CN116004909A - 一种猴痘病毒的多重荧光pcr检测引物、探针及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用，具体涉及生物技术领域。猴痘病毒的上游扩增引物MPXV‑F01如SEQ ID NO.1所示，下游扩增引物MPXV‑R01如SEQ ID NO.2所示；猴痘病毒西非分支的上游扩增引物MPXV‑WA‑F如SEQ ID NO.3所示，下游扩增引物MPXV‑WA‑R2如SEQ ID NO.4所示；猴痘病毒刚果分支的上游扩增引物MPXV‑CB‑F如SEQ ID NO.5所示，下游引物MPXV‑CB‑R1如SEQ ID NO.6所示。本发明检测方法的灵敏度高；反应快速：＜45min；特异性好：与其它样本/核酸无交叉；是首个西非型（致死率1%）和刚果分支（致死率10%）的检测方法。本发明开展猴痘PCR诊断方法的研究符合检验检疫部门的实际情况，能够满足检验检疫部门的工作需要。

Description

一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用。

背景技术

猴痘病毒（MPXV）归类于痘病毒科正痘病毒属，是对人类致病的4种正痘病毒属之一，另外3种是天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒。电镜下猴痘病毒颗粒呈砖形或椭圆形，大小为200nm×250nm，有包膜，病毒颗粒中有结构蛋白和DNA依赖的RNA多聚酶，基因组为双链DNA，长度约197kb。猴痘病毒分为西非分支和刚果盆地分支两个分支。猴痘病毒的主要宿主为非洲啮齿类动物（包括非洲松鼠、树松鼠、冈比亚袋鼠、睡鼠等）。猴痘病毒耐干燥和低温，在土壤、痂皮和衣被上可生存数月。对热敏感，加热至56℃ 30分钟或60℃ 10分钟可灭活。紫外线和一般消毒剂均可使之灭活，对次氯酸钠、氯二甲酚、戊二醛、甲醛和多聚甲醛等敏感。

猴痘是一种病毒性人畜共患病，由猴痘病毒引起，能够在动物和人类之间传播，在人类之间也可以进行二次传播。其动物宿主包括一系列啮齿动物，如松鼠、冈比亚袋鼠、睡鼠和非人类灵长类动物。

猴痘病毒是一种包膜双链DNA病毒，呈长方形，可在非洲绿猴肾细胞中培养生长，导致细胞病变，属痘病毒科的正痘病毒属，抵抗乙醚，对干燥有较强抵抗力，但易被氯仿、甲醇和福尔马林灭活。56℃加热30分钟，也易使其灭活。

猴痘病毒共有两个不同的遗传进化分支——中非分支和西非分支。其中，西非分支病死率约为1%；刚果分支历史上引起的疾病更严重，病死率约为10%，并被认为更具传染性。自1980年消灭天花以及随后人类停止接种天花疫苗，猴痘已成为公共卫生中最重要的正痘病毒。

经检索，国外报道受权威部门认可的的实验室诊断猴痘感染的方法分为三大类，第一类是病原分离的方法，通过细胞培养，分离出猴痘病毒；第二类是基因诊段的方法，采用PCR方法检测到标本中的猴痘病毒核酸；第三类是电镜检查，发现受检物中有与正痘病毒形态一致的病毒存在。

就上述三类诊断猴痘感染的发方法而言，各有利弊：病毒分离，结果准确，但检测周期太长，至少需要两个星期，用于出入境检验检疫不太现实，而且由于进行活毒操作，对实验室生物安全要求极高；电镜检查的方法，灵敏度不高，样品准备复杂，周期长，更致命的缺陷是的是需要电镜，电镜极其昂贵，操作极其复杂。采用PCR方法检测到标本中的猴痘病毒核酸会容易满足检验检疫部门的工作需要，但是现有采用PCR方法检测到标本中的猴痘病毒核酸的方法检测时间长；且现未找到西非型（致死率1%）和刚果分支（致死率10%）的检测方法相关专利报道。

发明内容

为此，本发明提供一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用，以解决现有猴痘病毒检测时间长，操作复杂等问题。

双链RNA结合蛋白区F3L基因可以有效区分天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒的特异基因片段。针对F3L基因设计专用Taqman探针和超级淬灭探针，可以对猴痘病毒进行快速检测。

针对不同猴痘病毒分离株所共有双链RNA结合蛋白区F3L基因，针对西非支和刚果分支的特异性基因分别设计专用的Taqman探针和超级淬灭探针，不仅能检测出猴痘病毒，还能分型，即判定它属于“刚果盆地分支（简称刚果分支）”和“西非分支”。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明的第一方面提供一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，猴痘病毒的上游扩增引物MPXV-F01：5’-ATCCTCTCTCATTGATTTTTC-3’，如SEQ ID NO.1所示，

下游扩增引物MPXV-R01：5’-TGATACACGGCCTACAGAT-3’，如SEQ ID NO.2所示；

猴痘病毒西非分支的上游扩增引物MPXV-WA-F：5’-TACCGGAACACAGAACAAATG-3’，如SEQ ID NO.3所示，

下游扩增引物MPXV-WA-R2：5’-GGTACACAAATCTCGACAATCTTC -3’，如SEQ ID NO.4所示；

猴痘病毒刚果分支的上游扩增引物MPXV-CB-F：5’-TATTAGTGTACACATTTTGGAAGT-3’，如SEQ ID NO.5所示，

下游引物MPXV-CB-R1：5’-CTAGCGGCTTAAAAGATCATAC-3’，如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述与猴痘病毒、西非分支或刚果分支特异性结合的荧光探针的5’端连接有荧光标记；

和/或，3’端修饰有淬灭基团。

进一步的，所述荧光标记为FAM、VIC、ROX、Joe或TAMRA等荧光基团；

和或，所述淬灭基团为Dabcyl、MGB、BHQ1或BHQ2等淬灭基团。

进一步的，所述猴痘病毒检测位点扩增引物的荧光探针MPXV-P01-FAM：5’-荧光报告基团-CATCATCTATTATAGCATCAGCATC-荧光淬灭基团-3’，序列如SEQ ID NO.7所示；

猴痘病毒西非分支荧光探针MPXV-WA-P-VIC：5’-荧光报告基团-TGTCATCCTGGTTGGTATACGCTAC -荧光淬灭基团-3’，序列如SEQ ID NO.8；

猴痘病毒刚果分支荧光探针MPXV-CB-P-ROX：5’-荧光报告基团-CTGCCATGTATTTCCTGGAGAGC -荧光淬灭基团-3’，序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步的，所述引物进行多重荧光PCR的反应体系为25μL；其中，所述反应体系包括2×Probe qPCR Buffer 2、猴痘病毒上下游引物及探针、西非分支上下游引物及探针、刚果分支上下游引物及探针、模板和无核酸酶水；等比例放大或缩小均在保护范围内。

作为示例，引物进行多重荧光PCR的反应体系：加入2×Probe qPCR Buffer 2 、猴痘病毒上下游引物及探针、西非分支上下游引物及探针、刚果分支上下游引物及探针、模板，最后加入无核酸酶水补至25μL，上述各种量可调整范围，最后的体系保证是25μL。

进一步的，所述引物进行多重荧光PCR的反应程序为95℃ 3min，循环1次；95℃5s，60℃15s，循环40次。FAM、VIC、ROX荧光通道采集荧光信号，合理范围内缩短或延长程序中的反应时间、更换荧光标记基团均在保护范围内。

进一步的，所述引物进行多重荧光PCR的反应采用纯化后的含有猴痘病毒基因片段、西非分支特异基因片段及刚果分支特异基因片段的质粒作为PCR反应的阳性对照。

根据本发明的第二方面提供的如上述猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物在制备检测猴痘病毒、猴痘病毒西非分支、猴痘病毒刚果分支产品中的应用。

根据本发明的第三方面提供的一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测方法，包括：

步骤一，针对猴痘病毒共有的基因片段、西非分支和刚果分支特异的基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时设计位于上下游引物间的Taqman荧光探针，合成分别针对猴痘病毒共有的基因片段及西非分支和刚果分支特异的基因片段的荧光PCR检测的引物、探针；

步骤二，经纯化后的含有猴痘病毒基因片段、西非分支特异基因片段及刚果分支特异基因片段的质粒，稀释后作为PCR反应的阳性对照；

步骤三，在多重荧光PCR的反应体系和多重荧光PCR的反应程序下，检测带有猴痘病毒基因组/基因片段的核酸或质粒；猴痘病毒西非分支毒株/含有西非分支特异性的基因片段的核酸或质粒；猴痘病毒刚果分支毒株/含有刚果分支特异性的基因片段的核酸或质粒。

本发明具有如下优点：

本发明开展猴痘PCR诊断方法的研究符合检验检疫部门的实际情况，能够满足检验检疫部门的工作需要。

双链RNA结合蛋白区F3L基因可以有效区分天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒的特异基因片段。针对F3L基因设计专用Taqman探针和超级淬灭探针，可以对猴痘病毒进行快速检测。

针对不同猴痘病毒分离株所共有双链RNA结合蛋白区F3L基因，针对西非支和刚果分支的特异性基因分别设计专用的Taqman探针和超级淬灭探针，不仅能检测出猴痘病毒，还能分型，即判定它属于“刚果盆地分支（简称刚果分支）”和“西非分支”。

本发明检测方法的灵敏度高；反应快速：＜45min；特异性好：与其它样本/核酸无交叉；是首个西非型（致死率1%）和刚果分支（致死率10%）的检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明提供的在FAM、VIC、ROX荧光通道采集荧光信号下，猴痘病毒、猴痘病毒西非分支和猴痘病毒刚果分支的检测灵敏度图；

图2为本发明提供的猴痘病毒、猴痘病毒西非分支和猴痘病毒刚果分支的特异性曲线对比图，图中，A为阳性对照，B为特异性样本。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种猴痘病毒Monkeypox virus引物探针的设计。

针对猴痘病毒Monkeypox virus共有的基因片段及西非分支和刚果分支特异的基因（核酸序列如基因片段所示）设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时设计位于上下游引物间的Taqman荧光探针。合成分别针对Monkeypox virus共有的基因片段及西非分支和刚果分支特异的基因片段的荧光PCR检测的引物、探针：

猴痘病毒共有的F3L基因片段：如SEQ ID NO.10所示；

上游引物MPXV-F01：5’-ATCCTCTCTCATTGATTTTTC-3’

下游引物MPXV-R01：5’-TGATACACGGCCTACAGAT-3’

荧光探针MPXV-P01-FAM：5’-荧光报告基团FAM-CATCATCTATTATAGCATCAGCATC-荧光淬灭基团BHQ1-3’

猴痘病毒西非分支特异性基因片段：如SEQ ID NO.11所示；

上游引物MPXV-WA-F：5’-TACCGGAACACAGAACAAATG-3’

下游引物MPXV-WA-R2：5’-GGTACACAAATCTCGACAATCTTC-3’

荧光探针MPXV-WA-P-VIC：5’-荧光报告基团VIC-TGTCATCCTGGTTGGTATACGCTAC-荧光淬灭基团BHQ1-3’

猴痘病毒刚果分支特异性基因片段：如SEQ ID NO.12所示；

上游引物MPXV-CB-F：5’-TATTAGTGTACACATTTTGGAAGT-3’

下游引物MPXV-CB-R1：5’-CTAGCGGCTTAAAAGATCATAC-3’

荧光探针MPXV-CB-P-ROX：5’-荧光报告基团ROX-CTGCCATGTATTTCCTGGAGAGC-荧光淬灭基团BHQ2-3’。

实施例2

本实施例提供一种猴痘病毒Monkeypox virus引物探针的设计。

猴痘病毒共有的F3L基因片段：如SEQ ID NO.10所示；

上游引物MPXV-F01：5’-ATCCTCTCTCATTGATTTTTC -3’

下游引物MPXV-R01：5’-TGATACACGGCCTACAGAT -3’

荧光探针MPXV-P01-VIC：5’-荧光报告基团VIC-CATCATCTATTATAGCATCAGCATC -荧光淬灭基团MGB’ -3’

猴痘病毒西非分支特异性基因片段：如SEQ ID NO.11所示；

上游引物MPXV-WA-F：5’- TACCGGAACACAGAACAAATG -3’

下游引物MPXV-WA-R2：5’- GGTACACAAATCTCGACAATCTTC -3’

荧光探针MPXV-WA-P-FAM：5’-荧光报告基团FAM- TGTCATCCTGGTTGGTATACGCTAC -荧光淬灭基团MGB-3’

猴痘病毒刚果分支特异性基因片段：如SEQ ID NO.12所示；

上游引物MPXV-CB-F：5’-TATTAGTGTACACATTTTGGAAGT-3’

下游引物MPXV-CB-R1：5’-CTAGCGGCTTAAAAGATCATAC-3’

荧光探针MPXV-CB-P-ROX：5’-荧光报告基团ROX- CTGCCATGTATTTCCTGGAGAGC -荧光淬灭基团MGB-3’。

实施例3

本实施例提供一种利用实施例1的引物和探针进行猴痘病毒的多重荧光PCR检测的方法。

阳性对照：经过纯化后的含有猴痘病毒基因片段、西非分支特异基因片段及刚果分支特异基因片段的质粒（分别为C011-MPXV-F3L、C012-MPX-WA、C013-MPX-CB），测定浓度，计算拷贝数浓度。稀释至一定的浓度作为PCR反应的阳性参考品及敏感性质控品。

检测对象：带有经过市售的核酸提取试剂盒提取纯化后的猴痘病毒基因组、F3L基因或F3L基因片段的核酸或质粒；猴痘病毒西非分支毒株/含有西非分支特异性的基因片段的核酸或质粒；猴痘病毒刚果分支毒株/含有刚果分支特异性的基因片段的核酸或质粒。

反应体系：

2×Probe qPCR Buffer 2 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）、探针（10 μmol/L）、模板，最后加入无核酸酶水补至25 μL，具体加入量见表1。

表1

反应程序见表2。

表2

备注：FAM、VIC、ROX荧光通道采集荧光信号，合理范围内缩短或延长程序中的反应时间、更换荧光标记基团均在保护范围内。

试验例1

利用实施例3的方法判断其检测的灵敏度。

采用敏感性质控品：

将含有目标扩增片段的质粒用核酸蛋白分析仪测定260nm与280nm波长下的OD值，判断其纯度（OD_260nm/OD_280nm>1.8者为纯品），按照公式转换为质粒拷贝数：拷贝数（copies/μL）=（质粒浓度（ng/μL）×10^-9×6.02×10²³）/（660（bp）×质粒碱基数（bp））。上述C011-MPXV-F3L质粒浓度为43.6 ng/ μL，总长为3026 bp，所得拷贝数为1.32×10¹⁰ copies/μL，-20℃保存备用。上述C012-MPX-WA质粒浓度为21.55 ng/ μL，总长为3026 bp，所得拷贝数为6.5×10⁹ copies/μL，-20℃保存备用。上述C013-MPX-CB质粒浓度为51.35 ng/μL，总长为3125 bp，所得拷贝数为1.5×10¹⁰ copies/μL，-20℃保存备用。

将1.32×10¹⁰ copies/μL的C011-MPXV-F3L质粒进行10倍梯度稀释，得到1.32×10⁹copies/μL的模板A；将6.5×10⁹ copies/μL的C012-MPX-WA质粒进行10倍梯度稀释，得到6.5×10⁸copies/μL的模板B；将1.5×10¹⁰ copies/μL的C013-MPX-CB质粒进行10倍梯度稀释，得到1.5×10⁹ copies/μL的模板C。将A、B、C以1:2:1的比例进行混合后得到含有3.3×10⁸copies/μL的C011-MPXV-F3L质粒、含有3.25×10⁸copies/μL的C012-MPX-WA质粒、含有3.75×10⁸copies/μL的C013-MPX-CB质粒的高浓度质控品Con。将Con进行10倍梯度稀释，获得8个梯度浓度的质粒质控品。采用优化好的PCR反应体系及程序，以上述梯度稀释质粒为模板进行荧光PCR扩增。扩增结果使用Applied Biosystems QuantStudio 3 QuantStudioTMDesign&Analysis Software v1.5.1软件进行分析。

分析发现将标准阳性质粒作10倍倍比稀释，直至无荧光信号出现，该实时荧光定量RT-PCR方法所能检出的猴痘病毒通检基因的最低模板拷贝数浓度为C011-MPXV-F3L：3.3copies/μL，如图1所示，猴痘病毒西非分支特异性的最低模板拷贝数浓度为C012-MPX-WA：3.25 copies/μL，如图1所示，猴痘病毒刚果分支特异性的最低模板拷贝数浓度为C013-MPX-CB：3.75 copies/μL，如图1所示，每个反应体系加入5μL核酸，因此本方法所能检出的最低拷贝数为猴痘病毒通检16.5 copies/反应、西非分支16.25 copies/反应、刚果分支18.75 copies/反应。

图1中扩增曲线从左到右依次为：猴痘病毒刚果型3.75×10⁷copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10⁷copies/μL、猴痘病毒3.3×10⁷copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10⁶copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10⁶copies/μL、猴痘病毒3.3×10⁶copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10⁵copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10⁵copies/μL、猴痘病毒3.3×10⁵copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10⁴copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10⁴copies/μL、猴痘病毒3.3×10⁴copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10³copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10³copies/μL、猴痘病毒3.3×10³copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10²copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10²copies/μL、猴痘病毒3.3×10²copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10¹copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10¹copies/μL、猴痘病毒3.3×10¹copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10⁰copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10⁰copies/μL、猴痘病毒3.3×10⁰copies/μL、猴痘病毒刚果型3.75×10^-1copies/μL、猴痘病毒西非型3.25×10^-1copies/μL、猴痘病毒3.3×10^-1copies/μL。

试验例2

本试验例检验实施例3检测方法的特异性。

利用实施例3的方法检测伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒-2、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、蓝耳病毒、口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪组织匀浆核酸、猫瘟病毒、猫肛拭子提取核酸、猫冠状病毒、猫腹水提取核酸，检测结果见图2所示。

由图2可知，与伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒-2、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、蓝耳病毒、口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪组织匀浆核酸、猫瘟病毒、猫肛拭子提取核酸、猫冠状病毒、猫腹水提取核酸均无交叉反应。

试验例3

本试验例提供的是实施例3检测方法的重复性实验。

选取案例4中高浓度质控品Con进行10倍梯度稀释的标准品分别做3个批内重复和批间重复，采用该实时荧光定量RT-PCR方法优化的最佳反应条件进行扩增，批内批间重复变异系数均小于3%，分别见表3、表4和表5，结果表明该实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。

检测猴痘病毒F3L基因：FAM荧光通道。

表3

检测猴痘病毒西非型特异性基因：VIC荧光通道。

表4

检测猴痘病毒刚果型特异性基因：ROX荧光通道。

表5

综上，本方法灵敏度高、特异性和重复性好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

                         序列表

<110>  北京纳百生物科技有限公司

<120>  一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用

<130>  2022.9.15

<141>  2022-09-15

<160>  12

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  MPXV-F01

<400>  1

atcctctctc attgattttt c                               21

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  MPXV-R01

<400>  2

tgatacacgg cctacagat                                  19

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  MPXV-WA-F

<400>  3

taccggaaca cagaacaaat g                               21

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  MPXV-WA-R2

<400>  4

ggtacacaaa tctcgacaat cttc                            24

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  MPXV-CB-F

<400>  5

tattagtgta cacattttgg aagt                            24

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  MPXV-CB-R1

<400>  6

ctagcggctt aaaagatcat ac                              22

<210>  7

<211>  25

<212>  DNA

<213>  MPXV-P01-FAM

<400>  7

catcatctat tatagcatca gcatc                           25

<210>  8

<211>  25

<212>  DNA

<213>  MPXV-WA-P-VIC

<400>  8

tgtcatcctg gttggtatac gctac                           25

<210>  9

<211>  23

<212>  DNA

<213>  MPXV-CB-P-ROX

<400>  9

ctgccatgta tttcctggag agc                             23

<210>  10

<211>  300

<212>  DNA

<213>  F3L

<400>  10

ttcaatacga aaagaccaat ctctcctagt tatttgacag tactcattaataacggtgac 60

agggttaaca cctttccaat aaataatttt tttaaccgga ataacatcatcaaaagactt 120

atgatcctct ctcattgatt tttcgcggga tacatcatct attatagcatcagcatcaga 180

atctgtaggc cgtgtatcag catccattgt cgtagaccaa cgaggaggagtatcgttgga 240

gctgtaaacc atagcactac gttgaagatc atacagagct ttattaacttctcgcttctc 300

<210>  11

<211>  300

<212>  DNA

<213>  xifei

<400>  11

catataccgc aatccccaat tattctaata gatgtcatca atgtataaaatgcccaacag  60

gatcatttga taaggtaaag tgtaccggaa cacagaacaa atgttcgtgtcatcctggtt 120

ggtatacgct actgattctt cacagactga agattgtcga gatttgtgtaccaaaaaagg 180

agatgtccat gcggatactt tggtggaata gatgaaggaa atcctatttgtaaatcgtgt 240

tgtgttggtg aatattgcga ctacctacgt aattatagac ttgatccatttcctccatgc 300

<210>  12

<211>  400

<212>  DNA

<213>  gangguo

<400>  12

cggtagacga taccgttaca tttgaattaa tggtgttcca ttttacaact tttaacaagt  60

tgaccaattc atttctaata gtatcaaact ctccatgatt aaatatttta atagtatcca 120

ttttatatca ctacggacat aaaccattgt ataattttta tgtttattag tgtacacatt 180

ttggaagtaa gttccggctg ccatgtattt cctggagagc aagtagatga tgaggaacca 240

gatagtttat atccatactt gcacttaaag tctacattgt agttgtatga gtgtatgatc 300

ttttaagccg ctagaagttt tccgtttgat ataggatgtg gacatttaac aatctgacac 360

gtgggtggat tggaccattc tcctcctgaa cacatgacac                       400

Claims (9)

1.一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，其特征在于，猴痘病毒的上游扩增引物MPXV-F01：5’-ATCCTCTCTCATTGATTTTTC -3’，如SEQ ID NO.1所示，

下游扩增引物MPXV-R01：5’-TGATACACGGCCTACAGAT -3’，如SEQ ID NO.2所示；

猴痘病毒西非分支的上游扩增引物MPXV-WA-F：5’- TACCGGAACACAGAACAAATG -3’，如SEQ ID NO.3所示，

下游扩增引物MPXV-WA-R2：5’- GGTACACAAATCTCGACAATCTTC -3’，如SEQ ID NO.4所示；

猴痘病毒刚果分支的上游扩增引物MPXV-CB-F：5’- TATTAGTGTACACATTTTGGAAGT -3’，如SEQ ID NO.5所示，

下游引物MPXV-CB-R1：5’- CTAGCGGCTTAAAAGATCATAC -3’，如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，其特征在于，所述猴痘病毒特异性结合的荧光探针的5’端连接有荧光标记；

和/或，3’端修饰有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，其特征在于，所述荧光标记为FAM、VIC、ROX、Joe或TAMRA；

和或，所述淬灭基团为Dabcyl、MGB、BHQ1或BHQ2。

4.根据权利要求3所述一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，其特征在于，所述猴痘病毒检测位点扩增引物的荧光探针MPXV-P01-FAM：5’-荧光报告基团-CATCATCTATTATAGCATCAGCATC -荧光淬灭基团-3’，序列如SEQ ID NO.7所示；

猴痘病毒西非分支荧光探针MPXV-WA-P-VIC：5’-荧光报告基团-TGTCATCCTGGTTGGTATACGCTAC -荧光淬灭基团-3’，序列如SEQ ID NO.8；

猴痘病毒刚果分支荧光探针MPXV-CB-P-ROX：5’-荧光报告基团-CTGCCATGTATTTCCTGGAGAGC -荧光淬灭基团-3’，序列如SEQ ID NO.9所示。

5.根据权利要求4所述一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，其特征在于，所述引物进行多重荧光PCR的反应体系为25μL；其中，所述反应体系包括2×Probe qPCR Buffer 2、猴痘病毒上下游引物及探针、西非分支上下游引物及探针、刚果分支上下游引物及探针、模板和无核酸酶水。

6.根据权利要求5所述一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，其特征在于，所述引物进行多重荧光PCR的反应程序为95℃ 3min，循环1次；95℃ 5s，60℃ 15s，循环40次。

7.根据权利要求6所述一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物，其特征在于，所述引物进行多重荧光PCR的反应采用纯化后的含有猴痘病毒基因片段、西非分支特异基因片段及刚果分支特异基因片段的质粒作为PCR反应的阳性对照。

8.权利要求1-7任一所述猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物在制备检测猴痘病毒、猴痘病毒西非分支、猴痘病毒刚果分支产品中的应用。

9.一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测方法，其特征在于，包括：

步骤一，针对猴痘病毒共有的基因片段、西非分支和刚果分支特异的基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时设计位于上下游引物间的Taqman荧光探针，合成分别针对猴痘病毒共有的基因片段及西非分支和刚果分支特异的基因片段的荧光PCR检测的引物、探针；

步骤二，经纯化后的含有猴痘病毒基因片段、西非分支特异基因片段及刚果分支特异基因片段的质粒，稀释后作为PCR反应的阳性对照；

步骤三，在多重荧光PCR的反应体系和多重荧光PCR的反应程序下，检测带有猴痘病毒基因组/基因片段的核酸或质粒；猴痘病毒西非分支毒株/含有西非分支特异性的基因片段的核酸或质粒；猴痘病毒刚果分支毒株/含有刚果分支特异性的基因片段的核酸或质粒。

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