CN110760617A - 检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光pcr引物探针组合及试剂盒 - Google Patents

检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光pcr引物探针组合及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽医领域中的动物病毒检测技术领域，具体公开了一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒；基于该试剂盒的PCR方法不仅可特异地检测非洲猪瘟病毒野毒。与现有的p72的荧光PCR配合使用时，还可作为区分非洲猪瘟病毒野毒和MGF360‑505R缺失弱毒疫苗毒株的方法，从而为检测非洲猪瘟病毒野毒及其感染动物提供重要工具，以利于该病的控制和净化。

Description

检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试 剂盒
技术领域
本发明涉及兽医领域中的动物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种烈性、出血性传染病；强毒株可在感染的约5-14天内致死家猪，其中死亡率接近100％，而且难以扑灭。该病是世界动物卫生组织(OIE)规定的属于法定报告的动物疫病。自2018年8月我国发生首起非洲猪瘟疫情后，已给我国养猪业造成了非常沉重打击。
非洲猪瘟病毒自从发现100多年来，仅仅有西班牙、巴西等屈指可数的国家依赖扑杀策略成功控制住非洲猪瘟。但我国生猪饲养量巨大，仅仅依靠扑杀手段，成本太高，安全、有效的疫苗是控制我国非洲猪瘟疫情的迫切需求。但采用传统疫苗研制策略，包括灭活疫苗、自然弱毒或传代致弱疫苗等)、新型佐剂和亚单位疫苗等新型疫苗等研制策略，均未成功。
国外研究表明，非洲猪瘟病毒基因组178643至182578的片段缺失导致MGF505-11L，MGF100-1L，17L18L ASFV G ACD01870，I9R，I10L I11L阅读框的缺失，可导致病毒毒力显著降低，且作为弱毒疫苗可产生有效保护。我国的研究单位也证实，将基因I型的非洲猪瘟病毒进行MGF360-505R基因缺失，或进行CD2V与MGF360-505R基因联合缺失而得到的非洲猪瘟病毒基因缺失毒株，不仅充分致弱，而且作为疫苗是非常安全的。
目前，非洲猪瘟病毒MGF360-505R缺失弱毒疫苗毒株已展现了很好的安全性和保护效果；但该疫苗一旦应用于临床，现有的基于非洲猪瘟病毒P72基因等的检测技术将不能区分野生型毒株毒和疫苗毒，导致疫苗毒和野生型病毒检测均为阳性。这将极大干扰弱毒疫苗使用后，非洲猪瘟病毒野毒的检测，从而不利于该病的控制。
因此，急需研发MGF360-505R缺失弱毒疫苗使用后，仍可特异性检测非洲猪瘟病毒野毒的检测试剂盒和方法。从而在弱毒疫苗使用后，特异地检测并甄别野毒感染动物，从而为该病的防控提供重要工具。
发明内容
本发明针对应用MGF360-505R缺失弱毒疫苗防控非洲猪瘟后，需要检测非洲猪瘟病毒野毒感染动物进行淘汰的需求和技术问题时；提供了一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒，从而在疫苗使用背景下，为检测非洲猪瘟病毒野毒及其感染动物提供重要工具，以利于该病的控制和净化。
为实现上述目的，本发明所设计一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合，它包括荧光PCR特异性引物和荧光PCR探针；所述荧光PCR特异性引物的核苷酸序列为：
荧光PCR引物为：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，
下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，
Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。
进一步地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。
本发明还提供了一种检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的试剂盒，包括上述荧光PCR引物探针组合。作为优选方案，还包括qPCRProbe MasterMix。
利用上述试剂盒检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的方法，包括以下步骤：
1)建立标准曲线
a.标准品的制备：
以非洲猪瘟病毒基因组DNA为模板，使用下述PCR引物：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，
下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，
Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ IDNO：4所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMGF_505-2R，即为标准品；
b.标准曲线的建立
将阳性质粒制作成标准品模板，应用荧光PCR进行检测(引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，Y为C/T；M为A/C，R为A/G；荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团)；并利用基因组拷贝数的Lg值与检测的Ct值的函数关系，建立标准曲线：
Lg(gene copies/μL)＝-0.2449x+12.348，R2＝0.9972，其中，Y为Lg值；x为Ct值；
2)待检测样品检测
a.荧光PCR
收集待检测样品并提取其基因组；使用下述荧光PCR引物和探针：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团
进行荧光PCR扩增，采集荧光信号得到Ct；
b.检测结果判定
若Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有非洲猪瘟病毒野生型毒株(Ct值越低，野毒的病毒含量越高)；将待测样品的Ct值带入标准工作曲线中，即判断待检测样品中非洲猪瘟病毒野生型毒株的病毒含量；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该待检测样品中不含有野毒或野毒含量极低至无法检测到(进一步检查，基于现有的p72的荧光PCR为阳性，则表明样品中含有的病毒为MGF360-505R缺失弱毒疫苗毒株。)。
本发明的有益效果：
本发明提供的检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合能将非洲猪瘟病毒野毒因含有目的序列检测出来，而非洲猪瘟病毒MGF360-505R缺失弱毒疫苗毒株因缺失该目的序列，不能被检出。因此基于该试剂盒的PCR方法不仅可特异地检测非洲猪瘟病毒野毒。与现有的p72的荧光PCR配合使用时，还可作为区分非洲猪瘟病毒野毒和MGF360-505R缺失弱毒疫苗毒株的方法，从而为检测非洲猪瘟病毒野毒及其感染动物提供重要工具，以利于该病的控制和净化。
附图说明
图1为实施例2的阳性质粒pMGF_505-2R的各稀释度样品进行荧光PCR检测后，绘制的质粒基因拷贝数的log值和荧光PCR检测的Ct值之间的线性关系图；其中，质粒拷贝数分别为2×1010、2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100拷贝/μL；
图2为实施例2的阳性质粒pMGF_505-2R拷贝数同一次实验内30个平行样品扩增曲线；
图3为实施例3的检测非洲猪瘟病毒和区分野毒与MGF360-505R缺失弱毒疫苗毒株的荧光PCR检测方法的流程框图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合的筛选
根据弱毒疫苗缺失的基因组靶序列，即非洲猪瘟病毒中国流行株Pig/CN/HLJ/2018基因组27942-35500bp的序列，考虑到引物的错配以及Tm值等因素，将设计的引物和探针分别通过Blast软件在NCBI数据库中进行分析，要求引物对和探针序列必须覆盖所有数据库已知的非洲猪瘟病毒序列，且和其他序列无明显配对。通过分析发现：
序列5’-TCTGCGTCAACTACCTCG-3’、5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’和5’-GACGAAAGTGAGGACGAT-3’可匹配绝大部分非洲猪瘟病毒的序列，可作为检测非洲猪瘟病毒野毒的组合，即引物对(上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCTCG-3’和下游引物：5’-GACGAAAGTGAGGACGAT-3’，以及探针5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’)。
进一步分析引物和非洲猪瘟野毒匹配的序列时，发现上游引物处的16位碱基，部分病毒的序列为C，因此，将上游引物修订为5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’；下游引物处的3、7、9、16位碱基，部分病毒的序列分别为A、T、T、A，为了覆盖到所有非洲猪瘟病毒，将下游引物修订为5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’；探针的核苷酸序列5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’可覆盖到所有数据库已知的非洲猪瘟病毒序列，予以采用。因此，建立了非洲猪瘟病毒野毒的荧光PCR检测方法的引物探针组合：即荧光PCR引物为：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；
Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，如SEQ ID NO.3且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有FAM等荧光报告基团，3’端结合有BHQ荧光淬灭基团。
之后，将非洲猪瘟病毒野毒的基因组作为模板，采用qPCR试剂盒检测这些基因的表达量；反应体系为Mix 5μL、ROX 0.2μL、10μM的引物各0.25μL、10μM的探针0.1μL、DNA模板2μL、补水至10μL；阴性对照组以去离子水代替待测样品，同时设置猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的基因组作为非特异性对照；
荧光PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s、50℃退火10，60℃延伸30s，45个循环，于60℃时采集荧光信号；
荧光PCR检测结果显示，经过100次试验验证，该靶序列可被检出，且Ct值均小于25，与目前基于P72序列的荧光检测方法相当。而且其他病毒(例如猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒)的基因组作为模板无检测信号、阴性对照无检测信号，表明该荧光PCR可作为检测非洲猪瘟病毒野毒的方法：其中：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，
下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，
Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有FAM等荧光报告基团，3’端结合有BHQ荧光淬灭基团。
实施例2
检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的试剂盒，包括上述荧光PCR引物探针组合；在本发明中，可将引物和探针直接加入到商品化的qPCR Probe MasterMix试剂中。基于上述试剂盒构建检测检测非洲猪瘟病毒野毒的方法，包括以下步骤：
1)标准品的制备：
以非洲猪瘟病毒基因组DNA为模板，使用荧光PCR引物：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，
下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，Y为C/T；M为A/C，R为A/G，
进行PCR扩增，得到产物为258bp的基因部分片段(如SEQ IDNO：4所示)，与pMD18-T载体连接，构建包含目标片段的阳性质粒pMGF_505-2R，测序结果无突变；
2)标准曲线的建立:
将2×1010拷贝/μL阳性质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为1×1010-1×102拷贝/μL，作为标准品模板，参照“靶标基因筛选”中反应体系和条件进行荧光PCR，基因组拷贝数的Lg值与检测的Ct值之间的函数关系为Lg(gene copies/μL)＝-0.2449x+12.348，R2＝0.9972，表明相关性较好；
3)检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的试剂盒的敏感性和重复性实验
将1×1010拷贝/μL阳性质粒进行10倍梯度稀释，使浓度依次为1×1010-1×102拷贝/μL，以此作为标准品模板用于qPCR反应进行敏感性测试，每个样品设置3个重复。通过对阳性质粒pMGF_505-2R各稀释度样品进行荧光PCR检测。
结果显示：该方法Ct>＝40时将不准确，因此将Ct<40对应的基因组拷贝数作为该方法可检测的范围，因此，该方法最低可检测到356个病毒核酸分子拷贝数，见图1，具有较高的灵敏性。
重复性实验结果显示，取约8×107拷贝/μL的阳性质粒在1次实验中重复30次，重复实验3次，通过组内和组间的Ct值变异系数(标准偏差/重复值平均数)来评估该方法的重复性，结果显示同一次实验内30个平行样品扩增曲线在阈值线附近基本重合(图2)，组间及组内变异系数均小于5％，表明具有较高的稳定性和重复性，可用于非洲猪瘟病毒基因组DNA的检测。
实施例3
检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的试剂盒的检测方法的流程及结果判定(图3)，包括以下步骤：
(1)取待检样品提取基因组
(2)采用荧光PCR进行检测：
荧光PCR反应体系为Mix 5μL、ROX 0.2μL、10μM的荧光PCR引物各0.25μL、10μM的荧光PCR探针0.1μL、DNA模板2μL、补水至10μL；
荧光PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s、50℃退火10s，60℃延伸30s，45个循环，于60℃时采集荧光信号；
(3)检测结果判定：
若Ct<40时为阳性，表明样品中含有野毒。且Ct值越低，野毒的病毒含量越高；若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明样品中不含有野毒或野毒含量极低至无法检测到；进一步检测：基于p72的荧光PCR为阳性，则表明样品中含有的病毒为MGF360-505R缺失弱毒疫苗毒株。
实施例4
检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的试剂盒应用于临床样品的检测：
将10份感染非洲猪瘟的临床阳性样品(血清4份，组织样6份)的基因组(非洲猪瘟病毒P72荧光PCR检测为阳性)、10份临床健康猪组织样品(血清4份，组织样6份)、猪伪狂犬病病毒、猪蓝耳病病毒感染的猪组织样品各3份，应用荧光PCR进行检测。
该荧光PCR的反应体系为Mix 5μL、ROX 0.2μL、10μM的荧光PCR引物引物各0.25μL、10μM的荧光PCR探针0.1μL、DNA模板2μL、补水至10μL；
荧光PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s、50℃退火10s，60℃延伸30s，45个循环，于60℃时采集荧光信号；
应用本荧光PCR的检测结果表明，所有非洲猪瘟感染阳性样品检测的Ct均<25；而所有健康猪组织样品检测的Ct均>42或无明显扩增曲线；猪伪狂犬病病毒、猪蓝耳病病毒感染的猪组织样品应用本荧光PCR进行检测的Ct均>40。表明该方法可用于非洲猪瘟病毒野毒的检测。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 1
tctgcgtcaa ctaccycg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 2
atmgtcytya ctttcrtc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 3
taaactactc cgtgaaac 18
<210> 5
<211> 258
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(中国流行株Pig/CN/HLJ/2018)
<400> 5
tctgcgtcaa ctacctcgta aacatattga aaaacttttg ttgctggccg tgcaggaaaa 60
ggcttctaaa aaaacattga acttactgtt gtcacattta aactactccg tgaaacgcat 120
caaaaaacta ccgcgctatg tgatagagta cgagtccacc ttggtgataa agattttatt 180
aaaaaaaaga gtgaacctga tagatgccat gttggaaaag atggtaagat atttttctgc 240
gacgaaagtg aggacgat 258

Claims (5)

1.一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合，其特征在于：它包括荧光PCR特异性引物和荧光PCR探针；所述荧光PCR特异性引物的核苷酸序列为：
荧光PCR引物为：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，
下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，
Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。
3.一种检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述荧光PCR引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括qPCR Probe MasterMix。
5.利用权利要求3所述试剂盒检测非洲猪瘟病毒野生型毒株的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)建立标准曲线
a.标准品的制备：
以非洲猪瘟病毒基因组DNA为模板，使用下述PCR引物：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，
下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，
Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的序列如SEQ ID NO：4所示，再将PCR产物与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒pMGF_505-2R，即为标准品；
b.标准曲线的建立
将阳性质粒制作成标准品模板，应用荧光PCR进行检测(引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，Y为C/T；M为A/C，R为A/G；荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团)；并利用基因组拷贝数的Lg值与检测的Ct值的函数关系，建立标准曲线：
Lg＝-0.2449x+12.348，R2＝0.9972，其中，Y为Lg值；x为Ct值；
2)待检测样品检测
a.荧光PCR
收集待检测样品并提取其基因组；使用下述荧光PCR引物和探针：
上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，Y为C/T；M为A/C，R为A/G；
荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团
进行荧光PCR扩增，采集荧光信号得到Ct；
b.检测结果判定
若Ct<40时为阳性，表明该待检测样品中含有非洲猪瘟病毒野生型毒株；将待测样品的Ct值带入标准工作曲线中，即判断待检测样品中非洲猪瘟病毒野生型毒株的病毒含量；
或，若Ct>＝40或无扩增曲线时，表明该待检测样品中不含有野毒或野毒含量极低至无法检测到。
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