KR20230101589A - 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법 - Google Patents
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 진단키트; 및, 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 PEDV 검출용 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP법을 수행할 경우, 낮은 시료의 농도만으로도 PEDV만을 특이적으로 검출하는 민감도가 우수하고, 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 기존의 RT-PCR 기반 진단법과는 달리 vRT-LAMP 법은 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서도 PEDV의 특이적인 진단에 효과적으로 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 PEDV 검출용 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP법을 수행할 경우, 낮은 시료의 농도만으로도 PEDV만을 특이적으로 검출하는 민감도가 우수하고, 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 기존의 RT-PCR 기반 진단법과는 달리 vRT-LAMP 법은 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서도 PEDV의 특이적인 진단에 효과적으로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV) 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 진단키트; 및, 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사병(porcine epidemic diarrhea; PED)은 돼지에 감염되는 고전염성의 소화기 질병으로 모든 연령의 돼지에 감염되어 설사 증상을 유발하지만 어린 돼지 특히 어린 포유 자돈에 감염되면 심한 설사와 구토 및 탈수 증상을 나타내며, 100%에 가까운 높은 폐사율을 나타내는 것이 특징이다.
현재 PED는 미국, 캐나다, 멕시코, 유럽 각국과 한국 및 중국을 포함한 대부분의 아시아국가에서 발생하고 있어 세계 양돈 산업에 막대한 경제적 피해를 야기하고 있다 (Lee 와 Lee, 2014; Lin 등, 2014; Mole, 2013; Stevenson 등, 2013; Van Diep 등, 2015; Vlasova 등, 2014). PED의 원인체인 PED 바이러스 (PEDV)는 감염된 돼지의 설사분변을 통하여 대량으로 배설되며, 이러한 설사 분변에 오염된 각종 기구, 차량과 오염물건 또는 설치류 등 야생동물을 통하여 돼지간 또는 농장간에 급속하게 전파 및 확산된다.
따라서 PED 발생 농장 및 돼지를 신속하게 찾아내어 조기에 적절한 방역조치를 이행해야 더 큰 피해를 막을 수 있으며, 이를 위해서는 감염된 돼지의 장이나 분변 시료에서 PEDV를 신속, 정확하게 진단할 수 있는 진단법의 개발 및 적용이 PED의 방역에 필수적인 요소이다.
현재 임상시료에서 PEDV의 신속, 정확한 진단을 위하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction: RT-PCR)이나 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR; qRT-PCR)과 같은 PCR-기반의 유전자 진단법을 가장 많이 사용하고 있다(Kim 등, 2007; Kim 등, 2001; Miller 등, 2016; Zhao 등, 2014). 그러나 이들 PCR 기반의 진단법들은 증폭된 DNA를 검출하기 위해 정교한 장비, 전문 인력 및 복잡한 절차가 필요하므로 개발도상국과 같은 장비가 부족한 실험실에는 활용하기가 곤란하다. 따라서 PEDV 감염이 의심되는 임상시료에서 PEDV를 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있으며, 기존 PCR 방법에 비해 더 간편하고 신속하면서도 비용-효율적인 새로운 진단법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은, 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification)용 또는 프로브 기반의 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)용일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 PEDV의 ORF6(open reading frame 6) 유전자를 표적으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법을 제공한다.
상기 단계 (a)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 56 내지 68℃에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 단계 (b)의 증폭 반응은 30분 내지 60분 동안 이루어지는 것일 수 있다.
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 vRT-LAMP 방법일 수 있다.
상기 단계 (b)의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제를 이용한 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것일 수 있다.
상기 발색 지시제는 칼세인(calcein), 하이드록시나프톨블루(hydroxy naphthol blue, HNB), 페놀레드(phenol red), 크레졸레드(cresol red), 말라키이트 그린(malachite green) 및 메틸 그린(methyl green)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 PEDV 검출용 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP법을 수행할 경우, 낮은 시료의 농도만으로도 PEDV만을 특이적으로 검출하는 민감도가 우수하고, 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 기존의 RT-PCR 기반 진단법과는 달리 vRT-LAMP 법은 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서도 PEDV의 특이적인 진단에 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 vRT-LAMP용 프라이머 세트의 증폭 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 56℃(레인 1), 58℃(레인 2), 60℃(레인 3), 62℃(레인 4), 64℃(레인 5), 66℃(레인 6), 68℃(레인 7) 및 NC(음성대조군)의 반응 온도 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 시약 반응, (B)는 PCR 증폭 결과이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 30, 40, 50 및 60분의 반응 시간 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다.(레인 1 내지 3 : PEDV의 DNA를 10배수 단계 희석한 것(5×102-0copies).
도 4는 PEDV, 돼지 관련 바이러스에 대하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.(레인 1 내지 15는 표 1의 돼지 병원체 각각에 대한 반응)
도 5는 본 발명의 프라이머 세트 중 루프 프라이머를 제외한 vRT-LAMP법(A 및 B), 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법(C 및 D), 다른 서열의 프라이머 세트를 이용한 conventional RT-PCR법(E) 및 real-time RT-PCR법(F)의 수행시, PEDV의 검출 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (각 레인 1 내지 7 : PEDV의 DNA를 10배수 단계 희석한 것(106-0copies 희석농도)
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 56℃(레인 1), 58℃(레인 2), 60℃(레인 3), 62℃(레인 4), 64℃(레인 5), 66℃(레인 6), 68℃(레인 7) 및 NC(음성대조군)의 반응 온도 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다. (A)는 시약 반응, (B)는 PCR 증폭 결과이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 최적 조건을 확립하기 위하여, 30, 40, 50 및 60분의 반응 시간 범위에서 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다.(레인 1 내지 3 : PEDV의 DNA를 10배수 단계 희석한 것(5×102-0copies).
도 4는 PEDV, 돼지 관련 바이러스에 대하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법 수행 시, 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.(레인 1 내지 15는 표 1의 돼지 병원체 각각에 대한 반응)
도 5는 본 발명의 프라이머 세트 중 루프 프라이머를 제외한 vRT-LAMP법(A 및 B), 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법(C 및 D), 다른 서열의 프라이머 세트를 이용한 conventional RT-PCR법(E) 및 real-time RT-PCR법(F)의 수행시, PEDV의 검출 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. (각 레인 1 내지 7 : PEDV의 DNA를 10배수 단계 희석한 것(106-0copies 희석농도)
본 발명자는 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)를 신속하고 정확하게 진단하기 위한 RT-LAMP 진단법에 대한 연구를 진행하던 중, PEDV를 표적으로 하는 프라이머 세트를 제작하고 이를 이용하여 RT-LAMP 방법을 수행한 결과, 낮은 농도에서도 PEDV 만을 검출하여 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 PEDV 만을 검출하는 특이도가 우수함을 확인하였다. 또한, 금속 색깔 지시제인 HNB를 적용하여 별도의 판독기 없이도 반응 결과를 육안으로 바로 확인 가능하여 오염 가능성이 낮은 특징이 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트; 서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "PEDV"는 Coronaviridae과에 속하며 외피를 보유한 단일 가닥의 정방향 RNA 바이러스이다. PEDV는 1970년대 초반 유럽에서 최초로 발견되었다. 그 이후로 질병은 다른 유럽이나 아시아 국가들에서 보고되었고, 더욱 심한 유행병으로 일본, 중국, 한국, 필리핀, 태국, 대만 그리고 베트남을 포함하는 아시아 국가들에서 주요하게 발생되고 있다.
본 발명에 있어서, “검출”은 화학 분석에서, 시료 속에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것으로, 본 발명에서는 PEDV를 검출하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, “프라이머”는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 제1 프라이머 세트는 2종의 외부 프라이머 N-F3(Forward, 서열번호 1) 및 N-B3((Backward, 서열번호 2)로 구성되고, 상기 제2 프라이머 세트는 2종의 루프(loop) 프라이머 N-LF(Forward loop primer, 서열번호 3) 및 N-LB(Backward loop primer, 서열번호 4)로 구성되고, 상기 제3 프라이머 세트는 2종의 내부 프라이머 N-FIP((Forward inner primer) 및 N-BIP(Backward inner primer)로 구성된다. 상기 내부 프라이머 N-FIP는 N-F1c(서열번호 5) 및 N-F2(서열번호 6)로 구성되고, N-BIP는 N-B1c(서열번호 7) 및 N-B2(서열번호 8)로 구성된다.
상기 3쌍의 프라이머 세트는 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification)용 또는 프로브 기반의 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)용인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 vRT-LAMP용이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop Mediated Isothermal Amplification)"는 박테리아 또는 바이러스로 야기된 질병을 진단하고, PCR법의 단점을 보완한 진단법으로, RT-PCR법과는 달리 일정한 온도(등온)에서 어닐링(annealing) 및 신장(extension)이 가능하여 온도조절장치가 필요하지 않으며, 일정한 온도조건에서 유전자를 증폭할 수 있다. 또한 신속성, 특이성 및 검출 감도가 높아 1시간 이내에 109 copy의 유전자를 증폭시킬 수 있다.
RT-LAMP 기법은 기존의 PCR 기반 진단법에서 사용되는 Taq DNA polymerase와 달리 목표유전자를 가닥 변위(strand displacement) 방식에 의해 대량 증폭할 수 있는 Bst DNA 중합효소를 이용함으로써 유전자 증폭효율이 월등하게 높다.
또한 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 항온수조와 같은 저가의 장비로도 반응이 가능하다. 따라서 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장 진단용 등으로 이용 가능하다. 또한 프로브 세트를 추가하여 실시간 LAMP을 수행할 수 있으며, 증폭산물 검출은 실시간 형광검출 장비를 이용하고, 병원체의 양에 따라 유전자 증폭량을 실시간으로 확인할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 PEDV의 ORF6(open reading frame 6) 유전자를 표적으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, ORF(open reading frame)는 아미노산의 서열로 번역되는 DNA 염기서열을 의미한다. 즉, 번역개시코돈(start codon; ATG)에서 정지코돈(stop codon; TGA, TAA, TAG)에 이르는 염기서열을 의미한다. PEDV의 S(Spike) 유전자보다 변이가 적은 ORFs 유전자를 표적으로 할 때 바이러스의 검출을 보다 안정적으로 유도할 수 있으며, 그 중 ORF6를 표적으로 할 때 다른 돼지 병원체를 구분하여 돼지 유행성 설사병 바이러스의 검출 특이도가 우수하게 나타났다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 키트;를 제공한다.
본 발명의 PEDV 검출용 조성물은 통상적으로 PEDV의 검출에 사용되는 공지의 구성을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법을 제공한다.
상기 단계 (a)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, PEDV 검출에 적합한 최적 vRT-LAMP 반응 조건을 확립하기 위하여 표준 RNA를 이용하여 반응온도(56-68 ℃)와 반응시간 (30-60 분)을 달리하여 vRT-LAMP를 실시한 결과 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상은 육안으로는 60, 62, 64 및 66 ℃에서 연청색(sky blue)의 HNB 특유 양성 색상이 관찰되었으며, 62 ℃의 반응 온도에서 특유의 사다리꼴 모양의 양성밴드가 가장 뚜렷하게 나타났다. 40 분간 반응시켰을 때 민감도 한계 값인 5×101 copy/μL의 양성 밴드가 뚜렷하게 관찰됨을 확인하였다.
따라서, 상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 56 내지 68℃에서 수행하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 60 내지 66℃, 더욱 바람직하게는 62℃일 수 있다.
또한, 상기 단계 (b)의 증폭 반응은 30분 내지 60분 동안 이루어지는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 40분일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 (b) 단계의 등온 증폭 반응은 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification) 또는 프로브 기반 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)일 수 있고, 바람직하게는 vRT-LAMP 법이나, 당업계에서 일반적으로 사용되는 등온 증폭 반응이라면 제한 없이 적용 가능하다.
본 발명의 "vRT-LAMP"는 전술한 바와 같다.
상기 단계 (b)의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색지시제를 이용한 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 반응산물의 탁도 측정법은 LAMP 반응 양성반응 시에 생성되는 피로인산 마그네슘(magnesium pyrophosphate) 침전물에 의해 반응산물의 탁도가 증가하는 현상을 이용한 측정방법으로 육안 관찰 또는 탁도계를 이용하여 실시간으로 탁도를 측정할 수 있는 방법을 의미할 수 있다. 또한 상기 형광측정에는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 형광 염색 물질을 적용할 수 있으며 바람직하게는 SYTO 9과 SYBR Green I, Quant-iT PicoGreen, GeneFinder, Ethdium bromide, 더욱 바람직하게는 SYTO 9과 SYBR Green I을 사용할 수 있다. 기 형광 염색 물질은 이중가닥에 선택적으로 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 첨가한 물질일 수 있으며 특히, 상기 SYTO 9과 SYBR 그린I은 RT-LAMP 생성물에 삽입되어 자연광에서 혹은 자외선 조사 시 녹색의 형광을 발현하는 물질을 의미한다.
예컨대 돼지 유행성 설사병 바이러스 핵산을 검출 방법을 이용하여 vRT-LAMP법으로 증폭시키고, 증폭된 LAMP 생성물에 상기 SYTO 9이나 SYBR Green I을 첨가하면 녹색 형광을 나타내게 된다. 따라서 상기 형광 측정방법을 이용하면 전기영동 등 별도의 추가적인 실험을 거치지 않고도, 형광을 인지함에 따라 돼지 유행성 설사병 바이러스에 감염된 것을 파악할 수 있다. 즉, 녹색 형광을 나타내지 않으면 비감염을 의미하므로 시료가 돼지 유행성 설사병 바이러스에 감염되었는지에 여부를 고감도로 신속하게 육안으로 확인할 수 있다.
또한, 상기 발색 지시제(colorimetric indicator) 측정 방법에서 발색 지시제로는 칼세인(calcein), 하이드록시나프톨블루(hydroxy naphthol blue, HNB), 페놀레드(phenol red), 크레졸레드(cresol red), 말라키이트 그린(malachite green), 메틸 그린(methyl green) 등을 사용할 수 있으나 바람직하게는 HNB를 사용할 수 있다.
상기 발색지시제를 첨가할 경우 LAMP 증폭 과정 중에 생성된 반응산물(pyrophosphate, Mg2+)에 의해 반응액의 색깔이 오렌지색 또는 청색으로 변화되는 특성을 이용하여 검출할 수 있는 바, 추가적 실험을 거치지 않고도 검출 여부를 신속하게 판독할 수 있다. 또한 상기 HNB는 증폭 이전의 반응액에 미리 첨가하여 반응을 진행할 수 있다. HNB를 증폭 이전의 반응액에 혼합하면, 반응튜브를 개봉하지 않고도 반응 결과의 확인이 가능하기 때문에, 반응 후에 염색액을 첨가해주어야 하는 방법에 비해 교차오염을 방지할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서는, PEDV의 ORF6 유전자를 표적으로 하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 구체적으로, 3쌍의 프라이머 세트를 제작하고, 2종의 외부 프라이머 N-F3(Forward, 서열번호 1) 및 N-B3((Backward, 서열번호 2)로 구성된 제1 프라이머 세트, 2종의 루프(loop) 프라이머 N-LF(Forward loop primer, 서열번호 3) 및 N-LB(Backward loop primer, 서열번호 4)로 구성된 제2 프라이머 세트, 2종의 내부 프라이머 N-FIP((Forward inner primer) 및 N-BIP(Backward inner primer)로 구성된 제3 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 내부 프라이머 N-FIP는 N-F1c(서열번호 5) 및 N-F2(서열번호 6)로 구성되고, N-BIP는 N-B1c(서열번호 7) 및 N-B2(서열번호 8)로 구성된다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 vLAMP의 최적 반응 조건을 확립한 결과, vRT-LAMP법은 62℃의 일정한 온도 조건으로 1시간 이내에(40분) PEDV를 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP 수행 시, 낮은 농도의 시료만으로도 PEDV를 검출할 수 있어 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 PEDV만을 검출하는 특이도가 우수하다.
또한, 야외 시료에 대한 검출 효율이 기존의 conventional PCR 및 Real-time PCR에 비하여 우수함을 확인하였다. 따라서, 기존의 PCR 기반 진단법과는 달리 온도 변화가 없는 등온조건에서 유전자 증폭이 이루어지기 때문에 검사시간이 단축될 뿐만 아니라 실시간으로 반응산물을 확인할 수 있다. 따라서, 전문 진단실은 물론 고가의 장비와 시약 및 전문인력이 확보되지 않은 소규모의 진단실이나 현장에서 PEDV의 검출에 효과적으로 이용할 수 있다.
본 발명을 설명함에 있어서, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. PEDV의 핵산 추출
표준 양성 바이러스는 돼지 유행성 설사 바이러스(이하 PEDV)의 분리주(KNU141112)를 이용하였으며, 표준유전자는 ORF6 전체 유전자가 포함되도록 시판 클로닝 키트(pTOPcloner™ TA Core Kit, Enzynomics, Korea)에 포함된 pTOP TA V2 벡터에 클로닝하여 표준 유전자로 사용하였으며, 음성 대조군은 PEDV 음성이 확인된 돼지 신장세포(PK-15)와 아프리카 초록원숭이 신장세포(Vero)를 사용하였다.
야외시료는 양돈장의 질병이 있는 돼지로부터 조직(소장) 55점 및 분변 94점을 채취하여 실험에 이용하였다. 분변시료는 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 채취한 다음, -20℃에 보관하여 이용하였고, 조직시료는 세절하여 PBS로 10% 유제액을 만든 다음, 조직균질기(Bertin technologies, France)을 사용하여 파쇄하였다. 이후, 8,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 채취한 다음, -20℃에 보관하였다.
또한, LAMP 및 PCR을 위한 핵산 추출은 실험 당일 보관 혈청 및 조직시료로부터 시판 자동 핵산 추출키트(TAN Bead, Taiwan)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 병원체, 이의 분리주 및 이의 제공처를 표 1에 나타내었다.
| 병원체(Pathogen) | 분리주(Strain) | 제공처(Source) | 튜브 NO. |
| 돼지 유행성 설사 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus) |
SM98 strain | ADIC | TUBE 1 |
| 돼지 유행성 설사 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus) |
DR-13 | ADIC | TUBE 2 |
| 돼지 유행성 설사 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus) |
CV777 | ADIC | TUBE 3 |
| 돼지 유행성 설사 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus) |
KNU-1305 strain | ADIC | TUBE 4 |
| 전염성 위장염 바이러스 (Transmissible gastroenteritis virus) |
175Lvac | APQA | TUBE 5 |
| 돼지 델타 코로나바이러스 (Porcine delta coronavirus) |
KNU16-07 | ADIC | TUBE 6 |
| 돼지 로타 바이러스 (Porcine rotavirus) |
A1vac | APQA | TUBE 7 |
| 돼지 써코바이러스 2형 (Porcine circovirus type 2) |
PCK0201 | ADIC | TUBE 8 |
| 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 유전자형1 (PRRS virus, genotype 1) |
Lelystad virus | APQA | TUBE 9 |
| 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스 유전자형2 (PRRS virus, genotype 2) |
LMY strain | APQA | TUBE 10 |
| 돼지 콜레라 바이러스 (Classical swine fever virus) |
LOM strain | APQA | TUBE 11 |
| 돼지 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus) |
Field isolate | ADIC | TUBE 12 |
| 돼지 파보바이러스 (Porcine parvovirus) |
Field isolate | ADIC | TUBE 13 |
| PK-15 세포 | - | ADIC | TUBE 14 |
| 베로 세포(Vero cell) | - | ADIC | TUBE 15 |
실시예 2. vRT-LAMP용 프라이머 설계
vRT-LAMP법을 이용하여 PEDV를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계하였다.
구체적으로, PEDV KNU141112 바이러스주의 유전자 염기서열(GenBank accession number KR873431)을 표준으로 하여 기 보고된 서로 다른 PEDV 유전자 그룹의 오픈 리딩 프레임 6(ORF6, open reading frame 6) 유전자 염기서열 정보를 확보하여 BioEdit Sequence Alignment Editor program (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html) 프로그램으로 비교 분석하고 가장 안정적인 부위를 선발하였다.
그 다음, LAMP용 프라이머 설계 프로그램인 프라이머-익스플로러 V5 소프트웨어(Primer-Explorer V5 software; Fujitsu System Solutions Ltd., Japan)를 이용하여 2종의 외부 프라이머 N-F3(Forward) 및 N-B3((Backward), 2종의 루프(loop) 프라이머 N-LF(Forward loop primer) 및 N-LB(Backward loop primer) 그리고 2종의 내부 프라이머 N-FIP((Forward inner primer) 및 N-BIP(Backward inner primer)를 설계하고 프라이머 제조업체(Bionics, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 2종의 내부 프라이머 N-FIP는 N-F1c 및 N-F2로 구성되고, N-BIP는 N-B1c 및 N-B2로 구성된다.
설계된 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 도 1 및 표 2에 나타내었다.
| 프라이머 특징 | 명칭 | 서열 Sequence (5’-3’) | |
| 제1 프라이머세트 (외부 프라이머) |
N-F3 | CTTCGAARGAACGTGACCT | 서열번호 1 |
| N-B3 | CAATGCTGCAACATTTGGT | 서열번호 2 | |
| 제2 프라이머세트 (루프 프라이머) |
N-LF | GCTATTTTCGCCCTTGGGA | 서열번호 3 |
| N-LB | AGGTGTTGATGCSTCAGG | 서열번호 4 | |
| 제3 프라이머세트 (내부 프라이머) |
N-F1c | TGGGTCCGAAGCAAGCTG | 서열번호 5 |
| N-F2 | AGACATCCCAGAGTGGAGG | 서열번호 6 | |
| N-B1c | TTGGAGATGCGGAATTTGTCG | 서열번호 7 | |
| N-B2 | AACTGGCGATCTGAGCATAG | 서열번호 8 |
실시예 3. vRT-LAMP법 수행 시 최적 반응조건 확립
상기 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법의 최적 반응조건을 확립하였다.
구체적으로, RT-LAMP를 수행하기 위한 반응액의 조성은 8 unit의 Bst DNA 중합효소(NEW England Biolabs, USA), 10 U /μL AMV 역전사 효소(Promega), 0.8 M 베타인(Sigma-Aldrich, USA), 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM 염화칼륨, 8 mM 황산마그네슘, 10 mM 황산암모늄, 0.1 % 트리톤 X-100, 1.4 mM의 dNTPs, 0.12 mM HNB(Lemongreen, Shanghai, China), 서열번호 1 및 2의 제 1프라이머 세트 각각 2.5 pmol, 서열번호 3 및 4의 제2 프라이머 세트 각각 10 pmol, 서열번호 5 내지 8의 제3 프라이머 세트 각각 20 pmol 첨가하여 제조하였다.
제조한 반응액에 상기 실시예 1에서 추출한 RNA 시료 5μL를 첨가한 다음, 멸균 증류수로 최종 용량을 25μL로 조절하였다. PEDV 검출에 적합한 최적 vRT-LAMP 조건을 확립하기 위하여 표준 RNA를 이용하여 반응온도(56-68 ℃)와 반응시간 (30-60 분)을 달리하여 vRT-LAMP를 실시한 다음, 80 ℃에서 5 분간 처리하여 반응액 내의 효소 활성을 제거하였다.
반응이 끝난 튜브의 반응액을 육안으로 관찰하여 색깔 변화를 관찰하여 양성 여부를 판독하였다(도 2 및 3의 (A)).
또한, 동시에 2.0 % 아가로스 겔에 전기영동을 실시한 다음, 자외선판독기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 LAMP 반응에서 특이적으로 나타나는 사다리 모양의 증폭 유전자 밴드를 확인하여 양성 여부를 판정하였다(도 2 및 3의 (B)).
도 2는 53∼66℃의 반응 온도 조건에서 실시된 vRT-LAMP법의 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2(A)를 참고하면, vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상은 육안으로는 60, 62, 64 및 66 ℃에서 연청색(sky blue)의 HNB 특유 양성 색상이 관찰되었다. 도 2(B)를 참고하면, 레인 4의 62 ℃의 반응 온도에서 특유의 사다리꼴 모양의 양성밴드가 가장 뚜렷하게 나타났다.
도 3은 30, 40, 50 및 60분 조건의 반응시간으로 양성 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 3(A)의 레인 1 내지 3은 PEDV의 RNA를 10배수 단계 희석함(5×102-0 copies)을 나타낸다.
도 3(B)를 참고하면, 40 분간 반응시켰을 때 민감도 한계 값인 5×101 copy/μL의 양성 밴드가 뚜렷하게 관찰됨을 확인하였다.
따라서, 이후의 모든 vRT-LAMP 실험은 62 ℃의 반응온도와 40 분의 반응시간으로 최적 반응조건을 고정하여 실시하였다.
실시예 4. vRT-LAMP법 수행 시 PEDV 검출 특이도 분석
상기 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP법 진단 시 돼지 유래 병원체를 제외하고 오직 PEDV를 검출하는지 확인하기 위하여, 실시예 1에서 핵산 추출한 PEDV 및 돼지 호흡기 및 전신성 질병의 병원체를 대상으로 PEDV 검출 특이도를 분석하였다.
구체적으로, 상기 실시예1에서 추출하고 표 1에 개시된 PEDV 및 돼지 소회기 및 전신성 질병의 병원체에 대하여, 상기 실시예 3에서 확립한 62℃ 및 40분 반응 조건으로 프라이머 세트(서열번호 1 내지 8)를 이용하여 vRT-LAMP를 수행했고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 튜브 1은 돼지 유행성 설사병 바이러스(SM-98), 튜브 2는 돼지 유행성 설사병 바이러스(DR13), 튜브 3은 돼지 유행성 설사병 바이러스(CV777), 튜브 4는 돼지 유행성 설사병 바이러스(KNU1305), 튜브 5는 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV), 튜브 6은 돼지 델타코로나바이러스(Porcine deltacoronavirus, PDCoV), 튜브 7은 돼지 로타 바이러스(Porcine rotavirus, PRV), 튜브 8은 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus 2, PCV2), 튜브 9는 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 유전형 1, 튜브 10은 돼지생식기호흡기증후군바이러스 유전형 2, 튜브 11은 돼지 콜레라 바이러스(classical swine fever virus), 튜브 12는 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus, SIV), 튜브 13은 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus), 튜브 14는 돼지 신장 세포(porcine kidney cell-15), 튜브 15는 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(Vero cell), NC는 음성 대조군을 나타낸다.
도 4를 참고하면, vRT-LAMP용 프라이머 세트는 PEDV ORF6 유전자만을 특이적으로 증폭하여 PEDV에 해당하는 튜브 1 내지 튜브 4에서 HNB 특유의 양성 색상(푸른색)이 나타남을 확인하였다.
따라서, 표 2의 프라이머 세트를 이용 시, PEDV만을 특이적으로 증폭하며, HNB을 이용하여 양성 반응을 판독 시, 젤 전기영동이나 DNA 염색액 첨가를 통하여 확인하는 경우 보다 오염률이 낮고 간편함을 확인하였다.
실시예 5. cRT-PCR 법 및 RT-PCR법을 이용한 PEDV 검출 민감도 비교 분석
표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 conventional RT-PCR 및 Real-time PCR법을 수행하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출에 대한 민감도의 차이를 확인하였다.
5-1. conventional RT-PCR(cRT-PCR) 수행 조건
cRT-PCR은 시판 RT-PCR 키트 (PrimeScriptTM one-step RT-PCR kit, TAKARA, Japan)를 이용하여 제조사의 추천 방법에 따라 검사하였다. 정방향 프라이머(TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG; cRT-PCR-Forward primer;서열번호9) 및 역방향 프라이머(CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT; cRT-PCR-Backward primer;서열번호10)를 이용하여 실시예 1에서 추출한 RNA 5μL를 PCR premix에 첨가한 다음, PCR 증폭기(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 50℃에서 30 분간 역전사를 수행하고, 94℃에서 2 분간 처리하고, 35 회전의 PCR 과정(denaturation 94℃, 30 초; annealing 55℃, 30 초; extension 72℃에서 40 초)를 수행하였으며, 72℃에서 2 분간 최종 반응하였다.
PCR 증폭산물은 NEO green 염색액(NEO science, Korea)을 첨가하여 1.5 % 아가로스 겔에 전기 영동한 다음, 자외선판독기 (Bio-Rad, USA)로 428 bp의 특이 밴드를 관찰하여 판독하였다.
5-2. Real-time PCR(rRT-PCR) 수행 조건
Real-time RT-PCR은 기 발표된 방법을 참고하여, 정방향 프라이머(CGCAAAGACTGAACCCACTAA; rRT-PCR-Forward primer;서열번호11), 역방향 프라이머(TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT; rRT-PCR-Backward primer;서열번호12) 및 프로브(FAM-TGTTGCCATTRCCACGACTCCTGC-BHQ1; rRT-PCR-Probe;서열번호13)를 시판 RT-PCR 키트 (PrimeScriptTM one-step RT-PCR kit, TaKaRa, Japan)를 사용하여 수행하였다.
10μL의 2X Reaction buffer, 0.5μL의 DNA polymerase, 0.5μL의 RT Enzyme mix, 0.4μM의 각 프라이머 및 프로브를 첨가한 반응액에 실시예 1에서 추출한 RNA template 5 μL를 첨가한 다음, 멸균증류수로 최종 용량을 20μL로 조정하였다. rRT-PCR 반응은 실시간핵산증폭기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 50℃에서 10 분간 역전사과정을 수행하고, 95℃에서 1 분간 처리한다음, 40 회전의 PCR 과정(denaturation 95℃에서 15 초, annealing 58℃에서 45 초)을 거친 다음, CT값이 37 이하일 경우 양성으로 판정하였다.
5-3. 각 진단법의 PEDV 검출 민감도 측정
표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 conventional RT-PCR법 및 Real-time RT-PCR법 간의 민감도를 비교하였다.
구체적으로, PEDV 표준 플라스미드를 NFW(Nuclease free water)로 10 배수 단계 희석하고, 민감도 측정에 사용된 유전자는 시판 플라스미드 추출키트(Gene All, Korea)를 이용하여 제조사의 방법대로 플라스미드를 추출하여 50 μL의 증류수에 용출한 후 그 중 5 μL를 채취하여 실험에 사용하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 (A)는 표 2의 프라이머 세트 중 제2 프라이머 세트(루프 프라이머)를 제외한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 산물을 전기영동 한 결과이다. (B)는 표 2의 프라이머 세트 중 제2 프라이머 세트(루프 프라이머)를 제외한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (C)는 표 2의 프라이머 세트 전체를 이용한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 산물을 전기영동 한 결과이다. (D)는 표 2의 프라이머 세트 전체를 이용한 vRT-LAMP 반응이 끝난 튜브의 반응액의 색상 변화를 나타내고, (E)는 cRT-PCR을 실시한 결과이며, (F)는 qRT-PCR을 실시한 결과이다.
상기 (A) 내지 (F)의 레인 1 내지 7은 PEDV의 표준 플라스미드 유전자를 10 배수 단계 희석한 것을 나타낸다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP 방법과 기존의 일반 PCR 방법(cRT-PCR) 및 real time PCR(qRT-PCR) 방법과 민감도를 비교한 결과, 각각 101 copy/μL (도 5의 C의 6번 레인 및 D의 6번 튜브까지), 103 copy/μL (도 5의 E의 4번 레인까지) 및 101 copy/μL (도 5의 F의 6번 검출선까지) 희석농도까지 검출됨을 확인하여, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP 방법을 이용할 경우, 기존의 cRT-PCR보다 100배 더 민감하고 qRT-PCR과 유사함을 확인하였다.
5-4. 야외시료에 대한 cRT-PCR, qRT-PCR 및 vRT-LAMP의 PEDV 검출 효율 비교
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 vLAMP법과 다른 서열의 프라이머를 이용한 cRT-PCR법 및 qRT-PCR법 간의 야외시료 검출 효율을 확인하였다.
구체적으로, 2020년 9월부터 2021년 8월까지 경북대학교 수의전염병제어센터에 검사 의뢰되어 보관하고 있던 PEDV 양성 국내 돼지 농장의 조직 55점과 분변 시료 94점을 대상으로 실시예 1의 방법으로 핵산을 추출하였다. 그 후, vRT-LAMP법, cRT-PCR법 및 qRT-PCR법을 실시하여 그 결과를 비교하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
| 샘플 | vRT-LAMP | cRT-PCR | qRT-PCR | |||
| 양성반응 수 /테스트 수 |
양성률 (%) |
양성반응 수 /테스트 수 |
양성률 (%) |
양성반응 수 /테스트 수 |
양성률 (%) |
|
| 분변시료 (Feces) |
73/94 | 77.7 | 54/94 | 57.4 | 71/94 | 75.5 |
| 장 조직 (Intestine) |
26/55 | 47.3 | 26/55 | 47.3 | 26/55 | 47.3 |
| Total | 99/149 | 66.4 | 80/149 | 53.7 | 97/149 | 65.1 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 총 149개의 야외시료에 대하여 기존의 cRT-PCR은 149점 중에서 80점이 양성으로 확인되었으나, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법을 수행 시, 기존 cRT-PCR에서 음성인 시료로 판정된 19점을 더 포함한 총 99점이 양성으로 확인되어, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법은 기존의 cRT-PCR 검출 방법보다 검출 효율이 우수함을 확인하였다.
또한 기존의 qRT-PCR은 총 149점 중에서 97점이 양성으로 확인되었으나, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법을 수행 시, 기존 qPCR에서 음성인 시료로 판정된 2점을 더 포함한 총 99점이 양성으로 확인되어, 표 2의 프라이머 세트를 이용한 vRT-LAMP법은 기존의 qRT-PCR 검출 방법보다 검출 효율이 우수함을 확인하였다.
따라서, 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 vRT-LAMP를 수행 시, 낮은 농도에서도 PEDV 만을 검출하여 민감도가 높고, 돼지에서 발생하는 다른 병원체를 제외하고 오직 PEDV 만을 검출하는 특이도가 우수함을 확인하였다.
또한, HNB를 적용하여 별도의 판독기 없이도 반응 결과를 육안으로 바로 확인 가능하여 오염 가능성이 낮음을 확인하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Compositions for detecting porcine epidemic diarrhea virus and
method for detecting porcine epidemic diarrhea virus using the
same
<130> 2021-0588(1.338P)
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-F3
<400> 1
cttcgaarga acgtgacct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-B3
<400> 2
caatgctgca acatttggt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-LF
<400> 3
gctattttcg cccttggga 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-LB
<400> 4
aggtgttgat gcstcagg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-F1c
<400> 5
tgggtccgaa gcaagctg 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-F2
<400> 6
agacatccca gagtggagg 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-B1c
<400> 7
ttggagatgc ggaatttgtc g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-B2
<400> 8
aactggcgat ctgagcatag 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cRT-PCR-Forward primer
<400> 9
ttcccagcgt agttgagatt g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cRT-PCR-Backward primer
<400> 10
cgaagtggct ctggatttgt t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rRT-PCR-Forward primer
<400> 11
cgcaaagact gaacccacta a 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rRT-PCR-Backward primer
<400> 12
ttgcctctgt tgttacttgg agat 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rRT-PCR-Probe
<400> 13
tgttgccatt rccacgactc ctgc 24
Claims (12)
- 서열번호 1 및 2로 이루어진 제1프라이머 세트;
서열번호 3 및 4로 이루어진 제2프라이머 세트; 및
서열번호 5 내지 8로 이루어진 제3프라이머 세트; 를 포함하는,
돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus) 검출용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 vRT-LAMP(visual Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification)용 또는 프로브 기반의 rLAMP(Probe-based real-time Loop Mediated Isothermal Amplification)용인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 PEDV의 ORF6(open reading frame 6) 유전자를 표적으로 하는,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 프라이머 세트. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물.
- 제4항의 조성물을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 키트.
- (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; 및
(b) 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하는 등온 증폭 반응을 수행함과 동시에 등온 증폭 산물을 검출하는 단계; 를 포함하는,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 단계 (a)의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 56 내지 68℃에서 수행하는 것인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 단계 (b)의 증폭 반응은 30분 내지 60분 동안 이루어지는 것인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 단계 (b)의 등온 증폭 반응은 vRT-LAMP 방법인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. - 제6항에 있어서,
상기 단계 (b)의 검출은 겔 전기영동, 반응산물의 탁도 측정, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 발색 지시제를 이용한 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법. - 제11항에 있어서,
상기 발색 지시제는 칼세인(calcein), 하이드록시나프톨블루(hydroxy naphthol blue, HNB), 페놀레드(phenol red), 크레졸레드(cresol red), 말라키이트 그린(malachite green) 및 메틸 그린(methyl green)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210191819A KR20230101589A (ko) | 2021-12-29 | 2021-12-29 | 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210191819A KR20230101589A (ko) | 2021-12-29 | 2021-12-29 | 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230101589A true KR20230101589A (ko) | 2023-07-06 |
Family
ID=87185690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020210191819A KR20230101589A (ko) | 2021-12-29 | 2021-12-29 | 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| KR (1) | KR20230101589A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116904667A (zh) * | 2023-09-06 | 2023-10-20 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法 |
| CN117210455A (zh) * | 2023-11-09 | 2023-12-12 | 广东省林业科学研究院 | 基于lamp方法检测东阳病毒的引物组、试剂盒及方法 |
-
2021
- 2021-12-29 KR KR1020210191819A patent/KR20230101589A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116904667A (zh) * | 2023-09-06 | 2023-10-20 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法 |
| CN116904667B (zh) * | 2023-09-06 | 2023-12-19 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法 |
| CN117210455A (zh) * | 2023-11-09 | 2023-12-12 | 广东省林业科学研究院 | 基于lamp方法检测东阳病毒的引物组、试剂盒及方法 |
| CN117210455B (zh) * | 2023-11-09 | 2024-02-02 | 广东省林业科学研究院 | 基于lamp方法检测东阳病毒的引物组、试剂盒及方法 |
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