CN108913812B - 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建 - Google Patents

一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建 Download PDF

Info

Publication number
CN108913812B
CN108913812B CN201810806937.6A CN201810806937A CN108913812B CN 108913812 B CN108913812 B CN 108913812B CN 201810806937 A CN201810806937 A CN 201810806937A CN 108913812 B CN108913812 B CN 108913812B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tag
primer
pcr
upstream primer
downstream primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810806937.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108913812A (zh
Inventor
刘惠莉
陶洁
李本强
马玉飞
程靖华
石迎
饶柏钟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Academy of Agricultural Sciences filed Critical Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201810806937.6A priority Critical patent/CN108913812B/zh
Publication of CN108913812A publication Critical patent/CN108913812A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108913812B publication Critical patent/CN108913812B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建，根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，筛选出合适的TAG序列，偶联于微球；将TAG互补序列标记于各病原PCR引物的上游引物5’端，并在PCR引物的下游引物5’端标记生物素；然后利用修饰引物进行多重PCR扩增，将PCR扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，检测MFI值，根据MFI值判定检测结果阴性或阳性。该方法提高了检测的特异性和灵敏度，实现了对猪病毒性腹泻多重病原的定性定量检测，具有高通量、省时省力、特异性强、灵敏度高等诸多的优势，能满足同时进行多种病原检测的需求。

Description

一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建。
背景技术
由病毒引起的猪腹泻疫病流行范围广，仔猪发病率高，死亡率可高达100％。而且多病原感染、协同感染较为普遍。临床很难确定主要诱发病因，给诊断和控制带来困难。
引起猪腹泻的主要病毒有猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacorona virus，PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪捷申病毒(Porcineteschvirus，PTV)、牛病毒毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)、猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus，PSV)、猪嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)、猪星状病毒(Porcine astrovirus，PAstV)、猪环曲病毒(Porcine torovirus，PToV)、猪札幌病毒(Porcine Sapovirus，PSaV)等，这些病毒引起不成程度腹泻，在多个病原共同感染情况下，可导致严重腹泻及猪只死亡。
目前，关于猪病毒性腹泻病原的检测研究最多的是多重PCR方法，但大多是2重或3重PCR方法。焦洋等(猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立，动物医学进展，2013，34(08)：71-75)建立了针对PEDV、TGEV和PBoV的3重PCR检测方法。
陈小芬等(PEDV/TGEV/PDCoV快速检测方法的建立及PEDV COE基因和ORF3基因遗传变异研究，华南农业大学，2016.)针对PEDV、TGEV和PDCoV，建立了三重RT-PCR检测方法。
刘高鹏(多重PCR检测和鉴定五种猪腹泻病毒研究，浙江理工大学，2017)建立了针对PEDV、TGEV、猪轮状病毒A型(Porcine group A rotavi ruses,GAR)、猪轮状病毒C型(Porcine group C rotaviruses，GCR)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)的5重实时荧光定量PCR方法，检测172份临床样品，发现GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2阳性率分别为5.81％、2.32％、8.72％、20.92％和46.51％，总混合感染率为22.09％。
但是，这些现有技术中，常规单重RT-PCR能够检测低至0.1pg的病毒RNA，而多重RT-PCR随着检测病原数量的增加，灵敏度下降十分明显。鉴于这种灵敏度的局限性，其检测病原范围也很有限。
近年来，Luminex检测得到了广泛应用，根据各病原序列，设计合适的检测引物，并根据检测引物扩增的目标序列，设计特异性探针；进一步在微球上偶联探针序列，通过探针与目标序列之间的杂交，最后在检测MFI值。该方法中，探针序列需要自行设计，随着病原数量的增加，探针设计难度也增加，导致探针特异性不强；而且微球偶联过程中，又增加了人为的不确定因素，导致试验误差增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建，能够对猪的1-11种腹泻病毒进行定性、定量检测，特异性好，灵敏度高，结果准确，为临床猪腹泻样品的大规模筛查提供有效方法。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法，包括以下步骤：
1)根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，设计扩增猪病毒性腹泻病原的PCR引物，所述PCR引物包括上游引物和下游引物；
2)根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，选择合适的TAG序列，将TAG序列偶联于对应的微球上；将TAG互补序列标记于PCR上游引物5’端，TAG互补序列和PCR上游引物之间有12个碳原子的臂距；在PCR下游引物5’端标记生物素，获得修饰引物；
3)提取样品RNA，反转录获得cDNA；
4)以步骤3)的cDNA为模板，利用修饰引物进行多重PCR扩增，退火温度50～58℃，获得多重PCR扩增产物；
5)步骤4)获得的扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，40～45℃反应20～30min，设阴性对照，检测杂交反应液，分别获得样品及阴性对照的MFI值，根据MFI值，进而确定cMFI值；当cMFI≥3时，结果判定为阳性，否则为阴性；
其中，cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)。
进一步，还包括定量检测步骤：构建猪病毒性腹泻病毒的阳性质粒标准品，制作猪病毒性腹泻病毒的MFI值与浓度的标准曲线，利用该标准曲线和步骤5)测得的样品MFI值，对样品进行定量检测。
优选地，所述的猪病毒性腹泻病原中有猪的1-11种病毒性腹泻病原。
进一步，所述猪的1-11种病毒性腹泻病原选自PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV。
进一步，所述猪的1-11种病毒性腹泻病原的PCR引物序列如下，从5’到3’：
PToV上游引物：AATTGCTTATTGGTGGCTTC；
下游引物：AGCDATTTGRGCDGCATTC；
PDCoV上游引物：CGCAGTTTTCATTGTGTCCA；
下游引物：CCTGTGGCGGATTTCTAACT；
PAstV上游引物：CCTTWCCCCACTGATGAAGA；
下游引物：CCTGTCCATCTGCCTTTCTGT；
PKoV上游引物：CGCCGTTCACTCTTTGTCC；
下游引物：ACCAAGCAGCATCCTACCAG；
PSV上游引物：CTGGACTGGGCCTATACT；
下游引物：TYAGGTACACACGGGCTC；
PTV上游引物：TGCAGCTCTTTCACATTTRGA；
下游引物：ACTTGTATGAGGCCCATCG；
PSaV上游引物：GTGGCAACGTACAAYGCRTGG；
下游引物：GCCTCCATCACGAACACT；
BVDV上游引物：AGCCATGCCCHTAGTAGGAC；
下游引物：CCTCTGCWRCACCCTATC；
PEDV上游引物：GTCAAGATGGCTATTCTATGG；
下游引物：ACCAAGAATGTGTCCTGCG；
TGEV上游引物：CAAAGGAATAGGTAACAGGG；
下游引物：ATCTGCATGAGGTCCAGT；
PoRV上游引物：GGATTACTTGGYACTACTTT；
下游引物：AATGATGCTGAYTATGGAAGT。
进一步，所述猪的1-11种病毒性腹泻病原的TAG序列如下，从5’到3’：
PToV-TAG：TTGAAAGAGAGAGATAAGAATAAA；
PDCoV-TAG：GATAGTAAATAGAGAAAGAGTTAA；
PAstV-TAG：GTTAAATGTAAAGTGAAAGAATAG；
PKoV-TAG：AGTAGTGAAAGAAATGAAATGTAA；
PSV-TAG：TTAAAGAAGAGAAAGAAAGTGTTA；
PTV-TAG：TGTGAGTAAATTGTGATAAAGTAA；
PSaV-TAG：TGTTTATAGATTGATGATAGTGTT；
BVDV-TAG：TATGAAATGTTTGTTTATTGTGTG；
PEDV-TAG：GAAAGAGTATGAAAGTTGATTAAA；
TGEV-TAG：AATTGTTGAATATGTTTGTGTTTG；
PoRV-TAG：GTATTAGTTAAAGTTGAAAGATGA。
又，所述猪的1-11种病毒性腹泻病原的TAG互补序列如下，从5’到3’：
PToV-TAG：AACTTTCTCTCTCTATTCTTATTT；
PDCoV-TAG：CTATCATTTATCTCTTTCTCAATT；
PAstV-TAG：CAATTTACATTTCACTTTCTTATC；
PKoV-TAG：TCATCACTTTCTTTACTTTACATT；
PSV-TAG：AATTTCTTCTCTTTCTTTCACAAT；
PTV-TAG：ACACTCATTTAACACTATTTCATT；
PSaV-TAG：ACAAATATCTAACTACTATCACAA；
BVDV-TAG：ATACTTTACAAACAAATAACACAC；
PEDV-TAG：CTTTCTCATACTTTCAACTAATTT；
TGEV-TAG：TTAACAACTTATACAAACACAAAC；
PoRV-TAG：CATAATCAATTTCAACTTTCTACT。
本发明提供所述多重猪病毒性腹泻病原的液相芯片检测方法的构建方法，包括以下步骤：
a)提取样品RNA，反转录获得cDNA；
b)根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，设计扩增病毒性腹泻病原的PCR引物，该PCR引物包括上游引物和下游引物；
c)以cDNA为模板，利用扩增猪病毒性腹泻病原的PCR引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，构建猪病毒性腹泻病毒阳性质粒；
d)根据猪病毒性腹泻病原的基因序列，选择合适的TAG序列，将TAG序列偶联于微球；将TAG互补序列标记于PCR上游引物5’端，TAG互补序列和PCR上游引物之间有12个碳原子的臂距，并在PCR下游引物的5’端标记生物素，得到修饰引物；
e)多重PCR扩增
以步骤c)构建的猪病毒性腹泻病毒阳性质粒为模板，利用修饰引物，进行多重PCR扩增，获得多重PCR扩增产物，确定合适的引物浓度和退火温度；
f)杂交反应
步骤e)获得的扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，设阴性对照，在37～45℃反应20～45min，检测杂交反应液，获得MFI值，根据MFI值的高低，确定合适的杂交温度和时间；根据MFI值确定cMFI值，判断样品的阴/阳性。
进一步，步骤e)中，确定的引物浓度和退火温度分别为：修饰引物的上下游引物浓度各为2.5μM，退火温度55℃；步骤f)中，确定的杂交温度和时间分别为：杂交温度40～45℃，杂交时间20～30min。
本发明利用Luminex液相芯片xTAG技术，实现对1-11种猪腹泻病毒的进行定性、定量检测，其以荧光编码的微球作为反应载体，根据微球内荧光染料配比的不同，产生出不同的编码微球，通过把Luminex液相芯片特有的TAG短序列结合到微球上，每个编码微球都可对应不同的目标物，从而实现多分子同时检测。
本发明中，首先根据猪腹泻病原的基因序列，分别筛选出合适的TAG序列并偶联于各微球；其次，将TAG互补序列标记于扩增各病原的PCR上游引物5’端，并在PCR下游引物5’端标记生物素；然后利用修饰引物进行多重PCR扩增，将PCR扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交；最后，在Luminex 200机器上进行检测；根据MFI值，确定各孔样品的阴/阳性，实现对猪病毒性腹泻多重病原进行定性定量检测。
本发明的检测方法中，杂交温度不仅对杂交效率有直接影响，而且对TAG与anti-TAG的特异性杂交也存在显著影响；为了进一步提高杂交效率，以及减少非特异性的结合，本发明对TAG与anti-TAG的杂交时间进行了筛选。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中，针对猪腹泻病原的基因序列，遵循与特定病原基因序列完全互补，而与其他病原基因序列无非特异性反应的原则，筛选出合适的TAG序列，然后与偶联该TAG序列的商品化微球进行偶联，将TAG互补序列和生物素制作修饰引物，对待测样品进行扩增，扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，检测MFI值，操作简单，无需进行探针序列的设计，既增加了特异性，又避免了不必要的误差。
本发明中，具有双重结合特性，偶联微球的TAG序列和PCR扩增产物识别并结合之后，才能进一步被链霉亲和素所识别，最后发出特异荧光信号，因此，该方法的特异性强于其他检测方法；并且，本发明可同时使用多达上百种微球，最多可以同时检测上百种病原，还具有高通量性。
本发明中，微球可以通过TAG序列多方位捕捉PCR扩增片段，再结合生物素-亲和素级联放大反应系统，大大提高了该方法的检测限量，比普通PCR灵敏度至少提高10倍。
附图说明
图1为本发明实施例1中猪的11种病毒性腹泻病原PCR扩增的目的片段。
图2为本发明实施例1中7重PCR引物在三种浓度下的扩增结果。
图3为本发明实施例1中4重PCR引物在三种浓度下的扩增结果。
图4为本发明实施例1中7重PCR引物在三个温度下的扩增结果。
图5为本发明实施例1中4重PCR引物在三个温度下的扩增结果。
图6-8为本发明实施例1中11重PCR产物的杂交中在三个温度及时间下的扩增结果。
图9-10为本发明实施例1中猪病毒性腹泻病原的Luminex灵敏度检测结果。
图11为本发明实施例1中猪的11种病毒性腹泻病原的特异性检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
MagPlex-TAG微球、校验试剂盒和鞘液购Luminex公司；链霉亲和素-藻红蛋白购自默克史密博公司；DNA marker DL500、PMD 18-T载体试剂盒和Trizol购自TakaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司；DEPC水购自Sigma公司；Gold view染料购自赛百胜公司；蛋白胨、酵母提取物购自OXOID LTD公司；琼脂粉购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
含有PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、BVDV、PSV、PKV、PAstV、PToV、PTV以及PSaV病原的阳性样品由上海市农业科学院实验室保存。E.coli.DH5α感受态菌株由上海市农业科学院实验室制备保存.
实施例1猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法的构建，包括以下步骤：
1.引物设计与修饰
首先，用Oligo7软件分析猪的11种病毒性腹泻病原，分别为PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、BVDV、PSV、PKV、PAstV、PToV、PTV以及PSaV，设计PCR引物，筛选合适的TAG序列；
猪的11种病毒性腹泻病原的PCR引物的序列分别如下：
PToV上游引物：AATTGCTTATTGGTGGCTTC；
下游引物：AGCDATTTGRGCDGCATTC；
PDCoV上游引物：CGCAGTTTTCATTGTGTCCA；
下游引物：CCTGTGGCGGATTTCTAACT；
PAstV上游引物：CCTTWCCCCACTGATGAAGA；
下游引物：CCTGTCCATCTGCCTTTCTGT；
PKoV上游引物：CGCCGTTCACTCTTTGTCC；
下游引物：ACCAAGCAGCATCCTACCAG；
PSV上游引物：CTGGACTGGGCCTATACT；
下游引物：TYAGGTACACACGGGCTC；
PTV上游引物：TGCAGCTCTTTCACATTTRGA；
下游引物：ACTTGTATGAGGCCCATCG；
PSaV上游引物：GTGGCAACGTACAAYGCRTGG；
下游引物：GCCTCCATCACGAACACT；
BVDV上游引物：AGCCATGCCCHTAGTAGGAC；
下游引物：CCTCTGCWRCACCCTATC；
PEDV上游引物：GTCAAGATGGCTATTCTATGG；
下游引物：ACCAAGAATGTGTCCTGCG；
TGEV上游引物：CAAAGGAATAGGTAACAGGG；
下游引物：ATCTGCATGAGGTCCAGT；
PoRV上游引物：GGATTACTTGGYACTACTTT；
下游引物：AATGATGCTGAYTATGGAAGT。
利用猪的11种腹泻病原的检测引物，分别进行单一PCR扩增，获得各阳性目的片段，参见图1，其中，M：DL500DNA相对分子质量标准；1：PSaV；2：阴性对照；3：PTV；4：阴性对照；5：PSV；6：阴性对照：7：PKV；8：阴性对照；9：PAstV；10：阴性对照；11：PDCoV；12：阴性对照；13：PToV；14：阴性对照；15：TGEV；16：阴性对照；17：PEDV；18：阴性对照；19：BVDV；20：阴性对照；21：PoRV；22：阴性对照；图1表明，各片段PCR扩增特异，大小均正确。
所述猪的11种病毒性腹泻病原的TAG序列如下，从5’到3’：
PToV-TAG：TTGAAAGAGAGAGATAAGAATAAA；
PDCoV-TAG：GATAGTAAATAGAGAAAGAGTTAA；
PAstV-TAG：GTTAAATGTAAAGTGAAAGAATAG；
PKoV-TAG：AGTAGTGAAAGAAATGAAATGTAA；
PSV-TAG：TTAAAGAAGAGAAAGAAAGTGTTA；
PTV-TAG：TGTGAGTAAATTGTGATAAAGTAA；
PSaV-TAG：TGTTTATAGATTGATGATAGTGTT；
BVDV-TAG：TATGAAATGTTTGTTTATTGTGTG；
PEDV-TAG：GAAAGAGTATGAAAGTTGATTAAA；
TGEV-TAG：AATTGTTGAATATGTTTGTGTTTG；
PoRV-TAG：GTATTAGTTAAAGTTGAAAGATGA。
其次，将各病原的PCR引物进行修饰，在各上游引物5’端以TAG互补序列进行修饰，两者之间增加了12个碳原子的臂距；下游引物5’端进行生物素修饰，11种腹泻病毒的修饰引物扩增长度以及所对应的微球编号见表1，引物的修饰由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2.提取RNA、反转录
吸取250μL猪粪便样品，加入750μL Trizol裂解液，充分震荡混匀，静置10min；加入200μL三氯甲烷，充分震荡，4℃离心15min；小心吸取500μL上清液，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀10min，然后4℃离心15min；弃上清液，加入1mL 75％乙醇洗涤，4℃离心15min；弃去上清，倒扣纸上，风干，用20μL无RNase DEPC水重悬，-80℃保存备用。
以提取的RNA为模板，利用随机引物进行反转录，获得cDNA，反应程序：42℃60min；75℃15min；4℃，∞。反转录产物-20℃保存，反转录反应体系参见表2。
表2
Figure BDA0001734677950000091
3.构建病毒的阳性质粒
以上述cDNA为模板，利用猪的11种病毒性腹泻病原的PCR引物分别进行PCR扩增，具体反应体系为：2μL cDNA，PCR Mix 12.5μL，上、下游引物(10μm)各0.5μL，用水补至25μL；反应程序：95℃，4min；(95℃，30s；55℃，30s；72℃，35s)，35个循环；72℃，7min；4℃，∞。
利用试剂盒回收PCR扩增产物，将回收的目的片段克隆入pMD18-T载体，并转化DH5α感受态，挑取单个菌落进行菌液PCR鉴定，将疑似阳性质粒送公司测序；在NCBI数据库内进行序列比对，将测序正确的阳性质粒于-20℃保存备用。
4.多重PCR反应体系的建立及条件筛选
将获得的猪的11种病毒阳性质粒进行稀释，以稀释好的猪的11种病毒阳性质粒为模板，用表1的修饰引物进行多重PCR；
反应体系为：各取2μL质粒、2.5μL 10×PCR buffer、2μL dNTP、0.5μL rTaq、11对病毒上、下游引物(10μM)各0.5μL，用水补至25μL。
反应程序为：95℃，4min；(95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)，35个循环；72℃，7min；4℃，∞。
进一步，设定不同引物浓度(2.5μM、5μM、10μM)和退火温度(50℃、55℃、58℃)进行PCR，根据MFI值，筛选引物浓度，结果参见图2-3，结果表明，3个引物浓度(2.5μM、5μM、10μM)均能扩增出特异性条带。
又，采用3个温度梯度，分别为50℃、55℃、58℃，进行多重PCR反应条件的优化，结果如图4-5，由图4-5可见，这3个退火温度均能扩增出目的条带，55℃为最佳退火温度。
5.多重PCR产物的杂交反应及条件筛选
将上述多重PCR反应的扩增产物与相对应的微球进行杂交，设立阴性对照，步骤如下：
(1)将配制好的微球工作液恢复至室温，加入八连管中，20μL/孔(每种微球个数为2500个)；
(2)在上述孔内加入5μL PCR扩增产物；
(3)用1×TM hybridization稀释SAPE，使其终浓度为10μg/mL；每孔加入75μLSAPE报告缓冲液，轻轻混匀；
(4)放置PCR仪上进行杂交反应，37～45℃反应20～45min；
(5)取100μL反应液在Luminex200仪器上进行检测。
进一步，筛选杂交温度及时间，参照Luminex推荐杂交温度37～45℃，选取40℃、42℃、45℃三个杂交温度，根据所得到的MFI值，确定最佳杂交温度；参照Luminex推荐杂交时间20～45min，选取20min、25min、30min三个时间点进行杂交，根据所得到的MFI值，确定最佳杂交时间为30min。
结果参见图6-8，可见，42℃杂交30min可获得的MFI值最高，因此，判定Luminex检测的最佳杂交条件为42℃杂交30min。
6.Luminex检测
Luminex 200液相系统预热30min，采用XPOINT 3.1软件，对每孔样品进行读数。当读取的微球数≥100，说明读值有效；记录每孔的MFI值(平均荧光强度)。
选取48个阴性对照样品，分别进行Luminex检测，获得各自的MFI值，从而来确定cMFI值。运用“信噪比”：cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)。当Cut-offcMFI≥3时，结果判定为阳性，否则为阴性。
利用DEPC水将各病原的阳性质粒进行10倍倍比稀释，然后采用筛选的多重PCR反应条件，分别进行7重PCR和4重PCR反应进行扩增进行扩增，检测该方法的灵敏性，结果参见图9-10。
由图9-10可见，当质粒稀释至10-6倍时，Luminex 200仪器检测到的MFI值低于阳性判定值，可判定这两种多重PCR方法可检测PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV、TGEV的质粒最低检测限量分别为3.12×103copies/μL、2.92×103copies/μL、2.79×103copies/μL、3.37×103copies/μL、2.7×103copies/μL、3.02×103copies/μL、2.65×103copies/μL、2.57×103copies/μL、1.74×103copies/μL、2.41×103copies/μL、2.75×103copies/μL。
以单一病毒的cDNA作为模板，分别进行7重PCR和4重PCR反应，进行扩增，检测该方法的特异性，结果如图11，可见，各反应中，只有相对应的病原能扩增出目的条带，其余病原扩增均为阴性，说明该方法的特异性良好。
7.绘制定量检测标准曲线
将11种猪病毒性腹泻病毒的标准阳性质粒进行10倍倍比稀释，稀释成100-10-7这8个浓度梯度。利用表1的修饰引物，将每个稀释度的混合质粒标准品分别进行PCR扩增反应，体系中同时加入11种病毒的修饰引物。将各PCR扩增产物与相对应的微球进行杂交，然后在Luminex机器上进行检测，系统会自动生成11条标准曲线，11种病原的标准曲线的R2均大于0.99，说明所有标准曲线的线性回归分析均具有高的相关系数。
实施例2临床猪病毒性腹泻样品的的液相芯片检测与分析
利用实施例1中的液相芯片检测方法，对173份猪腹泻粪便样品检测，检测设阴性对照，以复孔方式进行，获得平行实验的两组数据，取两组数据的平均值，对每个样品进行数据分析，以其中一个样品为例，检测获得的两组MFI值检测值及阴性对照值参见表3。
1.定性分析过程如下：
12#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝0.99＜3，为PoRV阴性；
14#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝0.15＜3，为PSV阴性；
19#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝8.56＞3，为BVDV阳性；
20#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝0.64＜3，为PEDV阴性；
39#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝2.25＜3，为PSaV阴性；
43#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝6.67＞3，为PToV阳性；
44#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝7.58＞3，为PKoV阳性；
51#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝0.52＜3，为PAstV阴性；
53#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝0.48＜3，为TGEV阴性；
72#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝0.89＜3，为PDCoV阴性；
74#xTAG微球：样品cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)＝5.56＞3，为PTV阳性。
可见，该检测样品中同时感染病毒BVDV、PToV、PKoV和PTV四种病毒。
173份样品的检测分析结果参见表4-5。
由表4可见，PoRV的阳性检出率为14.5％、PSV的阳性检出率为6.9％、BVDV的阳性检出率为6.4％、PEDV的阳性检出率为32.4％、PKoV的阳性检出率为26.0％、PSaV的阳性检出率为11.6％、PTV的阳性检出率为1.7％、PAstV的阳性检出率为26.0％、TGEV的阳性检出率为3.5％、PDCoV的阳性检出率为0.6％、PTV的阳性检出率为1.7％。
PEDV检出率最高，其次是PKoV和PAstV，接着是PoRV和PSaV。TGEV、PDCoV和PTV检出率较低。
由表5可见，在173份临床样品中有16.8％(29/173)的样品中存在2种病毒感染，主要是PKoV和PAstV；10.9％(19/173)的样品中存在3种病毒感染，主要是PKoV、PAstV和PToV；3.4％(6/173)的样品中存在4种病毒感染，主要是PKoV、PAstV、PToV与PEDV；1.7％(3/173)的样品中存在5种病毒感染，主要是PKoV、PAstV、PSaV、PToV与PTV混合感染，3份样品中存在PKoV、PEDV、PoRV、PAstV、PSaV、PToV与PSV混合感染。
2.定量分析
根据测得的MFI值，以定性判断标准为参照，结合各病毒的标准曲线，进一步进行定量判定，部分样品的定量检测结果参见表6。
由表6可知，PoRV、PSV、BVDV、PEDV、PKoV、PSaV、PAstV、TGEV、PDCoV和PTV的病毒含量分别≥100.29pg/mL、2.23pg/mL、156.53pg/mL、10.97pg/mL、34.69pg/mL、24.73pg/mL、367.62pg/mL、54.66pg/mL、10.64pg/mL、14.68pg/mL时，可判定为阳性。
进一步，可利用聚类分析原理，将各样品中的病原含量以颜色表示出来，可以很直观的估算各样品中病原含量。
Figure BDA0001734677950000151
Figure BDA0001734677950000161
Figure BDA0001734677950000171
Figure BDA0001734677950000181

Claims (4)

1.一种区分猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的多重液相芯片检测方法，用于非疾病的诊断与治疗目的，包括以下步骤：
1)分别根据猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV或TGEV病毒基因序列，设计扩增所述病毒的PCR引物，所述PCR引物包括上游引物和下游引物；
其中，猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的PCR引物序列如下，从5’到3’：PToV上游引物：AATTGCTTATTGGTGGCTTC；
下游引物：AGCDATTTGRGCDGCATTC；
PDCoV上游引物：CGCAGTTTTCATTGTGTCCA；
下游引物：CCTGTGGCGGATTTCTAACT；
PAstV上游引物：CCTTWCCCCACTGATGAAGA；
下游引物：CCTGTCCATCTGCCTTTCTGT；
PKoV上游引物：CGCCGTTCACTCTTTGTCC；
下游引物：ACCAAGCAGCATCCTACCAG；
PSV上游引物：CTGGACTGGGCCTATACT；
下游引物：TYAGGTACACACGGGCTC；
PTV上游引物：TGCAGCTCTTTCACATTTRGA；
下游引物：ACTTGTATGAGGCCCATCG；
PSaV上游引物：GTGGCAACGTACAAYGCRTGG；
下游引物：GCCTCCATCACGAACACT；
BVDV上游引物：AGCCATGCCCHTAGTAGGAC；
下游引物：CCTCTGCWRCACCCTATC；
PEDV上游引物：GTCAAGATGGCTATTCTATGG；
下游引物：ACCAAGAATGTGTCCTGCG；
TGEV上游引物：CAAAGGAATAGGTAACAGGG；
下游引物：ATCTGCATGAGGTCCAGT；
PoRV上游引物：GGATTACTTGGYACTACTTT；
下游引物：AATGATGCTGAYTATGGAAGT；
2)根据所述病毒的基因序列，选择合适的TAG序列，将TAG序列偶联于对应的微球上；将TAG互补序列标记于PCR上游引物5’端，TAG互补序列和PCR上游引物之间有12个碳原子的臂距；在PCR下游引物5’端标记生物素，获得修饰引物；
所述猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的TAG序列如下，从5’到3’：
PToV-TAG：TTGAAAGAGAGAGATAAGAATAAA；
PDCoV-TAG：GATAGTAAATAGAGAAAGAGTTAA；
PAstV-TAG：GTTAAATGTAAAGTGAAAGAATAG；
PKoV-TAG：AGTAGTGAAAGAAATGAAATGTAA；
PSV-TAG：TTAAAGAAGAGAAAGAAAGTGTTA；
PTV-TAG：TGTGAGTAAATTGTGATAAAGTAA；
PSaV-TAG：TGTTTATAGATTGATGATAGTGTT；
BVDV-TAG：TATGAAATGTTTGTTTATTGTGTG；
PEDV-TAG：GAAAGAGTATGAAAGTTGATTAAA；
TGEV-TAG：AATTGTTGAATATGTTTGTGTTTG；
PoRV-TAG：GTATTAGTTAAAGTTGAAAGATGA；
3)提取样品RNA，反转录获得cDNA；
4)以步骤3)的cDNA为模板，利用修饰引物进行多重PCR扩增，退火温度50～58℃，获得多重PCR扩增产物；
5)步骤4)获得的扩增产物与偶联在微球上的TAG序列进行杂交，40～45℃反应20～30min，设阴性对照，检测杂交反应液，分别获得样品及阴性对照的MFI值，根据MFI值，进而确定cMFI值；当cMFI≥3时，结果判定为阳性，否则为阴性；
其中，cMFI＝[MFI(样品)-MFI(阴性对照)]/MFI(阴性对照)。
2.根据权利要求1所述的多重液相芯片检测方法，其特征在于，所述猪的1-11种病毒性腹泻病原的TAG序列的互补序列如下，从5’到3’：
PToV-TAG：AACTTTCTCTCTCTATTCTTATTT；
PDCoV-TAG：CTATCATTTATCTCTTTCTCAATT；
PAstV-TAG：CAATTTACATTTCACTTTCTTATC；
PKoV-TAG：TCATCACTTTCTTTACTTTACATT；
PSV-TAG：AATTTCTTCTCTTTCTTTCACAAT；
PTV-TAG：ACACTCATTTAACACTATTTCATT；
PSaV-TAG：ACAAATATCTAACTACTATCACAA；
BVDV-TAG：ATACTTTACAAACAAATAACACAC；
PEDV-TAG：CTTTCTCATACTTTCAACTAATTT；
TGEV-TAG：TTAACAACTTATACAAACACAAAC；
PoRV-TAG：CATAATCAATTTCAACTTTCTACT。
3.根据权利要求1所述的多重液相芯片检测方法，其特征在于，步骤4)中多重PCR扩增时，修饰引物的上下游引物浓度各为2.5μM，退火温度55℃。
4.一种区分猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的多重液相芯片修饰引物，其包括PCR引物及TAG互补序列，所述TAG互补序列标记于PCR上游引物5’端，TAG互补序列和PCR上游引物之间有12个碳原子的臂距；PCR下游引物5’端标记生物素；
其中，猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的PCR引物序列如下，从5’到3’：
PToV上游引物：AATTGCTTATTGGTGGCTTC；
下游引物：AGCDATTTGRGCDGCATTC；
PDCoV上游引物：CGCAGTTTTCATTGTGTCCA；
下游引物：CCTGTGGCGGATTTCTAACT；
PAstV上游引物：CCTTWCCCCACTGATGAAGA；
下游引物：CCTGTCCATCTGCCTTTCTGT；
PKoV上游引物：CGCCGTTCACTCTTTGTCC；
下游引物：ACCAAGCAGCATCCTACCAG；
PSV上游引物：CTGGACTGGGCCTATACT；
下游引物：TYAGGTACACACGGGCTC；
PTV上游引物：TGCAGCTCTTTCACATTTRGA；
下游引物：ACTTGTATGAGGCCCATCG；
PSaV上游引物：GTGGCAACGTACAAYGCRTGG；
下游引物：GCCTCCATCACGAACACT；
BVDV上游引物：AGCCATGCCCHTAGTAGGAC；
下游引物：CCTCTGCWRCACCCTATC；
PEDV上游引物：GTCAAGATGGCTATTCTATGG；
下游引物：ACCAAGAATGTGTCCTGCG；
TGEV上游引物：CAAAGGAATAGGTAACAGGG；
下游引物：ATCTGCATGAGGTCCAGT；
PoRV上游引物：GGATTACTTGGYACTACTTT；
下游引物：AATGATGCTGAYTATGGAAGT；
所述猪的PTV、PKOV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV、PoRV、PEDV、BVDV和TGEV病毒的TAG互补序列如下，从5’到3’：
PToV-TAG：AACTTTCTCTCTCTATTCTTATTT；
PDCoV-TAG：CTATCATTTATCTCTTTCTCAATT；
PAstV-TAG：CAATTTACATTTCACTTTCTTATC；
PKoV-TAG：TCATCACTTTCTTTACTTTACATT；
PSV-TAG：AATTTCTTCTCTTTCTTTCACAAT；
PTV-TAG：ACACTCATTTAACACTATTTCATT；
PSaV-TAG：ACAAATATCTAACTACTATCACAA；
BVDV-TAG：ATACTTTACAAACAAATAACACAC；
PEDV-TAG：CTTTCTCATACTTTCAACTAATTT；
TGEV-TAG：TTAACAACTTATACAAACACAAAC；
PoRV-TAG：CATAATCAATTTCAACTTTCTACT。
CN201810806937.6A 2018-07-18 2018-07-18 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建 Active CN108913812B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810806937.6A CN108913812B (zh) 2018-07-18 2018-07-18 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810806937.6A CN108913812B (zh) 2018-07-18 2018-07-18 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108913812A CN108913812A (zh) 2018-11-30
CN108913812B true CN108913812B (zh) 2021-11-30

Family

ID=64415678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810806937.6A Active CN108913812B (zh) 2018-07-18 2018-07-18 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108913812B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109880937A (zh) * 2019-04-24 2019-06-14 四川大学 一种猪病毒性腹泻多重rt-pcr检测方法
CN110273024A (zh) * 2019-05-08 2019-09-24 广西大学 基于猪流行性腹泻病毒m基因的荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN110512027B (zh) * 2019-08-27 2022-04-01 南京农业大学 猪病毒性腹泻病病原的五重rt-pcr检测方法
CN110592278A (zh) * 2019-09-04 2019-12-20 广西大学 PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒
CN113201598B (zh) * 2020-12-25 2022-07-22 中国动物卫生与流行病学中心 一种用于检测多种猪源性病原的液相芯片

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8354514B2 (en) * 2007-01-12 2013-01-15 Lawrence Livermore National Security, Llc Multiplex detection of agricultural pathogens
CN103205509A (zh) * 2013-04-23 2013-07-17 中国检验检疫科学研究院 基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法
CN105154589A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 广东省实验动物监测所 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8354514B2 (en) * 2007-01-12 2013-01-15 Lawrence Livermore National Security, Llc Multiplex detection of agricultural pathogens
CN103205509A (zh) * 2013-04-23 2013-07-17 中国检验检疫科学研究院 基于新型悬浮芯片技术的13种呼吸道病毒高通量非诊断性检测方法
CN105154589A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 广东省实验动物监测所 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
多重 PCR 液相芯片技术在腹泻病原体检测中的应用;黎俊宏;《现代预防医学》;20170925;第44卷(第8期);3390-3394 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108913812A (zh) 2018-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108913812B (zh) 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建
WO2021174674A1 (zh) 检测冠状病毒并分型的组合物、试剂盒及方法
CN110551846B (zh) 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN111187858A (zh) 新型冠状病毒检测试剂盒
CN109487013B (zh) 单纯疱疹病毒i型和ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN113502352B (zh) 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用
CN109706269B (zh) 能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒
CN113943830A (zh) 一种用于同时检测猫细小病毒、猫疱疹病毒1型和猫杯状病毒的引物探针组及试剂盒
CN105907890B (zh) 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法
CN103509880A (zh) 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的lamp检测试剂盒
CN107326099B (zh) 五种猪腹泻病毒富集多重pcr快速检测试剂盒及其应用
CN113249517A (zh) 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒
CN110804677B (zh) 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒
CN116814857A (zh) 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法
CN112921123B (zh) 快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒
WO2021226754A1 (zh) 一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法
CN102851395B (zh) 一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法
CN106521038A (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN111500773A (zh) 一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量rt-pcr引物、探针和试剂盒
KR102168866B1 (ko) 구제역 바이러스 o 타입 검출용 프라이머 세트
KR102168858B1 (ko) 구제역 바이러스 a 타입 검출용 프라이머 세트
CN106319091A (zh) 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒
CN113322350B (zh) 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型病毒的试剂盒及应用
CN114196789B (zh) 一种非侵入性快速确定植物是否感染番茄黄化曲叶病毒的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant