RU2694499C1 - Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени - Google Patents
Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694499C1 RU2694499C1 RU2018101637A RU2018101637A RU2694499C1 RU 2694499 C1 RU2694499 C1 RU 2694499C1 RU 2018101637 A RU2018101637 A RU 2018101637A RU 2018101637 A RU2018101637 A RU 2018101637A RU 2694499 C1 RU2694499 C1 RU 2694499C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- genome
- mixture
- control sample
- cattle
- test system
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 6
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title abstract description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 claims abstract description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 claims abstract description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 4
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- -1 100 mM Chemical compound 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711443 Bovine coronavirus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000047479 Escherichia virus MS2 Species 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в реальном времени. Тест–система включает буфер для проведения ПЦР, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для коронавируса А и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE и обратной транскриптазы MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE. Смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2 содержит следующие нуклеотидные последовательности: BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер; BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер; BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3' - BHQ1 – зонд; MS2F 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер; MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер; MS2P Су5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3 BHQ' - зонд. Изобретение расширяет арсенал средств для обнаружения генома коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота. 4 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики коронавирусной инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.
Известна тест-система для обнаружения РНК вируса инфекционной болезни, путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя инфекции олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов (патент РФ №2515916, кл. C12N 15/11, 2014).
Также известна тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для коронавируса, смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE и обратной транскриптазы MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE; буфер для разведения РНК в виде деионизованной воды, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, (патент РФ №2506317, C12Q 1/68, 2014 г. - прототип).
Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности диагностики коронавирусной инфекции у животных.
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и получение достоверной диагностики с помощью ОТ - ПЦР в реальном времени.
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для коронавируса; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE и обратной транскриптазы MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE; буфер для разведения РНК в виде деионизованной воды, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, согласно изобретению, для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103/мл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмид-ных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики коронавирусной инфекции животных используют тест-систему с использованием специфичных для участка генома коронавируса олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со с специфическими к нему праймерами и зондом.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно в качестве средств диагностики коронавирусной инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Использование заявляемых олигонуклеотидных праймеров BCoVF, BCoVR и флуоресцентно-меченного зонда BCoVP обеспечивает специфическое выявление РНК коронавируса у животных.
Использование разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом, бактериофага MS2 обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения РНК из образцов.
Для выбора последовательности и расчета первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов, был проведен сравнительный анализ доступных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательности гена BCoV, кодирующего один из пяти главных структурных белков вириона (nucleocapsid protein (N) gene) коронавирусов, входящих в семейство Coronaviridae. Как и другие представители этого семейства, короновирусы представлены однонитевой нефрагментированной РНК позитивной полярности, размером порядка 26-30 тысяч оснований. N белок является фосфопротеи-ном с молекулярным весом 50-60 кДа, который взаимодействуя с геномной РНК образует вирусный нуклеокапсид и играет определенную роль в репликации вирусной РНК.
С помощью программы "BioEdit 7.0" выравнены нуклеотидные последовательности N гена BCoV-представителей родов коронавирусов (альфа, бета и гамма подсемейств) нуклеотидной последовательностью гена N генома коронавируса изолята BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 (Bovine corona-virus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 nucleocapsid protein (N) gene, complete cds. (код доступа KT318096). В результате анализа построенного элайнмента внутри гена капсидного белка N выбран участок между 700 и 800 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности.
С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд BCoVP, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров BCoVF, и BCoVR. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
С помощью программы "Oligo 6.0" проанализирована нуклеотидная последовательность бактериофага MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940). Бактериофаг MS2 содержит однонитевую позитивно ориентрованную РНК размером 3569 оснований. В результате анализа внутри гена белка "созревания' (maturation protein) выбран участок между 200 и 350 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд MS2P, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров MS2F и MS2R. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Пример применения тест-системы для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у животных
Для исследования используют следующий биологический материал:
- фекалии весом 5 г. отбирают в стерильный пластиковый контейнер.
- из тканей кишечника вырезают кусочки размером 1 см3 и помещают в стерильный контейнер. Далее обрабатывают исследуемый материал.
Пробы тканей кишечника с содержимым (до 1 г) гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 1 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции РНК.
Из фекалий (1-5 г) готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Взвесь фекалий декантируют в течение 5-10 минут. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку 1,5 мл, центрифугируют при 5000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, в течение 5 мин. Экстракцию РНК из осветленного экстракта фекалий проводят по возможности, сразу.
Для исследования респираторной коронавирусной инфекции используют по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости.
- Выделения из носоглотки и трахеи, мазки со слизистой носовой полости, снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора/фосфатного буфера/транспортной среды.
- Фарингеальные смывы помещают в стерильный контейнер. Смывы, мазки берут на исследование без предварительной подготовки.
Вязкую по консистенции мокроту обрабатывают реагентами типа муколи-зин, с целью снижения вязкости.
Анализ проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-КОРОНАВИРУС-ФАКТОР» (Инструкция по применению «ПЦР-КОРОНАВИРУС-КРС-ФАКТОР», набора реагентов для выявления РНК коронавируса (Bovine coronavirus, BCoV) крупного рогатого скота в биологическом материале методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), ТУ 21 10.60-133-51062356-2017, http://www.vetfaktor.ru/) который состоит из трех этапов (см. таблицу 1 и 2):
- экстракция НК;
- проведение ОТ-ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;
- учет результатов анализа.
Реакцию ОТ-ПЦР РВ проводят в одной пробирке.
Подготовка образцов к проведению ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО BCoV, ВКО BCoV и РНК буфера.
Буфер для проведения ОТ-ПЦР, ПЦР буфер BCoV; состав: 2,5х ПЦР-буфер (хлорид калия, 100 мМ, Трис-HCl, рН 8,8 100 мМ, глицерол 1%, Tween-20 0.02%); хлорид магния, 5 мМ; деионизированная вода.
Смесь для проведения ПЦР, ПЦР-смесь BCoV состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в концентрации 0,25 мМ; деионизированная вода, смесь праймеров и флуоресцентного зонда на корона-вирус (прямой и обратный праймеры BCoV F и BCoVR в концентрации 0,2 мкМ, зонд BCoVP-FAM в концентрации 0,1 мкМ, взятых в соотношении 1:1:0,5), смесь праймеров и флуоресцентного зонда на ПКО (прямой и обратный праймеры MS2F и MS2R в концентрации 0,2 мкМ, зонд MS2P-Cy5 в концентрации 0,1 мкМ, взятых в соотношении 1:1:0,5).
Смесь ферментов, RT PCR ENZ, состав: ДНК полимераза с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE (5 ед/мкл), обратная транскриптаза MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE (100 ед/мкл).
Буфер для разведения РНК, РНК буфер, состав: деионизованная вода.
Внутренний контрольный образец, ВКО BCoV; состав: суспензия бактериофага MS2 (5×103/мл)
- Отрицательный контрольный образец, ОКО (ТЕ буфер); состав: ТЕ буфер (10 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ EDTA, pH 8,0)
- Положительный контрольный образец, ПКО BCoV; состав: смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2, взяты в соотношении 1:1.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
10 мкл ПЦР БУФЕР BCoV
5 мкл ПЦР СМЕСЬ BCoV
0,75 мкл RT PCR ENZ.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб. В них вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки внести:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл НК соответствующей пробы, включая пробу ВК-);
в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BCoV.
Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборах «Rotor-Gene Q», «ДТ-96» и «CFX96» указаны в таблице 3.
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора.
Интерпретация результатов анализа
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.
Учет результатов ОТ-ПЦР проводился по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале FAM/Green и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых по каналу Cy5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по каналу FAM/Green значение Ct также отсутствует) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Cy5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробах или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.
Образец считается положительным, РНК коронавируса КРС присутствует, если наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу FAM/Green значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green) - образец считается положительным.
Образец считается отрицательным (РНК коронавируса КР отсутствует) если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале FAM/ Green, при этом значения Ct по каналу Cy5/Red и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).
Claims (7)
- Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для коронавируса А и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE и обратной транскриптазы MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE; буфер для разведения РНК в виде деионизованной воды, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, отличающаяся тем, что для выделения РНК используют биологический материал, взятый от инфицированных животных, для внутреннего контрольного образца - суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103/мл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
- BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер,
- BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер,
- BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3' - BHQ1 - зонд,
- MS2F 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер,
- MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер,
- MS2P Су5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3 BHQ' - зонд.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018101637A RU2694499C1 (ru) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018101637A RU2694499C1 (ru) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2694499C1 true RU2694499C1 (ru) | 2019-07-15 |
Family
ID=67309128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018101637A RU2694499C1 (ru) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2694499C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10975418B1 (en) * | 2020-06-29 | 2021-04-13 | Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd | Rapid PCR-based virus detection method, and kits therefor |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2435853C1 (ru) * | 2010-10-15 | 2011-12-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Streptococcus agalactiae В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ |
| WO2016034610A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Intervet International B.V. | Attenuated bovine coronavirus and related vaccines |
| EP2780477B1 (en) * | 2011-11-15 | 2018-03-14 | The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Selective detection of norovirus |
-
2018
- 2018-01-16 RU RU2018101637A patent/RU2694499C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2435853C1 (ru) * | 2010-10-15 | 2011-12-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Streptococcus agalactiae В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ |
| EP2780477B1 (en) * | 2011-11-15 | 2018-03-14 | The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Selective detection of norovirus |
| WO2016034610A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Intervet International B.V. | Attenuated bovine coronavirus and related vaccines |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10975418B1 (en) * | 2020-06-29 | 2021-04-13 | Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd | Rapid PCR-based virus detection method, and kits therefor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090226888A1 (en) | Diagnostic Primers And Method For Detecting Avian Influenza Virus Subtype H5 And H5N1 | |
| BR112014000138B1 (pt) | Método para identificar a presença ou ausência de um ácido nucleico alvo | |
| RU2694558C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота | |
| RU2681473C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| KR102717732B1 (ko) | 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법 | |
| RU2385943C2 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации | |
| EP2753629B1 (en) | Methods for detecting lyme disease | |
| RU2694499C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| CN116814857A (zh) | 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法 | |
| WO2006132601A1 (en) | Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1 | |
| RU2694501C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2511440C2 (ru) | Способ количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма "москва 3253" | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2689718C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя ротовирусной инфекции у сельскохозяйственных животных | |
| PH12015501382B1 (en) | High resolution melt genotyping od ibv, csfv and ndv | |
| KR101729977B1 (ko) | 돼지인플루엔자바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지인플루엔자바이러스 검출 방법 | |
| RU2728342C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ выявления пестивируса Н крупного рогатого скота | |
| RU2700481C1 (ru) | Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2741887C1 (ru) | Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов | |
| RU2703400C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2740097C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов | |
| CN111500774A (zh) | 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒 | |
| RU2700254C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200117 |