CN112921123B - 快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒，涉及一种猫杯状病毒的检测方法及检测用引物和试剂盒。本发明保护上游引物ERA‑F、下游引物ERA‑R、探针Probe。试剂盒包含上述的引物及探针、阳性对照样品、等温核酸扩增试剂盒和试纸条。检测方法：一、配置检测溶液；二、用试纸条检测步骤一反应产物，获得检测结果。本发明采用引物和探针组合的方式，通过RT‑ERA技术对猫杯状病毒进行快速检测。本发明的引物和探针组合是针对猫杯状病毒ORF1保守区域设计，具有灵敏性高、特异性强和重复性好等优点，与猫疱疹病毒、猫细小病毒以及猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应。

Description

快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种猫杯状病毒的检测方法及检测用引物和试剂盒。

背景技术

猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)是引起猫呼吸系统疾病的高度流行病原体，常感染一岁以下的幼猫，猫感染FCV后通常会引起的临床表现为口腔溃疡、发热、打喷嚏、鼻炎、结膜炎，非典型症状可引起跛行、腹泻或致死性全身性疾病(Virulent SystemicDisease，VSD)。临床病猫康复后以及无症状携带者仍可长期排毒，有利于FCV在猫群中的扩散，是重要的传染源。

目前，FCV的检测方法有血清学检测法和病毒学检测法，血清学检测包括血清中和试验、琼脂扩散试验、免疫荧光或酶联免疫法等，这些方法相对耗时。病毒检测法，包括电镜检查、RT-PCR、荧光定量RT-PCR及抗原捕获胶体金检测方法等，；但是由于猫杯状病毒属于RNA病毒，具有高度变异性，制备的单克隆抗体无法具有通用性，抗原捕获胶体金检测方法多存在假阴性；RT-PCR、荧光定量RT-PCR等方法，都需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员进行操作，不能满足非实验室等基层现场条件下的检测要求。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒。

快速检测猫杯状病毒的引物及探针的上游引物ERA-F的序列为：5'-GTCTCAAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAAC-3'；

快速检测猫杯状病毒的下游引物ERA-R的序列为：5’-Biotin-ACTTAGGACATACATCATAACTAGCACAAG-3’；

快速检测猫杯状病毒的探针Probe的序列为：5’-FAM-AAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAACTCACA[THF]TGTCCGTAAGGACTT-C3Spacer-3’。

快速检测猫杯状病毒的RT-ERA核酸试纸条扩增试剂盒包含上述的引物及探针、阳性对照样品、等温核酸扩增试剂盒和试纸条；

其中，阳性对照样品中含猫杯状病毒ORF1区域RNA序列；

等温核酸扩增试剂盒中包括重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、RNA酶抑制剂和RNase-free H₂O。

快速检测猫杯状病毒的方法：

一、在离心管中配置下列溶液：15μL溶解剂、2.1μL上游引物ERA-F、2.1μL下游引物ERA-R、0.6μL探针Probe、0.5μL RNA酶抑制剂和2～6μL待测样品，RNase-free H₂O补充至48μL，振荡混匀并离心；将上述48μL的混合溶液转移至含有重组酶冻干酶粉的反应管中，振荡混匀直至完全溶解，再在反应盖上加2μL激活剂，离心5～6s后，40℃水浴锅中反应30min；

二、用试纸条检测步骤一反应产物，获得检测结果；

①阴性：仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带，表明待检样本无猫杯状病毒感染；

②阳性：在质控线和检测线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫杯状病毒感染；

③无效：在质控线和检测线均无红色条带，表明试纸条失效。

本发明引物设计与普通PCR引物设计不同，RT-ERA的引物长度为30～35bp，探针长度为46～52bp；由于引物要避免引物对之间及引物与探针之间形成二聚体结构，所以引物和探针序列长度的增加，大幅增加了引物和探针的设计难度。

本发明快速检测猫杯状病毒的方法将RT-ERA技术与试纸检测技术相结合，兼具分子生物学检测的高灵敏度、高通量，以及免疫学检测的特异性强、操作简单的优点。本发明方法可用于现地检测，不需要复杂的仪器设备(无需PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等仪器设备)，可以在40℃条件下进行扩增反应，试纸条可视化检测，为猫杯状病毒的现地检测提供了一种快速、可靠的新方法。

本发明采用引物和探针组合的方式，通过RT-ERA技术对猫杯状病毒进行快速检测。本发明的引物和探针组合是针对猫杯状病毒ORF1保守区域设计，具有灵敏性高、特异性强和重复性好等优点，与猫疱疹病毒、猫细小病毒以及猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应。本发明检测方法能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平，最低检测限为RNA相当于3.2×10⁰TCID₅₀。

附图说明

图1是实施例2本发明检测方法特异性实验结果图，图中试纸条所检测样品从左到右依次为FHV、FPV、FIPV、FCV和阴性对照；

图2是实施例2本发明检测方法敏感性实验结果图，图中1号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10⁷TCID₅₀，2号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10⁶TCID₅₀，3号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10⁵TCID₅₀，4号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10⁴TCID₅₀，5号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10³TCID₅₀，6号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10²TCID₅₀，7号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10¹TCID₅₀，8号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10⁰TCID₅₀，9号试纸条检测的RNA浓度为3.2×10^-1TCID₅₀，10号试纸条检测样品为阴性；

图3是实施例2中采用FCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法检测猫杯状病毒的敏感性实验结果图，图中1号检测的RNA浓度为3.2×10⁶TCID₅₀，2号检测的RNA浓度为3.2×10⁵TCID₅₀，3号检测的RNA浓度为3.2×10⁴TCID₅₀，4号检测的RNA浓度为3.2×10³TCID₅₀，5号检测的RNA浓度为3.2×10²TCID₅₀，6号检测的RNA浓度为3.2×10¹TCID₅₀，7号检测的RNA浓度为3.2×10⁰TCID₅₀，8号检测的RNA浓度为3.2×10^-1TCID₅₀，9号检测样品为阴性；

图4是实施例4中阳性病料病毒分离盲传5代，出现病变的CRFK细胞；

图5是正常的CRFK细胞。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式快速检测猫杯状病毒的引物及探针的上游引物ERA-F的序列为：5'-GTCTCAAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAAC-3'；

快速检测猫杯状病毒的下游引物ERA-R的序列为：5’-Biotin-ACTTAGGACATACATCATAACTAGCACAAG-3’；

快速检测猫杯状病毒的探针Probe的序列为：5’-FAM-AAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAACTCACA[THF]TGTCCGTAAGGACTT-C3Spacer-3’。

本发明在下游引物的5’端偶联生物素(Biotin)；在探针的5’端偶联FAM基团，在探针序列的中间位置用四氢呋喃(THF)替代一个碱基，并在探针的3’端用C3-间臂基团处理。

具体实施方式二：本实施方式快速检测猫杯状病毒的RT-ERA核酸试纸条扩增试剂盒包含具体实施方式一所述的引物及探针、阳性对照样品、等温核酸扩增试剂盒和试纸条；

其中，阳性对照样品中含猫杯状病毒ORF1区域RNA序列；

等温核酸扩增试剂盒中包括重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、RNA酶抑制剂和RNase-free H₂O。

本发明中以RNase-free H₂O作为阴性对照样品。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：所述的试纸条含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体和金标颗粒。其它步骤及参数与实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式快速检测猫杯状病毒的方法：

一、在1.5mL离心管中配置下列溶液：15μL溶解剂、2.1μL上游引物ERA-F、2.1μL下游引物ERA-R、0.6μL探针Probe、0.5μL RNA酶抑制剂和2～6μL待测样品，RNase-free H₂O补充至48μL，振荡混匀并离心；将上述48μL的混合溶液转移至含有重组酶冻干酶粉的0.2mL反应管中，振荡混匀直至完全溶解，再在反应盖上加2μL激活剂，短暂离心5～6s后，40℃水浴锅中反应30min；

二、用试纸条检测步骤一反应产物，3～5min获得检测结果；

步骤一反应体系中上游引物、下游引物、探针的含量均为10μmol。

检测结果阴性：检测试纸仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带。表明待检样本无猫杯状病毒感染。

检测结果阳性：检测试纸在质控线和检测线均有一条红色条带。表明待检样本中有猫杯状病毒感染。

检测结果无效：检测试纸在质控线和检测线均无红色条带。表明试纸条失效。

与普通PCR相比，本发明方法不用经过变性、退火、延伸三个步骤，在40℃可有效扩增，反应30mim即可完成反应。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点是：所述的试纸条含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体和金标颗粒。其它步骤及参数与实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五的不同点是：加入激活剂离心后40℃反应30min。其它步骤及参数与实施方式四或五相同。

实施例1

快速检测猫杯状病毒的方法：

一、在1.5mL离心管中配置下列溶液：15μL溶解剂、2.1μL上游引物ERA-F、2.1μL下游引物ERA-R、0.6μL探针Probe、0.5μL RNA酶抑制剂和2～6μL待测样品，RNase-free H₂O补充至48μL，振荡混匀并离心；将上述48μL的混合溶液转移至含有重组酶冻干酶粉的0.2mL反应管中，振荡混匀直至完全溶解，再在反应盖上加2μL激活剂，短暂离心5～6s后，40℃水浴锅中反应30min；并以猫杯状病毒RNA为阳性对照样品，以RNase-free H₂O作为阴性对照样品，同步检测；

二、吸取5μL步骤一反应产物加入到295μL的试纸条缓冲液中，用移液枪吹打混匀后，再从中吸取60μL加入到90μL新试纸条缓冲液中吹打混匀后取80μL至新的1.5mL离心管中，然后将试纸条插入其中，等待3～5min，即可获知检测结果；

其中，上游引物ERA-F的序列为：5'-GTCTCAAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAAC-3'；

快速检测猫杯状病毒的下游引物ERA-R的序列为：5’-Biotin-ACTTAGGACATACATCATAACTAGCACAAG-3’；

快速检测猫杯状病毒的探针Probe的序列为：5’-FAM-AAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAACTCACA[THF]TGTCCGTAAGGACTT-C3Spacer-3’。

检测结果：

阴性：检测试纸仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带。表明待检样本无猫杯状病毒感染。

阳性：检测试纸在质控线和检测线均有一条红色条带。表明待检样本中有猫杯状病毒感染。

无效：检测试纸在质控线和检测线均无红色条带。表明试纸条失效。

实施例2

采用实施例1的检测方法对猫疱疹病毒(FHV)、猫细小病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫杯状病毒(FCV)样品分别进行检测。

检测结果如图1所示，猫杯状病毒(FCV)样品检测试纸条出现两条红色条带，一条位于检测线(T)，一条位于质控线(C)；猫疱疹病毒(FHV)、猫细小病毒(FPV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)样品检测试纸条只出现一条红色条带，仅位于质控线(C)。实验结果表明本发明检测方法特异性良好，能够特异性检测到猫杯状病毒。

实施例3

从3.16×10⁸TCID₅₀/0.1mL的FCV中提取RNA，用40μL Elution Buffer洗脱，得到的RNA相当于1.6×10⁷TCID₅₀/μL，然后用RNase-free H₂O 10倍比稀释，即1.6×10⁶TCID₅₀/μL～1.6×10^-1TCID₅₀/μL。分别吸取2μL的各浓度梯度的RNA作为检测样品，采用实施例1的方法进行检测(同时设置阴性对照)。

检测结果如图2所示，结果显示，本发明方法的检测灵敏度为3.2×10⁰TCID₅₀。

对比实验：采用FCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法检测猫杯状病毒。

从3.16×10⁸TCID₅₀/0.1mL的FCV中提取RNA，用40μL Elution Buffer洗脱，得到的RNA相当于1.6×10⁷TCID₅₀/μL，然后用RNase-free H₂O 10倍比稀释，即1.6×10⁶TCID₅₀/μL～1.6×10^-1TCID₅₀/μL；分别以各浓度梯度的RNA反转录得到的cDNA作为样品模板。RT-PCR反应体系为2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL、上游引物ERA-F(10μm)和下游引物ERA-R(10μm)各0.2μL、样品模板5μL、DEPC水补充至20μL。RT-PCR反应条件为95℃30s；40个循环：95℃10s，57℃30s,；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

对比实验检测结果如图3所示，FCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度为3.2×10⁰TCID₅₀～3.2×10¹TCID₅₀。

实施例3

采用实施例1的方法进行检测，以猫杯状病毒(FCV)RNA标准品为基础，令每批检测样品中的RNA质量不同(分别为10ng、10^-3ng、10^-5ng)，RNA的每个质量做3个重复孔，进行组内重复试验；同时每个质量分别做3次独立的重复性检测作为组间重复试验。

检测结果如表1所示，组内和组间试验的变异系数CV均小于7％，表明本试验的重复性和稳定性较好。

表1

实施例4

从哈尔滨某猫舍采取的23份疑似患FCV的猫口腔拭子，采用实施例1的方法进行检测，结果阳性数为14，阴性数为9。

对实施例1方法检测为阳性的病料随机选择4份，进行病毒分离，盲传5代待CRFK细胞出现病变(如图4所示)，进行RT-PCR扩增并测序，测序结果经Blast比对后证实为FCV。正常的CRFK细胞如图5所示。

相比较于普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法，本发明方法操作简单，反应时间短，不需要复杂的仪器设备；对操作人员的技术要求不高。同时本发明方法更适用于猫杯状病毒的现地检测，能够快速、准确、便捷的检测和预防猫杯状病毒，可广泛应用于实验条件及仪器设备较差的区域。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctcaaact ctgagcttcg tgcttaaaac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acttaggaca tacatcataa ctagcacaag 30

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_binding

<222> (30)..(30)

<223> THF

<400> 3

aaactctgag cttcgtgctt aaaactcaca tgtccgtaag gactt 45

Claims (5)

1.快速检测猫杯状病毒的引物及探针，其特征在于快速检测猫杯状病毒的上游引物ERA-F的序列为：5'-GTCTCAAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAAC-3'；

快速检测猫杯状病毒的下游引物ERA-R的序列为：5’-Biotin-ACTTAGGACATACATCATAACTAGCACAAG-3’；

快速检测猫杯状病毒的探针Probe的序列为：5’-FAM-AAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAACTCACA[THF]TGTCCGTAAGGACTT-C3 Spacer-3’。

2.快速检测猫杯状病毒的RT-ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征在于该检测猫杯状病毒的RT-ERA核酸试纸条扩增试剂盒包含权利要求1所述的引物及探针、阳性对照样品、等温核酸扩增试剂盒和试纸条；

其中，阳性对照样品中含猫杯状病毒ORF1区域RNA序列；

等温核酸扩增试剂盒中包括重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、RNA酶抑制剂和RNase-free H₂O。

3.根据权利要求2所述的快速检测猫杯状病毒的RT-ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征在于所述的试纸条含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体和金标颗粒。

4.快速检测猫杯状病毒的方法，该方法为非疾病的诊断方法，其特征在于快速检测猫杯状病毒按以下步骤进行：

一、在离心管中配置下列溶液：15 μL溶解剂、2.1 μL上游引物ERA-F、2.1 μL下游引物ERA-R、0.6 μL探针Probe、0.5 μL RNA酶抑制剂和2~6 μL待测样品，RNase-free H₂O 补充至48 μL，振荡混匀并离心；将上述48 μL的混合溶液转移至含有重组酶冻干酶粉的反应管中，振荡混匀直至完全溶解，再在反应盖上加2 μL激活剂，离心5~6 s后，40℃水浴锅中反应30 min；

二、用试纸条检测步骤一反应产物，获得检测结果；

三、结果判读：直接肉眼观察

①阴性：仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带，表明待检样本无猫杯状病毒感染；

②阳性：在质控线和检测线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫杯状病毒感染；

③无效：在质控线和检测线均无红色条带，表明试纸条失效。

5.根据权利要求4所述的快速检测猫杯状病毒的方法，其特征在于所述的试纸条含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体和金标颗粒。

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