CN104561368A

CN104561368A - 六种猪病毒多重实时荧光定量pcr快速诊断试剂盒

Info

Publication number: CN104561368A
Application number: CN201410524484.XA
Authority: CN
Inventors: 姜永厚; 饶品彬; 吴海港
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-09-30
Also published as: CN104561368B

Abstract

本发明公开了六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，包括如下6对PCR引物：PCV2-F、PCV2-R、PPV-F、PPV-R、PRRSV-F、PRRSV-R、PEDV-F、PEDV-R、PRV-F、PRV-R、CSFV-F、CSFV-R。该试剂盒还包括荧光定量PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和定量PCR标准品。该发明通过一个PCR反应可以从样本中同时检测出PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、省时和快捷。

Description

六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)，猪细小病毒(PPV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪瘟病毒(CSFV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)和伪狂犬病病毒(PRV)六种猪病毒，适用于临床及科研中对六种猪病毒的快速定量检测。

背景技术

近年来，随着养猪业向规模化和集约化方向发展，猪群发生多病原混合感染及继发感染的情况越来越普遍。感染猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)这几种疾病在临床上呈现出相似的呼吸和繁殖障碍的症状，并且它们常常呈混合感染，而且上述疾病的发生使对其它疾病如猪流行性腹泻的诊断变得复杂和困难，死亡率很高，给养猪业造成重大损失。

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是目前已知的最小的动物病毒。PCV具有PCV1和PCV2两种基因型，PCV1无致病性，PCV2有致病性可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道传染疾病、猪繁殖系统障碍等疾病。在哺乳期和育成期的猪最易感染此病，流行病学调查表明，PCV2广泛存在于世界各国的猪群中，临床上易与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)，猪细小病毒(PPV)等其他病原混合感染，表现出多种临床症状和病理变化。

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)在1967年首次发现于英国，目前世界各个国家均有发现。PPV感染导致的临床症状为胚胎和胎儿死亡、母猪流产、死胎和木乃伊胎等，是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。近年来，PPV感染呈扩大上升趋势，并呈现出许多新的流行特点，给养猪业造成巨大的经济损失。研究发现，由PPV引起母猪繁殖障碍疾病与感染PRRSV、CSFV等病毒引起的症状难以区别诊断，给PPV的防治带来了一定的困难。

猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要症状的传染病，并伴随高死亡率，该病于1987年在美国和加拿大首次发现，现在遍布世界各个养猪国家。临床表现为母猪繁殖障碍，呈现流产、早产、死胎、木乃伊胎及子猪成活率下降等病症。我国1996年首次报道该病的存在，临床和血清调查显示，该病在我国普遍存在，且近年来呈流行态势。

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是一种世界性范围高度接触性传染病，可导致妊娠母猪流产，木乃伊胎、畸胎，死产等症状是引发猪瘟的病原。猪瘟的高致病率和高死亡率给养猪业造成了巨大的经济损失，近十年来它的流行和发病特点发生很大变化,呈非典型化态势，临床症状缺乏规律，严重威胁着养猪业的发展。

伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)是引发伪狂犬病的主要病原，可以感染多种家畜和野生动物。对猪的危害极为严重，感染后可引发妊娠母猪流产、产死胎、弱仔及木乃伊胎等症状。该病在猪群中具有死亡率高、传播速度快、流行范围广等特点，我国自1947年首次报道以来，现己扩展到全国二十几个省市，给我国畜牧业特别是养猪业造成了巨大的经济损失。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可达100％。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了我国养猪业的健康发展。

常规的病原学和血清学检测很难将这些疾病同时加以区别鉴定，同时又存在操作繁琐、费时费力、敏感度低等缺陷，尤其是多种病原感染时，难以有效进行早期检测，容易产生误判错判。而多重实时荧光定量PCR技术可以一次同时检测多种病原体，并具有高特异性和敏感性、检测时间短、检测成本低等优点，是一种较为理想的检测方法。因此，开发出一种同时特异检测多种猪病毒感染的多重实时荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，有助于提升病毒检测水平，在疾病诊断和防治及食品安全等方面具有重要的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒：

包括如下6对PCR引物(为六种病毒特异性引物)：

PCV2-F：CGAGAAAGCGAAAGGAA，

PCV2-R：ACTCGATCAGTAAGTTGCC；

PPV-F：GCGTTAGAATAGGATGCGAGGAA，

PPV-R：CGCAAGTCCAAAATCACCTGGC；

PRRSV-F：TGATAGCACAGCTCCACAGA，

PRRSV-R：CCGCGACTTACCTTTAGAGC；

PEDV-F：TGGCATTTCTACTACCTCG，

PEDV-R：AGTGGGTTCAGTCTTTGC；

PRV-F：CGACGGCGTGAACATCCT；

PRV-R：GAACTTGTACGTGCGGTGCT；

CSFV-F:GCTCCCTGGGTGGTCTAAG；

CSFV-R:CTCGTCCACATAGCATCTCG。

作为本发明的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒的改进：

所述试剂盒包括：a)、荧光定量PCR反应液、b)、阳性对照品、c)、阴性对照品和d)、定量PCR标准品；

a)、所述荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶(酶混合物)、六种病毒特异性引物；

所述PCR反应缓冲液包括缓冲液，氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；

备注说明：酶混合物含RNA酶抑制剂，M-MuLV逆转录酶和耐热DNA聚合酶；

b)、所述阳性对照品为：含PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV六种病毒的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μl)；

c)、所述阴性对照品为：灭菌后焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H₂O)；

d)所述定量PCR标准品由以下6种标准品组成：

PCV2标准品、PPV标准品、PRRSV标准品、CSFV标准品、PEDV标准品、PRV标准品。

备注说明：

上述六种病毒标准品序列如下：

所述PCV2标准品序列为：

CGAGAAAGCGAAAGGAACAGATCAGCAGAATAAAGAATACTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTGATCGAGTGTGGAGCTCCTAGATCTCAGGGACAACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAACGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACTAATGTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGTAAAAGCAAATGGGCTGCTAATTTTGCAGACCCGGAAACCACATACTGGAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACC。

PPV标准品序列为：

AAAGTTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATAAACCTAACCAGAAAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTGAATGGCCACTAATATGTGCTTGGTTGGTAAAGAAAGGTTACCAAGCAACAATGGCTAGCTATATGCATCATTGGGGAAATGTACCTGATTGGTCAGAAAAATGGGAGGAGCCAAAAATGCAAACCCCAATAAATACACCAACAGACTCTCAGATTTCCACATCAGTGAAAACTTCGCCAGCGGACAACAACTACGCAGCAACTCCAATACAGGAGGACCTGGATTTAGCTTTAGCCTTGGAGCCGTGGAGCGAGCCAACAACACCAACTTTCACCAACCTGCACTTAACTCCAACACCGCCAGATTCAGCAATACGGACACCAAGTCCAACTTGGTCAGAAATAGAAACCGACATAAGAGCCTGCTTTGGTGAAAACTGTGCACCCACAACAAACCTTGAATAAGGTAGGATGGCGCCTCCTGCAAAAAGAGCAAGAGGTAAGGGTAGTTTTAAGGGGGTGGTGGGCATACATATAAAACTAACTGCAAATAATTTTTTTATATATTACAGGACTAACTCTACCAGGATACAAATACCTTGGTCCAGGAAACTCACTAGACCAAGGAGAACCAACTAATCCATCAGACGCCGC。

PRV标准品序列为：

CGCACCTGCTGTACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCAGATCTTTGGGCGCTGCCGGCGCCGCACCACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACCGGCGCCTGGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTGCTGGAGCGACGACAGCTTCAAGCGGGGCGTGGACGTGATGCGATTCCTGACGC。

PRRSV标准品序列为：

GAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATAGCACAGCTCCACAGAAGGTGCTTTTGGCGTTTTCCATTACCTACACGCCAGTGATGATATATGCTCTAAAGGTAAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCTTCTGCACCTTTTGATCTTTCTGAATTGTGCTTTTACCTTCGGGTACATGACATTCGTGCACTTTGAGAGCACAAATAGGGTCGCGCTCACTATGGGAGCAGTAGTTGCACTTCTTTGGGGAGTGTACTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGC。

PEDV标准品序列为：

TGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATTATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTACAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAACAGGTCCAGATCCCCGAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACC。

CSFV标准品序列为：

GCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTACGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGGGGGTCGCTAGGGTGAAATCACACCACGTGATGGGAGTACGACCTGATAGGGCGCTGCAGAGGCCCACTATTAGGCTAGTATAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGAATCACT。

作为本发明的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒的进一步改进：

每种病毒的特异性引物的上下游引物同管包装。

Tm值范围：

PCV2为76.19～76.53℃、PPV为78.32～78.95℃、PRRSV为81.01～81.55℃、CSFV为84.28～84.87℃、PEDV为86.43～87.21℃和PRV为90.68～91.16℃。

作为本发明的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒的进一步改进：所述的试剂盒避光保存于-20度。

本发明的诊断试剂盒，能用于检测检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和伪狂犬病病毒(PRV)。

本发明提供的快速诊断试剂盒，避光保存于-20度，尽量减少反复冻融。

表1本发明中所设计的荧光定量PCR引物引物

本发明试剂盒的使用方法具体可如下：

每次检测根据具体使用情况设立阴性对照和阳性对照；

标准品用无菌双蒸水稀释为1.0×10²～1.0×10⁸Copies/μl。

RNA/DNA病毒样品提取：根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0(TAKARA)从细胞株、新鲜或冷冻的样本提取病毒核酸。

反转录反应：在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板1μl，使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.RR019A)进行RT-PCR反应，其中10×RTPCR Buffer 1μl，25mM MgCl₂2μl，10mM dNTP Mixture 1μl，40U/μl RNase Inhibitor 0.25μl，5U/μl AMV RTase XL 0.5μl，Random 9mers 0.5μl，RNase Free dH₂O至总体积为10μl，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

核酸的检测：取1～1.5μl已抽提的待测样品核酸RNA/DNA为模板进行多重荧光PCR反应，其中10×PCR buffer 5μl，25mM MgCl₂5μl，2.5mΜdNTP 4μl，20×EvaGreen 2.5μl，Ex TaqDNA聚合酶2.5U，PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV上下游引物终浓度在反应体系中各为0.26、0.12、0.14、0.13、0.05及0.13μM，加ddH₂O至反应体系总体积为50μl；反应参数为：95℃5min；95℃15s，60℃1min，40个循环；熔解曲线程序为95℃15s，60℃1min，95℃15s；从60℃开始收集荧光信号。

标准曲线制作：分别取PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV及PRV重组质粒系列标准品1×10⁰～1×10⁷Copies/μl进行实时定量荧光PCR反应，反应体系：1～1.5μl标准品模板，10×PCRbuffer 5μl，25mM MgCl₂5μl，2.5mΜdNTP 4μl，20×EvaGreen 2.5μl，Ex Taq DNA聚合酶2.5U，PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV上下游引物终浓度在反应体系中各为0.26、0.12、0.14、0.13、0.05及0.13μM，加ddH₂O至反应体系总体积为50μl。反应参数为：95℃5min；95℃15s，60℃1min，40个循环。扩增完成后，以CT值为纵坐标，log₁₀X(X为标准品系列浓度)为横坐标，CT值与log₁₀X呈线性关系，制作标准曲线。

荧光定量结果报告：

1)、通过PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV的扩增产物在熔解曲线中对应的峰值高低及有无来判定检测样品。如果其中PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV相应扩增产物产生特异熔解峰，即对应的Tm值(通过多次试验统计学方法所得PCV2为76.19～76.53℃、PPV为78.32～78.95℃、PRRSV为81.01～81.55℃、CSFV为84.28～84.87℃、PEDV为86.43～87.21℃和PRV为90.68～91.16℃)，则检测结果对应于该种病毒为阳性，即待测样品携带相应病毒，反之，则阴性没有携带相应病毒。

2)、如果检测结果为阳性，根据所获得的标准曲线及待测样品CT值，计算待测标本病毒(Copies/μl)。

本发明的优点：运用实时荧光定量PCR技术，采用PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV六种病毒的特异性引物，开发研制一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒。该发明是通过一个PCR反应可以从样本中同时检测出PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、省时和快捷，并且能够对待检测的病毒进行实时准确定量。本发明提供的试剂盒可区分病毒感染，为病毒感染的检测提供快速简便的工具，从而为实现临床早期诊断和及时制定治疗方案、减少死亡率及后遗症成为可能。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为试剂盒的结构示意图。

图2为六种病毒特异性熔解峰。从左至右依次为：PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV。

图3为含六种猪病毒(PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV)源的疫苗样品混合进行六重实时荧光定量PCR检测实例。

备注说明：上曲线从左到右依次为PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV，下曲线为阴性对照。

图4为阳性样本定量图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1试剂盒结构

参见图1，一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，由荧光定量PCR反应液1、PCV2病毒标准品2、PPV病毒标准品3、PRRSV病毒标准品4、CSFV病毒标准品5、PEDV病毒标准品6、PRV病毒标准品7、阳性对照品8、阴性对照品9和盒体10组成。

在盒体10设有相应的容器孔，用于分别放置定量PCR反应液管、PCV2病毒标准品管、PPV病毒标准品管、PRRSV病毒标准品管、CSFV病毒标准品管、PEDV病毒标准品管、PRV病毒标准品管、阳性对照品管和阴性对照品管。其中荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)3管(标记为)、荧光染料为3管(标记为)、DNA聚合酶为3管(标记为)、六种病毒通用引物(上下游引物同管装)为6管(标记为)。

具体如下：

1)、所述PCR反应缓冲液包括10×PCR buffer、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，每种成分各1管。

2)、荧光染料为Biotum公司生产的EvaGreen(20×)荧光染料共3管。

3)、DNA聚合酶为TaKaRa公司生产的Ex Taq(Code No.RR001A)共3管；

4)、每种病毒通用引物(上下游引物)各装1管。每管上标注引物的浓度。引物的浓度为10uM。

5)、阳性对照品为PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV六种病毒的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μl)；

6)、阴性对照品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H₂O)。

实施例2质粒标准品制备

第一步：引物合成

将本发明所设计的6种病毒引物序列(见表1)在中国上海生工生物公司技术服务公司合成引物，合成量为每引物2OD。

第二步：病毒总DNA/RNA提取

将含有PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV毒源的干粉样品各10ul置于1.5ml离心管中，根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.4.0(TAKARA)提取，得到病毒RNA/DNA。

第三步：反转录合成cDNA

反转录反应：在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板0.5μl，根据TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)(Code No.RR024A)的操作说明书，进行RT-PCR反应，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。

第四步：普通PCR扩增

PCR反应体系(总反应体积25ul)：10×PCR buffer 2.5μL，25mM MgCl₂2μL，2.5mΜdNTP1μl，Taq DNA Polymerase 1U，以第三步中合成cDNA/DNA为模板，第一步中合成的六种病毒引物分别进行PCR扩增。反应在Bio-Rad S1000PCR扩增仪进行反应参数为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min。

第五步：质粒标准品制备

将第四步获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNA Gel Extraction Kit操作方法回收目的片段，将回收产物连接到PMD18-T载体上，通过大肠杆菌DH5α感受态转化，挑取其中白色单菌落进行鉴定，重组质粒序列委托上海生工生物公司进行序列测定。利用PlasmidMiniprep Kit提取测序正确的重组质粒DNA，利用Nanodrop 2000定量重组质粒为1.4×10¹¹Copies/ul、3.5×10¹¹Copies/ul、3.8×10¹²Copies/ul、1.7×10¹²Copies/ul、2×10¹²Copies/ul和4.9×10¹¹Copies/ul分别对应于PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV，以无菌双蒸水将重组质粒按照1.0×10⁸～1.0×10²Copies/ul 10倍梯度稀释制备质粒标准品。

实施例3本发明检测六种病毒特异性实验

第一步：引物合成

第二步：单个病毒在多重体系中的特异性检测

按照EvaGreen多重实时荧光定量PCR反应体系配制6份相同的反应液，分别单独加入1μl的1.0×10⁶Copies/μl的PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV的质粒标准品，即，反应体系为10×PCR buffer 5μl，25mM MgCl₂5μl，2.5mΜdNTP 4μl，20×EvaGreen 2.5μl，Ex TaqDNA聚合酶2.5U，其中PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV上下游引物终浓度各为0.26、0.12、0.14、0.13、0.05及0.13μM，1μl模板，加ddH₂O至反应体系总体积为50μl；反应程序为95℃5min；95℃15s，60℃1min，40个循环：熔解曲线程序为95℃15s，60℃1min，95℃15s；同时进行PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV每种病毒的多重实时荧光定量PCR特异性检测试验。

特异性试验结果显示：在多重反应体系下分别单独加入PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV的质粒标准品进行实时荧光定量PCR反应，每种病毒的扩增片段在其相应目的片段Tm值位置都有特异的目的峰产生(参见图2)，可见本发明中构建的EvaGreen多重实时荧光定量PCR反应体系特异性较好。PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV的Tm范围是通过检测50份阳性样品确定的Tm值，再用统计学方法计算出平均数和标准偏差，所得Tm值范围PCV2为76.19～76.53℃、PPV为78.32～78.95℃、PRRSV为81.01～81.55℃、CSFV为84.28～84.87℃、PEDV为86.43～87.21℃和PRV为90.68～91.16℃。

实施例4本发明检测六种病毒稳定性实验

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

将PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV，分别进行如下操作：

取3份1.0×10⁶Copies/μl的质粒标准品和一份阴性对照品(DEPC-H₂0)，分别进行批内、批间重复试验。批内重复试验是将3份样品在同一次实时荧光中重复3次；批间重复试验是在3次不同时间的试验中(间隔3天)进行实时荧光定量PCR试验。6种病毒的批间、批内重复试验的平均变异系数CV值均小于1％，本发明检测过程中具有良好的稳定性。

实施例5、本发明检测六种病毒敏感性实验

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：敏感性检测

以10倍系列稀释的PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV质粒标准品(1.0×10⁷～1.0×10⁰Copies/μl)做为模板，每个稀释度设立3个重复，分别进行实时荧光定量PCR、普通PCR检测敏感度，比较敏感性。

试验结果表明，本发明可检测出50～100Copies/μl的病毒量，而常规PCR只能检测到1.0×10³～1.0×10⁴Copies/μl的病毒量，由此可见本发明检测病毒的敏感性高于常规PCR约20～100倍。

实施例6、本发明对六种猪病毒六重实时荧光PCR检测实例

第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：病毒总DNA/RNA提取

将含有PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV毒源的干粉样品各10μl置于1.5ml离心管中，根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.4.0(TAKARA)提取，得到各病毒总RNA/DNA(约102ng/μl)。

第三步：反转录合成cDNA

反转录反应：在无RNase的0.2ml PCR管中加入上一步骤制备的总RNA模板1μl，进行RT-PCR反应，其中10×RT PCR Buffer 1μl，25mM MgCl₂2μl，10mM dNTP Mixture 1μl，40U/μl RNase Inhibitor 0.25μl，5U/μl AMV RTase XL 0.5μl，Random 9mers 0.5μl，RNase FreedH₂O至总体积为10μl，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA/DNA模板。

第四步：多重荧光定量PCR扩增

多重荧光定量PCR反应体系(总反应体积50μl)：10×PCR buffer 5μl，25mM MgCl₂5μl，2.5mΜdNTP 4μl，20×EvaGreen 2.5μl，Ex Taq DNA聚合酶2.5U，第三步合成的cDNA DNA(约102ng)和第一步中的病毒引物，其中PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV上下游引物终浓度各为0.26、0.12、0.14、0.13、0.05及0.13μM，加ddH₂O至反应体系总体积为50μl。同时设一阳性对照和一阴性对照(DEPC-H₂O)。反应在ABI 7000荧光定量仪上进行反应参数为：95℃5min；95℃15s，60℃1min，40个循环：熔解曲线程序为95℃15s，60℃1min，95℃15s；从60℃开始收集荧光信号。

第五步:检测结果判定

根据ABI7000荧光定量PCR仪所自动生成的熔解曲线图，来分析扩增结果。

备注说明：Tm值范围PCV2为76.19～76.53℃、PPV为78.32～78.95℃、PRRSV为81.01～81.55℃、CSFV为84.28～84.87℃、PEDV为86.43～87.21℃和PRV为90.68～91.16℃。

结果显示：本发明能很好地同时通过PCR扩增出对应六种病毒扩增产物，并通过熔解曲线峰不同，将六种产物明显区分开来，阴性对照只有一个较小非特异熔解峰，不影响结果判断。本实施例的试验结果见图3。

图3中：上曲线从左到右依次为PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV，下曲线为阴性对照。

根据图3，我们可得以下结论：六种病毒可同时通过一次多重实时荧光PCR反应，扩增出相应目的产物，并能在熔解曲线上，通过Tm的不同，将各种病毒有效区分开来，试验结果与阳性对照品产生的熔解曲线很吻合，而阴性对照熔解曲线上没有熔解峰，可以很直观通过熔解曲线来判定试验结果，证明所检测六种病毒正是PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV。

实施例7本发明临床检测六种猪病毒血清样品试验及对临床检测阳性样品进行准确定量第一步：引物合成

同实施例2中第一步。

第二步：样本采集

血清样本共计67份，其中在浙江地区采集全血34份，粪便13份，组织病料20份。

第三步：总DNA/RNA小量抽提

根据产品使用说明书，用病毒RNA/DNA抽提试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.4.0(TAKARA)从新鲜或冷冻的第二步中采集的样本中提取病毒核酸。

第四步：反转录合成cDNA/DNA：

同实施例5中第三步。

第五步：普通PCR检测和多重荧光定量PCR

1、普通PCR检测：PCR反应体系(总反应体积25μl)：10×PCR buffer 2.5μl，25mM MgCl₂2μl，2.5mΜdNTP 1μl，Ex Taq DNA聚合酶1U，以第四步中合成cDNA/DNA(约100ng)为模板，第一步中合成的六种病毒引物分别进行普通PCR扩增。反应在ABI 7000PCR扩增仪进行反应参数为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min。

2、多重荧光定量PCR过程同实施例5中第四步；

第六步：结果检测

普通PCR结果通过琼脂糖凝胶电泳进行检测；多重荧光定量PCR结果检测同实施例5中第五步。

普通PCR法检测与本发明检测结果如下：

普通PCR法检测与本发明检测结果如下：普通PCR检测出PCV224份，本发明检测出25份阳性；普通PCR检测出PPV 4份，本发明检测出4份；普通PCR检测出PRRSV 11份，本发明检测出13份阳性；普通PCR检测出CSFV 3份，本发明检测出3份阳性；普通PCR检测出PEDV2份，本发明检测出2份阳性；普通PCR检测出PRV 1份，本发明检测出1份阳性；其中CSFV和PRRSV混合感染2份；PRRSV和PCV2混合感染4份；PCV2、PPV与PRRSV混合感染1份。

本发明检测效果明显好于普通PCR检测效果，可以减少假阴性的发生，同时一次可以检测出混合感染，减少二次PCR验证及不需要PCR扩增后续处理，大大节约时间，提高工作效率。

第七步：对阳性检测结果进行准确定量

分别取PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV及PRV重组质粒系列标准品1×10²～1×10⁷Copies/μl进行实时定量荧光PCR反应，反应体系：1μl标准品模板，10×PCR buffer 5μl，25mM MgCl₂5μl，2.5mΜdNTP 4μl，20×EvaGreen 2.5μl，Ex Taq DNA聚合酶2.5U，PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV上下游引物终浓度在反应体系中各为0.26、0.12、0.14、0.13、0.05及0.13μM，加ddH₂O至反应体系总体积为50μl。反应参数为：95℃5min；95℃15s，60℃1min，40个循环，扩增完成后，以CT值为纵坐标，log₁₀X(X为标准品系列浓度)为横坐标，制作标准曲线。

根据所获得的标准曲线及待测样品CT值，计算待测标本病毒Copies/μl。通过结果分析得出所采集样本中PCV2、PRRSV、PRV及CSFV四种病毒的总DNA/cDNA的大都在10⁵～10⁶Copies/μl之间，而在普通PCR检测呈阴性通过本发明检测结果为阳性的样本，其对应拷贝数值在10³Copies/μl左右。其中PRV阳性样本准确定量见图4，其在标准曲线上的CT值为23.21，通过CT值与log₁₀X(X为标准品系列浓度)的线性关系，计算出的DNA拷贝数为10^5.7Copies/μl左右。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江理工大学

<120> 六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒

<160> 12

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PCV2-F

<400> 1

cgagaaagcg aaaggaa 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PCV2-R

<400> 2

actcgatcag taagttgcc 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PPV-F

<400> 3

gcgttagaat aggatgcgag gaa 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PPV-R

<400> 4

cgcaagtcca aaatcacctg gc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PRRSV-F

<400> 5

tgatagcaca gctccacaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PRRSV-R

<400> 6

ccgcgactta cctttagagc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PEDV-F

<400> 7

tggcatttct actacctcg 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PEDV-R

<400> 8

agtgggttca gtctttgc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PRV-F

<400> 9

cgacggcgtg aacatcct 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PRV-R

<400> 10

gaacttgtac gtgcggtgct 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CSFV-F

<400> 11

gctccctggg tggtctaag 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物CSFV-R

<400> 12

ctcgtccaca tagcatctcg 20

Claims

1.六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

包括如下6对PCR引物：

PCV2-F：CGAGAAAGCGAAAGGAA，

PCV2-R：ACTCGATCAGTAAGTTGCC；

PPV-F：GCGTTAGAATAGGATGCGAGGAA，

PPV-R：CGCAAGTCCAAAATCACCTGGC；

PRRSV-F：TGATAGCACAGCTCCACAGA，

PRRSV-R：CCGCGACTTACCTTTAGAGC；

PEDV-F：TGGCATTTCTACTACCTCG，

PEDV-R：AGTGGGTTCAGTCTTTGC；

PRV-F：CGACGGCGTGAACATCCT；

PRV-R：GAACTTGTACGTGCGGTGCT；

CSFV-F:GCTCCCTGGGTGGTCTAAG；

CSFV-R:CTCGTCCACATAGCATCTCG。

2.根据权利要求1所述的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒包括：a)、荧光定量PCR反应液，b)、阳性对照品，c)、阴性对照品和d)、定量PCR标准品；

a)、所述荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶、六种病毒特异性引物；

b)、所述阳性对照品为：含PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV六种病毒的阳性质粒混合品；

c)、所述阴性对照品为：灭菌后焦碳酸二乙酯处理水；

d)、所述定量PCR标准品由以下6种标准品组成：

3.根据权利要求1或2所述的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

每种病毒的特异性引物的上下游引物同管包装。

4.根据权利要求3所述的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：

Tm值范围：

5.根据权利要求4所述的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒避光保存于-20度。