CN107326099B - 五种猪腹泻病毒富集多重pcr快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

五种猪腹泻病毒富集多重pcr快速检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了五种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，包括5对病毒特异性组合引物、1对通用引物对、5对病毒特异性引物。本发明还同时公开了上述试剂盒在同时特异检测5种猪腹泻病毒感染中的应用，5种猪腹泻病毒为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2。

Description

五种猪腹泻病毒富集多重PCR快速检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种检测5种猪腹泻病毒的多重PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测5种猪腹泻病毒，适用于临床及科研中对猪腹泻病毒的快速检测。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒A型(Porcine group Arotaviruses,GAR)、猪轮状病毒C型(Porcine group C rotaviruses,GCR)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2,PCV2)，被认为是最主要的猪病毒性腹泻病原体(Jung et al.,2006；Marthaler et al.,2014；Zhang et al.,2013)。
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可达100％。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了我国养猪业的健康发展。
猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)属冠状病毒科、冠状病毒属，基因组为单股正链不分节段的RNA，全长28.5kb。对小肠造成损伤，产生消化和吸收不良，最终导致腹泻和脱水，引起哺乳仔猪死亡(Tuboly et al.,2000；南文金和娄高明,2010)。该病毒感染率高，造成的仔猪死亡率高(王黎等,2015)。
轮状病毒(RV)属于呼肠病毒科家族，无包膜，基因组是一条的11分段的双链RNA(Estes and Cohen,1989)。RV是引起包括人类以及其他动物腹泻的重要因素，目前轮状病毒以VP6基因分成6型，A、B、C、E和H组(GAR、GBR、GCR、GER和GHR)都已经在猪上检测出(Matthijnssens et al.,2012；Saif et al.,1980；Wakuda et al.,2011)。GAR在1975年首次报道，一直被认为是猪腹泻的一个主要病原(Amimo et al.,2013；Ciarlet et al.,2002；Ciarlet et al.,1995；Miyazaki et al.,2011,2012)。GCR在1979年首次被检测出，很难进行细胞培养(Amimo et al.,2013；Marthaler et al.,2013；Saif et al.,1988；Saif et al.,1996；Tsunemitsu et al.,1991)。GCR能引起严重胃肠感染且易造成散发性传播或大爆发(Bohl et al.,1982；Collins et al.,2008；Saif et al.,1980)。一般GAR被认为是引起猪腹泻的首因，而GBR、GCR的作用没那么大。Douglas marthaler等应用RT-PCR检测7508份猪腹泻样品的研究发现GAR的阳性率为62％，GCR感染率也很高(53％)，GCR主要感染1-20天仔猪，GAR主要感染21天以上仔猪。认为应该同时检测GAR和GCR(Marthaler etal.,2014)。
猪圆环病毒2型(PCV2)属圆环病毒科圆环病毒属，近年新报道猪病毒，是能在哺乳动物细胞自主复制最小单链环状DNA病毒，包含4个开放阅读框(ORF)：ORF1-4(Murphy,1995)。猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)症状之一是引发肠炎。PCV2可以由单独感染或者混合感染引发肠炎(Kim et al.,2004；Zhang et al.,2013)。PCV2对猪有很强感染力，各年龄都可感染，而且侵害猪的免疫系统产生免疫抑制和其它病原微生物继发感染。
常规的病原学和血清学检测很难将这些疾病同时加以区别鉴定，同时又存在操作繁琐、费时费力、敏感度低等缺陷。多重PCR技术在单重PCR基础上发展而来，在一个体系中同时加入多种引物，可以一次同时检测多种病原体，并具有高特异性和敏感性、检测时间短、检测成本低等优点，在实验室和临床上的研究很广泛(Zhang et al.,2011)。通常猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒(A组)在病毒性腹泻中较为常见，在发病猪样品中的检出率较高(Ogawa et al.,2009)。新的研究进展报道认为GCR和PCV2在猪腹泻中所扮演的作用也非常大(Marthaler et al.,2014)。因此对这些病毒的检测方法的建立也较多，相关多重普通PCR方法的建立也较为常见，但未见对这五种病毒的多重PCR检测研究报道。
但普通多重PCR存在各组引物对扩增效率不一致，通常需复杂的体系优化，而且多重普通PCR灵敏度通常要比单重PCR低，容易产生误判错判，在临床上不能满足对这几种病毒的早期快速检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时特异灵敏地检测5种猪腹泻病毒感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒以及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供如一种五种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，包括如下5对病毒特异性组合引物：
PEDV-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-AACACGGCGACTACTCAGC
PEDV-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-GCCTTCTTTAGCAACCCAG
TGEV-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-GTGGTGTTAGGTGATTATTTTCC
TGEV-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-TATGGTTTAACCTGCACTCACTA
GAR-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-TATGCAATACCAGTAGGACCAG
GAR-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-GCTCTACGTAGCGAGTATGAAATC
GCR-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-TGTTGCATCCGTGAAGAGAATGGT
GCR-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-GCATTAGCCCCTACGCAAGC
PCV2-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-AAGAAGCGGACCCCAAC
PCV2-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-AGGTGGCCCCACAATGA
还包括如下通用引物对：
UF：GGCATCGCATAACATAAGCA
UR：CGTCCGTCCAACCGTCTG。
注：所述每对猪腹泻病毒特异性组合引物均在病毒特异性引物序列的5′端均连一段共同的通用引物序列。
作为本发明的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒的改进，还包括如下5对病毒特异性引物：
PEDV-F：AACACGGCGACTACTCAGC
PEDV-R：GCCTTCTTTAGCAACCCAG
TGEV-F：GTGGTGTTAGGTGATTATTTTCC
TGEV-R：TATGGTTTAACCTGCACTCACTA
GAR-F：TATGCAATACCAGTAGGACCAG
GAR-R：GCTCTACGTAGCGAGTATGAAATC
GCR-F：TGTTGCATCCGTGAAGAGAATGGT
GCR-R：GCATTAGCCCCTACGCAAGC
PCV2-F：AAGAAGCGGACCCCAAC
PCV2-R：AGGTGGCCCCACAATGA。
备注说明：上述病毒特异性引物可用于标准样品的扩增。
作为本发明的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒的进一步改进，试剂盒包括：a)PCR反应液、b)PCR标准品、c)阳性对照品、d)阴性对照品、e)引物。
所述PCR标准品由以下5种标准品组成：PEDV标准品、TGEV标准品、GAR标准品、GCR标准品、PCV2标准品。
上述5种病毒标准品序列如SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:15所述。
作为本发明的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒的进一步改进，所述PCR反应液(即，多重PCR反应混合液)包含PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶；所述PCR反应缓冲液含有缓冲液，氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；
所述阳性对照品含TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μl)；
所述阴性对照品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H2O)。
作为本发明的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒的进一步改进，5种猪腹泻病毒的病毒特异性组合引物、病毒特异性引物和通用引物的上下游引物同管包装。
例如：“PEDV-F、PEDV-R”同管包装，“PEDV-uF、PEDV-uR和通用引物”同管包装。
作为本发明的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒的进一步改进，试剂盒避光保存于-20℃。
本发明还同时提供了利用上述任一试剂盒在同时特异检测5种猪腹泻病毒感染中的应用。五种猪腹泻病毒为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2。
表1、本发明中所设计的PCR引物
Figure BDA0001337170720000041
Figure BDA0001337170720000051
本发明试剂盒的使用方法为：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
病毒样品核酸提取：根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪样本中提取病毒核酸。
反转录反应：在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA/DNA模板1μl，使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.RR019A)进行RT-PCR反应，其中10×RT PCR Buffer 1μl，25mM MgCl2 2μl，10mM dNTP Mixture 1μl，40U/μl RNaseInhibitor 0.25μl，5U/μl AMV RTase XL 0.5μl，Random 9mers 0.5μl，RNase Free dH2O至总体积为10μl，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。
病毒的检测：取2.0μL已抽提的待测样品核酸DNA/RNA为模板进行多重PCR反应，其中10×PCR buffer 2.0μL，25mM MgCl2 2.0μL，2.5mΜdNTP 1.6μL，Taq DNA Polymerase2.5U，表1中的5对病毒特异性组合引物和1对通用引物，其中TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒上下游组合引物终浓度各为0.01μM，通用引物上下游引物0.5μM，加ddH2O至反应体系总体积为20μL；反应参数分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，
15个循环；94℃30s，62℃30s，72℃30s，30个循环，72℃10min，4℃保存。将扩增产物进行2％琼脂糖电泳检测。
结果报告：根据TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2基因目标片段的有无，对是否有这五种猪腹泻病毒进行鉴定。
本发明具有如下技术效果：本发明为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒快速检测试剂盒，五对猪腹泻病毒特异性组合引物和一对通用引物联合使用，建立富集五重PCR扩增体系，能够对待测样品是否含有TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒进行快速鉴定，特异性高，试剂盒的最低灵敏度为5-50copies/μL，可检测出样品中低含量的病毒。试剂盒使用范围广，可用于五种猪腹泻病毒流行病学调查以及实验室检测。
综上所述，本发明采用靶标富集多重PCR方法，即通过分别设计病毒特异性组合引物(病毒特异性引物序列的5′端均连一段共同的通用引物序列)和1对通用引物，病毒特异性组合引物先进行适当扩增再利用通用引物对扩增产物进行扩增，达到相对均衡和更加灵敏地扩增各病毒靶标的目的，是一种较为理想的检测方法。在此基础上开发的可同时特异和灵敏地检测5种猪腹泻病毒感染的靶标富集多重PCR快速诊断试剂盒，有助于提升临床病毒检测水平，在猪腹泻病毒分子流行病毒学研究，疾病诊断和防治等方面具有重要的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1.富集多重PCR特异性检测。泳道1-21从左至右依次为：M:DL2000DNA Marker；1:GCR；2:GAR；3:TGEV；4:PEDV；5:PCV2；6:GCR、GAR；7:GCR及TGEV；8:GAR及TGEV；9:TGEV及PCV2；10:GCR、GAR及PCV2；11:GAR、PEDV及TGEV；12：GAR、TGEV及PEDV；13:GCR、PEDV及PCV2；14:GAR、TGEV、PEDV及PCV2；15：GCR、TGEV、PEDV及PCV2；16：GCR、GAR、PEDV及PCV2；17：GCR、GAR、TGEV及PCV2；18：GCR、GAR、TGEV、PEDV及PCV2；19：阴性对照；20:非靶标模板。
图2本发明对五种猪腹泻病毒的灵敏性检测。泳道1-8从左至右依次为：1：5×105；2：5×104；3：5×103；4：5×102；5：5×101；6：5×100；7：5×10-1copies/μL标准品混合物；8：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于本发明。
实施例1、试剂盒结构
一种同时特异检测五种猪腹泻病毒感染的富集多重PCR快速诊断试剂盒，包含：PCR反应液、引物、GCR病毒标准品、GAR病毒标准品、TGEV病毒标准品、PEDV病毒标准品、PCV2病毒标准品、阳性对照品、阴性对照品、盒体组成。
盒体中设有容器孔，分别放置PCR反应液管、引物管、GCR病毒标准品管、GAR病毒标准品管、TGEV病毒标准品管、PEDV病毒标准品管、PCV2病毒标准品管、阳性对照品管和阴性对照品管。
其中PCR反应液包含PCR反应缓冲液(含氯化镁，三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)和Taq DNA聚合酶，引物管为五种猪腹泻病毒特异性组合引物、5种病毒特异性引物和通用引物混合。阳性对照品为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μl)；阴性对照品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H2O)。
实施例2、质粒标准品制备
第一步：引物合成
本发明所设计的5对病毒特异性引物(见表1)，由上海生工生物公司技术服务公司合成，合成量为每引物3OD。
第二步：病毒总DNA/RNA提取
将含有TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2毒源的样品置于1.5mL离心管中，根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从样本中提取病毒核酸，得到病毒DNA/RNA。
第三步：反转录反应
在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的病毒DNA/RNA模板1μl，使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.RR019A)进行RT-PCR反应，其中10×RTPCRBuffer 1μl，25mM MgCl2 2μl，10mM dNTP Mixture 1μl，40U/μl RNase Inhibitor0.25μl，5U/μl AMV RTase XL0.5μl，Random 9mers 0.5μl，RNase Free dH2O至总体积为10μl，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。
第四步：PCR扩增
PCR反应体系(总反应体积25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2.5μL，2.5mΜdNTP2μL，Taq DNA Polymerase 1.25U，以第三步中提取的1μL cDNA/DNA为模板，第一步中合成的每组病毒特异性引物(1μL，浓度为10μM)，加ddH2O至反应体系总体积为25μL；分别进行PCR扩增。反应在Bio-Rad S1000PCR扩增仪进行反应参数为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。
第五步：质粒标准品制备
将第三步获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNA Gel Extraction Kit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到PMD18-T载体上，通过大肠杆菌DH5α感受态转化，挑取其中白色单菌落进行鉴定，重组质粒序列委托上海生工生物公司进行序列测定。利用PlasmidMiniprep Kit提取测序正确的重组质粒DNA，利用Nanodrop 2000定量TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2重组质粒浓度，以无菌双蒸水将重组质粒按照5.0×105～5.0×10- 1Copies/μL 10倍梯度稀释制备质粒标准品。
实施例3本发明检测五种猪腹泻病毒特异性实验
第一步：引物合成
本发明所设计的5对病毒特异性组合引物和1对通用引物(见表1)，由上海生工生物公司技术服务公司合成，合成量为每引物3OD。。
第二步：特异性检测
按照富集多重PCR反应体系配制20份相同的反应液，即10×PCR buffer 2.0μL，25mMMgCl2 2.0μL，2.5mΜdNTP 1.6μL，Taq DNA Polymerase 2.5U，表1中5对病毒特异性组合引物和1对通用引物，其中GCR，GAR，TGEV，PEDV和PCV2上下游组合引物终浓度各为0.01μM，通用引物上下游引物0.5μM，分别加入1.0×104copies的GCR，GAR，TGEV，PEDV，PCV2，GCR+GAR，GCR+TGEV，GAR+TGEV，TGEV+PCV2，GCR+GAR+PCV2，GAR+PEDV+TGEV，GAR+TGEV+PEDV，GCR+PEDV+PCV2，GAR+TGEV+PEDV+PCV2，GCR+TGEV+PEDV+PCV2，GCR+GAR+PEDV+PCV2，GCR+GAR+TGEV+PCV2，GCR+GAR+TGEV+PEDV+PCV2质粒标准品2.0μL，第19份加去离子水2.0μL作为空白阴性对照，第20份加非靶标病毒2.0μL作为阴性对照，加ddH2O至反应体系总体积为20μL。反应参数分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，15个循环；94℃30s，62℃30s，72℃30s，30个循环，72℃10min。取5μL PCR产物，与1μL Loading Buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120V电压，电泳30min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果参见图1，判定标准详见表1对应PCR产物大小PEDV：432bp，TGEV：357bp，GAR：280bp，GCR：197bp，和PCV2：546bp，可见本发明中构建的多重PCR反应体系特异性较好。
实施例4本发明检测5种猪腹泻病毒敏感性实验
第一步：引物合成
同实施例3中第一步。
第二步：敏感性检测
富集多重PCR敏感性检测体系如下：10×PCR buffer 2.0μL，25mM MgCl2 2.0μL，2.5mΜdNTP 1.6μL，Taq DNA Polymerase 2.5U，表1中所述的5对病毒特异性组合引物和1对通用引物，其中GCR，GAR，TGEV，PEDV和PCV2上下游引物终浓度各为0.01μM，通用引物上下游引物0.5μM，10倍系列稀释的GCR，GAR，TGEV，PEDV和PCV2质粒标准品(5.0×105～5.0×10-1copies/μL)模板2.0μL，加ddH2O至反应体系总体积为20μL；反应参数分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，15个循环；94℃30s，62℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，4℃保存。取5μL扩增产物进行2％琼脂糖电泳检测，结果参见图2。
常规单重PCR敏感性检测反应体系：10×PCR buffer 2μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mΜdNTP2μL，Taq DNA Polymerase 1U，表1中所述的每种病毒特异性引物(单一使用每对)，上下游引物终浓度均为0.2μM，10倍系列稀释的每种病毒质粒标准品(1.0×105～1.0×10- 1copies/μL)模板1μL，加ddH2O至反应体系总体积为20μL；在Bio-Rad S1000PCR扩增仪进行反应，参数为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，40个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行1％的琼脂糖电泳检测。
试验结果表明：本发明最低可检测出50copies的GAR，TGEV和PCV2，以及5copies的GCR和PEDV病毒量；而常规单重PCR反应GCR的最低检出量为5×102copies，GAR为5×103copies，TGEV为5×102copies，PEDV为5×102copies，PCV2为5×102copies。由此可见本发明检测病毒的敏感性高于常规PCR约10-100倍。由此可见本发明对5种猪腹泻病毒具有较高的检测敏感性。
实施例5、本发明检测临床样品试验
第一步：引物合成
同实施例3中第一步。
第二步：样品收集
检测样品共计97份，均为浙江地区采集的猪粪便和血清样品。
第三步：总DNA/RNA小量抽提
病毒样品提取：根据产品使用说明书，用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(AXYGEN)从猪粪及血清样本中提取病毒核酸。
第四步：反转录反应
同实施例2第三步。
第五步：单重PCR检测和多重PCR检测
1、普通单重PCR检测
PCR反应体系(总反应体积20μL)：10×PCR buffer 2μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mΜdNTP2μL，Taq DNA Polymerase 1U，以第三步中提取的1μL DNA/cDNA为模板，第一步中合成的5组猪病毒特异性引物(终浓度为250nM，单一使用每对)分别进行PCR扩增。反应在Bio-Rad S1000PCR扩增仪进行，反应参数为：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。取5μL扩增产物进行1％的琼脂糖电泳检测。
2、富集多重PCR检测：取2.0μL第四步中提取的cDNA/DNA，作为模板进行多重PCR反应，其中10×PCR buffer 2.0μL，25mM MgCl2 2.0μL，2.5mΜdNTP 1.6μL，Taq DNAPolymerase2.5U，表1中所述的5对病毒特异性组合引物和1对通用引物，其中GCR，GAR，TGEV，PEDV和PCV2上下游组合引物终浓度各为0.01μM，通用引物上下游引物0.5μM，加ddH2O至反应体系总体积为20μL；反应参数为分为两步：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，15个循环；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环72℃，10min，4℃保存。取5μL扩增产物进行2％的琼脂糖电泳检测。
第六步：结果检测
经琼脂糖凝胶电泳进行检测，普通PCR法检测与本发明检测结果如下：普通PCR检测出PEDV 25份，本发明检测出32份；普通PCR检测出PCV2 36份，本发明检测出44份阳性；普通PCR检测出GCR 6份，本发明检测出10份阳性；普通PCR检测出TGEV 5份，本发明检测出7份阳性；普通PCR检测出GAR 2份，本发明检测出3份阳性；其中，本发明检测出PEDV和PCV2混合感染14份，普通PCR检测出PEDV和PCV2混合感染11份；发明检测出PEDV和GCR混合感染3份，普通PCR检测出PEDV和PCV2混合感染1份；发明检测出TGEV和PCV2混合感染1份，普通PCR检测出TGEV和PCV2混合感染0份。
表明本发明检测效果较好，在具备良好灵敏度的同时，可一次检测出多个猪腹泻病毒混合感染，大大节约时间和试剂成本，提高检测效率。
验证实验：按照本行业所公认的检测精度最好的荧光定量PCR法对上述78份样品进行复查，所得结果完全同本发明。
对比例1、将5对病毒特异性组合引物和1对通用引物改成表1中5对病毒特异性引物，其余等同于实施例4。
试验结果为，富集多重PCR反应对GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2五种病毒的最低检出量分别为5×103copies，5×103copies，5×102copies，5×103copies，5×102copies。
对比例2、将TGEV病毒特异性组合引物改成如下引物对：上游引物TGEV-uF:5’-GGCATCGCATAACATAAGCATTAGGTGATTATTTTCCTACTGT，下游引物TGEV-uR:5’-CGTCCGTCCAACCGTCTGGGTTTAACCTGCACTCACTACCC，其余等同于实施例4。
试验结果为，富集多重PCR反应对GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2五种病毒的最低检出量分别为50copies，50copies，5×102copies，5copies，50copies。
对比例3、将1对通用引物改成如下引物对：UF:5’-CATCGCATAACATAAGCAGC，下游引物UR:5’-CGTCCGTCCAACCGAATATT，其余等同于实施例4。
试验结果为，富集多重PCR反应对GCR、GAR、TGEV、PEDV和PCV2五种病毒的最低检出量分别为50copies，500copies，500copies，50copies，500copies。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江理工大学
<120> 五种猪腹泻病毒富集多重PCR快速检测试剂盒及其应用
<160> 15
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物PEDV-uF
<400> 1
ggcatcgcat aacataagca aacacggcga ctactcagc 39
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物PEDV-uR
<400> 2
cgtccgtcca accgtctggc cttctttagc aacccag 37
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物TGEV-uF
<400> 3
ggcatcgcat aacataagca gtggtgttag gtgattattt tcc 43
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物TGEV-uR
<400> 4
cgtccgtcca accgtctgta tggtttaacc tgcactcact a 41
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAR-uF
<400> 5
ggcatcgcat aacataagca tatgcaatac cagtaggacc ag 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GAR-uR
<400> 6
cgtccgtcca accgtctggc tctacgtagc gagtatgaaa tc 42
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GCR-uF
<400> 7
ggcatcgcat aacataagca tgttgcatcc gtgaagagaa tggt 44
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物GCR-uR
<400> 8
cgtccgtcca accgtctggc attagcccct acgcaagc 38
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物PCV2-uF
<400> 9
ggcatcgcat aacataagca aagaagcgga ccccaac 37
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物PCV2-uR
<400> 10
cgtccgtcca accgtctgag gtggccccac aatga 35
<210> 11
<211> 394
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PEDV标准品
<400> 11
aacacggcga ctactcagct gtgagtaatc cgagtgcggt tctcacagat agtgagaaag 60
tgcttcattt agtctaaaca gaaactttat ggcttctgtc agctttcagg atcgtggccg 120
caaacgggtg ccattatccc tctatgcccc tcttagggtt actaatgaca aacccctttc 180
taaggtactc gcaaacaacg ctgtacccac taataagggg aataaggacc agcaaattgg 240
atactggaat gagcaaattc gctggcgcat gcgccgtggt gagcgaattg aacaaccttc 300
caattggcat ttctactacc tcggaacagg acctcacgcc gacctccgtt ataggactcg 360
tactgagggt gttttctggg ttgctaaaga aggc 394
<210> 12
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGEV标准品
<400> 12
gtggtgttag gtgattattt tcctactgta caaccttggt ttaattgcat tcgcaatgat 60
agtaatgacc tttatgttac actggaaaat cttaaagcat tgtattggga ttatgctaca 120
gaaaatatca cttggaatca cagacaacgg ttaaacgtag tcgttaatgg atacccatac 180
tccatcacag ttacaacaac ccgcaatttt aattctgctg aaggtgctat tatatgcatt 240
tgtaagggct caccacctac taccaccaca gaatctagtt tgacttgcaa ttggggtagt 300
gagtgcaggt taaaccata 319
<210> 13
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAR标准品
<400> 13
tatgcaatac cagtaggacc agtatttcca ccgggtatga attggacgga attgattacc 60
aattattcac cttcaagaga agataacttg caacgtgttt ttacagtagc ttccattaga 120
agcatgttga ttaagtgagg actaggctaa ctacctggta tccgatctta accaacatgt 180
agctatgtca agtcaatcag actctacaag taagggtatg atttcatact cgctacgtag 240
ag 242
<210> 14
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GCR标准品
<400> 14
tgttgcatcc gtgaagagaa tggtgttgta aagaagctag agatctaaca aatctctatg 60
tggactacgc accatgtagc atgattcacg aatgggttta gtccatgctt gcgtaggggc 120
aaatgc 126
<210> 15
<211> 508
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV2标准品
<400> 15
aagaagcgga ccccaaccac acaaaaggtg ggtgttcacg ttgaataatc cttccgagga 60
cgagcgcaag aaaatacggg agcttccaat ctcccttttt gattatttta ttgttggcga 120
ggagggtaat gaggaaggac gaacacccca cctccagggg ttcgctaatt ttgtgaagaa 180
gcaaacattt aataaagtga aatggtattt cggtgcccgc tgccacatcg agaaagcgaa 240
aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac tgattgaatg 300
tggagctcct agatctcagg gacaacggag tgacctgtct actgctgtga gtaccttgct 360
ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg tcagaaattt 420
ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg attggaagac 480
taatgtacac gtcattgtag ggccacct 508

Claims (7)

1.五种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：
包括如下5对病毒特异性组合引物：
PEDV-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-AACACGGCGACTACTCAGC，
PEDV-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-GCCTTCTTTAGCAACCCAG；
TGEV-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-GTGGTGTTAGGTGATTATTTTCC，
TGEV-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-TATGGTTTAACCTGCACTCACTA；
GAR-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-TATGCAATACCAGTAGGACCAG，
GAR-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-GCTCTACGTAGCGAGTATGAAATC；
GCR-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-TGTTGCATCCGTGAAGAGAATGGT，
GCR-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-GCATTAGCCCCTACGCAAGC；
PCV2-uF：GGCATCGCATAACATAAGCA-AAGAAGCGGACCCCAAC，
PCV2-uR：CGTCCGTCCAACCGTCTG-AGGTGGCCCCACAATGA；
还包括如下通用引物对：
UF：GGCATCGCATAACATAAGCA，
UR：CGTCCGTCCAACCGTCTG。
2.根据权利要求1所述的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于还包括如下5对病毒特异性引物：
PEDV-F：AACACGGCGACTACTCAGC，
PEDV-R：GCCTTCTTTAGCAACCCAG；
TGEV-F：GTGGTGTTAGGTGATTATTTTCC，
TGEV-R：TATGGTTTAACCTGCACTCACTA；
GAR-F：TATGCAATACCAGTAGGACCAG，
GAR-R：GCTCTACGTAGCGAGTATGAAATC；
GCR-F：TGTTGCATCCGTGAAGAGAATGGT，
GCR-R：GCATTAGCCCCTACGCAAGC；
PCV2-F：AAGAAGCGGACCCCAAC，
PCV2-R：AGGTGGCCCCACAATGA。
3.根据权利要求1或2所述的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：a)PCR反应液、b)PCR标准品、c)阳性对照品、d)阴性对照品、e) 引物。
4.根据权利要求3所述的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：
所述PCR标准品由以下5种标准品组成：PEDV标准品、TGEV标准品、GAR标准品、GCR标准品、PCV2标准品。
5.根据权利要求3所述的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：
所述PCR反应液包含PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶；所述PCR反应缓冲液含有缓冲液，氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；
所述阳性对照品含TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2五种病毒的阳性质粒混合品；
所述阴性对照品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。
6.根据权利要求3所述的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：5种猪腹泻病毒的病毒特异性组合引物、病毒特异性引物和通用引物的上下游引物同管包装。
7.根据权利要求3所述的5种猪腹泻病毒富集多重PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒避光保存于-20℃。
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