CN111394515B - 一种用于检测犬细小病毒的lamp引物组、荧光可视化快速试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测犬细小病毒的LAMP引物组及其荧光可视化快速检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒中包含了针对犬细小病毒设计的引物组，所述引物组合中包含了一对外引物、一对内引物和一条环引物。利用本发明制备的荧光可视化快速检测试剂盒可实现对犬细小病毒的高灵敏度和高特异性检测，检测最低为10copies，同时操作简便，成本较低，设备适用范围广，适于在疫病发生时现场快速诊断疫病，及时治疗。

Description

一种用于检测犬细小病毒的LAMP引物组、荧光可视化快速试 剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于检测犬细小病毒的LAMP引物组、荧光可视化快速试剂盒及检测方法。

背景技术

犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）引起的犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病。临床以感染性腹泻症状、急性出血性胃肠炎、急性心肌炎和高死亡率为特征。犬细小病毒属于细小病毒科细小病毒属，无囊膜的单链DNA病毒结构。基因组全长为5323bp，含有两个主要的开放阅读框（Open reading frames, ORFS）ORF1和ORF2，编码的蛋白包括非结构蛋白NS1和NS2，结构蛋白VP1和VP2。自1970年首次报道在狗体内发现CPV以来， CPV不断出现抗原变异类型，包括CPV-2a，CPV-2b，CPV-2c等。不同年龄阶段的犬均可以感染CPV，幼犬的感染几率最高，死亡率高达70%以上，对养犬业具有巨大的危害，因此临床上急需一种能够快速检测CPV的方法。

传统的CPV检测方法主要包括病毒的分离鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析技术等。传统的PRRSV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。PCR和Real-time PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是对于操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本很贵，所需仪器费用较高，难以在基层实际生产中普及应用。

环介导等温扩增技术 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP），能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳观察结果，是一种适合宠物医院现场快速检测的方法。但是由于靶基因的选择是对特异性检测的前提条件，且对引物设计要求较高，否则容易引起检测的假阳性或假阴性，导致检测结果的不准确，导致LAMP检测试剂短缺。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供用于检测犬细小病毒的LAMP引物组，本发明的另一目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、荧光可视化的检测犬细小病毒LAMP试剂盒，用于犬细小病毒核酸的快速、精确地检测。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一组用于检测犬细小病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和一条环引物LB；其中，所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的，所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

一种用于检测犬细小病毒的LAMP试剂盒，其包括如上所述的引物组。

一种用于检测犬细小病毒的荧光可视化快速试剂盒，其包括LAMP预混液、Bst DNA聚合酶溶液和荧光目视检测试剂，所述LAMP预混液含10×Thermopol buffer、MgSO₄、甜菜碱、dNTPs、如上所述的引物组。

如上所述的荧光可视化快速试剂盒，优选地， 还包括样品快速处理试剂，所述样品快速处理试剂包括DNA Extract Solution A和DNA Extract Solution B，所述DNAExtract Solution A中含有质量百分比为2.5%的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1%Triton-X100，所述DNA Extract Solution B含有3mmol/LEDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25%的海藻糖。

如上所述的荧光可视化快速试剂盒，优选地， 还包括阴性质控标准品和阳性质控标准品，所述阳性质控标准品为含有细小病毒VP2基因的重组质粒，所述VP2基因的序列如SEQ ID NO.6所示，阴性质控标准品为无DNA酶蒸馏水。

本发明的试剂盒适用于水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列恒温扩增设备。

一种用于检测犬细小病毒的荧光可视化快速检测方法，其包括如下步骤：

（1）从样品中提取DNA；

（2）对步骤（1）提取的所述DNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述的引物组，置于63℃恒温反应；

（3）结果判定：60分钟内呈现绿色为阳性，60分钟内呈现橘黄色为阴性。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤（2）中，所述反应体系为25μL，其中含有18 μL的LAMP预混液：2×反应缓冲液12.5 μL、5 μmol/L的外引物F3 1 μL、5 μmol/L的外引物B31 μL、40 μmol/L的内引物FIP 1 μL、40 μmol/L的内引物BIP 1 μL、20 μmol/L的环引物LB1 μL、无DNA酶的蒸馏水0.5 μL；

1 μL 的8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶溶液；

1 μL的荧光目视检测试剂；

5μL的样品DNA溶液。

如上所述的检测方法，优选地，在步骤（1）中，样品中提取DNA采用如下方法进行：将样本拭子上清10µL加入到1.5 mL离心管中，加入100 µL DNA Extract Solution A，涡旋震荡20 s，室温静置3-5 min或95℃金属浴孵育3-5 min进行裂解，之后再加入100µLDNAExtract Solution B，涡旋震荡30 s，获得检测样品DNA。

如上所述的检测方法，优选地，所述DNA Extract Solution A中含有质量百分比为2.5%的聚乙二醇， 3mg/mL的蛋白酶K，0.1%Triton-X100；

所述DNA Extract Solution B含有3mmol/L EDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25%的海藻糖。

本发明经大量实验验证，最后确定采用含聚乙二醇，蛋白酶K， Triton-X100先处理，其中，聚乙二醇的主要作用是与多酚结合，阻止多酚与DNA 的结合；蛋白酶K的主要作用是水解蛋白质，使DNA完整的分离出来；Triton-X100的主要作用是溶解细胞膜蛋白，使DNA从细胞中释放出来；这样DNA先释放出来后，再进行含有EDTA、Ttis-HCl、海藻糖进行对释放出来的DNA的保护，其中，EDTA的主要作用是抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用；Ttis-HCl的主要作用是缓冲作用，使DNA更稳定的存在；海藻糖的主要作用是保护酶的活性，更有效的降解蛋白质，释放DNA。

经过大量实验，优选质量百分比为2.5%的聚乙二醇， 3mg/mL的蛋白酶K，0.1%Triton-X100；能将DNA有效提出，优选浓度为3mmol/L EDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25%的海藻糖能保存完整的DNA，使检测结果能更加准确、可靠。

本发明的检测方法可用于临床样品中病毒的检测，也可用于动物饲料、饮水等环境中的病毒检测，此外，本发明的方法也可用于实验室用途。

本发明提供的试剂盒在犬疫病检测和预防中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明试剂盒检测结果的判定方法为：（1）阳性对照：60分钟内呈现绿色。（2）阴性对照：60分钟内呈现橘黄色；待测样本结果判定：（1）阳性：60分钟内呈现绿色。（2）阴性：60分钟内呈现橘黄色。

本发明的发明人经过大量的探索和尝试，通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、扩增长度及片段区域等参数，最终设计并筛选出用于检测犬细小病毒最佳引物组合，本发明的引物组合相对于备选的其他引物而言，在病毒检测方面具有更高的灵敏度、特异性和准确性，能够更好的实现对犬细小病毒的检测。

利用本发明的引物组合所制备的试剂盒，具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、操作简便等优点，最低检测限在10 copies，与实时荧光定量PCR相当，但操作上相对于后者更简便，成本也更低，因此本发明的试剂盒适于在宠物医院或者养殖场进行现场快速诊断疫病，及时控制疫情。

附图说明

图1为本发明引物组合1组的扩增效果验证结果。

图2为本发明引物组合2组的扩增效果验证结果。

图3为本发明的引物组最佳反应温度的检测结果。

图4为利用本发明的引物组合进行LAMP的检测结果。

图5为Real-time PCR检测结果。

图6为本发明的引物组合制备的试剂盒特异性检测结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 LAMP引物的设计与验证

1、引物的设计

通过对Genbank已发表的50个不同犬细小病毒全基因的数据比对分析，找出一段高度保守的VP2基因序列（参考序列GenBank: M19296.1），运用在线生物软件（http://primerexplorer.jp/），通过调整Tm值、GC含量、dG临界值、扩增长度和片段区域等参数值，进行设计适用于LAMP的特异性引物组若干组，包括基础引物（F3、B3、FIP、BIP）和环引物(LB)，其中2组如表1所示，环引物为非必须引物，但加入环引物的主要目的是加速反应过程，缩短检测时间，通过对引物组进行实验筛选，选出特异性好、灵敏度高的1个引物组，最终得到本发明的引物组合为引物1组。具体见表1所示。

表1引物序列

2、引物的验证

（1）毒株与试剂

犬细小病毒阳性样本核酸、犬瘟热病毒、犬冠状病毒由北京市动物疫病预防控制中心实验室保存。LAMP扩增试剂购自荣研生物科技（中国）有限公司。

（2）在loopamp®实时浊度测定仪器（LA-320C）上使用设计的引物组合（表1）进行LAMP扩增，扩增反应体系（25 μL）为：

LAMP预混液（18 μL）：2×反应缓冲液12.5 μL（购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP246）、5 μmol/L的外引物F3 1 μL、5 μmol/L的外引物B3 1 μL、40 μmol/L的内引物FIP 1 μL、40 μmol/L的内引物BIP 1 μL、20 μmol/L的环引物LB 1 μL、无DNA酶的蒸馏水0.5 μL；

Bst DNA聚合酶溶液 1 μL（购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP206）；

荧光目视检测试剂 1 μL（购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP221）。

DNA样品5 μL。

扩增反应工作程序为：63℃，120 min。

（3）扩增结果如图1和图2所示，引物组1在第26min检出犬细小病毒阳性样本核酸（参见图1中的编号1），犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬健康血液(参见图1中的编号2-4)在120min内均未检出。引物组2在第47min检出犬细小病毒阳性样本核酸（参见图2中的编号1），犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬健康血液(参见图2中的编号2-4)在120min内均未检出。结果表明，本发明的引物组1具有较高的扩增效率和特异性。

实施例2在loopamp®实时浊度测定仪器上检测犬细小病毒的LAMP方法最佳反应温度

1、选择引物组合为：实施例1表1中的引物组合1组。

2、LAMP扩增反应体系如实施例1，即LAMP预混液 18 μL ，酶溶液 1 μL，荧光目视检测试剂1 μL，DNA 5 μL。

3、在Loopamp仪上进行扩增， 设置61℃ ，63℃ ，65℃ ，67℃ 四个温度，扩增60分钟。

4、分析结果：结果如图3所示，其中编号1为61℃，编号2为63℃，编号3为65℃，编号4为67℃。结果显示，63℃条件下扩增效果最好，选择63℃作为本发明的引物组合的扩增温度。

实施例3 使用制备的LAMP试剂盒检测犬细小病毒

1、荧光可视化快速检测犬细小病毒的LAMP试剂盒的组装

用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签， 标示名称、批号、生产日期、有效期等。

LAMP预混液按照一个检测反应18 μL的配方为：2×反应缓冲液12.5 μL、5 μmol/L的外引物F3（SEQ ID NO.1） 1 μL、5 μmol/L的外引物B3（SEQ ID NO.2） 1 μL、40 μmol/L的内引物FIP（SEQ ID NO.3） 1 μL、40 μmol/L的内引物BIP（SEQ ID NO.4） 1 μL、20 μmol/L的环引物LB （SEQ ID NO.5）1 μL、无DNA酶的蒸馏水0.5 μL反应体系中还需要Bst DNA聚合酶反应液1μL，荧光目视检测剂1μL（可购置于荣研生物科技有限公司，货号SLP221），检测试剂中还可配置有质控标准品为含有犬细小病毒VP2基因的重组质粒，VP2基因序列如SEQ IDNO.6所示，阴性质控标准品使用空载体质粒为阴性模板，使用 Tris-EDTA 缓冲液（0.01 MpH8.0）稀释后冷冻保存。

其中LAMP预混液还可替换为：2×反应缓冲液含有：10×Thermopol buffer 2.5 μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5 μL溶液、5.0mmol/L甜菜碱溶液2.5 μL、10mmol/L dNTPs 3 μL，无DNA酶的蒸馏水1μL。反应体系中还需要8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶 1 μL，荧光目视检测剂（按终浓度计：6mmol/L MnCl₂和0.4mmol/L的钙黄绿素溶液）1μL，

根据检测数量进行配制48T、96 T、216T等不同检测次的检测试剂。

48T/盒可按如下进行配制：

溶液A(LAMP预混液)1支，864 μL；溶液B（酶反应液）1支48 μL，溶液C（荧光目视检测剂）1支，48 μL；溶液D（阳性质控标准品）1支，100 μL；溶液E(阴性质控标准品) 1支，100μL。阳性质控标准品使用含有犬细小病毒VP2基因的质粒为阳性模板，VP2基因的序列如SEQID NO.6所示，阴性质控标准品使用空载体质粒为阴性模板，使用 Tris-EDTA 缓冲液（0.01M pH8.0）稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照和阴性对照制剂均按100 μL定量分装。

实施例4 样品的处理及检测

1、样品采集：用棉签蘸取鼻、眼、粪便拭子放入装有PBS的1.5mL离心管中。采集的样品2~8℃ 保存，进行现场检测或者送实验室检测。

2、样品处理：每份样品分别处理。

（1）将样本拭子上清10µL加入到1.5 mL离心管中，加入100 µL DNA ExtractSolution A，涡旋震荡20 s，室温静置3-5 min（或95℃金属浴孵育3-5 min获得更好的提取效果）进行充分裂解。其中，DNA Extract Solution A中含有质量百分比为2.5%的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1%Triton-X100。

（2）样本充分裂解后（95℃金属浴孵育的样本需恢复至室温），加入100µL DNAExtract Solution B，涡旋震荡30 s，获得检测样品DNA。

其中，DNA Extract Solution B含有3mmol/L EDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25%的海藻糖。

（3）处理后的样本进行下一步扩增试验。采用实施例3中的试剂在18 μL的LAMP预混液中加入1 μL酶反应液、1 μL荧光目视检测剂和5 μL的样品DNA模板，得到25 μL的LAMP反应体系，用于反应。

同时采用含有犬细小病毒VP2基因重组质粒作为阳性对照，无DNA酶蒸馏水作为阴性对照。

（4）扩增试验采用，63℃扩增60min。将配置好、分装完毕的反应试管置于loopamp®实时浊度测定仪器中在63℃下恒温60分钟。

4、结果分析和判定

本发明试剂盒检测结果的判定方法为：（1）阳性对照：60分钟内呈现绿色。（2）阴性对照：60分钟内呈现橘黄色。待测样本结果判定：（1）阳性：60分钟内呈现绿色。（2）阴性：60分钟内呈现橘黄色。

实施例5 灵敏度检验

1、DNA模板的制备：将犬细小病毒DNA ，经荧光定量PCR定量为10⁴ copies/μL, 进行10倍倍比稀释，分别进行LAMP和Real-time PCR扩增，检测灵敏度。

2、采用实施例3制备的试剂盒配制LAMP反应体系：LAMP预混液18 μL，酶反应液1 μL，荧光目视检测剂1 μL，DNA 5 μL，总体积25μL。反应程序为：63℃ 60min。

3、检测结果如图4所示，图中，管1为10⁴ copies，管2为10³ copies，管3为10²copies，管4为10 copies，管5为1 copies，管6为0.1 copies，管7为阴性对照，管8为阳性对照。LAMP检测结果显示，管1-管4均为阳性（显示绿色），管5-管6为阴性（显示橙色），即本发明的方法的检测最低限为10 copies。

同时采用Real-time PCR反应体系：按照犬细小病毒通用型实时荧光PCR检测试剂盒使用说明书（购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，生产批号：CP20190729P）进行操作。反应体系是：无菌无核酸酶水 5.9μL，PCR反应液 10 μL，荧光探针2.1 μL，DNA 2 μL，总体积20 μL。反应程序为： 95℃ 5 s，60℃ 35 s，循环数为40。检测结果如图5所示，图中POS为阳性对照，编号1-4的曲线分别表示10⁴ copies-10 copies，编号5-7的曲线分别表示1copies、0.1 copies和阴性对照。结果说明编号1-4为阳性，编号5-7为阴性，说明Real-timePCR的灵敏度为10 copies。

可见，本发明的方法与Real-time PCR检测灵敏度基本一致。

实施例6 特异性检验

1、用本发明制备的试剂盒按照实施例4表述的方法分别检测犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒病、狂犬病毒、犬流感病毒、健康犬血液等提取的基因组，验证反应体系的特异性，上述病毒由北京市动物疫病预防控制中心保存提供。

2、检测结果如图6所示，其中管1为犬细小病毒，管2为犬瘟热病毒，管3为犬冠状病毒病，管4为狂犬病毒，管5为犬流感病毒，管6为健康犬血液，管7为阴性对照，管8为阴性对照。从图中可以看出，本发明的试剂盒可以成功检测出犬细小病毒（管1）；犬瘟热病毒、犬冠状病毒病、狂犬病毒、犬流感病毒、健康犬血液均未检出（分别对应管2、管3、管4、管5、管6），结果表明本发明的引物组合制备的试剂盒具有良好的特异性。

实施例7 临床样品检测

1、用本发明的试剂盒和实施例5中的实时荧光定量PCR方法同时检测30份临床样品（其中22份为阴性样本，8份为阳性样品），分析两种检测结果的符合率。

2、检测结果显示，用所建立的LAMP方法与荧光定量PCR方法检测结果一致（表2），符合率为100%。但LAMP方法设备依赖低，结果可视化，适用于现场的快速检测。

表2 LAMP与荧光定量PCR方法检测结果

以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、检测方便快捷、结果准确可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京市动物疫病预防控制中心

<120> 一种用于检测犬细小病毒的LAMP引物组、荧光可视化快速试剂盒及方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaaaccatg tagactaaca cat 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcactataac caacctcagc 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctccttcag attgaggcaa agacatggca aacaaataga gca 43

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagttcaaca agataaaaga cgtggggtct cataatagta gcttcagt 48

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atttagaaat ggtggtaagc ccaa 24

<210> 6

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtaaaccatg tagactaaca catacatggc aaacaaatag agcattgggc ttaccaccat 60

ttctaaattc tttgcctcaa tctgaaggag ctactaactt tggtgatata ggagttcaac 120

aagataaaag acgtggtgta actcaaatgg gaaatacaaa ctatattact gaagctacta 180

ttatgagacc agctgaggtt ggttatagtg c 211

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcctcaatc tgaaggag 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttcatatgt ttgcgctcc 19

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcccatttga gttacaccac gtctactaac tttggtgata taggag 46

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttatgagacc agctgaggtt gggtgtttta aatggccctt gtg 43

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcaccatatt attcttttga ggcgt 25

Claims (10)

1.一种用于检测犬细小病毒的LAMP引物组，其特征在于，其包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和一条环引物LB；其中，所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQID NO.3所示的，所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测犬细小病毒的LAMP试剂盒中的应用。

3.一种用于检测犬细小病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。

4.一种用于检测犬细小病毒的荧光可视化快速试剂盒，其特征在于，其包括LAMP预混液、Bst DNA聚合酶溶液和荧光目视检测试剂，所述LAMP预混液含10×Thermopol buffer、MgSO₄、甜菜碱、dNTPs、如权利要求1所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的荧光可视化快速试剂盒，其特征在于，所述荧光目视检测试剂为含6mmol/L MnCl₂和0.4mmol/L钙黄绿素的溶液。

6.根据权利要求4所述的荧光可视化快速试剂盒，其特征在于，还包括样品快速处理试剂，所述样品快速处理试剂包括DNA Extract Solution A和DNA Extract Solution B，所述DNA Extract Solution A中含有质量百分比为2.5%的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1%Triton-X100，所述DNA Extract Solution B含有3mmol/LEDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25%的海藻糖。

7.根据权利要求4所述的荧光可视化快速试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控标准品和阳性质控标准品，所述阳性质控标准品为含有细小病毒VP2基因的重组质粒，所述VP2基因的序列如SEQ ID NO.6所示，阴性质控标准品为无DNA酶蒸馏水。

8.一种非疾病诊断用途的用于检测犬细小病毒的荧光可视化快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

（1）从样品中提取DNA；

（2）对步骤（1）提取的所述DNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用如权利要求要求1所述的引物组，置于63℃恒温反应；

（3）结果判定：60分钟内呈现绿色为阳性，60分钟内呈现橘黄色为阴性。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述反应体系为25μL，其中含有18 μL的LAMP预混液：2×反应缓冲液12.5 μL、5 μmol/L的外引物F3 1 μL、5 μmol/L的外引物B3 1 μL、40 μmol/L的内引物FIP 1 μL、40 μmol/L的内引物BIP 1 μL、20 μmol/L的环引物LB 1 μL、无DNA酶的蒸馏水0.5 μL；

1 μL 的8.0 U/μL的Bst DNA聚合酶溶液；

1 μL的荧光目视检测试剂；

5μL的样品DNA溶液。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在步骤（1）中，样品中提取DNA采用如下方法进行：将样本拭子上清10µL加入到1.5 mL离心管中，加入100 µL DNA ExtractSolution A，涡旋震荡20 s，室温静置3-5 min或95℃金属浴孵育3~5 min进行裂解，之后再加入100µLDNA Extract Solution B，涡旋震荡30 s，获得检测样品DNA；

其中，所述DNA Extract Solution A中含有质量百分比为2.5%的聚乙二醇，3mg/mL的蛋白酶K，0.1%Triton-X100；

所述DNA Extract Solution B含有3mmol/L EDTA，1.5mmol/L Ttis-HCl，质量百分比为0.25%的海藻糖。

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