CN112391497A - 一种引物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒 - Google Patents

一种引物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学检验的技术领域，本发明提供了一种引物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒。本发明提供的引物探针组包括针对非洲猪瘟病毒的特异性引物、非洲猪瘟病毒探针、针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物、猪流行性腹泻病毒探针。本发明提供的试剂盒同时含有非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的引物探针组，4条引物及2条探针同时加入一个反应体系，不互相干扰，使用本发明的试剂盒检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒时，一次扩增反应可完成两种病原筛查，有效克服了现有试剂盒不能同时检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的弊端。

Description

一种引物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒和猪流行 性腹泻病毒的试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学检验的技术领域，尤其涉及一种引物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swinefevervirus，ASFV)引起的一种猪急性、烈性、高度接触病毒性传染病。临床上典型病例表现为高热、皮肤发绀及内脏各器官广泛出血。该病传染性强、死亡率可达100％，目前无有效疫苗和药物进行有效防治，猪场发病后损失严重。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病之一，我国将其列为一类动物疫病。1921年非洲肯尼亚首次报道该病，自2018年8月传入我国，随着非洲猪瘟病毒在我国的发生和流行，病毒对猪致死性减弱，部分体质较强猪甚至可耐过，但当受到应激时，间歇性不定期排毒，有再次发病的风险。
腹泻是导致集约化养殖场仔猪死亡的重要因素，而由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic diarrhea，PEDV)引起的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrheaviruse，PED)又是首要原因，该病是一种临床表现以呕吐、水样腹泻、脱水为特征的高度接触性肠道传染病。该病发病急，传播速度快，死亡率高，全年可发生，冬春季节多发，疫苗防控效果不理想。中大猪症状轻微，有时呈一过性腹泻，症状轻微，但可长期带毒排毒，康复猪排毒期长达2个月。
随着非洲猪瘟在全国范围的发生和流行，生猪存栏量有很大程度的减少，猪价当前在一定时期内处于高位运行，猪场扩产及复养需求迫切，引种频率高，但引种即引病，外表健康猪未必不携带病原，仅凭肉眼观察很难挑选合适猪只，引种时一定要做好猪相关病原筛查。
非洲猪瘟和猪流行性腹泻无疑是当前最重要的两种猪病，外表健康猪均可携带病原，虽然有这两种病原单项检测的试剂盒，但操作加样繁琐，成本高，亟需开发一种现场快速筛查同时检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒。
荧光PCR技术已经广泛应用在各种猪病的诊断中，技术成熟，Taqman探针法荧光PCR技术与染料法荧光PCR相比多了一条探针，特异性更好，应用广泛，通过对不同探针标记不同的发光基团可实现病原多重检测，与传统PCR检测比，检测速度快，敏感性高，不需要开盖电泳检测PCR产物，减少实验室气溶胶污染风险。
当前国内外均没有非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光PCR检测试剂盒，本发明可填补国内外相关领域研究空白。
发明内容
基于以上背景，本发明的目的是提供一种非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒，以满足猪场引种时，在一个反应体系中同时完成非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒两种病原快速筛查检测。并且提高检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒两种病原的特异性、稳定性和灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种引物探针组，所述引物探针组包括针对非洲猪瘟病毒的特异性引物、非洲猪瘟病毒探针、针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物、猪流行性腹泻病毒探针；
所述针对非洲猪瘟病毒的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述针对非洲猪瘟病毒的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述针对非洲猪瘟病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述针对猪流行性腹泻病毒的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述针对猪流行性腹泻病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述非洲猪瘟病毒探针为Taqman水解探针，探针序列如SEQ ID NO.5所示；所述针对猪流行性腹泻病毒探针为Taqman水解探针，探针序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述非洲猪瘟病毒的特异性引物和非洲猪瘟病毒探针是针对非洲猪瘟病毒的VP72基因序列设计的；所述猪流行性腹泻病毒的特异性引物和猪流行性腹泻病毒探针是针对猪流行性腹泻病毒的N基因序列设计的。
优选的，所述非洲猪瘟病毒探针5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ-1，所述猪流行性腹泻病毒探针5’端标记有荧光报告基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ-1。
本发明还提供了一种所述的引物探针组在制备检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种基于双重荧光PCR同时检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物探针组。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、缓冲液和酶混合物。
优选的，所述阳性对照品为含有SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的pMD-18T混合质粒，所述阴性对照品为无核酸酶水，所述缓冲液为2×One Step RT-PCR Buffe，所述混合酶为DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶的混合物。
优选的，所述DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照体积比0.8～1.2:0.8～1.2混合，进一步优选为按照体积比1:1混合。
优选的，所述试剂盒中的SEQ ID NO.1～4所示引物和SEQ ID NO.5～6所示探针的浓度分别独立的为12～18pmol/μL，进一步优选为15pmol/μL；所述引物及探针的摩尔比为0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，进一步优选为1:1:1:1:1:1；所述双重荧光PCR扩增的反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共计38～45个循环，进一步优选为40个循环。
本发明提供的试剂盒同时含有非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的引物探针组，4条引物及2条探针同时加入一个反应体系，不互相干扰，使用本发明的试剂盒检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒时，一次扩增反应可完成两种病原筛查，成本低；反应结束后，无需进行琼脂糖凝胶电泳检测，仅通过对扩增曲线的观察与分析即可判定结果，减少了实验室气溶胶的污染风险；有效克服了现有试剂盒不能同时检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的弊端；特异性好，对猪其它常见病原无扩增反应；特异性强，稳定性好，操作简便，可实现对猪场新引进猪只快速病原筛查与日常疾病监测。
附图说明
图1为双重荧光PCR试剂盒对非洲猪瘟病毒检测的敏感性试验；
图2为双重荧光PCR试剂盒对猪流行性腹泻病毒检测的敏感性试验；
图3为双重荧光PCR试剂盒对非洲猪瘟病毒检测的特异性试验；
图4为双重荧光PCR试剂盒对猪流行性腹泻病毒检测的特异性试验。
具体实施方式
为使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，所述实施例仅用于说明本发明，而不是全部的实施例，不应以任何方式限制本发明的范围。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下的其他实施，均为本发明所保护的范围。本发明所用仪器、试剂、耗材均可通过市售获得。
实施例1
非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的双重荧光PCR反应体系的建立
1、引物探针的设计和制备
从Gen Bank中查找ASFV非洲猪瘟病毒不同毒株VP72基因序列和猪流行性腹泻病毒不同毒株N基因序列，经比对分析，分别选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针，序列如下：
用于非洲猪瘟病毒扩增的引物为：
SEQ ID NO.1：上游引物TTGGCATTTCTACTACCTCGG；
SEQ ID NO.2：下游引物ACGCCTTTCTGACACCCAG；
用于猪流行性腹泻病毒扩增的引物为：
SEQ ID NO.3：上游引物CTCCGATTCAGGGCACGT；
SEQ ID NO.4：下游引物TAAGGGTGTTTGGTTGTCC；
用于非洲猪瘟病毒扩增的探针为：
SEQ ID NO.5：CCGCTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTT；
用于猪流行性腹泻病毒扩增的探针为：
SEQ ID NO.6:TGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGC；
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示探针的5’端分别标记荧光报告基团HEX和FAM；所示探针的3’端均标记荧光淬灭基团(BHQ-1)。
上述引物和探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成并进行标记。
2、阳性对照质粒的制备
本实施例提供的阳性对照品为人工合成的为含有非洲猪瘟病毒VP72基因序列的阳性质粒和含有猪流行性腹泻病毒N基因序列的阳性质粒。含非洲猪瘟病毒VP72基因保守区序列的阳性质粒中的目的片段序列如SEQ ID NO.7所示；含猪流行性腹泻病毒N基因序列的阳性质粒中的目的片段序列如SEQ ID NO.8所示。
将含有非洲猪瘟病毒VP72基因的阳性对照质粒命名为pMD-VP72、将含猪流行性腹泻病毒N基因序列的阳性对照质粒命名为pMD-N；阳性对照质粒pMD-VP72和pMD-N按照体积比1:1进行混合，得到混合质粒，即本发明的阳性对照品，将其命名为pMD-VP72/N。
3、反应体系的配制
2×One Step RT-PCRBuffer 10μL，酶混合液0.8μL，浓度均为15pmol/μL的引物探针混合液共3μL，无核酸酶水4.2μL，模板2μL进行混匀，共20μL。其中，酶混合液为DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照体积比1:1混合得到；引物探针混合液是由SEQ ID No.1～4所示的4条引物和SEQ ID No.5～6所示的两条探针按照1:1:1:1:1:1的摩尔比混合得到。配制好反应体系后即可进行荧光PCR检测。
荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。所述分析待测样品结果判定标准如下：
若检测样品的Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线时，则判为阳性；若检测样品Ct值≥38.0或无Ct值时，判为阴性；对于35.0＜Ct值＜38.0且出现典型的扩增曲线的样品，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。FAM荧光检测阳性时判为非洲猪瘟病毒核酸阳性，HEX荧光检测阳性时判为猪流行性腹泻病毒核酸阳性，同时检测阳性时判为二者混合样品。
实施例2
非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的双重荧光PCR检测试剂盒灵敏度试验
提取含非洲猪瘟病毒VP72基因的pMD-VP72质粒和含猪流行性腹泻病毒N基因的pMD-N质粒，并用仪器测定两种阳性质粒的浓度，根据浓度计算拷贝数，得到pMD-VP72和pMD-N质粒拷贝数分别为7.3×1010拷贝/μL和2.5×1010拷贝/μL。两种质粒分别10倍比系列梯度稀释，分别取105拷贝/μL～10-2拷贝/μL的两种质粒标准品，同等稀释度等量混合后做模板。以该7个浓度梯度进行灵敏性试验。
结果如图1和图2所示，图1中1表示7.3×105拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×105拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；2表示7.3×104拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×104拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；3表示7.3×103拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×103拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；4表示7.3×102拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×102拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；5表示7.3×101拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×101拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；6表示7.3×100拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×100拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；7表示7.3×10-1拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×10-1拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；8表示7.3×10-2拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×10-2拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液。从图1中可以看出，1～6的Ct值≤35.0，且出现了典型的扩增曲线，判断1～6为阳性。因此，可以确定该法对pMD-VP72质粒的最低检测限度为7.3拷贝/μL。
图2中1表示7.3×105拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×105拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；2表示7.3×104拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×104拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；3表示7.3×103拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×103拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；4表示7.3×102拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×102拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；5表示7.3×101拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×101拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；6表示7.3×100拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×100拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；7表示7.3×10-1拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×10-1拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液；8表示7.3×10-2拷贝/μL的PMD-VP72和2.5×10-2拷贝/μL的pMD-N质粒标准品等体积混合液。从图2中可以看出，1～6的Ct值≤35.0，且出现了典型的扩增曲线，判断1～6为阳性。因此，可以确定该法对pMD-N质粒的最低检测限度为2.5拷贝/μL。
这表明本试剂盒对非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒检测均具有较高的敏感性。
实施例3
非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的双重荧光PCR检测试剂盒的特异性试验
分别以阳性质粒pMD-VP72/N、阳性质粒pMD-VP72、阳性质粒pMD-N、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒基因组作为模板，进行特异性试验。
结果如图3和图4所示。在图3中1表示质粒pMD-VP72/N；2表示质粒PMD-VP72；3表示质粒pMD-N；4表示猪瘟病毒；5表示猪繁殖与呼吸综合征病毒；6表示猪伪狂犬病毒；7表示猪圆环病毒2型；8表示猪传染性胃肠炎病毒；9表示猪轮状病毒；10表示猪德尔塔冠状病毒。阳性质粒pMD-VP72在FAM荧光通道有典型扩增的曲线，且CT≤30.0。
在图4中1表示质粒pMD-VP72/N；2表示质粒PMD-VP72；3表示质粒pMD-N；4表示猪瘟病毒；5表示猪繁殖与呼吸综合征病毒；6表示猪伪狂犬病毒；7表示猪圆环病毒2型；8表示猪传染性胃肠炎病毒；9表示猪轮状病毒；10表示猪德尔塔冠状病毒。阳性质粒PMD-N在HEX荧光通道有典型扩增的曲线，且CT≤30.0。
阳性质粒pMD-VP72/N在FAM和HEX荧光通道有典型扩增的曲线，且两者CT≤30.0，其余均为阴性，证明本发明的试剂盒特异性较好。
实施例4
非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的双重荧光PCR检测试剂盒的重复性试验
分别取pMD-VP72和pMD-N 103、104和105copies.μL-1三种不同稀释度质粒标准品，同浓度梯度质粒标准品等体积混合作模板，每份模板做3个重复试验，进行组内和组间重复性试验，计算变异系数，分析该方法重复性。结果如表1所示，pMD-VP72和pMD-N组内和组间变异系数均小于2％，表明该方法具有较好的重复性。
表1双重荧光定量PCR组间重复性试验结果
Figure BDA0002807083100000081
实施例5
应用本发明的试剂盒进行实际样本检测
采集80份猪口鼻拭子、粪便样本，用Axygen病毒基因组DNA/RNA共提取试剂盒提取样本核酸，以其为模板，用本发明的试剂盒进行非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光PCR检测，同时用OIE推荐的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR方法及商品化猪流行性腹泻病毒荧光PCR检测试剂盒进行复核试验，检测结果均为阴性，符合率100％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种引物探针组及其试剂盒，该试剂盒可以用于对非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的同时检测，4条引物及2条探针同时加入一个反应体系，不互相干扰。使用引物探针组的试剂盒检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒时，一次扩增反应可完成两种病原筛查，成本低。且本发明的试剂盒对非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒灵敏度高、特异性强、稳定性好，对猪其它常见病原无扩增反应，对非洲猪瘟病毒的最低检测限度为7.3拷贝/μL，对猪流行性腹泻病毒最低检测限度为2.5拷贝/μL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东绿都生物科技有限公司 深圳市康百得生物科技有限公司 山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 一种引物探针组及其应用和一种检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttggcatttc tactacctcg g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgcctttct gacacccag 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctccgattca gggcacgt 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taagggtgtt tggttgtcc 19
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgctatagga ctcgtactga gggtgtt 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggcagctt caaacgtttc ctcgc 25
<210> 7
<211> 356
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaggaaata aggaccagca aattggatac tggaatgagc aaattcgctg gcgcatgcgc 60
cgtggtgagc gaattgagca accttccaat tggcatttct actacctcgg aacaggacct 120
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<210> 8
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 60
ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 120
ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 180
ggatatgact gggacaacca aacaccctta gagggcgccg tttacacgct tgtagatcct 240
tttggaagac ccattgtacc cggcacaaag aatgcgta 278

Claims (9)

1.一种引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括针对非洲猪瘟病毒的特异性引物、非洲猪瘟病毒探针、针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物、猪流行性腹泻病毒探针；
所述针对非洲猪瘟病毒的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述针对非洲猪瘟病毒的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述针对非洲猪瘟病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述针对猪流行性腹泻病毒的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述针对猪流行性腹泻病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述非洲猪瘟病毒探针为Taqman水解探针，探针序列如SEQ ID NO.5所示；所述猪流行性腹泻病毒探针为Taqman水解探针，探针序列如SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒的特异性引物和非洲猪瘟病毒探针是针对非洲猪瘟病毒的VP72基因序列设计的；所述猪流行性腹泻病毒的特异性引物和猪流行性腹泻病毒探针是针对猪流行性腹泻病毒的N基因序列设计的。
3.如权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒探针5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ-1，所述猪流行性腹泻病毒探针5’端标记有荧光报告基团HEX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ-1。
4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组在制备检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒中的应用。
5.一种基于双重荧光PCR同时检测非洲猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的引物探针组。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、缓冲液和酶混合液。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有SEQ ID NO.7或SEQID NO.8所示序列的pMD-18T混合质粒，所述阴性对照品为无核酸酶水，所述缓冲液为2×One Step RT-PCR Buffe，所述酶混合液为DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScriptRT Enzyme Mix酶的混合液。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照体积比0.8～1.2:0.8～1.2混合。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的SEQ ID NO.1～4所示引物和SEQ ID NO.5～6所示探针的浓度分别独立的为12～18pmol/μL，所述引物及探针的摩尔比为0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2；所述双重荧光PCR扩增的反应程序为：42℃反转录5min；95℃预变性10s；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共计38～45个循环。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046480A (zh) * 2021-03-23 2021-06-29 乐尚生物科技(无锡)有限公司 一种基于CRISPR-Cas13a蛋白快速检测非洲猪瘟病毒的方法
CN114480726A (zh) * 2021-08-13 2022-05-13 深圳市博德致远生物技术有限公司 非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法
CN116287443A (zh) * 2022-12-26 2023-06-23 内蒙古正大食品有限公司 一种具有质控体系的检测pedv的荧光pcr方法及其特异性引物探针组合
WO2024066083A1 (zh) * 2022-09-29 2024-04-04 福州奥吉芯生物科技有限公司 检测病原的恒温检测试剂盒和检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107686864A (zh) * 2017-09-28 2018-02-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR试剂盒及其检测方法
CN109781981A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 河南中泽生物工程有限公司 检测非洲猪瘟病毒的分子探针、试剂盒及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107686864A (zh) * 2017-09-28 2018-02-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR试剂盒及其检测方法
CN109781981A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 河南中泽生物工程有限公司 检测非洲猪瘟病毒的分子探针、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李自刚等: "《生物检测技术》", 31 August 2016, 中国轻工业出版社 *
罗忠永: "CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂盒的初步组装", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》 *
肖琳等: "《环境微生物实验技术》", 31 July 2004, 中国环境科学出版社 *
颜邦斌等: "猪常见病毒性疫病防控关键技术与应用研究", 《畜牧兽医科学(电子版)》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046480A (zh) * 2021-03-23 2021-06-29 乐尚生物科技(无锡)有限公司 一种基于CRISPR-Cas13a蛋白快速检测非洲猪瘟病毒的方法
CN114480726A (zh) * 2021-08-13 2022-05-13 深圳市博德致远生物技术有限公司 非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法
WO2024066083A1 (zh) * 2022-09-29 2024-04-04 福州奥吉芯生物科技有限公司 检测病原的恒温检测试剂盒和检测方法
CN116287443A (zh) * 2022-12-26 2023-06-23 内蒙古正大食品有限公司 一种具有质控体系的检测pedv的荧光pcr方法及其特异性引物探针组合

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