RU2694558C1 - Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота - Google Patents
Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694558C1 RU2694558C1 RU2018101642A RU2018101642A RU2694558C1 RU 2694558 C1 RU2694558 C1 RU 2694558C1 RU 2018101642 A RU2018101642 A RU 2018101642A RU 2018101642 A RU2018101642 A RU 2018101642A RU 2694558 C1 RU2694558 C1 RU 2694558C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- genome
- coronavirus infection
- rna
- probe
- reaction
- Prior art date
Links
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 9
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 title claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 11
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 7
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 4
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 100 mM Chemical compound 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 101150082072 14 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711443 Bovine coronavirus Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000047479 Escherichia virus MS2 Species 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота. Способ включает в себя выделение РНК из биологического материала в виде экстракта фекалий или фрагментов органов брюшной полости сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контрольных образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда. Фрагмент генома возбудителя короновирусной инфекции имеет следующие нуклеотидные последовательности: BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер; BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер; BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3'-BHQ1 – зонд. Изобретение расширяет арсенал способов диагностики короновирусной инфекции у крупного рогатого скота. 4 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики коронавирусной инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.
Известно техническое решение, в котором коронавирусную инфекцию определяют методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2504585, C12Q 1/68, 2014 г.), включающий выделение РНК из биологического материала, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.
Также известен способ выявления коронавирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2460803, C12Q 1/68, 2014 г. - прототип), включающий выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости от инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего положительного контроля мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией Threshold.
Недостатком прототипа является отсутствие возможности получения достоверной диагностики короновирусной инфекции КРС.
Техническим результатом является получение достоверной диагностики коронавирусной инфекции КРС с помощью ОТ - ПЦР в реальном времени.
Технический результат достигается тем, что в способе выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота, включающем выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контрольных образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией Threshold, согласно изобретению для выделения РНК используют дополнительный биологический материал в виде экстракта фекалий или фрагментов органов брюшной полости, взятый от животных инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции, а для внутреннего контрольного образца - суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103, и для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер
BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер
BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3' - BHQ1 - зонд
MS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер
MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер
MS2P, Су5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' - зонд, при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Су5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции -отрицательный.
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики коронавирусной инфекции животных используют две последовательные реакции: обратной транскрипции вирусной РНК для получения кДНК и полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента полученной кДНК матрицы. Обе реакции проводятся последовательно в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома коронавируса олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ОТ-ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации и возможность ошибки при переносе кДНК в другую пробирку для ПЦР. Кроме того, детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики коронавирусной инфекции у животных что соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота осуществляется следующим образом.
Для исследования респираторной коронавирусной инфекции используют мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости. Для исследования на коронавирусный энтерит и носительство коронавирусов используют предварительно выделяют РНК из экстракта фекалий или фрагментов органов от инфицированных животных сорбционным методом. Проводят синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной мультиплексной реакции обратной транскрипции с использованием внутреннего контрольного образца - суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103/мл и положительного контрольного образца в качестве, которого используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома коронавируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеитидными последовательностями:
BCoVF 5'-GATCAAATTGCTAGT-3' - прямой праймер
BCoVR 5'-CAGTCTGCTTAGTTA-3' - обратный праймер
BCoVP 5'-FAM-GGATGCCACTAAGCCA-3' - BHQ1 - зонд
MS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер
MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер
MS2P, Су5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' - зонд
и полимеразной цепной реакции - с проведением 40 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя коронавирусной инфекции олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда.
Затем измеряют накопление флуоресцентного сигнала по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Су5/Red для сигнала внутреннего контроля и интерпретируют результаты на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold). Если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции -отрицательный.
Использование следующих олигонуклеотидных праймеров BCoVF, и BCoVR флуоресцентно-меченного зонда BCoVP обеспечивает специфическое выявление РНК коронавируса у животных.
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага MS2: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения РНК из образцов.
Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.
Проведен сравнительный анализ доступных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей N гена BCoV, кодирующего один из пяти главных структурных белков вириона (nucleocapsid protein (N) gene) коронавирусов, входящих в семейство Coronaviridae. Как и другие представители этого семейства, коронавирусы представлены однонитевой нефрагментированной РНК позитивной полярности, размером порядка 26-30 тысяч оснований. N белок является фосфопротеином с молекулярным весом 50-60 кДа, который взаимодействуя с геномной РНК образует вирусный нуклеокапсид и играет определенную роль в репликации вирусной РНК.
С помощью программы "BioEdit 7.0" выравнены нуклеотидные последовательности N гена BCoV - представителей родов коронавирусов (альфа, бета и гамма подсемейств) нуклеотидной последовательностью гена N генома коронавируса изолята BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 (Bovine corona-virus isolate BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 nucleocapsid protein (N) gene, complete cds. (код доступа KT318096). В результате анализа построенного элайнмента внутри гена капсидного белка N выбран участок между 700 и 800 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности.
С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд BCoVP, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров BCoVF, и BCoVR. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
С помощью программы "Oligo 6.0" проанализирована нуклеотидная последовательность бактериофага MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940). Бактериофаг MS2 содержит однонитевую позитивно ориентрованную РНК размером 3569 оснований. В результате анализа внутри гена белка 'созревания' (maturation protein) выбран участок между 200 и 350 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд MS2P, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров MS2F и MS2R. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Пример конкретного осуществления способа выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у животных
Для исследования используют следующий материал:
Для исследования на коронавирусный энтерит и носительство коронавирусов используют:
- фекалии, которые берут весом 5 г. в стерильный пластиковый контейнер;
- из тканей кишечника вырезают кусочки размером 1 см3 и помещают в стерильный контейнер. Далее обрабатывают исследуемый материал.
Пробы тканей кишечника с содержимым (до 1 г) гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 1 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции РЖ. Из фекалий (1-5 г) готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Взвесь фекалий декантируют в течение 5-10 минут. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку 1,5 мл, центрифугируют при 5000 об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, в течение 5 мин. Экстракцию РНК из осветленного экстракта фекалий проводят по возможности, сразу. При необходимости хранения замораживают.
Для исследования респираторной коронавирусной инфекции используют по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости.
• Выделения из носоглотки и трахеи, мазки со слизистой носовой полости, снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора/фосфатного буфера/транспортной среды.
• Фарингеальные смывы помещают в стерильный контейнер. Смывы, мазки берут на исследование без предварительной подготовки.
Вязкую по консистенции мокроту обрабатывают реагентами типа муколизин, с целью снижения вязкости.
Анализ проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-КОРОНОВИРУС-ФАКТОР» http://www.vetfaktor.ru/ (см. таблицу 1 и 2), который состоит из трех этапов: http://www.vetfaktor.ru/ экстракция НК;
• проведение ОТ-ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;
• учет результатов анализа.
Реакцию ОТ-ПЦР РВ проводят в одной пробирке.
Подготовка образцов к проведению ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО BCoV, ВКО BCoV и РНК буфера.
Буфер для проведения ОТ-ПЦР, ПЦР буфер BCoV; состав: 2,5х ПЦР-буфер (хлорид калия, 100 мМ, Трис-HCl, рН 8,8 100 мМ, глицерол 1%, Tween-20 0.02%); хлорид магния, 5 мМ; деионизированная вода.
Смесь для проведения ПЦР, ПЦР-смесь BCoV состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в концентрации 0,25 мМ; деионизированная вода, смесь праймеров и флуоресцентного зонда на корона-вирус (прямой и обратный праймеры BCoV F и BCoVR в концентрации 0,2 мкМ, зонд BCoVP-FAM в концентрации 0,1 мкМ, взятых в соотношении 1:1:0,5), смесь праймеров и флуоресцентного зонда на ПКО (прямой и обратный праймеры MS2F и MS2R в концентрации 0,2 мкМ, зонд MS2P-Су5 в концентрации 0,1 мкМ, взятых в соотношении 1:1:0,5).
Смесь ферментов, RT PCR ENZ, состав: ДНК полимераза с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE (5 ед/мкл), обратная транскриптаза MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE (100 ед/мкл).
Буфер для разведения РНК, РНК буфер, состав: деионизованная вода.
Внутренний контрольный образец, ВКО BCoV; состав: суспензия бактериофага MS2 (5×103/мл)
- Отрицательный контрольный образец, ОКО (ТЕ буфер); состав: ТЕ буфер (10 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8,0)
- Положительный контрольный образец, ПКО BCoV; состав: смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса BCoV и фрагмент генома бактериофага MS2, взяты в соотношении 1:1.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
10 мкл ПЦР БУФЕР BCoV
5 мкл ПЦР СМЕСЬ BCoV
0,75 мкл RT PCR ENZ.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб. В них вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки внести:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл НК соответствующей пробы, включая пробу ВК-);
в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BCoV.
Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборах «Rotor-Gene Q», «ДТ-96» и «CFX96» указаны в таблице 3.
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора.
Интерпретация результатов анализа
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.
Учет результатов ОТ-ПЦР проводился по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале FAM/Green и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых по каналу Су5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по каналу FAM/ Green значение Ct также отсутствует) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Су5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробах или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.
Образец считается положительным, РНК коронавируса КРС присутствует, если наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу FAM/ Green значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green) - образец считается положительным.
Образец считается отрицательным (РНК коронавируса КР отсутствует) если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале FAM/ Green, при этом значения Ct по каналу Су5/Red и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл.4).
Claims (8)
- Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота, включающий выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости от инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией - Threshold, отличающийся тем, что для выделения РНК используют дополнительный биологический материал в виде экстракта фекалий или фрагментов органов брюшной полости, взятый от животных, инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции, для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 мл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
- BCoVF 5`-GATCAAATTGCTAGT-3` - прямой праймер,
- BCoVR 5`-CAGTCTGCТTАGТТА-3` - обратный праймер,
- BCoVP 5`-FAM-GGATGCCACTAAGCCА-3` - BHQ1 - зонд,
- MS2F, 5`-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3` - прямой праймер,
- MS2R, 5`-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3` - обратный праймер,
- MS2P, Су5 5`-СACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3` - зонд,
- при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018101642A RU2694558C1 (ru) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018101642A RU2694558C1 (ru) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2694558C1 true RU2694558C1 (ru) | 2019-07-16 |
Family
ID=67309145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018101642A RU2694558C1 (ru) | 2018-01-16 | 2018-01-16 | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2694558C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2740097C1 (ru) * | 2020-08-11 | 2021-01-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов |
| RU2741887C1 (ru) * | 2020-08-11 | 2021-01-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов |
| RU2766344C1 (ru) * | 2021-07-08 | 2022-03-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН) | Способ выявления и идентификации коронавирусов у крупного рогатого скота |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2435853C1 (ru) * | 2010-10-15 | 2011-12-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Streptococcus agalactiae В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ |
| WO2016034610A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Intervet International B.V. | Attenuated bovine coronavirus and related vaccines |
| EP2780477B1 (en) * | 2011-11-15 | 2018-03-14 | The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Selective detection of norovirus |
-
2018
- 2018-01-16 RU RU2018101642A patent/RU2694558C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2435853C1 (ru) * | 2010-10-15 | 2011-12-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Streptococcus agalactiae В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ |
| EP2780477B1 (en) * | 2011-11-15 | 2018-03-14 | The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Selective detection of norovirus |
| WO2016034610A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Intervet International B.V. | Attenuated bovine coronavirus and related vaccines |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2740097C1 (ru) * | 2020-08-11 | 2021-01-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов |
| RU2741887C1 (ru) * | 2020-08-11 | 2021-01-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов |
| RU2766344C1 (ru) * | 2021-07-08 | 2022-03-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН) | Способ выявления и идентификации коронавирусов у крупного рогатого скота |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20080261198A1 (en) | Diagnostic Primers and Method for Detecting Avian Influenza Virus Subtype H5 and H5n1 | |
| BR112014000138B1 (pt) | Método para identificar a presença ou ausência de um ácido nucleico alvo | |
| RU2694558C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота | |
| CN111286559B (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN110438265B (zh) | 一种对非洲猪瘟病毒基因i型和ii型的快速鉴别诊断方法 | |
| CN112029900A (zh) | 新型冠状病毒的快速核酸检测方法及检测系统 | |
| CN115461476A (zh) | 用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物及其试剂盒、检测方法和应用 | |
| RU2681473C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2385943C2 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации | |
| KR20230101589A (ko) | 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법 | |
| CN112831605A (zh) | 多酶恒温扩增检测试剂盒及其应用 | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| CN116814857A (zh) | 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法 | |
| RU2694499C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2703401C1 (ru) | Тест-система для выявления и генотипирования РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней | |
| RU2689718C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя ротовирусной инфекции у сельскохозяйственных животных | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2694501C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2700481C1 (ru) | Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| CN114395643A (zh) | 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法 | |
| RU2741887C1 (ru) | Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов | |
| RU2740097C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов | |
| CN112899406A (zh) | 一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN111996288A (zh) | 检测冠状病毒的组合物、试剂盒和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200117 |