CN116814862A

CN116814862A - 非洲猪瘟基因i型强毒、i型弱毒和ii型病毒鉴别检测

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Publication number: CN116814862A
Application number: CN202310994600.3A
Authority: CN
Inventors: 赵东明; 步志高; 孙恩成; 丁蕾蕾; 李芳�; 朱远茂
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2023-08-09
Filing date: 2023-08-09
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2043-08-09
Also published as: CN116814862B

Abstract

本发明公开了一种核酸组合，包括第一引物SEQ ID NO.1，第二引物SEQ ID NO.2，第一探针VIC‑SEQ ID NO.3‑MGB，第三引物(SEQ ID NO.4+SEQ ID NO.5)，第四引物SEQ ID NO.6，第二探针Cy5‑SEQ ID NO.7‑BHQ2，第五引物SEQ ID NO.8，第六引物SEQ ID NO.9和第三探针FAM‑SEQ ID NO.10‑TAMRA。本发明还公开了含有前述核酸组合的试剂盒，应用前述核酸组合的鉴别检测方法，以及前述核酸组合与试剂盒的用途。前述核酸组合能够用于高灵敏度和特异性地鉴别检测基因I型非洲猪瘟病毒弱毒、基因I型非洲猪瘟病毒强毒与基因II型非洲猪瘟病毒。

Description

非洲猪瘟基因I型强毒、I型弱毒和II型病毒鉴别检测

技术领域

本发明属于兽医诊断领域，涉及非洲猪瘟基因I型强毒、I型弱毒和II型病毒鉴别检测。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，各年龄阶段和种类的猪均易感，且病死率可达100％，严重危害全球养猪业。ASFV可分为强毒力毒株(可达100％致死率)、中等毒力毒株(30％～50％致死率)和低毒力毒株(0％～30％致死率)。根据临床表现，ASFV感染可分为5种类型：最急性型、急性型、亚急性型、慢性型和亚临床型。据世界动物卫生组织(WOAH)报道，从2021年1月至2023年6月全球已有包括非洲、美洲、亚洲和欧洲共50个国家和地区报告ASF疫情，造成家猪和野猪损失数量超过1,450,000头，由此造成的直接和间接经济损失不可估量。

ASF的防控至关重要，事关食品安全和社会经济稳定。尽管ASF已存在一个多世纪，但由于ASFV基因组庞大(170～190kb)、且结构复杂(编码蛋白超过150种)，目前仍无有效的商业化疫苗和特效的抗病毒药物。当前以控制传染源、切断传播途径和保护易感动物为原则的相关生物安全措施是防控ASF的主要手段。因此早期实验室诊断对于ASF防控至关重要，所以加强ASFV的检测技术研究，开发快速、灵敏、特异的诊断试剂和诊断方法，特别是能够有效鉴别诊断不同基因型和不同毒力的ASFV，具有重要意义。

现有ASF实验室的病原学检测方法主要有病毒分离(红细胞吸附试验，HA)、ASFV核酸检测(PCR、qPCR)、直接免疫荧光试验(DIF)和双抗体夹心ELISA试验等，其中PCR和荧光PCR(qPCR)方法的应用最为广泛，是目前WOAH推荐的检测方法。我国《非洲猪瘟防治技术规范(试行)》中的病原学检测方法也列出了PCR和qPCR方法。

ASFV根据B646L基因(编码p72蛋白)可划分为24个基因型，均可在非洲发现。目前，仅有基因I型和基因II型ASFV传播至非洲以外的地区。2018年8月3日我国首次报道ASF疫情以来，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室第一时间相继检测、分离、鉴定出我国ASFV基因II型强毒力毒株(2019年)、基因II型中等毒力自然变异毒株(2021年)和基因I型低毒力毒株(2021年)。近期，其又首次报道了基因I型和基因II型重组ASFV已入侵我国田间猪群，经系统的研究后发现，该毒株为基因I型强毒株，与基因II型ASFV强毒株相似，感染猪只表现出急性型临床症状，死亡率高达100％。当前，基因II型ASFV强毒株仍是我国主要流行毒株，但同时也存在其它多种类型毒株(基因II型自然变异株、基因I型弱毒株、基因I型强毒株及人工改造弱毒株)，这给我国ASF的防控带来了巨大挑战。因此，建立可高效、特异鉴别诊断ASFV不同类型和不同毒力毒株的方法，有助于监测ASF在我国的分布以及流行趋势，为追溯疫源及其传播方式的研究提供技术支持，这对ASF的有效防控具有重要意义。

发明内容

与普通PCR、基因芯片及恒温扩增等分子诊断方法相比，荧光定量PCR(qPCR)具有灵敏性高、特异性好、操作简单、方便快捷等特点，且可以满足不通层次工作人员的需要。目前，qPCR作为病毒核酸快速检测的主要方法之一，已被广泛的应用在动物疫病诊断、基因定性和定量检测等方面。

我国ASF存在多种类型毒株共存的现象，当前针对ASFV的单重或多重荧光定量PCR检测方法较多，如通用型ASFV的单重qPCR、鉴别检测基因I型和基因II型ASFV的双重qPCR和鉴别检测ASF基因缺失疫苗的三重qPCR等。近期中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室报道了一种新的基因I型强毒株已入侵我国田间猪群，然而，目前还没有对应的鉴别检测方法。本发明针对上述情况，基于我国田间存在的ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株及基因II型毒株的全基因组序列，通过筛选保守且特异的诊断标识基因(MGF_360-14L、B646L和X64R)，同时设计相对应的特异性引物和探针，成功研发了一种用于快速鉴别ASFV基因I型强毒株、基因I型弱毒株及基因II型毒株的三重荧光定量PCR方法。

为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种核酸组合，所述核酸组合包括第一引物，第二引物，第三引物，第四引物，第五引物，第六引物，第一探针，第二探针和第三探针；

其中：

所述第一引物下游与模板互补的特异性核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述第二引物下游与模板互补的特异性核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述第三引物为下游与模板互补的特异性核酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物和下游与模板互补的特异性核酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的混合物；

所述第四引物下游与模板互补的特异性核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述第五引物下游与模板互补的特异性核酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述第六引物下游与模板互补的特异性核酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述第一探针中，核酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.3所示，一端连接有第一荧光基团，另一端连接有第一淬灭基团，所述第一淬灭基团能够淬灭所述第一荧光基团发出的荧光；

所述第二探针中，核酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.7所示，一端连接有第二荧光基团，另一端连接有第二淬灭基团，所述第二淬灭基团能够淬灭所述第二荧光基团发出的荧光；

所述第三探针中，核酸序列或其互补序列如SEQ ID NO.10所示，一端连接有第三荧光基团，另一端连接有第三淬灭基团，所述第三淬灭基团能够淬灭所述第三荧光基团发出的荧光。

在一些实施方式中，所述第一淬灭基团不能够淬灭所述第二荧光基团与所述第三荧光基团中任一种基团发出的荧光；

所述第二淬灭基团不能够淬灭所述第一荧光基团与所述第三荧光基团中任一种基团发出的荧光；

所述第三淬灭基团不能够淬灭所述第一荧光基团与所述第二荧光基团中任一种基团发出的荧光。

在一些实施方式中，所述第一荧光基团不能够淬灭所述第二荧光基团与所述第三荧光基团中任一种基团发出的荧光；

所述第二荧光基团不能够淬灭所述第一荧光基团与所述第三荧光基团中任一种基团发出的荧光；

所述第三荧光基团不能够淬灭所述第一荧光基团与所述第二荧光基团中任一种基团发出的荧光。

在一些实施方式中，所述第一淬灭基团为MGB，所述第一荧光基团为VIC，所述第二淬灭基团为BHQ2，所述第二荧光基团为Cy5，所述第三淬灭基团为TAMRA，所述第三荧光基团为FAM；或者

所述第一淬灭基团为MGB，所述第一荧光基团为VIC，所述第二淬灭基团为TAMRA，所述第二荧光基团为FAM，所述第三淬灭基团为BHQ2，所述第三荧光基团为Cy5；或者

所述第一淬灭基团为BHQ2，所述第一荧光基团为Cy5，所述第二淬灭基团为MGB，所述第二荧光基团为VIC，所述第三淬灭基团为TAMRA，所述第三荧光基团为FAM；或者

所述第一淬灭基团为BHQ2，所述第一荧光基团为Cy5，所述第二淬灭基团为TAMRA，所述第二荧光基团为FAM，所述第三淬灭基团为MGB，所述第三荧光基团为VIC；或者

所述第一淬灭基团为TAMRA，所述第一荧光基团为FAM，所述第二淬灭基团为BHQ2，所述第二荧光基团为Cy5，所述第三淬灭基团为MGB，所述第三荧光基团为VIC；或者

所述第一淬灭基团为TAMRA，所述第一荧光基团为FAM，所述第二淬灭基团为MGB，所述第二荧光基团为VIC，所述第三淬灭基团为BHQ2，所述第三荧光基团为Cy5。

在一些实施方式中，所述第一探针中，5’端连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；

所述第二探针中，5’端连接有第二荧光基团，3’端连接有第二淬灭基团；

所述第三探针中，5’端连接有第三荧光基团，3’端连接有第三淬灭基团。

在一些实施方式中，所述第一引物的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述第二引物的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述第三引物为核酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物和核酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的混合物；

所述第四引物的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述第五引物的核酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述第六引物的核酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第一方面所述的核酸组合。

本发明第三方面提供了一种非诊断目的的鉴别检测第一类非洲猪瘟病毒、第二类非洲猪瘟病毒与第三类非洲猪瘟病毒的方法；

所述第一类非洲猪瘟病毒包括：第一类第一组非洲猪瘟病毒、第一类第二组非洲猪瘟病毒和第一类第三组非洲猪瘟病毒；

所述第一类第一组非洲猪瘟病毒为：基因I型非洲猪瘟病毒弱毒；

所述第一类第二组非洲猪瘟病毒为：能够正常存活增殖的，保持X64R基因中与所述第一引物、所述第二引物和所述第一探针互补的序列均不变的，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的，所述基因I型非洲猪瘟病毒弱毒的传代病毒株、所述基因I型非洲猪瘟病毒弱毒的自然突变病毒株和所述基因I型非洲猪瘟病毒弱毒的实质相同的病毒株中的任一种；

所述第一类第三组非洲猪瘟病毒为：能够正常存活增殖的，保持X64R基因中与所述第一引物、所述第二引物和所述第一探针互补的序列均不变的，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的，所述第一类第一组非洲猪瘟病毒或所述第一类第二组非洲猪瘟病毒的基因工程病毒株；

所述第二类非洲猪瘟病毒包括：第二类第一组非洲猪瘟病毒、第二类第二组非洲猪瘟病毒和第二类第三组非洲猪瘟病毒；

所述第二类第一组非洲猪瘟病毒为：基因I型非洲猪瘟病毒强毒；

所述第二类第二组非洲猪瘟病毒为：能够正常存活增殖的，保持X64R基因中与所述第一引物、所述第二引物和所述第一探针互补的序列均不变的，保持MGF_360-14L基因中与所述第三引物、所述第四引物和所述第二探针互补的序列均不变，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的，所述基因I型非洲猪瘟病毒强毒的传代病毒株、所述基因I型非洲猪瘟病毒强毒的自然突变病毒株和所述基因I型非洲猪瘟病毒强毒的实质相同的病毒株中的任一种；

所述第二类第三组非洲猪瘟病毒为：能够正常存活增殖的，保持X64R基因中与所述第一引物、所述第二引物和所述第一探针互补的序列均不变的，保持MGF_360-14L基因中与所述第三引物、所述第四引物和所述第二探针互补的序列均不变的，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的，所述第二类第一组非洲猪瘟病毒或所述第二类第二组非洲猪瘟病毒的基因工程病毒株；

所述第三类非洲猪瘟病毒包括：第三类第一组非洲猪瘟病毒、第三类第二组非洲猪瘟病毒和第三类第三组非洲猪瘟病毒；

所述第三类第一组非洲猪瘟病毒为：基因II型非洲猪瘟病毒；

所述第三类第二组非洲猪瘟病毒为：能够正常存活增殖的，保持MGF_360-14L基因中与所述第三引物、所述第四引物和所述第二探针互补的序列均不变的，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的，所述基因II型非洲猪瘟病毒的传代病毒株、所述基因II型非洲猪瘟病毒的自然突变病毒株和所述基因II型非洲猪瘟病毒的实质相同的病毒株中的任一种；

所述第三类第三组非洲猪瘟病毒为：能够正常存活增殖的，保持MGF_360-14L基因中与所述第三引物、所述第四引物和所述第二探针互补的序列均不变的，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的，所述第三类第一组非洲猪瘟病毒或所述第三类第二组非洲猪瘟病毒的基因工程病毒株；

所述非洲猪瘟病毒的基因工程病毒株包括通过定点突变、基因敲除、转基因，或其组合改变基因组序列得到的非洲猪瘟病毒株；

所述方法为：使用本发明第一方面所述的核酸组合对从目标检测样本所提取出来的核酸进行qPCR检测，通过荧光信号进行所述鉴别检测。

在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：

S1：提取所述目标检测样本的基因组模板；

S2：将所述基因组模板、本发明第一方面所述的核酸组合与qPCR反应试剂混合，得到qPCR反应体系；

S3：对所述qPCR反应体系进行热循环，通过荧光信号针对所述第一类非洲猪瘟病毒、所述第二类非洲猪瘟病毒与所述第三类非洲猪瘟病毒进行所述鉴别检测。

本发明中，非诊断目的的鉴别检测基因I型非洲猪瘟病毒弱毒、基因I型非洲猪瘟病毒强毒与基因II型非洲猪瘟病毒，是指鉴别检测基因I型非洲猪瘟病毒弱毒、基因I型非洲猪瘟病毒强毒与基因II型非洲猪瘟病毒不是以诊断为目的或结果而获得猪的感染状况，评价猪的健康状况，或评价针对猪的治疗或预防效果，而是其他目的或作用。

非诊断目的操作的一个应用举例：为了新建养猪场选址，当进行环境病原体安全性评价而对多种潜在猪病原体(比如，基因I型非洲猪瘟病毒弱毒、基因I型非洲猪瘟病毒强毒、基因II型非洲猪瘟病毒、古典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒等)进行检测时，对于环境样本针对潜在基因I型非洲猪瘟病毒弱毒、基因I型非洲猪瘟病毒强毒与基因II型非洲猪瘟病毒进行鉴别检测，如检测阳性，则需要进行有针对性的环境消毒后再建养猪场，或者取消在该地址建养猪场的计划，该案例环境评估的检测不属于诊断目的的鉴别检测。

很显然，把基因I型非洲猪瘟病毒弱毒、基因I型非洲猪瘟病毒强毒与基因II型非洲猪瘟病毒分别依次视为第一类非洲猪瘟病毒、第二类非洲猪瘟病毒与第三类非洲猪瘟病毒的方法中各自三组之一是合理的，本发明能够胜任鉴别检测前述第一类非洲猪瘟病毒、第二类非洲猪瘟病毒与第三类非洲猪瘟病毒。

以第一类非洲猪瘟病毒为例进行说明，对于第一类第二组非洲猪瘟病毒与所述第一类第三组非洲猪瘟病毒，均限定了“能够正常存活增殖的”，能够存活的才有检测的应用价值和意义，限定了“保持X64R基因中与所述第一引物、所述第二引物和所述第一探针互补的序列均不变的，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的”，能够保证本发明所设计的探针与引物的组合对这些序列不突变的基因I型非洲猪瘟病毒弱毒检测有效。

对于传代病毒株，很显然，任何发现的非洲猪瘟病毒株，都会有一部分进行天然感染传代或人工培养传代，这些传代病毒株保留了遗传特性，具有相同的基因组序列，能够被相同的引物和探针定量扩增检测。

对于自然突变病毒株，天然感染传代或人工培养传代的非洲猪瘟病毒株，不可避免引入微小突变，自然突变不会改变基因组的分型，当突变不致死且设计的引物和探针互补序列不突变时，能够被相同的引物和探针定量扩增检测。通常情况，这种突变不会明显影响病毒的致病性与免疫原性，对其进行鉴别检测具有应用价值，通常来说，自然突变病毒株是频繁发生且不可避免的。

对于实质相同的病毒株，如果一个新鉴定的非洲猪瘟病毒株与一个已经鉴定的基因I型非洲猪瘟病毒弱毒存在共同祖先，在演化的过程中也存在一些基因组碱基的差别，当差别比较微小时，通常认为是相同病毒基因型，如果“保持X64R基因中与所述第一引物、所述第二引物和所述第一探针互补的序列均不变的，并且保持B646L基因中与所述第五引物、所述第六引物和所述第三探针互补的序列均不变的”，很显然适用本发明所设计的鉴别检测方法。非洲猪瘟病毒不断地突变与演化，任何鉴定的非洲猪瘟病毒株都必然有共同祖先的其他病毒株以及二者的突变传代病毒株，这些病毒株基因分型相同，它们互称实质相同的病毒株。

对于非洲猪瘟病毒的基因工程病毒株，经常通过非洲猪瘟病毒定点突变、基因敲除、转基因等手段改造非洲猪瘟病毒，制备基因工程疫苗或其他用途。当然，本发明的鉴别检测方法能够覆盖对上文限定的基因工程病毒株的检测。这也具备应用价值，比如，如果通过本发明的方法鉴定得到了基因I型非洲猪瘟病毒强毒，但通过临床症状看属于感染了非洲猪瘟弱毒病毒，就可以推测是感染(接种)了基因I型非洲猪瘟病毒强毒的致弱基因工程疫苗株，可进一步通过其他手段进行验证。

在一些实施方式中，所述鉴别检测的判定方法为：

分别或并行采用所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团的激发波长激发qPCR反应体系，检测荧光信号；

当仅检测到所述第一荧光基团和所述第三荧光基团发出的荧光时，所述目标检测样本中含有所述第一类非洲猪瘟病毒；

当仅检测到所述第二荧光基团和所述第三荧光基团发出的荧光时，所述目标检测样本中含有所述第三类非洲猪瘟病毒；

当检测到所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团发出的荧光时，所述目标检测样本中含有所述第二类非洲猪瘟病毒；

当检测不到所述第三荧光基团发出的荧光时，所述目标检测样本中不含有基因I型非洲猪瘟病毒和基因II型非洲猪瘟病毒中的任一种。

在一些实施方式中，所述热循环中，预处理为：95℃，30s，温度循环程序为：95℃，10s，59℃，20s，循环次数为38-45。

在一些实施方式中，所述基因I型非洲猪瘟病毒弱毒的毒株的GenBank号包括：MZ945537、MZ945536、AM712240、KM262845和NC_001659；

所述基因I型非洲猪瘟病毒强毒的毒株的GenBank号包括：OQ504956、OQ504955、OQ504954、KP055815、KM262844、AM712239、NC_044958、MZ202520和MN913970；

所述基因II型非洲猪瘟病毒的毒株的GenBank号包括：MK333180、FR682468、NC_044948、MG939587、MN393476、MK940252、OR180113、MK128995、MT496893、MK645909、MW656282、MW361944、OM105586、ON400500和OM105587。

本发明第四方面提供了本发明第一方面所述的核酸组合或本发明第二方面所述的试剂盒在制备鉴别检测第一类非洲猪瘟病毒、第二类非洲猪瘟病毒与第三类非洲猪瘟病毒的制剂或系统中的应用；

所述非洲猪瘟病毒的基因工程病毒株包括通过定点突变、基因敲除、转基因，或其组合改变基因组序列得到的非洲猪瘟病毒株。

本发明所述第一、第二、第三、第四、第五、第六等顺序性限定是为了区分场景，便于清楚地表达，不代表重要性的先后顺序或操作中的先后使用顺序，也不必然代表结构/组成不同。

本发明的核酸组合敏感性好，特异性高，能够通过qPCR对基因I型非洲猪瘟病毒弱毒、基因I型非洲猪瘟病毒强毒与基因II型非洲猪瘟病毒的核酸进行有效的鉴别检测。

附图说明

图1示出了基因I型与基因II型ASFV基因组片段序列比对结果。

图2示出了SD/DY-I/21、JS/LG/21和HLJ/18株ASFV阳性培养物的qPCR检测结果。

图3示出了含有B646L、X64R和MGF_360-14L基因的标准品质粒的三重荧光定量PCR标准曲线。

图4示出了不同浓度含有B646L的ASFV阳性质粒FAM通道敏感性测试反应结果。

图5示出了不同浓度含有X64R的ASFV阳性质粒VIC通道敏感性测试反应结果。

图6示出了不同浓度含有MGF_360-14L的ASFV阳性质粒Cy5通道敏感性测试反应结果。

图7示出了本发明鉴别检测方法的特异性试验结果。

（图2坐标4-7中，横坐标数字代表qPCR循环反应的次数）。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明没有说明的材料与仪器为本领域常规材料与仪器，本发明没有说明的操作细节为本领域常规操作。

本发明所示核酸序列均是按照5’到3’的方向从左到右书写。

本发明所述上游是指核酸的5’端或5’端方向，下游是指核酸的3’端或3’端方向。

材料与方法

(1)细胞与病毒

猪肺泡巨噬细胞(PAM)、ASFV基因I型弱毒株：Pig/SD/DY-I/2021(简称：SD/DY-I/21、GenBank：MZ945537)和Pig/HeN/ZZ-P1/2021(简称：HeN/ZZ-P1/21、GenBank：MZ945536)；ASFV基因I型强毒株：Pig/JiangSu/LG/2021(简称：JS/LG/21、GenBank：OQ504956)、Pig/HeNan/123014/2022(简称：HeN/123014/22、GenBank：OQ504954)和Pig/Inner Mongolia/DQDM/2022(简称：IM/DQDM/22、GenBank：OQ504955)；ASFV基因II型强毒株：Pig/HLJ/2018(简称：HLJ/18、GenBank：MK333180)；ASFV基因II型弱毒株：Pig/HeiLongJiang/HRB1/2020(简称：HLJ/HRB1/20、GenBank：MW656282)均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定与保存。

(2)核酸提取试剂盒

本发明所用核酸提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA/RNA提取试剂盒(货号：DP315)。

实施例1：非洲猪瘟基因I型强毒、I型弱毒与II型病毒鉴别检测荧光定量PCR方法的建立

一、引物、探针的设计与合成

(一)序列比对

查阅文献并下载GenBank数据库中ASF基因I型强毒株9个、基因I型弱毒株5个和基因II型病毒82个，共计96个毒株的全基因组序列，利用SnapGene软件进行序列比对分析。结果显示：根据ASFV基因II型(强毒株与弱毒株)和基因I型强毒株之间共有的MGF_360-14L基因的保守序列区段是相同的，ASFV基因I型弱毒株和基因I型强毒株之间共有的X64R基因的保守序列区段是相同的以及ASFV基因I型和基因II型之间共有的B646L基因的保守序列区段是相同的，能够分别用于设计三组引物对和探针，前述96个基因组中29个基因组序列比对的结果如图1所示，虚线代表基因组含有相同序列的基因组片段。

前述29个毒株的信息如下。

ASFV基因I型强毒株：JS/LG/21(GenBank：OQ504956)、IM/DQDM/22(GenBank：OQ504955)、HeN/123014/22(GenBank：OQ504954)、BA71(GenBank：KP055815)、L60(GenBank：KM262844)、Benin 97(GenBank：AM712239)、E75(GenBank：NC_044958)、K49(GenBank：MZ202520)、Liv-13/33(GenBank：MN913970)。

ASFV基因I型弱毒株：SD/DY-I/21(GenBank：MZ945537)、HeN/ZZ-P1/21(GenBank：MZ945536)、OURT88/3(GenBank：AM712240)、NHV(GenBank：KM262845)、BA71V(GenBank：NC_001659)。

ASFV基因II型毒株：HLJ/18(GenBank：MK333180)、Georgia2007(GenBank：FR682468)、Odintsovo_02/14(GenBank：NC_044948)、Po117_03029_C201(GenBank：MG939587)、Wuhan 2019-1(GenBank：MN393476)、InnerMongolia-AES01(GenBank：MK940252)、ASFV JS(GenBank：OR180113)、AnhuiXCGQ(GenBank：MK128995)、GZ201801(GenBank：MT496893)、wbBS01(GenBank：MK645909)、HLJ/HRB1/20(GenBank：MW656282)、China/GD/2019(GenBank：MW361944)、LYG18(GenBank：OM105586)、YNFN202103(GenBank：ON400500)、JX21(GenBank：OM105587)。

(二)引物和探针设计

在上述序列比对结果的基础上，选取ASFV基因I型SD/DY-I/21株基因组的X64R基因、基因II型HLJ/18株和基因I型JS/LG/21基因组共有的MGF_360-14L基因片段，以及基因I型SD/DY-I/21株和基因II型HLJ/18株基因组共有的B646L基因片段。

利用引物、探针设计软件分别针对ASFV MGF_360-14L、X646R和B646L基因设计引物与探针，同时要充分考虑引物与探针的退火温度(Tm值)、长度(bp)、CG含量(CG％)、探针的荧光基团和淬灭基团的选择，以及引物和探针之间相互干扰等影响因素。最后将设计好的引物和探针分别在GenBank数据库中进行序列比对，以确保其特异性和扩增效率。通过筛选和验证，最终得到ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株和基因II型毒株鉴别检测的引物和探针信息如表1所示，均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

通过寻找不同毒株之间的共同序列，设计了三个引物对，其中：

引物对X64R-F与X64R-R能够用于扩增序列比对所用所有ASFV基因I型强毒、所有ASFV基因I型弱毒，通过探针X64R-Probe发出VIC荧光。

引物对MGF_360-14L-F与MGF_360-14L-R能够用于扩增序列比对所用所有ASFV基因I型强毒、所有ASFV基因II型强毒、所有ASFV基因II型弱毒，通过探针MGF_360-14L-Probe发出Cy5荧光。

引物对B646L-F与B646L-R能够用于扩增序列比对所用所有ASFV基因I型强毒、所有ASFV基因I型弱毒、所有ASFV基因II型强毒、所有ASFV基因II型弱毒，通过探针B646L-Probe发出FAM荧光。

表1：引物和探针序列信息

注：“N”代表无数据(无荧光分子)。MGF_360-14L-F中，存在1个差异位点，I型强毒是GT；II型是CC，采用SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所述序列的混合物作为上游引物，就能够对前述两种病毒通用，以方便做鉴别检测。

(三)ASF基因I型强毒、I型弱毒和II型病毒鉴别检测荧光定量PCR方法的建立

(1)样品处理与基因组DNA提取

含有ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株和基因II型毒株的细胞培养物、组织脏器、血液、口腔和肛门拭子等生物材料，在P3实验室内按前述DNA核酸提取试剂盒说明书提取基因组DNA，-70℃冰箱保存，备用。

(2)反应体系的构建

反应体系如表2所示，按25μl/管进行配制，其中含引物、探针、qPCR酶的扩增试剂共20μl，模板量5μl。扩增试剂根据“待检样本数(n)+ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株和基因II型毒株对照(3)+阴性对照(1)+1＝应测试数N”，分装至反应管中，20μl/管，然后加入提取的样本核酸(DNA模板)5μl，同时设定阴性对照(无核酶水)、ASFV基因I型弱毒株阳性对照(SD/DY-I/21株PAM常规培养物，灭活后提取的基因组DNA)、基因I型强毒株阳性对照(JS/LG/21株PAM常规培养物，灭活后提取的基因组DNA)和基因II型毒株阳性对照(HLJ/18株PAM常规培养物，灭活后提取的基因组DNA)，瞬时离心后进行上机检测。

针对含引物、探针的qPCR反应液，每个反应体系中分别含有0.5μl X64R-F(10pmol)、0.5μl X64R-R(10pmol)、0.5μl X64R-Probe(10pmol)、0.5μl MGF_360-14L-F(SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所示的引物各10pmol)、0.5μl MGF_360-14L-R(10pmol)、0.5μl MGF_360-14L-Probe(10pmol)、0.5μl B646L-F(10pmol)、0.5μl B646L-R(10pmol)、0.5μlB646L-Probe(10pmol)、12.5μl 2×Mix、3.0μl ddH₂O。

表2：反应体系

(3)反应程序

在荧光定量PCR仪(BIO-RAD:CFX96)上按照表3进行反应程序的设定；荧光检测通道选择：FAM、Cy5和VIC，具体检测通道设置可参照各仪器使用说明书进行操作。

表3：程序设定参数

(4)结果判定

(a)试验结果成立的条件：ASFV基因I型弱毒株阳性对照孔，B646L与X64R基因片段被扩增，FAM和VIC荧光通道均有明显指数扩增曲线，且两个荧光通道的Ct值均≤32，而MGF_360-14L基因片段不被扩增，Cy5荧光通道结果为无Ct值或Ct值>40；ASFV基因II型毒株阳性对照孔，B646L与MGF_360-14L基因片段被扩增，FAM和Cy5荧光通道均有明显指数扩增曲线，且两个荧光通道的Ct值均≤32，而X64R基因片段不被扩增，VIC荧光通道结果为无Ct值或Ct值>40；ASFV基因I型强毒株阳性对照孔，B646L、MGF_360-14L与X64R基因片段均被扩增，FAM、Cy5和VIC荧光通道均有明显指数扩增曲线，且3个荧光通道的Ct值均≤32；阴性对照检测，无基因片段被扩增，结果为无Ct值或Ct值>40，以上均成立才可判定试验成立，体系有效，否则试验无效。

(b)结果判定标准：在试验结果成立的条件下，按表4判定标准进行结果判定；可疑样品需要进行第二次检测，第二次检测结果的Ct值≤40，则判定为阳性；否则，判定为阴性。

表4：判定标准

注：“-”代表无Ct值或Ct值>40。

实施例2：ASF基因I型强毒、I型弱毒与II型病毒鉴别检测荧光定量PCR方法的验证

对ASFV基因I型弱毒株(SD/DY-I/21)、基因I型强毒株(JS/LG/21)和基因II型毒株(HLJ/18)常规方法感染猪肺泡巨噬细胞培养物，灭活后提取的DNA，以及阴性对照样品(无核酶水)，未设待检测样本，采用实施例2的方法进行三重qPCR检测，以便验证阳性对照的有效性。结果显示，SD/DY-I/21样品的FAM(B646L)和VIC(X64R)两个荧光通道的Ct值分别为24.93和23.63，且有明显的扩增曲线，而Cy5(MGF_360-14L)荧光通道无Ct值；HLJ/18样品的FAM和Cy5两个荧光通道的Ct值为24.86和25.33，且有明显的扩增曲线，而VIC荧光通道无Ct值；JS/LG/21样品的FAM、VIC、Cy5三个荧光通道的Ct值分别为29.46、28.24和29.96，且有明显的扩增曲线；阴性对照样品的FAM、Cy5和VIC三个荧光通道均无Ct值(图2)。

由此可知：对于基因I型ASFV弱毒样品：FAM和VIC的Ct值均≤40，而Cy5无Ct值；基因II型ASFV样品：FAM和Cy5的Ct值均≤40，而VIC无Ct值；基因I型ASFV强毒样品：FAM、Cy5和VIC的Ct值均≤40；阴性对照样品：FAM、Cy5和VIC均无Ct值；这符合ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株及基因II型毒株鉴别诊断的判定标准，完全能够将三种ASFV区分开，实施例1的方法可用于鉴别检测其他ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株及基因II型毒株。

实施例3：敏感性试验

(1)标准质粒

含有GenBank序列号为MZ945537的基因I型弱毒株基因组16,113-16,307bp(X64R基因的编码区)、MK333180的基因II型强毒株基因组103,618-105,558bp(B646L基因的编码区)和31,854-32,927bp(MGF_360-14L基因的编码区)的阳性质粒(基础质粒为：pCAGGS)，三者分别简称X64R基因标准质粒、B646L基因标准质粒和MGF_360-14L基因标准质粒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建、鉴定和保存。用于敏感性试验。

(2)荧光定量PCR标准曲线和敏感性检测

根据拷贝数计算公式：拷贝数/ml＝(6.02x10²³拷贝数/摩尔)x(浓度g/ml)/(MW g/mol)，首先将分别X64R基因标准质粒、B646L基因标准质粒和MGF_360-14L基因标准质粒用无核酶水稀释至10¹¹拷贝数/μl，将3种质粒混至一个EP管中，并使每个质粒的拷贝数均为10¹⁰拷贝数/5μl，然后用无核酶水进行十倍系列稀释，取稀释为每5μl含有10¹、10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶拷贝数的模板样品，每个稀释度设置3个重复，同时设置阴性对照(无核酶水)。按照实施例1建立方法的反应条件在PCR仪设置程序进行检测。

建立的三重荧光定量PCR标准曲线如图3所示，B646L、X64R和MGF_360-14L三个基因的标准曲线的相关系数(R²)均为0.998，扩增效率(E)均在90％～110％，表明该方法具有良好的线性关系。

B646L基因标准质粒、X64R基因标准质粒和MGF_360-14L基因标准质粒敏感性检测结果分别如图4、5、6所示：对于含有B646L、X64R和MGF_360-14L三个基因的6种不同浓度的标准品，与之对应的FAM、VIC和Cy5三个荧光通道的Ct值均≤40，结果均为阳性，且有明显的扩增曲线；因此，该三重荧光定量PCR方法的敏感性检测结果为小于等于10个拷贝/反应。

实施例4：特异性试验

(1)特异性验证样品

古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)的核酸，由各自病毒的适应性细胞的常规细胞培养物中提取，其毒价TCID₅₀均达到10⁶/ml以上，取0.2ml，分别用前述核酸提取试剂盒提取制备而成。

将提取好的CSFV、PRRSV、PRV、PCV 2、PCV 3、PEDV、TGEV和PoRV的核酸作为特异性检测用模板样品，同样，根据反应体系中每个样品需要扩增试剂20μl进行配制，分装后再分别加入各5μl模板，同时按照实施例1的方式设置阴性(无核酶水)、ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株和基因II型毒株对照，最后按照实施例1的方法在PCR仪上设置反应程序进行检测。

(2)特异性试验结果

对CSFV、PRRSV、PRV、PCV 2、PCV 3、PEDV、TGEV和PoRV的核酸作为特异性验证用样品进行检测，在试验成立的条件下，各样品FAM、Cy5和VIC三个荧光通道的均无Ct值，检测结果均为阴性(图7)。针对三种阳性对照，结果与图2雷同。因此，该方法具有良好的特异性。

实施例5：重复性试验

(1)测试方法

按照实施例3稀释标准品质粒的方法，分别采用含有X64R、MGF_360-14L和B646L基因为10⁶、10⁴和10²拷贝数/5μl的标准品质粒，按“实施例1的反应体系和反应程序”进行三重荧光PCR试验，两个不同的实验人员于不同时间分别重复检测三次，分析该方法的稳定性。

(2)重复性试验结果

分别采用10⁶、10⁴和10²/5μl拷贝数的标准品质粒评价三重荧光定量PCR方法组内和组间的重复性。结果如表5所示，组内Ct值的变异系数在0.22～1.69之间；组间Ct值的变异系数在0.66～2.09之间；表明该方法具有良好的重复性。

表5：重复性检测结果

实施例6：受检样品的检测

将ASFV基因I型弱毒株(SD/DY-I/21)、基因I型强毒株(JS/LG/21)及基因II型毒株(HLJ/18)分别以1×10⁶TCID₅₀和1×10⁶HAD₅₀、1×10^3.5HAD₅₀剂量经肌肉注射SPF猪，分别采集感染猪的血液、口腔拭子、肛门拭子、肺脏、脾脏和淋巴结等样品各2份，以及分离毒株SD/DY-I/21、HeN/ZZ-P1/21、HLJ/18、HLJ/HRB1/20、JS/LG/21、HeN/123014/22、IM/DQDM/22的PAM常规细胞培养物灭活后样品，共计43份样品，分别按照核酸提取试剂盒说明书提取病毒基因组DNA。利用实施例1建立的三重荧光定量PCR方法分别对它们进行检测；同时采用世界动物卫生组织推荐的Fernández-Pinero等人针对B646L基因建立的ASFV通用型qPCR检测方法(基因I型与基因II型通用的检测方法)进行检测。Fernández-Pinero等人建立的qPCR方法的引物和探针如下：WOAH-F：5’-ccc agg gga taa aat gac tg-3’(SEQ ID NO.11)，WOAH-R：5’-cac trg ttc cct cca ccg ata-3’(SEQ ID NO.12)，WOAH-Probe：5’-(FAM)tcctgg ccr acc aag tgc tt(BHQ1)-3’(核酸部分序列名SEQ ID NO.13)。每个反应中引物WOAH-F和WOAH-R浓度均为8pmol(0.4μl)，WOAH-Probe浓度为2pmol(0.2μl)；反应程序为：1.95℃，5min；2.95℃，10s；3.60℃(此步收集荧光)，30s，45个循环。

上述ASFV各毒株的肺泡巨噬细胞感染试验、SPF猪的感染试验，均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P3和P4实验室进行。

检测结果由表6所示：对于ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株和基因II型毒株感染猪后的各类型样品，本发明建立的三重荧光定量PCR方法均能有效的鉴别检测，且同一样品的Ct值与WOAH推荐的qPCR方法检测的Ct值相当。

以上检测结果，完全符合ASFV荧光定量PCR鉴别检测的判定标准与条件，因此该方法能够用于ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株和基因II型毒株的鉴别检测。

表6：受检样品结果

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注：“-”代表无Ct值或Ct值>40。

本发明的方法能够灵敏、快速、准确、特异性的鉴别检测细胞培养物、血液、口腔和肛门拭子，以及组织等样品中ASFV基因I型弱毒株、基因I型强毒株和基因II型强毒株的荧光定量PCR检测方法。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims

1.一种核酸组合，所述核酸组合包括第一引物，第二引物，第三引物，第四引物，第五引物，第六引物，第一探针，第二探针和第三探针；

其中：

2.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述第一淬灭基团不能够淬灭所述第二荧光基团与所述第三荧光基团中任一种基团发出的荧光；

所述第三淬灭基团不能够淬灭所述第一荧光基团与所述第二荧光基团中任一种基团发出的荧光；

优选地，所述第一荧光基团不能够淬灭所述第二荧光基团与所述第三荧光基团中任一种基团发出的荧光；

所述第三荧光基团不能够淬灭所述第一荧光基团与所述第二荧光基团中任一种基团发出的荧光；

优选地，所述第一淬灭基团为MGB，所述第一荧光基团为VIC，所述第二淬灭基团为BHQ2，所述第二荧光基团为Cy5，所述第三淬灭基团为TAMRA，所述第三荧光基团为FAM；或者

3.如权利要求1或2所述的核酸组合，其特征在于，所述第一探针中，5’端连接有第一荧光基团，3’端连接有第一淬灭基团；

4.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述第一引物的核酸序列如SEQ IDNO.1所示；

所述第二引物的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述第四引物的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述第五引物的核酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述第六引物的核酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1-4中任一项所述的核酸组合。

6.一种非诊断目的的鉴别检测第一类非洲猪瘟病毒、第二类非洲猪瘟病毒与第三类非洲猪瘟病毒的方法；

所述方法为：使用权利要求1-4中任一项所述的核酸组合对从目标检测样本所提取出来的核酸进行qPCR检测，通过荧光信号进行所述鉴别检测。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：提取所述目标检测样本的基因组模板；

S2：将所述基因组模板、权利要求1-4中任一项所述的核酸组合与qPCR反应试剂混合，得到qPCR反应体系；

S3：对所述qPCR反应体系进行热循环，通过荧光信号针对所述第一类非洲猪瘟病毒、所述第二类非洲猪瘟病毒与所述第三类非洲猪瘟病毒进行所述鉴别检测；

优选地，所述鉴别检测的判定方法为：

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述热循环中，预处理为：95℃，30s，温度循环程序为：95℃，10s，59℃，20s，循环次数为38-45；

优选地，所述基因I型非洲猪瘟病毒弱毒的毒株的GenBank号包括：MZ945537、MZ945536、AM712240、KM262845和NC_001659；

9.权利要求1-4中任一项所述的核酸组合或权利要求5所述的试剂盒在制备鉴别检测第一类非洲猪瘟病毒、第二类非洲猪瘟病毒与第三类非洲猪瘟病毒的制剂或系统中的应用；

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基因I型非洲猪瘟病毒弱毒的毒株的GenBank号包括：MZ945537、MZ945536、AM712240、KM262845和NC_001659；