CN113604607A - 快速检测猫疱疹病毒的era核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法 - Google Patents

快速检测猫疱疹病毒的era核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法，它可有效扩增靶基因。敏感性能够检测到7.86 × 101copies/μL；特异性强，无交叉反应；重复性好，组内和组间变异系数均小于5%。本发明的ERA等温扩增体系，反应迅速，温度范围广，在37~40℃均能有效扩增靶基因，但在37℃反应30 min扩增效果最佳。本发明的扩增试剂盒能够快速、高效、灵敏地检测猫疱疹病毒，具有操作简单、特异性强、安全无污染等特点，且反应结果易于观察，不仅对现地快速检测筛查猫疱疹病毒提供了有效的技术手段，而且对防控由FHV带来的对宠物及虎、豹等猫科类动物行业的经济损失具有重要意义。

Description

快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒及制备方 法和检测方法
技术领域
本发明设计快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法。
背景技术
猫传染性鼻气管炎（feline infectious rhinotracheitis）是由猫疱疹病毒１型（feline herpesvirus-1, FHV-1）引起的一种以上呼吸道症状为主的急性、高度接触性传染病。FHV-1主要感染猫，可以引起体温升高、精神沉郁、厌食、咳嗽、打喷嚏等临床症状。临床上幼猫发病率为100%，致死率高达50%。虽然猫是本病毒的自然宿主，但近年来常有印度豹、虎等猫科类动物感染FHV-1的报道。FHV-1是猫上呼吸道感染和眼部损伤的最主要病原之一，常与猫杯状病毒混合感染，也可引起细菌的继发感染，严重威胁着猫科类动物的健康，给疾病的防控带来极大的困难。目前，FHV的检测方法主要有核酸检测、病毒分离鉴定、免疫荧光检测及抗体检测等，这些都需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员进行操作，不能满足非实验室等基层现场条件下的检测要求。
发明内容
本发明提供了快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法，它能够快速、高效、灵敏地检测猫疱疹病毒，具有操作简单、特异性强、安全无污染，且反应结果易于观察，不仅对现地快速检测筛查猫疱疹病毒提供了有效的技术手段，而且有效地防控由FHV带来的对宠物及虎、豹等猫科类动物的影响。
本发明采用了以下技术方案：快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，它包括以下试剂：a、包含快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对及探针；b、含猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品；c、等温核酸扩增试剂盒和快速检测所用的试纸条；d、所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂和ddH2O。
所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对包括上游引物和下游引物，
上游引物：
ERA-F：5’-TTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGC-3’，
下游引物：
ERA-R：5’-Biotin-TACAGACCCAAGAGTCATATCACCCACAAAAT-3’。
所述的探针为探针：
Probe：
5’-FAM-GTATCTATGCCGTCCAGGACCGGAAACGACGT[THF]GTGAATTATCAGCTG-C3Spacer-3’。
本发明还公开了快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，扩增引物对及探针的制备：在下游引物5’端偶联上生物素；探针5’端偶联上FAM基团，中间位置采用THF（四氢呋喃）替代一个碱基，3’端用C3-间臂基团处理；步骤二，核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、ddH2O，为商品化制备；步骤三，所用的快速检测试纸条：含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体及金标颗粒；步骤四，所述的猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品均为临床检测获得的样品。
本发明还公开了快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的检测方法，其特征是它包括以下步骤：
步骤一，在ERA冻干酶粉中加入20 μL溶解剂，上游引物10 μm和下游引物10 μm各为2.1 μL，探针10 μm为0.6 μL，模板2~10 μL，ddH2O 补充至48 μL，振荡混匀并短暂离心；在反应盖上加2 μL激活剂，短暂离心后37 ℃反应30 min。
步骤二，检测：将步骤一中的反应产物用试纸条检测，2~3 min观察结果；
步骤三，对步骤二中产生的结果判读：采用肉眼观察，
a、阴性：仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带，表明待检样本无猫疱疹病毒感染；
b、阳性：在质控线和检测线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫疱疹病毒感染；
c、无效：在质控线和检测线均无红色条带，表明试纸条失效。
步骤四，使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为35-40℃的水浴锅中进行，反应时间为30 min；反应结束后用横向流动试纸条对扩增产物进行检测；
步骤五，针对的是猫疱疹病毒的TK基因保守区域设计并合成的扩增引物对及探针，与普通PCR引物设计不同，ERA的引物长度为30-35 bp，探针长度为46-52 bp；引物设计时为了避免引物对之间及引物与探针之间形成二聚体结构，因其序列长度的增加也使引物设计及选择的难度增加。
所述的步骤四中使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为37℃的水浴锅。
本发明具有以下有益效果：采用本发明建立的快速检测猫疱疹病毒的ERA与试纸条结合的方法，通过灵敏性、特异性及重复性评价，可用于现地检测，为猫疱疹病毒的现地检测提供了一种灵敏、可靠的新方法；本发明的引物及探针组合是从靶标序列的两端设计多对引物进行优化、筛选得到的。采用本发明的引物和探针组合，可有效扩增靶基因，通过ERA技术对猫疱疹病毒的快速检测方法具有灵敏性高、特异性强和重复性好等优点；本发明设计及选用的猫疱疹病毒TK基因保守区域的引物及探针组合，特异性高，与猫细小病毒、猫杯状病毒以及猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应；组内和组间变异系数均小于5%，ERA方法能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平，本发明的最低检测限为7.86 ×101copies/μL，重复性好，组内和组间变异系数均小于5%。本发明采用ERA技术结合横向流动试纸条检测猫疱疹病毒的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏度、高通量，又具有免疫学检测的特异性强、操作简单等优点。本发明不需要复杂的仪器设备，适用于现地检测，可以在37 ℃条件下进行扩增反应，试纸条可视化检测，不需要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等仪器设备。本发明检测速度快：ERA与普通PCR相比，不用经过变性、退火、延伸三个步骤，ERA等温扩增体系，反应迅速，温度范围广，在37~40 ℃下可有效扩增靶基因，本发明的最适温度是37 ℃，反应30 mim即可完成反应， 本发明的扩增试剂盒能够快速、高效、灵敏地检测猫疱疹病毒，具有操作简单、特异性强、安全无污染等特点，且反应结果易于观察，不仅对现地快速检测筛查猫疱疹病毒提供了有效的技术手段，而且对防控由FHV带来的对宠物及虎、豹等猫科类动物行业的经济损失具有重要意义。
附图说明
图1为本发明猫疱疹病毒ERA凝胶检测体系的建立及初步筛选引物结果图(M: DNA2000 Marker，1-12分别表示F1R1~F1R4,F2R1~ F2R4,F3R1~F3R4，NC1-12表示相应的阴性对照)。
图2为本发明猫疱疹病毒ERA凝胶检测体系的建立及确定最佳引物结果图(M: DNA2000 Marker，1-7分别表示F1R1~F1R3,F2R1~F2R3,F3R3，NC1-7表示相应的阴性对照）。
图3为本发明猫疱疹病毒ERA-LFD体系建立及探针筛选结果图（PC1-3为Probe1，PC4-6为Probe2，PC7-9为Probe3，NC1-3分别为Probe1、Probe2、Probe3；）。
图4为本发明猫疱疹病毒ERA-LFD反应检测最佳温度确立的结果图（其中1-4分别表示37-40 ℃，NC1-4为相应的阴性对照）。
图5为本发明猫疱疹病毒ERA-LFD检测条件时间优化的结果图（1:10 min，2:15min，3:20 min，4:25 min，5:30 min，6:35 min，7:40 min，NC1-7分别表示相应的阴性对照）。
图6为本发明的特异性结果图（从左到右依次为模板FPV、FCV、FIPV、FHV的ERA-LFD的反应产物，最后一个为阴性对照）。
图7为本发明猫疱疹病毒ERA-LFD试纸条检测的敏感性结果图（1-10分别表示质粒标准品的浓度7.86 × 109copies/μL~7.86 × 100copies/μL，11：阴性对照）。
图8为本发明猫疱疹病毒普通PCR凝胶电泳检测敏感性结果图（M：DNA2000Marker，1-10分别表示质粒标准品的浓度7.86 × 109copies/μL~7.86 × 100copies/μL，11：阴性对照）。
图9为本发明FHV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的灵敏度分析结果图（1-8分别表示质粒标准品的浓度7.86 × 107copies/μL~7.86 × 100copies/μL，9：阴性对照）。
具体实施方式
快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，它包括以下试剂：a、包含快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对及探针；b、含猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品；c、等温核酸扩增试剂盒和快速检测所用的试纸条；d、所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂和ddH2O。
所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对包括上游引物和下游引物，
上游引物：
ERA-F：5’-TTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGC-3’，
下游引物：
ERA-R：5’-Biotin-TACAGACCCAAGAGTCATATCACCCACAAAAT-3’。
所述的探针为探针：
Probe：
5’-FAM-GTATCTATGCCGTCCAGGACCGGAAACGACGT[THF]GTGAATTATCAGCTG-C3Spacer-3’。
本发明还公开了快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，扩增引物对及探针的制备：在下游引物5’端偶联上生物素；探针5’端偶联上FAM基团，中间位置采用THF（四氢呋喃）替代一个碱基，3’端用C3-间臂基团处理；步骤二，核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、ddH2O，为商品化制备；步骤三，所用的快速检测试纸条：含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体及金标颗粒；步骤四，所述的猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品均为临床检测获得的样品。
本发明还公开了快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的检测方法，其特征是它包括以下步骤：
步骤一，在ERA冻干酶粉中加入20 μL溶解剂，上游引物10 μm和下游引物10 μm各为2.1 μL，探针10 μm为0.6 μL，模板2~10 μL，ddH2O 补充至48 μL，振荡混匀并短暂离心；在反应盖上加2 μL激活剂，短暂离心后37 ℃反应30 min。
步骤二，检测：将步骤一中的反应产物用试纸条检测，2~3 min观察结果；
步骤三，对步骤二中产生的结果判读：采用肉眼观察，
a、阴性：仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带，表明待检样本无猫疱疹病毒感染；
b、阳性：在质控线和检测线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫疱疹病毒感染；
c、无效：在质控线和检测线均无红色条带，表明试纸条失效。
步骤四，使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为35-40℃的水浴锅中进行，反应时间为30 min；反应结束后用横向流动试纸条对扩增产物进行检测；
步骤五，针对的是猫疱疹病毒的TK基因保守区域设计并合成的扩增引物对及探针，与普通PCR引物设计不同，ERA的引物长度为30-35 bp，探针长度为46-52 bp；引物设计时为了避免引物对之间及引物与探针之间形成二聚体结构，因其序列长度的增加也使引物设计及选择的难度增加。
所述的步骤四中使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为37℃的水浴锅。
下面通过实验进一步说明本发明。
一、猫杯状病毒ERA检测引物、探针及其检测方法的建立
1、针对GenBank中猫疱疹病毒的TK基因保守区域，根据ERA引物及探针设计原则，设计的引物及探针如下表（表1）。
ERA所用候选引物及探针（表1）
Figure 282986DEST_PATH_IMAGE002
2、猫疱疹病毒ERA凝胶体系的建立及引物筛选
用Fine Quick快速病毒DNA/RNA柱式提取试剂盒提取目的基因，构建重组质粒，用基础型核酸扩增试剂盒筛选最佳引物对。
1）初步引物筛选：模板浓度均为7.86 × 105copies/μL分为3组，第一组以F1为上游引物，R1-R4为下游引物；第二组以F2为上游引物，R1-R4为下游引物；第三组以F3为上游引物，R1-R4为下游引物。反应结束后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃掉下游引物R4、F3R1及F3R2引物对，如图1。
2）最佳引物筛选：模板浓度均为7.86 × 105copies/μL，在初步引物筛选的基础上，分为3组：第一组以F1为上游引物，R1-R3为下游引物；第二组以F2为上游引物，R1-R3为下游引物；第三组以F3为上游引物，R3为下游引物。反应结束后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，最终确定最佳引物对F1R3，如图2。
综合以上结果，确定ERA凝胶反应体系最佳引物对为F1R3。
上游引物F1：5’-TTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGC-3’。
下游引物R3：5’-TACAGACCCAAGAGTCATATCACCCACAAAAT-3’。
3、FHV ERA-LFD试纸条检测体系的建立，具体操作步骤如下：
1）在已确定的下游引物R3的5’端添加Biotin基团并合成，即5’-Biotin-
TACAGACCCAAGAGTCATATCACCCACAAAAT-3’；
2）以病毒DNA为阳性对照，以ddH2O为阴性对照，分别加入下列组分：20 μL溶解剂，2.1 μL上游引物（10 μm）和2.1 μL下游引物（10 μm），0.6 μL探针（10 μm），2~10 μL模板，ddH2O补充至48 μL；
3）将48 μL反应混合液转移到含有冻干酶粉的0.2 mL的反应管中，振荡混匀并短暂离心；
4）在每个反应盖上加2 μL激活剂离心混匀后，37 ℃水浴锅中反应30 min；
5）反应结束后，吸取5 μL反应产物加入到295 μL的试纸条缓冲液中，用移液枪吹打混匀后，取80 μL至新的1.5 mL离心管中，将试纸条插入其中，等待2~3 min，通过试纸条的显色来进行判读。通过对检测样品是否出现假阳性以及阳性样品检测出现条带颜色的深浅来选择所用的探针，如图3。
4、FHV ERA检测条件的优化
1）ERA方法最佳反应温度的确立：反应时间一定，通过在不同的温度条件下进行反应，结果表明最佳反应温度为37 ℃，如图4。
2）ERA方法最佳反应时间的确立：通过在37 ℃反应不同时间，结果表明，最佳反应时间为30 min，如图5。
二、FHV ERA-LFD特异性分析
样品分别为猫细小病毒（FPV）、猫杯状病毒（FCV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）、猫疱疹病毒（FHV）。反应体系如具体步骤所示，反应条件为确定的优化条件，反应结束后用试纸条进行检测。结果显示为，以FHV为模板的ERA-LFD出现两条红色条带，一条位于检测线（T），一条位于质控线（C）；以FPV、FCV、FIPV为模板的ERA-LFD出现一条红色条带，仅位于质控线（C）。如图6所示，结果表明该检测体系特异性良好，能够特异性检测到猫疱疹病毒。
三、ERA-LFD灵敏度分析及其与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的灵敏度比较
1、标准品的制备
设计包含检测片段的引物对FHV TK基因保守区域进行扩增，对目的条带大小的产物进行DNA 凝胶回收（操作见试剂盒说明书），得到的目的片段与pMD18-T载体进行连接、DH5α感受态细胞内转化、质粒小剂量提取并鉴定。实验中的用以制备标准质粒的A260/A280的 OD 值需在1.8～2.0，并测定其浓度。
将合格的质粒标准品进行10倍比稀释，依次获得7.86 × 109copies/μL、7.86 ×108copies/μL、7.86 × 107copies/μL……直到7.86 × 100copies/μL的质粒标准品。
吸取上述标准质粒各稀释度2µl为模板，按照最优化条件进行反应，依次将7.86× 109copies/μL、7.86 × 108copies/μL、7.86 × 107copies/μL……直到7.86 ×100copies/μL的质粒标准品，阴性对照为模板，如图7，同时对各拷贝数为模板普通PCR反应后的产物进行凝胶电泳，可以看出普通PCR的灵敏度为7.86 × 102copies/μL，如图8。
2、FHV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的灵敏度分析
采用文献报道的引物（3种猫疱疹病毒Ⅰ型检测方法的比较），并对反应条件进行了探索，最终确定为 95℃ 30s; 95℃10s, 57℃ 30s, 40个循环；95℃15s, 60℃ 1min，95℃15s。反应体系为：上、下游引物0.4μl, 2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL, DEPC水 7.2µl, 模板（7.86 × 107copies/μL、7.86 × 100copies/μL）2µl。结果显示，FHV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测灵敏度为7.86 × 101copies/μL，如图9所示。
四、FHV ERA-LFD重复性分析
以三个浓度的质粒标准品为模板，每个浓度做3个重复孔，进行组内重复试验；同时每个浓度分别做3次独立的重复性检测作为组间重复试验。组内和组间试验的变异系数CV均小于5%，如表2，表明本试验的重复性和稳定性较好。
表2 ERA-LFD重复性分析结果：
Figure 200126DEST_PATH_IMAGE004
五、临床样品检测
从哈尔滨某猫舍采取的30份疑似患FHV的猫眼拭子，采用ERA-LFD方法进行检测，结果阳性数为6，阴性数为24。
相比于普通PCR和实时荧光定量PCR方法，本研究操作简单，反应时间短，不需要复杂的仪器设备；对操作人员的技术要求不高。同时本研究更适用于猫疱疹病毒的现地检测，能够快速、准确、便捷的检测和预防猫疱疹病毒，可广泛应用于实验条件及仪器设备较差的区域。
本实验采用的相关材料和试剂等均为商业途径得到；基础型核酸扩增试剂盒、试纸型核酸扩增试剂盒均来自苏州先达基因科技有限公司，引物和探针均来自吉林库美生物科技有限公司，试纸条来自南京钟鼎生物技术有限公司，Fine Quick快速病毒DNA/RNA柱式提取试剂盒来自济凡生物科技有限公司产品，定量试验，均作3个复孔，结果取算数平均值，猫疱疹病毒的序列信息已在NCBI上公开，对其TK基因保守区域所在序列进行扩增，并进行了亚克隆。

Claims (6)

1.快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征是它包括以下试剂：
a、包含快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对及探针；
b、含猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品；
c、等温核酸扩增试剂盒和快速检测所用的试纸条；
d、所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂和ddH2O。
2.根据权利要求1所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征是所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对包括上游引物和下游引物，
上游引物：
ERA-F：5’-TTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGC-3’，
下游引物：
ERA-R：5’-Biotin-TACAGACCCAAGAGTCATATCACCCACAAAAT-3’。
3.根据权利要求1所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征是所述的探针为探针：
Probe：
5’-FAM-GTATCTATGCCGTCCAGGACCGGAAACGACGT[THF]GTGAATTATCAGCTG-C3 Spacer-3’。
4.快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的制备方法，其特征是它包括以下步骤：
步骤一，扩增引物对及探针的制备：在下游引物5’端偶联上生物素；探针5’端偶联上FAM基团，中间位置采用THF（四氢呋喃）替代一个碱基，3’端用C3-间臂基团处理；
步骤二，核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、ddH2O，为商品化制备；
步骤三，所用的快速检测试纸条：含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体及金标颗粒；
步骤四，所述的猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品均为临床检测获得的样品。
5.快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的检测方法，其特征是它包括以下步骤：
步骤一，在ERA冻干酶粉中加入20 μL溶解剂，上游引物10 μm和下游引物10 μm各为2.1μL，探针10 μm为0.6 μL，模板2~10 μL，ddH2O 补充至48 μL，振荡混匀并短暂离心；在反应盖上加2 μL激活剂，短暂离心后37 ℃反应30 min；
步骤二，检测：将步骤一中的反应产物用试纸条检测，2~3 min观察结果；
步骤三，对步骤二中产生的结果判读：采用肉眼观察，
a、阴性：仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带，表明待检样本无猫疱疹病毒感染；
b、阳性：在质控线和检测线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫疱疹病毒感染；
c、无效：在质控线和检测线均无红色条带，表明试纸条失效；
步骤四，使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为37-40 ℃的水浴锅中进行，反应时间为30 min；反应结束后用横向流动试纸条对扩增产物进行检测；
步骤五，针对的是猫疱疹病毒的TK基因保守区域设计并合成的扩增引物对及探针，与普通PCR引物设计不同，ERA的引物长度为30-35 bp，探针长度为46-52 bp；引物设计时为了避免引物对之间及引物与探针之间形成二聚体结构，因其序列长度的增加也使引物设计及选择的难度增加。
6.根据权利要求5所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的检测方法，其特征是所述的步骤四中使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为37℃的水浴锅。
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