CN115976285A - 一种检测非洲猪瘟的四重荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和/或ASFV‑G‑ΔI177L毒株的四重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含一组检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和/或ASFV‑G‑ΔI177L毒株的特异性引物和荧光探针，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、2、4、5、7、8、10、11所示；所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、6、9、12所示。本发明设计四重荧光定量PCR检测方法，可以同时对4个基因进行检测，而且四对引物和探针具有相对一致的扩增效率。本发明基于国内非洲猪瘟流行毒株特点，建立了鉴别非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型野毒株、基因Ⅱ型野毒株与ASFV‑G‑ΔI177L毒株的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和/或ASFV-G-ΔI177L毒株的四重荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪和野猪而引起的一种高度接触性的急性、烈性传染病，临床上以高发病率和高致死率为主要特征。ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，为20面体对称的有囊膜的双股DNA病毒。ASFV不同毒株由于基因组序列的缺失或者插入，使得ASFV基因组大小介于170～190kb，可编码200多种蛋白。ASFV具有复杂的蛋白结构和基因组结构，在环境中极为稳定，而且在家猪和野猪中的长期传播导致它具有遗传多样性。根据编码衣壳蛋白p72的B646L基因的3’端可变核苷酸序列，全世界至少有24种ASFV基因型。
研究人员通过遗传进化分析，发现我国首次报道流行的非洲猪瘟毒株属于基因Ⅱ型，广大科研人员总结ASF等重大动物疫病防控理论和实践的经验并进行创新，通过精准清除技术可以及时清除ASFV阳性猪只、阻止病毒扩散进而达到净化猪群内ASFV的目的。
通过已发表的研究结果表明，接种ASFV-G-ΔI177L疫苗存在向外界排毒的现象，甚至可能存在水平传播的风险，而且随着传代次数的增加，病毒滴度没有下降的趋势且子代越来越稳定。由于母猪生产利用周期较长，而动物研究实验只进行28天，ASFV-G-ΔI177L疫苗的有效性和安全性有待进一步研究。
针对不同的毒株猪场制定的防控措施以及定点清除的方法有着极大的区别，基因Ⅰ型弱毒株难以早期发现、难于精准剔除。ASF的早期发现、早期诊断以及毒株分型对于防控具有至关作用。TaqMan实时荧光定量PCR技术因其高特异性、高灵敏性、时间短等优点已经广泛应用于ASF的临床诊断。目前我国已经出现了基因Ⅱ型强毒株、基因Ⅰ型弱毒株，而且有可能流入I177L基因缺失疫苗，在生产实践过程中有可能出现不同毒株的单一感染或者混合感染，因此有必要建立针对这些不同类型毒株的鉴别诊断方法。
根据当前报道的ASFV检测技术主要是基于基因Ⅱ型强毒株及相关的部分基因缺失毒株建立的，无法对基因Ⅰ型弱毒株及I177L基因缺失疫苗毒株进行鉴别诊断。因此，亟需建立一种快速、准确且能同时检测与鉴定多种非洲猪瘟毒株的实时荧光定量PCR方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种能够用于鉴别非洲猪瘟基因Ⅰ型野毒株、基因Ⅱ型野毒株、ASFV-G-ΔI177L毒株的四重定量荧光探针引物组合、检测方法和试剂盒。
本发明提供了一组检测非洲猪瘟Ⅰ型野毒株、Ⅱ型野毒株和ASFV-G-ΔI177L毒株的特异性引物和荧光探针组合，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1、2、4、5、7、8、10、11所示；所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、6、9、12所示。
进一步，所述探针的5'端分别修饰不同的荧光基团，3'端分别修饰适宜的淬灭基团。
进一步，所述荧光基团为FAM、VIC、Cy5和TARMA，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和BHQ2。
本发明还提供了所述引物和探针组合在制备检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和ASFV-G-ΔI177L毒株试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和ASFV-G-ΔI177L毒株的四重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含所述引物和探针组合。
进一步，所述试剂盒中还包括探针法荧光定量PCR预混液、阳性对照和阴性对照的一种或几种。
进一步，所述阳性对照含有B646L基因、I9R基因、F778R基因和ΔI177L插入基因，所述阴性对照为ddH2O。
进一步，所述检测试剂盒的PCR扩增反应体系为：探针法荧光定量PCR预混液25μL，10μM权利要求1所述引物各1μL，10μM所述探针各1μL，核酸模板4μL，ddH2O补至50μL。
进一步，所述检测试剂盒的PCR扩增反应条件为：25℃10min；95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
本发明相对于现有技术的有益效果在于：
本发明设计四重荧光定量PCR检测方法，可以同时对4个基因进行检测，而且四对引物和探针具有相对一致的扩增效率。本发明基于国内非洲猪瘟流行毒株特点，建立了鉴别非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型毒株、基因Ⅱ型毒株与ASFV-G-ΔI177L毒株的方法。
本发明在基因保守的序列中，设计合适的引物和探针，通过优化引物浓度、探针浓度以及引物和探针比例，保证四对引物和探针保持相对一致的扩增效率。
国内目前存在有Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株，两种毒株在I9R和F778R的基因序列存在差异。设计靶向I9R和F778R基因的引物和探针，检测I9R和F778R基因，鉴定是Ⅰ型毒株还是Ⅱ型毒株或者两种毒株混合感染。
越南已经批准ASFV-G-ΔI177L疫苗上市使用，在构建ASFV-G-ΔI177L毒株时缺失了I177L基因112个碱基，同时在缺失位置插入新的序列，根据插入的序列设计特异性引物和探针，从而鉴定是否是ASFV-G-ΔI177L毒株。
本发明可以同时鉴别检测非洲猪瘟基因Ⅰ型毒株、基因Ⅱ型毒株和ASFV-G-ΔI177L毒株以及不同毒株的混合感染。
本发明中不同基因的引物和探针之间互相不干扰，检测灵敏度高。
本发明特异性强，与常见猪疫病病毒毒株不发生特异性扩增。
本发明检测快速、高效，重复性和稳定性好，可以批量检测。
附图说明
图1为基因Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株基因序列比对图；其中A为I9R基因扩增序列比对图；B为F778R基因扩增序列比对图；GⅠ：基因1型；GⅡ：基因2型；红色碱基：有差异的碱基。
图2为基因质粒合成序列图；其中：A为B646L基因质粒合成序列图；B为I9R基因质粒合成序列图；C为F778R基因质粒合成序列图；D为ΔI177L插入序列质粒合成序列图。
图3为四重实时荧光定量PCR的特异性试验扩增曲线图；其中：1a～1d为阳性质粒FAM、VIC、Cy5、TARMA通道扩增曲线；2a～2d为基因Ⅰ型野毒株FAM、VIC、Cy5、TARMA通道扩增曲线；3a～3d为Ⅱ型基因缺失株FAM、VIC、Cy5、TARMA通道扩增曲线；4～11分别为PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PCV3、PEDV、TGEV和阴性对照的扩增曲线。
图4为四重实时荧光定量PCR的灵敏性检测结果图；其中：A为B646L基因的扩增曲线图；B为I9R基因的扩增曲线图；C为F778R基因的扩增曲线图；D为ΔI177L插入序列的扩增曲线图；a～h分别为107～100copies/μL
图5为四重实时荧光定量PCR标准曲线构建结果图；其中：A为B646L基因的标准曲线图；B为I9R基因的标准曲线图；C为F778L基因的标准曲线图；D为ΔI177L插入序列的标准曲线图。
图6为四重实时荧光定量PCR检测方法检测临床样品的扩增曲线图；其中：A为基因Ⅰ型野毒株；B为基因Ⅱ型野毒株；1a～1d为阳性对照的扩增曲线；2a～2d为临床样品的扩增曲线；3a～3d为阴性对照的扩增曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1.特异性引物和探针的设计
目前国内主要流行ASFV基因Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株，两种毒株的I9R和F778R基因序列存在差异。比对国内外流行的基因Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株的I9R和F778R基因，在有差异且保守区域设计特异性引物和探针。设计的引物扩增序列在两种基因型毒株的比对结果如图1。根据ASFV-G-ΔI177L设计时插入的序列设计特异性引物和探针。具体序列如表1所示。
基因Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株在I9R和F778R基因序列存在差异，在差异且保守区域设计特异性引物和探针可鉴别基因Ⅰ型毒株和Ⅱ型毒株。在ASFV-G-ΔI177L毒株构建时插入的序列设计特异性引物和探针可以用来鉴定是否是ASFV-G-ΔI177L毒株。
表1各引物和探针序列
2.质粒标准品制备
根据GenBank中ASFV中国分离株(MK333180和MZ945536)序列以及ASFV-G-ΔI177L毒株序列，分别合成基因序列B646L、I9R、F778R、ΔI177L(具体序列见图2)，克隆至pUC57载体，转化细菌感受态细胞DH5α，提取质粒，测序验证后作为多重荧光定量PCR的质粒标准品。
3.荧光定量PCR检测方法
(1)PCR扩增反应
以提取的咽拭子等样本的核酸为模板，质粒标准品为阳性对照，ddH2O为阴性对照；扩增反应体系为：PCR预混液25μL，引物各1μL，探针各1μL，核酸模板4μL，ddH2O补至50μL；扩增反应条件为：25℃10min；95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环，在60℃扩增时采集荧光信号。
(2)结果判定
阳性对照四个通道Ct值均<35且出现特异的扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异性的扩增曲线，二者均成立方可判定实验结果成立。有FAM信号才能说明非洲猪瘟病毒核酸阳性，如果没有FAM信号而有其他信号，则说明实验无效，需重新检测。
①当FAM和VIC荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，Cy5和TARMA荧光信号通道无信号或无扩增曲线，判定为Ⅰ型野毒株。
②当FAM和Cy5荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，VIC和TARMA荧光信号通道无信号或无扩增曲线，判定为Ⅱ型野毒株。
③当FAM和TARMA荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，VIC和Cy5均无荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，判定为ASFV-G-ΔI177L毒株。
④当FAM、VIC和Cy5荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，TARMA无荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，判定为Ⅰ型野毒株和Ⅱ型野毒株混合感染。
⑤当FAM、VIC和TARMA荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，Cy5无荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，判定为Ⅰ型野毒株和ASFV-G-ΔI177L毒株混合感染。
⑥当FAM、Cy5和TARMA荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，VIC无荧光信号通道有信号和特异性扩增曲线，判定为Ⅱ型野毒株和ASFV-G-ΔI177L毒株混合感染。
⑦当FAM、VIC、Cy5和TARMA荧光信号通道均有信号和特异性扩增曲线，判定为Ⅰ型野毒株、Ⅱ型野毒株和ASFV-G-ΔI177L毒株混合感染。
4.特异性试验
以基因Ⅰ型野毒株和基因Ⅱ型野毒株及猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪场常见病毒的DNA或cDNA为模板，采用上述的反应体系和程序进行荧光定量PCR。
结果如图3所示，PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PCV3、PEDV、TGEV检测和阴性对照检测均为阴性，表明该方法特异性良好，与常见猪病毒疫病病原体无交叉反应，可应用于临床检测。
5.灵敏性试验
将标准质粒进行10倍梯度稀释，浓度为107copies/μL～100copies/μL，使用上述的反应体系和程序，以稀释后的质粒作为模板进行荧光定量PCR检测，同时分析其标准曲线。
结果如图4所示，四重荧光定量PCR所能检测阳性标准质粒的最低拷贝量均能达到1copies、1copies、1copies和1copies，表明该方法具有较高的敏感性。结果如图5所示，在稀释的浓度范围内，模板量与Ct值呈现良好的线性关系，相关系数R2均大于0.99。
6.重复性试验
将标准质粒进行10倍梯度稀释，浓度为107～102copies/μL，使用上述的反应体系和程序，以稀释后的质粒作为模板进行荧光定量PCR检测，每个梯度设3个重复。
结果表明每个梯度的重复性均十分良好，变异系数(CV值)均小于2％，表明该方法具有很好的重复性。
7.临床样本检测
以临床收集的临床样品DNA为模板，以阳性质粒为阳性对照，以ddH2O为阴性对照，利用本研究建立的方法和WOAH推荐的方法进行平行B646L基因检测，比较两种方法的ASFV检测阳性结果一致性。参照WOAH推荐的ASFV分型方法，ASFV阳性的样品核酸采用普通PCR方法扩增B646L基因，然后送公司测序，得到序列后进行同源性分析，进一步明确各阳性样品的毒株类型，比较两种方法的分型结果一致性。
根据判定标准，结果如表2、图6所示。本方法共检测阳性样本10份，其中Ⅰ型野毒株2份，Ⅱ型野毒株8份，未检测到ASFV-G-ΔI177L。本次检测ASFV阳性样品及毒株类型与WOAH推荐的检测及分型方法结果一致，说明该方法可以实现灵敏、快速、准确地检测不同非洲猪瘟病毒毒株的目的。
表2临床样品检测结果表
| 毒株类型 | 本方法 | WOAH推荐方法 |
| ASFV阴性 | 1216 | 1216 |
| ASFV阳性 | 10 | 10 |
| Ⅰ型野毒株 | 2 | 2 |
| Ⅱ型野毒株 | 8 | 8 |
| ASFV-G-ΔI177L | 0 | 0 |
Claims (9)
1.一组同时检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和/或ASFV-G-ΔI177L毒株的特异性引物和荧光探针组合，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1、2、4、5、7、8、10、11所示；所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、6、9、12所示。
2.根据权利要求1所述特异性引物和荧光探针组合，其特征在于，所述探针的5'端分别修饰不同的荧光基团，3'端分别修饰相应的淬灭基团。
3.根据权利要求2所述特异性引物和荧光探针组合，其特征在于，所述荧光基团为FAM、VIC、Cy5和TARMA，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和BHQ2。
4.权利要求1所述特异性引物和荧光探针组合在制备检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和/或ASFV-G-ΔI177L毒株试剂盒中的应用。
5.一种同时检测非洲猪瘟Ⅰ型、Ⅱ型野毒株和/或ASFV-G-ΔI177L毒株的四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括探针法荧光定量PCR预混液、阳性对照和阴性对照的一种或几种。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照含有B646L、I9R、F778R和I177L基因，所述阴性对照为ddH2O。
8.根据权利要求5～7任一所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的PCR扩增反应体系为：探针法荧光定量PCR预混液25μL，10μM权利要求1所述引物各1μL，10μM所述探针各1μL，核酸模板4μL，ddH2O补至50μL。
9.根据权利要求5～7任一所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的PCR扩增反应条件为：25℃ 10min；95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。
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| CN117701779A (zh) * | 2024-02-04 | 2024-03-15 | 湖南派智生物科技有限公司 | 鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用 |
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2023
- 2023-01-02 CN CN202310000207.8A patent/CN115976285A/zh active Pending
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