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus- equi, paratyphi AeB, derby, hadar, heidelberg, agona e arizonae. Flagelos são estruturas longas projetando-se da superfície celular, que desempenham um importante papel na motilidade e invasão de certas células hospedeiras. t Os flagelos consistem de polímeros longos da proteína chamados flagelina. E sabido que estes flagelos induzem altos níveis de anticorpos. É também sabido que a ausência de flagelos não prejudica significativamente a viabilidade da bactéria fora do hospedeiro: mutantes sem flagelos de praticamente todas as espécies de Salmonella são conhecidos e podem ser cultivados in vitw. Não obstante, uma vez que eles não preenchem, ou o fazem apenas parcialmente, três das quatro exigências do marcador: - embora não essenciais para a sobrevivência fora do hospedeiro, eles desempenham um papel significativo na sobrevivência bacteriana e persistência nos macrófagos hospedeiros, envolvidos em induzir imunidade [Methner, U. e Barrow, P. a, Berl. Münch. Tierãtzl. Wachr. 110: 391-396 (1997), Weinstein et al, Infect. Immun. 46: 819-825 (1984)]. — eles contribuem intensamente para a imunogenicidade da bactéria, uma razão por que eles são igualmente usados como proteínas veículoas para sequências curtas de aminoácidos heterólogos [Joys, T. M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4: 56-59 (1991), Newton, S. M. C. et al., Science 244: 70-72 (1989)]. - Sua ausência não contribui para a atenuação [Lockman, H. A. e Curtiss, R., Infect. & Immun. 58: 137-143 (1990), Methner, U. e Barrow, P. A., Berl. Münch, Tierãzl. Wschr. 110: 391-396 (1997)]. — as bactérias Salmonella flageladas inibem a ligação de outras Salmonellas. As bastérias sem flagelos, no entanto, apresentam um potencial de inibição reduzido em relação a outras Salmonellas flageladas e, portanto, igualmente aumentam o nível global de infecção de Salmonella [Methner, U. e Barrow, P. A., Berl. Münch. Tierãrtzl. Wschr. 110: 391-396 (1997), Weinstein et alInfect. Immun. 46: 819-825 (1984)].

Por estas razões combinadas, o flagelo nunca foi considerado como sendo um antígeno marcador deletável adequado para vacinas de Salmonella.

Surpreendentemente, foi observado agora que, ao contrário da suposição geral, a ausência de flagelos não afetavam o potencial da vacinação de Salmonella. Isto é especialmente surpreendente, em vista do fato de que, nos animais infectados com a Salmonella do tipo selvagem, grandes quantidades de anticorpos contra os flagelos são encontradas, uma vez mais provando sua antigenicidade. É um objeto da presente invenção fornecer pela primeira vez bactérias do gênero Salmonella, que, na sua forma do tipo selvagem carrega flagelos, mas não mais são capazes de induzir anticorpos contra pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou flagelos, para uso em uma vacina para a proteção de seres humanos e animais contra a salmonelose.

Flagelinas são proteínas de cerca de 500 aminoácidos que compreendem vários determinantes antigenicos, isto é, existem várias regiões nas flagelinas contra as quais os anticorpos são originados no animal hospedeiro. Estes determinantes antigênicos foram identificados e localizados por T. M. Joys [Joys, T. M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4: 56-59 (1991)]. Para os fins da presente invenção, as bactérias que não mais são capazes de induzir anticorpos contra pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou de flagelos são consideradas como sendo bactérias que não compreendem flagelina ou flagelos que ainda possuam todos os determinantes antigênicos. Não é necessário remover todos os determinantes antigênicos! é suficiente deletar um dos determinantes antigenicos. A triagem quanto aos anticorpos contra este determinante antigênico no soro de animais soropositivos deve, então, possibilitar a discriminação entre animais vacinados com o marcador e infetados com o tipo selvagem. Tais anticorpos não devem ser encontrados em animais vacinados, enquanto eles devem estar presentes em animais naturalmente infectados. A triagem pode facilmente ser feita com ferramentas de diagnóstico simples em uma base rotineira, como será descrito abaixo.

Muito é presentemente conhecido acerca da síntese de flagelina e a maturação subsequente nos flagelo [por exemplo, em Escherichia coli e na Salmonella typhimurium. Capítulo 10: Flagella and motility. Eds. Frederick C. Neidhardt et al, Segunda Edição ISBN 1-55581- 084-5 (1996) e em Macnab, R. M.; Genetics and biogenesis os bacterial flagella (Revista Anual de Genética 26: 131-158 (1992)]. O processo de biogênese flagelar requer a ação combinada de um grande número de genes, não apenas o gene codificando a flagelina, mas também um grande número de genes envolvidos na síntese do flagelo e do motor flagelar. Em princípio, existem duas abordagens para produzir bactérias de acordo com a presente invenção. Antes de mais nada, as mutações podem ser produzidas no gene codificando a proteína flagelina de modo a mudar um ou mais determinantes antigênicos. Em segundo lugar, um ou mais genes envolvidos na biogênese do flagelo podem ser mudados. Isto evitará a biossíntese da flagelina ou, mesmo, do flagelo completo e, em muitos casos, mesmo o transporte da flagelina através da membrana bacteriana. No cado em que nenhum flagelo é produzido, os determinantes antigênicos determinados pela duplicação específica da flagelina em flagelos estarão ausentes. Se a própria flagelina não for transportada através da membrana e, assim, permanecer dentro da bactéria, não haverá qualquer indução de anticorpos contra a flagelina. Todas as espécies de genes ou cachos de genes conhecidos na técnica a serem envolvidos na montagem e exportação, tais como o Morphological Assembly Pathway e um Flagellum-specific Export Pathway podem ser alvos para a mutação. Elas todas conduzem ou a flagelina carente de bactérias ou pelo menos a flagelos. Para fins de clareza, todos os caminhos envolvidos no processo total de síntese dos flagelos finais são ainda referidos como caminhos da biogênese flagelar.

Portanto, em uma modalidade preferida, a bactéria não é capaz de induzir anticorpos contra pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou de flagelos, devido a uma mutação em um gene do caminho da biogênese flagelar.

De um ponto de vista prático, pode, no entanto, ser desejável deletar (parte de) o gene de flagelina completo das bactérias a serem usadas na vacina, simplesmente por deleção do gene codificando a proteína flagelar.

Os genes codificando as proteínas flagelares das várias espécies de Salmonella são conhecidos. Eles são todos muito intimamente relacionados e, portanto, altamente homólogos. Os genes de flagelina foram, inter alia, descritos quanto à Salmonella enterica [Li, J. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. 91, 2552-2556 (1994)], Salmonella enteritidis [Selander, R. K. et ah, J. Bacteriol. 174, 3587-3592 (1992)], Salmonella dublin [Masten, B. J. e Joys, T. M., .

Bacteriol. 175, 5359-5365 (1993)], Salmonella typhimurium [de Vries, N. et aU Appl. Environ. Microbiol. 64, 5033-5038 (1998)], Salmonella abortus- equi [Hanafusa, T. et aL, Mol. Gen. Genet. 236, 260-266 (1993)]. Os genes de flagelina das novas espécies de Salmonella podem facilmente ser encontrados na base de sua homologia com todos os genes de flagelina de Salmonella conhecidos: técnicas padrão de hibridização são suficientes para localizar o gene de flagelina.

Existem dois genes de flagelina em bactérias de Salmonella transportando flagelo do tipo selvagem. Apenas um destes genes é ligado, isto é, produz flagelina em qualquer tempo dado. Devido a um mecanismo 2 chamado variação de fase flagelar, em uma escala de tempo da ordem de 10 a 105 gerações, os genes mudam de papéis de modo que um não expresso se toma expresso, e vice-versa [por exemplo, descrito em Escherichia coli e Salmonella typhimurium. Capítulo 10: Flagella and motility. Eds. Frederick C. Neidhardt et aL, Segunda Edição, ISBN 1-55581-084-5 (1996)]. De modo a evitar cepas de acordo com a invenção para iniciar a expressão da flagelina após um certo número de gerações, ambos os genes de flagelina devem ser tomados não funcionais. Altemativamente, se o mecanismo de mudança de fase é tomado não funcional, é suficiente nocautear o gene de flagelina que é expresso nesse momento.

Um gene não funcional é um gene que não mais codifica uma flagelina. Este pode ser um gene do qual uma parte da sequência codificadora tenha sido removida que codifique um determinante antígênico.

Um possível meio de tomar o gene de flagelina ou qualquer um dos outros genes conhecidos, envolvidos na biossíntese não funcional do flagelo é por meio de processos clássicos, tais como o tratamento de bactérias produtoras de flagelos de bactérias do tipo selvagem com agentes mutagênicos, tais como análogos de base, tratamento com luz ultravioleta ou tratamento de temperatura [Anderson, P. 1995. Mutagenesis, pp. 31 a 58, em Methods in Cell Biology 48. H. F. Epstein e D. C. Shakes (Eds.)]. Outros processos para produzir mutantes sem flagelos de várias bactérias cujo tipo selvagem tem flagelos, foram descritos, entre outros, por Liu, S. L. et ãl. (Infect. Immun. Agosto de 1988; 56(8): 1967-1973); Haas, R. et al, (Mol.

Microbiol. Maio de 1993; 8(4): 753-760) e Graf, J. et al (J. Bacteriol.

Novembro de 1994; 176(22): 6986-6991). A seleção de bactérias sem flagellos é muito facilmente feita por análise microscópica ótica quanto à ausência ou presença de flagelos. A seleção quanto às bactérias em que falte pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou de flagelos, pode ser feita por meio de ensaios de ligação com anticorpos monoclonais contra flagelina ou flagelos. Tais anticorpos monoclonais antíflagelares ou anti-flagelina podem ser feitos de acordo com técnicas padrão, entre outras mediante imunização (com flagelos) de camundongos endógamos por técnicas conhecidas na prática (Kohler e Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Os monoclonais assim obtidos podem ser usados em ensaios de ligação com as bactérias transformadas, e aquelas bactérias que não se ligam a um monoclonal específico são bactérias carentes de pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou flagelos. A natureza da mutação causada por técnicas clássicas de mutação é desconhecida. Este pode ser uma mutação pontual que pode, embora isto seja improvável de acontecer, eventualmente reverter ao tipo selvagem. Portanto, a mutagênese do transpóson é uma boa alternativa. A mutação por mutagênese do transpóson também é uma técnica de mutagênese bem conhecida na prática. Esta é uma mutação realizada em um sítio localizado no cromossomo.

Uma possibilidade para introduzir uma mutação em um sítio predeterminado, melhor deliberadamente do que aleatoriamente, é oferecida pela tecnologia do DNA recombinante. Uma tal mutação pode ser uma inserção, uma deleção, uma substituição de um nucleotídeo por ooutro, ou uma combinação destes, com a única condição de que o gene transformado não mais codifique flagelina funcional. Uma tal mutação pode, por exemplo, ser feita por deleção de vários pares de base. Mesmo muito pequenas deleções, tais como extensões de 10 pares de base, podem já tomar a flagelina não funcional. Mesmo a deleção de um único par de base já pode conduzir a uma flagelina não funcional, desde que, como resultado de uma tal mutação, os outros pares de base não estejam mais na matriz de leitura correta. Cada deleção ou inserção de vários pares de base indivisíveis por três causa um tal deslocamento da matriz. Mais preferivelmente, uma extensão mais longa é removida, por exemplo de 100 pares de base. Mesmo mais preferivelmente, o gene completo de flagelina e deletado. Pode ser facilmente observado que, especialmente as mutações que introduzem um códon de parada na matriz de leitura aberta, ou mutações que causem um deslocamento da matriz na matriz de leitura aberta, são muito adequadas para se obter uma cepa que não mais codifique a flagelina. A mutagênese locodirigida é o processo de escolha para produzir um gene de flagelina que careça de um ou mais determinantes antigênicos específicos. Com base no mapa dos determinantes antigênicos elaborado por Joys [Joys, T. M., SAAS Bulletin: Biochem. & Biotech. 4: 56-59 (1991)], os genes mutantes de flagelina podem ser produzidos, dos quais um ou mais determinantes antigênicos específicos tenham sido removidos. Todas as técnicas de DNA recombinante para a construção de mutantes negativos quanto à flagelina são técnicas padrão bem conhecidas. Elas dizem respeito à clonagem do gene de flagelina, à modificação da sequência de genes por mutagênese locodirigida, à digestão da enzima de restrição seguida por re-ligação ou abordagens de PCR, e à substituição subsequente do gene de flagelina do tipo selvagem pelo gene mutante (troca alélica ou substituição alélica). Técnicas padrão de DNA recombinante, tais como a clonagem do gene de flagelina em um plasmídeo, a digestão do gene com uma enzima de restrição, seguida por tratamento de endonuclease, re-ligação e recombinação homóloga na cepa hospedeira, são todas conhecidas na técnica e descrita, entre outros, em Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et ai, Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969- 309-6). As mutações locodirigidas podem, por exemplo, ser produzidas por meio de mutagênese locodirigida in vitro usando-se o kit Transformer vendido pela Clontech. As técnicas de PCR são extensivamente descritas em [Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969- 447-5 (1995)].

Portanto, em uma forma mais preferida, esta modalidade da invenção diz respeito a uma bactéria que não e capaz de expressar uma flagelina devido a uma mutação no gene da flagelina.

De maior preferência, as bactérias são selecionadas do grupo consistindo de S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus-equi, paratyphi A e B, derby, hadar, heidelberg, agona e arizonae. É outro objeto da presente invenção prover pela primeira vez vacinas marcadoras adequadas para a proteção de seres humanos e animais contra a Salmonelose. As vacinas de acordo com a invenção possuem como um aspecto característico o fato de que elas compreendem bactérias conforme definido acima ou seu material antigênico, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A principal vantagem das vacinas de acordo com a presente invenção, é que os seres humanos e os animais com elas vacinados podem ser discriminados tanto dos seres humanos quanto dos animais não vacinados, e os seres humanos e dos animais infectados de Salmonella do tipo selvagem na base de seu painel de anticorpos.

As vacinas de acordo com a invenção podem estar em uma forma viva atenuada ou inativada. Em ambos os casos, a ausência de pelo menos um determinante antigênico de flagelos ou de flagelina resultará em um painel de anticorpos após a vacinação, que pode facilmente ser discriminado daquele induzido após a infecção do tipo selvagem.

As vacinas inativadas têm a vantagem sobre as vacinas vivas pelo fato de que elas são inerentemente seguras. Portanto, uma forma preferida da invenção diz respeito a vacinas em que as bactérias estão em uma forma inativada.

As vacinas em conformidade com a invenção, que se baseiam nas bactérias vivas Salmonella, no entanto, têm uma vantagem sobre as vacinas que compreendem bactérias inativadas, no fato de que elas imitam melhor a infecção natural e, portanto, deflagram o sistema imune de uma maneira superior. Elas também têm uma vantagem importante adicional como daqui em diante explanado, ü desenvolvimento de vacinas vivas atenuadas, em geral, é difícil e demorado. Além disso, a sintonia fina do grau de atenuação é complexa: a alta virulência causa doença, e a baixa virulência induz a insuficiente proteção. Surpreendentemente, as vacinas de acordo com a invenção não apresentam diferenças significativas na virulência, quando comparadas às suas contrapartes que conduzem flagelos. Em outras palavras, a remoção do gene de flagelina não muda significativamente o nível de atenuação. Isto tem uma vantagem inesperada, em que as cepas vivas de Salmonella, atenuadas existentes, tanto futuras quanto aprovadas, adequadas para uso em vacinas, podem ser usadas na presente invenção logo que são tomadas não capazes de induzir anticorpos contra pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou de flagelos. Portanto, em outra forma preferida, as vacinas de acordo com a invenção compreendem bactérias vivas atenuadas.

Dada a grande quantidade de vacinas aplicadas hoje em dia tanto a animais de estimação quanto de criação, fica claro que a administração combinada de várias vacinas deve ser desejável, mesmo que apenas por razões de custos reduzidos da vacinação. A administração de um tal veículo recombinante tem a vantagem de que a imunidade é induzida contra duas ou mais doenças ao mesmo tempo. As bactérias vivas atenuadas para uso em uma vacina de acordo com a presente invenção proporcionam veículos muito adequados para genes heterólogos. Em princípio, tais genes heterólogos podem ser inseridos no genoma bacteriano em qualquer sítio não essencial.

Portanto, outra modalidade da invenção diz respeito a bactérias de acordo com a invenção, em que um gene heterólogo seja interserido. Um tal gene heterólogo pode, como mencionado acima, por exemplo, ser um gene que codifique um antígeno selecionado de outros microorganismos ou vírus patogênicos. Tais genes podem, por exemplo, ser derivados de herpesvírus patogênicos (por exemplo, os genes que codificam as proteínas estruturais dos herpesvírus), retrovíms (por exemplo o invólucro proteínico gp 160), adenovírus e outros.

Igualmente, um gene heterólogo pode ser obtido de bactérias patogênicas. Como exemplo, os genes que codificam toxinas bascterianas, tais como as toxinas das pleuropneumonias de Actinobacillus, as toxinas de Clostridium, as proteínas de membranas externas e outras, são genes heterólogos bacterianos muito adequados.

Outra possibilidade é inserir um gene que codifica uma proteína envolvida na deflagração do sistema imune, tal como uma interleucina, o Fator de Necrose Tumoral ou um interferon, ou outro gene envolvido na regulação imune. O uso do gene de flagelina como um sítio de inserção tem a vantagem de que não existe a necessidade de encontrar um novo sítio de inserção para o gene heterólogo e, ao mesmo tempo, o gene de flagelina é inativado e o gene heterólogo recém-introduzido pode ser expresso (em comum acordo com os genes bacterianos homólogos). A construção de tais veículos recombinantes pode ser feita rotineiramente, usando técnicas padrão de biologia molecular, tais como a troca alélica.

Assim, em uma forma preferida desta modalidade, o gene heterólogo é inserido no gene de flagelina. O gene heterólogo pode ser inserido em alguma parte no gene de flagelina, ou pode ser inserido no sítio do gene de flagelina, enquanto este gene tenha sido parcial ou completamente deletado.

Uma vacina de acordo com a presente invenção também contém, além da bactéria descrita acima ou de seu material antigênico, um veículo farmaceuticamente aceitável. Um tal veículo pode ser tão simples quanto à água, mas também pode, por exemplo, compreender o fluido de cultura em que a bactéria tenha sido cultivada. Outro veículo adequado é, por exemplo, uma solução de concentração de sal fisiológico. A dosagem útil a ser administrada variará na dependência da idade, do peso e do animal vacinado, do modo e da via de administração e do tipo de patógeno contra o qual a vacinação é dirigida. A vacina pode compreender qualquer dose de bactérias, suficiente para evocar uma resposta imune. As doses variando entre 103 e IO10 bactérias são, por exemplo, doses muito adequadas.

Opcionalmente, um ou mais compostos que têm atividade adjuvante podem ser adicionados à vacina. Os adjuvantes não são estimuladores não específicos do sistema imune. Eles intensificam a resposta imune do hospedeiro para a vacina. Exemplos de adjuvantes conhecidos na técnica são o adjuvante completo e incompleto de Freunds, a vitamina E, os polímeros de bloqueio não iônicos, os muramildipeptídeos, ISCOMs (complexos estimuladores imune, conforme, por exemplo, a Patente Européia EP 109942), saponinas, óleo mineral, óleo vegetal e Carbopol. Adjuvantes especialmente adequados para aplicação mucosa são, por exemplo, a toxina termolábil de E. colí (LT) ou a toxina do cólera (CT). Outros adjuvantes adequados são, por exemplo, o hidróxido de alumínio, o fosfato de alumínio ou o óxido de alumínio, as emulsões em óleo (por exemplo as saponinas de Bayol F® ou Marcol 52® ou o solubilizado de Vitamina E. Portanto, em uma forma preferida, as vacinas de acordo com a presente invenção compreendem um adjuvante.

Outros exemplos de veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis úteis na presente invenção incluem estabilizadores tais como SPGA, carboidratos (por exemplo sorbitol, manitol, amido, sacarose, glicose, dextran), proteínas tais como albumina ou caseína, agentes contendo proteína, tais como soro bovino ou leite desnatado e tampões (por exemplo, tampão de fosfato). Especialmente quando tais estabilizadores são adicionados à vacina, a vacina é muito adequada para secagem por congelamento ou secagem por pulverização. Portanto, em uma forma mais preferida, a vacina se acha em uma forma secada por congelamento ou secada por pulverização.

Para administração a animais ou seres humanos, a vacina de acordo com a presente invenção pode ser aplicada, inter alia, por via intranasal, mediante aspersão, por via intradérmica, subcutânea, oral, por aerossol ou por via intramuscular. Para aplicação a aves domésticas, a administração na membrana da asa e o colírio são adicionalmente adequados.

Outra modalidade da invenção diz respeito ao uso de bactérias de acordo com a invenção, para a fabricação de uma vacina para a proteção de seres humanos e de animais contra a infecção com uma bactéria de Salmonella ou contra os efeitos patogênicosa da infecção. A invenção diz respeito a processos para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção. Tais processos compreendem a mistura de bactérias de acordo com a invenção ou seu material antigênico, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Um teste diagnóstico para a triagem quanto à ausência/presença de anticorpos anti-flagelina ou anti-flagelos de Salmonella nos soros pode ser, por exemplo, um teste ELISA simples em que os flagelos ou a flagelina purificada ou um polipeptídeo curto compreendendo um seu fragmento antigênico é aplicado à parede dos reservatórios de uma placa de ELISA. A incubação com o soro de seres humanos ou de animais a serem analisados, seguida por, por exemplo, incubação com um anticorpo rotulado contra o anticorpo relevante humano ou de animal, pode então revelar a presença ou ausência de anticorpos contra a flagelina.

Outro exemplo de um sistema de teste disgnóstico é, por exemplo, a incubação de uma mancha ocidental compreendendo flagelina com soro de seres humanos ou de animais a serem analisados, seguida pela análise da mancha.

Os testes diagnósticos para a detecção de anticorpos contra a flagelina da Salmonella são preferivelmente na forma de um kit, compreendendo a flagelina em uma forma purificada. A flagelina pode, por exemplo, ser purificada através de técnicas padrão de separação de proteínas através de uma coluna adequada. Uma outra possibilidade é a separação em um gel PAAGE seguida por manchamento ocidental. Na mancha ocidental, a flagelina formará uma banda específica, separada das outras bandas de proteínas de Salmonella, e assim é também considerada para ser purificada.

Igualmente, uma forma pura da proteína pode ser obtida pela expressão das sequências de ácido nucléico codificando na flagelina. Em princípio, o meio mais fácil de produzir um tal sistema de teste diagnóstico é usar flagelina completamente purificada como explanado acima. É, entretanto, muito bem possível usar apenas parte da flagelina. Isto, com a condição de que o fragmento usado ainda compreenda um determinante antigênico da proteína.

Todos os determinantes antigênicos da flagelina induzirão anticorpos, por definição. Portanto, o uso de um fragmento de flagelina compreendendo mesmo um único determinante antigênico da flagelina, será capaz de ligar a anticorpos anti-flagelina.

Um teste que é capaz de discriminar entre o soro de seres humanos ou animais não infectados, infectados e vacinados compreende, por exemplo, um reservatório A, revestido com flagelina, e um reservatório B, revestido com outro imunógeno de Salmonella, ou possivelmente com células completas de Salmonella. O soro que reage com os reservatórios A e B indica uma infecção ou vacinação de campo, com uma vacina clássica, enquanto o soro que reage apenas com o reservatório B indica que o animal analisado é vacinado com a vacina marcadora. EXEMPLO 1 A cepa de Salmonella typhimurium STMP, uma cepa atenuada que foi testada como uma vacina viva em aves domésticas e porcos e fornece bons níveis de proteção, foi usada como material de partida para a mutagênese química.

MUTAGÊNESE QUÍMICA S. typhimurium STMP foi cultivada em meio de ágar sangue e conferida quanto à aglutinação do grupo B de antígeno O positivo e aglutinação do tipo 2 de antígeno H. Uma colônia foi inoculada em meio LB e incubada por 20 horas a 37°C com aeração. Dez μΐ de cultura noturna foi diluída em 10 ml de LB (3 culturas) e incubada a 37°C por 6 horas com aeração, até que a cultura alcançasse um O.D. em 600 nm de 0,5. Uma amostra foi retirada para determinar o número de bactérias viáveis. A cada uma das três culturas de 10 ml, 100 μΐ de trioxalen (mutágenos químicos da Sigma; 3 mg/ml em DMSO) foram adicionados e a suspensão foi escoada em uma placa de Petri de 10 cm de diâmetro. A suspensão foi irradiada com U.V. (Transiluminador UVP; comprimento de onda de 365 nm) por 5, 10 ou 15 minutos em uma distância de 20 cm. Dez μΐ foram transferidos para 10 ml de NaCL a 0,9%, diluições de 1/10 foram feitas e 100 ml foram colocados em placa em placas de ágar sangue de modo a determinar o índice de sobrevivência das bactérias em culturas mutagenizadas. As culturas com índices de sobrevivência de aproximadamente 3% e 20% foram cultivadas em 100 ml de LB até um OD em 600 nm de 0,5. As bactérias foram coletadas por centrifugação, recolocadas em suspensão em 5 ml de LB e armazenadas em glicerol a 30% em ~70°C.

SELEÇÃO QUANTO A UM MUTANTE NÃO FLAGELADO NÃO

MÓVEL

As bactérias mutagenizadas (sobrevivência de 3%; entre 5000 e 10000 mutantes independentes) foram inoculadas do estoque de glicerol sobre três placas de ágar sangue cada. As bactérias foram coletadas em LB e o OD a 600 nm foi ajustado a 2,17. Seis diluições décuplas foram feitas em LB e, depois, 50 μΐ de antissoro H2 (Difco) foram adicionados a 450 μΐ de suspensão bacteriana. Esta etapa de seleção com antissoro H foi incluída de modo a enriquecer a suspensão de mutantes para as bactérias não flageladas.

Esta suspensão foi incubada a 37°C por 6 horas, enquanto se agitava (250 rpm) e, então, foi centrifugada por 1 minuto a 1000 rpm em uma minicentrifugadora de Eppendorf, de modo a remover o complexo de aglutinação. Do sobrenadante, 1, 10 e 100 μΐ foram colocados em placa, sobre placas de ágar sangue, e incubadas por 20 horas a 37°C. RESULTADOS: IDENTIFICAÇÃO DE UM MUTANTE NÃO MÓVEL DE S. typhimurium STMP. A seleção quanto às bactérias não flageladas, por incubação com antissoro H2, resultou no crescimento de aproximadamente 40 colônia nas placas (diluição de 106) inoculadas com a suspensão de mutantes tratados com soro (sobrevivência de 3%), enquanto nenhuma colônia nas placas (diluição de 106) inoculadas com a suspensão de STMP tratada com soro.

Este resultado indicou que estavam presentes os mutantes que não se aglutinaram com o antissoro H2, possivelmente sendo não flagelados. As 40 colônias foram analisadas quanto à aglutinação de H2 e quanto à motilidade usando-se microscopia ótica. Todos os mutantes foram negativos quanto à aglutinação de H2, mas apenas um mutante pareceu não móvel, conforme observado por microscopia ótica. Este mutante não móvel era positivo quanto à aglutinação do antígeno O do grupo B. O mutante foi denominado de STM2000.

ESTABILIDADE IN VITRO DO STM2000, UM MUTANTE NÃO MÓVEL DE S. typhimurium STMP. A estabilidade fenotípica do STM2000 foi analisada por 12 passagens in vitro em placas de ágar sangue. Na mesma experiência, a cepa precursora, STMP, foi também passada 12 vezes. Estas culturas foram observadas por microscopia ótica e todas as bactérias na cultura mutante eram ainda não móveis. As vactérias STMP eram móveis, embora nem todas as células apresentassem o mesmo nível de motilidade. A comparação de STMP e de STM2000 por microscópico eletrônico confirmou que nenhum flagelo estava presente nas bactérias mutantes.

ESTABILIDADE IN VITRO DE STM2001, UM MUTANTE NÃO MÓVEL DE S. typhimurium STMP.

Em uma experiência diferente, S. typhimurium SL3261 (número de depósito SGSC 439, Salmonella Genetic Stock Centre, Universidade de Calgary, Alberta, Canadá) foi quimicamente mutagenizado com NTG e mutantes não móveis foram selecionados conforme antes descrito. Um mutante, STM2001, não apresentou nenhuma com um anticorpo monoclonal específico de flagelina. Após a eletroforese de gel de proteína 2D, foi mostrado que STM2001 carecia da mancha de flagelina de 51 kDa e pi 4,7, em comparação com sua cepa precursora. A estabilidade genética desta cepa foi analisada pelo crescimento para pelo menos 50 gerações. Após este período, ainda nenhum revertante foi encontrado: todas as bactérias ainda eram não móveis. A cepa STM2001 foi depositada no Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, PO.box 273, 3740 AG Baam, Países Baixos, sob o número de acesso CBS 108955. EXEMPLO 2 ESQUEMA EXPERIMENTAL

As vacinas foram preparadas de uma cepa tipo 4 de fago de S. enteritidis (S.e.) flagelada e não flagelada. As bactérias foram cultivadas em Caldo de Triptose Fosfato, inativadas pela adição de formalina em uma concentração final de 0,5%, seguida por colheita das células bacterianas, por centrifugação. As células foram recolocadas em suspensão em solução salina tampão de fosfato e formuladas em vacinas de emulsão de água em óleo em 5 x 109 bactérias/ml. Cinco frangos receberam por injeção intramuscular a vacina S.e. fla+, e 5 frangos receberam a vacina S.e. fla\ Os animais foram Λ vacinados com 0,5 ml de vacina em 14 e 18 semanas de idade. As 22 semanas de idade, os frangos foram sangrados, e o soro foi analisado em um sistema duplo ELISA de bloqueio de sanduíche de anticorpo, específico para anticorpos à flagelina g,m de S.e. (Zijderveld, G. G. van et al. (1993) Vet.

Quart. 15, 135-137).

ANIMAIS

Frangos comerciais do tipo de postura, de aproximadamente 14 semanas de idade, foram obtidos de um grupo livre de Salmonella. RESULTADOS: Todos os 5 frangos que haviam recebido a vacina S.e. fla+ se soroconverteram no ELISA específico de g,m (percentual de bloqueio > 60%), enquanto os 5 frangos vacinados com a vacina fia’ permaneceram soronegativos. EXEMPLO 3 EXPERIÊNCIA 1 Esquema esperimental Para avaliar com segurança, os frangos foram inoculados por via oral (1 ml), por via subcutânea (0,5 ml) e por via intramuscular (0,5 ml), com STMP da cepa de Salmonella typhimurium flagelos-positiva, com a cepa STM2000 de Salmonella typhimurium flagelos-negativa, ou com S. typhimurium do tipo selvagem {Salmonella typhimurium). Os animais foram observados por uma semana após a inoculação seguida por exame pós-morte dos frangos sobreviventes.

ANIMAIS

Frangos comerciais, três semanas de idade, foram obtidos de um grupo isento de Salmonella.

Resultados: Em seguida à inoculação, S dos 10 animais que haviam recebido a Salmonella typhimurium tipo selvagem morreram (Tabela 1). Na necrópsia, os dois frangos sobreviventes inoculados com a cepa do tipo selvagem tinham os fígados intumescidos com focos necróticos, os baços inchados e edema pericárdico. Um dos frangos inoculados com STMP tinha o fígado levemente inchado e um frango inoculado com STM2000 tinha o baço levemente inchado. Nenhuma outra anormalidade foi observada naqueles dois grupos. TABELA 1 __________________ Grupos com diferentes índices sobrescritos em uma coluna diferem (p < 0,5, teste exato de Fisher). EXPERIÊNCIA 2 ESQUEMA EXPERIMENTAL

Para analisar tanto a segurança quanto a eficácia, os frangos foram inoculados por via oral em 3 e 15 dias de idade, ou com STMP ou com STM2000, seguido pela infecção de prova com uma cepa de Salmonella typhimurium do tipo selvagem resistente à tetraciclina aos 22 dias de idade. A segurança foi avaliada por observação clínica após a vacinação e determinação do ganho de peso. Igualmente, mechas cloacais foram tomadas nos dias 10 e 22, para determinar a presença das cepas da vacina no trato intestinal. As mechas foram usadas para inocular ágares verdes brilhantes (BGA) diretamente e após o enriquecimento em Caldo Vassiliades de Rappaport (RVB). Os animais foram observados por uma semana após a infecção de prova, seguido por exame pós-morte dos frangos sobreviventes. Os fígados, os baços, os chumaços cloacais e os chumaços dos conteúdos do cecum dos frangos vacinados sobreviventes foram cultivados quanto à cepa de prova mediante inoculação direta na tetraciclina contendo BGA (BGAtet). Além disso, os chumaços foram incubados em um meio de enriquecimento (tetraciclina contendo água com peptona tamponada) seguido por colocação em placa em BGAtet.

ANIMAIS

Frangos comerciais, três dias de idade, foram obtidos de um grupo isento de Salmonella. RESULTADOS;

Nenhuma anormalidade clínica foi observada após as vacinações orais em 3 e 15 dias de idade. Igualmente, os ganhos médios de peso nos grupos vacinados não foram diferentes do grupo de controle (Tabela 3). Ambas as cepas estavam presentes nos chumaços cloacais dos animais vacinados, tomados 7 dias após a vacinação (Tabela 2). O fato de que uma maior proporção dos frangos no grupo inoculado com STMP tenha sido positivo em cultura após colocação direta em placa, indica que esta cepa se coloniza no trato intestinal em números mais elevados do que a cepa STM2000.

Tabela 2_________________________________ Os grupos com diferentes sobrescritos em uma coluna diferem (p < 0,5, teste exato de Fisher) Um frango no grupo de STMP morreram após a infecção de prova (7%), em compaação com nenhuma mortalidade no grupo de STM2000 e 80% de mortalidade nos controles não vacinados (Tabela 3). Os frangos sobreviventes no grupo de controle também obtiveram consideravelmente menos peso do que os vacinados. O ganho de peso do grupo vacinado com STM2000 após a infecção de prova foi significativamente maior do que o ganho de peso do grupo vacinado com STMP. TABELA 3 Os grupos com diferentes sobrescritos em uma coluna diferem (p < 0,5, teste exato de Fisher (mortalidade) ou teste t de duas amostras (oívnhn de nesnV

Como mostrado na Tabela 4, não existiu qualquer diferença nos índices de re-isolamento do organismo de prova do baço e do fígado. A colonização do trato intestinal, como julgado pelo re-isolamento dos chumaços cloacais e do conteúdo do ceco, foi significativamente menor no grupo vacinado com STM2000. TABELA 4____________________________ Os grupos com diferentes sobrescritos em uma coluna diferem (p < 0,5, teste exato de Fisher). EXEMPLO 4 ESQUEMA EXPERIMENTAL

Para provar a eficácia, os porcos foram inoculados oralmente com STMP (IO9,0 CFU) ou STM2000 (109,3 CFU), seguido por uma infecção oral de prova com uma cepa de Salmonella typhimurium do tipo selvagem resistente à estreptomicina (IO11,0 CFU) 2 semanas mais tarde. A dispersão da cepa de prova foi medida pelo cultivo de amostras fecais nos dias 5 e 8 após a prova. Aproximadamente 5 gramas de fezes foram colocadas em água de peptona e incubadas por 2 horas. Depois, diluições décuplas em série foram feitas em meio RVB contendo estreptomicina, incubadas durante a noite, seguido por plaqueamento em Caldo de Triptose Fosfato contendo estreptomicina. A diluição máxima contendo a cepa de prova foi usada para calcular a classificação de re- isolamento (a recíproca da diluição máxima positiva). Oito porcos vacinados com STMP e 8 controles não vacinados foram usados em uma primeira experiência. Em uma segunda experiência, 9 porcos foram vacinados com STM2000 e 9 controles não vacinados foram usados.

ANIMAIS

Porcos de 6 semanas de idade foram usados em ambas as experiências. RESULTADOS: Como mostrado na Tabela 5, ambas as cepas de vacina foram capazes de reduzir a dispersão fecal da cepa de prova, significativamente. TABELA 5 ___ Os grupos com diferentes sobrescritos diferem (p < 0,5, Teste U de Mann-Whitney).

LEGENDA PARA AS FIGURAS

Figura 1: análise do perfil proteínico de STM2000 e sua cepa precursora de S. typhimurium STMP. Marcadores de peso molecular das colunas 1, 11 e 12 conforme indicado; colunas 2, 5 e 8, S. typhimurium STMP 12x passados em meio de ágar sangue; colunas 3, 6 e 9, STM2000 12 x passado em meio de ágar sangue; colunas 4,7 e 10, STM2000 2x passado em meio de ágar sangue. Colunas 2, 3 e 4, perfil proteínico total; colunas 5, 6 e 7, pelota após sonicação e centrifiigação; colunas 8, 9 e 10, sobrenadante após sonicação e centrifugação. As proteínas foram manchadas com Azul Brilhante de Coomassie.

Figura 2: fotografias do exame microscopico eletrônico de S. typhimurium STMP (A) e seu mutante não móvel STM2000 (B).

Claims (9)

1. Uso de uma bactéria do gênero Salmonella que, na sua forma de tipo selvagem, carrega flagelos, dita bactéria não sendo capaz de induzir anticorpos contra pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou flagenos, e um adjuvante, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de uma vacina inativada para a proteção de seres humanos ou de animais contra infecção com uma bactéria Salmonella ou os efeitos patogênicos da infecção.

2. Uso de uma bactéria do gênero Salmonella que, na sua forma de tipo selvagem, carrega flagelos, dita bactéria não sendo capaz de induzir anticorpos contra pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou flagenos, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de uma vacina viva atenuada para a proteção de seres humanos ou de animais contra infecção com uma bactéria Salmonella ou os efeitos patogênicos da infecção.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a dita bactéria não ser capaz de induzir anticorpos contra pelo menos um determinante antigênico de flagelina ou flagelos, devido a uma mutação em um gene do caminho da biogênese flagelar.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que dita mutação é localizada no gene de flagelina.

5. Uso de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria é selecionada do grupo consistindo de S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi, abortus- equi, paratyphi A e B, derby, hadar, heidelberg, agona e arizonae.

6. Uso de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria ainda carrega um gene heterólogo, dito gene heterólogo sendo preferivelmente inserido no gene de flagelina.

7. Vacina para a proteção de animais contra a Salmonelose, caracterizada pelo fato de que compreende bactérias inativadas, como definidas nas reivindicações 1 ou 3 a 5, um adjuvante e um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Vacina para a proteção de animais contra a Salmonelose, caracterizada pelo fato de que compreende bactérias vivas atenuadas, como definidas nas reivindicações 2 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de estar em uma forma secada por congelamento ou secada por pulverização.