CN107988435A

CN107988435A - 一种检测pcv2、prv、prrsv的多重pcr引物组

Info

Publication number: CN107988435A
Application number: CN201810012579.1A
Authority: CN
Inventors: 单虎; 解倩倩; 杨瑞梅; 单恒; 单一恒; 秦志华; 张洪亮
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2018-05-04

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测PCV2、PRV、PRRSV的三重PCR检测方法及寡核苷酸引物对。根据保守序列片段分别设计三对特异性引物，探索最佳反应体系和反应条件，对建立的PCR反应方法进行敏感性试验、特异性试验、重复性试验，并对临床具有发热、呼吸困难、腹泻、神经症状、免疫抑制及种猪繁殖障碍等症状病畜样本进行PCR检测。试验结果表明本研究所建立的三重PCR检测方法具有很好的应用性，能够用于猪圆环病毒病、猪伪狂犬病和猪蓝耳病的检测。

Description

一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组及检测方法。

背景技术

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒Ⅱ型引起的猪呼吸道疾病综合征、皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭以及繁殖障碍等多种症状的传染病。德国学者Tischer在1974首次发现圆环病毒，此后很多国家陆续报道了猪圆环病毒病的发生。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的主要侵害机体生殖系统和神经系统的传染病。猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的呼吸道症状和母猪繁殖障碍的一种急性传染病。

猪圆环病毒病、猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸障碍综合征不仅引起猪只高死亡率，而且还会导致机体产生免疫抑制，引起其他病原的继发感染、药物疗效降低及造成疫苗免疫失败，对当前养猪业存在很大的威胁。这三种病均能引起发热、呼吸困难、腹泻、神经症状、免疫抑制及对种猪引起繁殖障碍等临床症状，病理变化和流行病学极为相似，临床上很难区分，因此建立PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR检测方法具有重要意义。

PCR是近年来动物疫病最常用的临床检测方法，具有灵敏度高、特异性好等优点，而多重PCR是在单一PCR的基础上加入多对引物，通过对反应条件和程序的不断优化，建立的一种可以在一个反应体系中同时扩增出多个核酸片段的检测方法，可以同时检测多种特定病原的单一或混合感染，具有省时省力，操作简单、快速，且具有很高的特异性和灵敏度，因此有很高的应用价值和前景。但多重PCR的一种关键问题是获得能再一次反应中进行扩增的引物组。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组及检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组，所述的引物组中包含有：

检测PCV2的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1；下游引物的序列为SEQ IDNO:2；

检测PRV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3；下游引物的序列为SEQ IDNO:4；

检测PRRSV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5；下游引物的序列为SEQID NO:6；

本发明的引物组用于制备检测PCV2、PRV、PRRSV的试剂盒；

本发明再一个方面提供一种用于非疾病诊断治疗目的的检测PCV2、PRV、PRRSV的方法，其PCR最佳反应条件：95℃5min；94℃30s，52.1℃35s，72℃30s，循环31次；最后4℃冷却10min。

本发明通过序列比对，针对基因的同源性序列设计引物，既能保证鉴定病原的正确性，又确保不漏检同种不同株病原，提高检测的特异性。另外，本发明的扩增片段长度适宜，三种PCR产物可根据长度明显区分。另外，通过PCR反应体系和反应条件的优化，得到特异性和灵敏性较高的针对特定基因的PCR检测方法。经最终实验证实，本发明的PCR检测方法由于引物设计和实验体系的选取，该方法对PCV2的最低检出浓度为4.53×10^-5ng/μL，对PRV的最低检出浓度为6.24×10^-5ng/μL，对PRRSV的最低检出浓度为6.37×10^-5ng/μL。且成本低廉，能够同步快速实现对PCV2、PRV和PRRSV的特异性和敏感性检测。

附图说明

图1为PCV2基因部分保守序列分析结果。

图2为PRV/猪猪孢疹病毒基因部分保守序列分析结果。

图3为PRRSV基因部分保守序列分析结果。

图4为PCV2扩增序列比对结果。

图5为PRV扩增序列比对结果。

图6为PRRSV扩增序列比对结果。

图7为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳酶浓度，M代表DNA MarkerDL1000，第1-7泳道分别代表Taq酶的添加量为0.3μL-0.9μL时的PCR扩增结果。

图8为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳引物浓度，M代表DNA MarkerDL1000，第1-7泳道分别代表引物的添加量为0.5μL-1.1μL时的PCR扩增结果。

图9为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳退火温度，M代表DNA MarkerDL1000，第1-7泳道分别代表退火温度为50.0℃-55.0℃时的PCR扩增结果。

图10为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳循环次数，M代表DNA MarkerDL1000，第1-7泳道分别代表循环次数为23次-35次时的PCR扩增结果。

图11为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的特异性试验结果，M代表DNA MarkerDL1000，第1-7泳道分别为以PCV2、PRV的DNA和PRRSV的cDNA的混合核酸；PCV2的DNA；PRV的DNA；PRRSV的cDNA；PEDV的cDNA；CSFV的cDNA及ddH2O为模板的扩增结果。

图12为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的敏感性试验结果，M代表DNA MarkerDL1000，第1-6泳道分别为10^-1～10^-6倍稀释的PCV2、PRV的DNA和PRRSV的cDNA的混合核酸扩增结果；第7泳道是以ddH2O为模板的扩增结果。

具体实施方式

1、本发明所涉及的实验材料及组分记载如下：

1.1毒株及临床样品

PCV2、PRV、PRRSV疫苗均购自瑞普生物技术股份有限公司；79份猪圆环病、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸障碍综合征的疑似病料采集自2016年6月至2016年12月山东境内13个猪场的患病猪只。

1.2试验试剂

DNA zol Reagent、RNA iso Plus、premix Taq(Ex Taq Versionn 2.0plus dug)、dNTPs、Ex Taq、Recombinant RAase Inhibitor、5×Rever TranscriptaseM/MLV Buffer、Rever Transciptase M-MLV、dNTP、DNA Marker(DL1000)购自TaKaRa公司；DEPC购自Sigma公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇购自上海国药。

1.3试验仪器

台式高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；超净工作台：苏州净化设备有限公司；PCR扩增仪：Applied Biosystems 9700，Applied Biosystems；电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器有限公司；微量振荡器：金坛市恒丰仪器厂；紫外可见分光光度计：日本岛津；全温振荡器：中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；电子天平：上海海康电子仪器厂；紫外凝胶成像系统：T2A，BIO-RAD。

2、本发明所所涉及的方法步骤记载如下：

2.1病料的处理

取病猪的淋巴结、扁桃体、脾脏等病变实质器官，剪取5～10g，置于灭菌的小烧杯中剪碎，加入约4倍体积的灭菌PBS，然后将组织混合物转移到研钵中研磨至糊状，反复冻融3次，12000rpm离心10min，取上清保存于-80℃冰箱。

2.2病毒DNA的提取

(1)在离心管加入250μL组织匀浆和750μL DNAzol，使其充分混匀后，在室温条件下孵育5min，12 000rpm 4℃离心10min。

(2)取500μL上清放入新的1.5mL离心管中，然后在离心管中加入-20℃预冷的无水乙醇500μL，充分混匀后，在室温条件下孵育5min。

(3)12 000rpm 4℃离心10min。

(4)将上清弃去，用1mL 75％的乙醇洗涤1～2次，12 000rpm 4℃离心5min。

(5)洗涤完成后，将洗涤液弃去，把离心管倒置在超净工作台的吸水纸上进行干燥，最后用30μL ddH₂O将DNA溶解，放在-20℃冰箱保存备用。

2.3病毒RNA的提取及反转录为cDNA

2.3.1病毒RNA的提取

(1)在250μL组织匀浆中加入750μL RNA iso Plus，混匀后，在室温条件下孵育5min。

(2)加入250μL氯仿，混匀后，室温下孵育5～15min。

(3)12 000rpm 4℃离心10min。

(4)取500μL上清放于新的1.5mL离心管中，加入-20℃预冷的异丙醇500μL，混匀后，孵育10min。

(5)12 000rpm 4℃离心10min。

(6)将上清弃去，用1mL在-20℃预冷的75％的乙醇洗涤1～2次，12000rpm 4℃离心5min。

(7)洗涤完成后，将洗涤液弃去，把离心管倒置在超净工作台的吸水纸上进行干燥，用30μL DEPC水将RNA溶解，保存在-80℃冰箱。

2.3.2病毒RNA反转录为cDNA

按照表2-1反转录体系在20μL的PCR反应管中加入试剂，充分混匀，在水浴锅42℃温度下水浴l h，然后在水浴锅70℃温度下水浴10min，将反转录好的cDNA保存于-20℃冰箱。

实施例1：引物的设计与合成

比对GenBank上发表的PCV2、PRV和PRRSV基因，选取同源性较高的区域(部分保守序列分析结果见附图1～3)，使用Primer premier5.0软件分别设计出PCV2的特异性检测引物PCV2-F/R、PRV的特异性检测引物PRV-F/R和PRRSV的特异性检测引物PRRSV-F/R，由Takara公司合成，用ddH₂O按20pmol/μL稀释后，置-20℃冻存。序列如下见表1：

表1引物名称、序列、扩增长度

2.5多重PCR方法的建立

2.5.1多重PCR最佳酶浓度的筛选

将提取的PCV2、PRV的DNA溶液和反转录的PRRSV的cDNA溶液等比混合作为模板，用25μL的反应体系进行PCR扩增，对酶浓度进行优化，确定PCR反应体系的最佳酶浓度。

2.5.2多重PCR最佳引物浓度的筛选

将提取的PCV2、PRV的DNA溶液和反转录的PRRSV的cDNA溶液等比混合作为模板，用25μL的反应体系进行PCR扩增，对引物浓度进行优化，确定PCR反应体系最佳引物浓度。

2.5.3多重PCR最佳退火温度的筛选

将提取的PCV2、PRV的DNA溶液和反转录的PRRSV的cDNA溶液等比混合作为模板，用25μL的反应体系进行PCR扩增，对退火温度进行优化，确定PCR反应体系的最佳退火温度。

2.5.4多重PCR最佳循环次数的筛选

将提取的PCV2、PRV的DNA溶液和反转录的PRRSV的cDNA溶液等比混合作为模板，用25μL的反应体系进行PCR扩增，对循环次数进行优化，确定PCR反应体系的最佳循环次数。

2.5.5特异性试验

用建立的PCV2、PRV、PRRSV三重PCR方法，以阳性病料中提取的PCV2、PRV、PRRSV的等比混合核酸溶液，PCV2、PRV的DNA，PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的cDNA以及ddH₂O为模板进行目的基因的扩增，然后分别将PCR产物进行电泳鉴定，检验所建立的单一PCR方法的特异性。

2.5.6敏感性试验

用紫外分光光度计测定PCV2、PRV的DNA浓度以及PRRSV的cDNA的浓度，然后将核酸进行等比混合进行10倍的梯度稀释，共稀释6个梯度，用建立的PCV2、PRV和PRRSV的三重PCR方法进行扩增，将PCR产物进行电泳，然后观察结果以确定反应的敏感性。

2.5.7重复性试验

按已优化的PCV2、PRV和PRRSV的三重PCR方法的最优条件对PCV2、PRV和PRRSV混合核酸溶液进行PCR扩增，重复5次，以验证结果的可靠性。2.5.8临床样品检测

对采集自山东省内13个猪场的79份样品进行单一PCR和多重PCR的检测，来验证二者之间的符合率，并进行ELISA方法来检测病料，与PCR方法的结果进行比较。

实施例2：阳性参考品的制备检测

3.1目的片段PCR的扩增

用PCV2、PRV和PRRSV的单一PCR方法的分别对PCV2、PRV和PRRSV进行目的基因的扩增，并进行电泳鉴定。将PCV2、PRV和PRRSV的PCR产物分别送至生物公司进行测序。

3.2目的片段的纯化回收

在紫外灯下将目的条带迅速切下，用吸水纸吸干表面残存液体后，装在已称重的1.5mL离心管内，再次称量离心管和胶的重量，根据差值求得胶的重量。将已切取的胶用胶回收试剂盒对目的基因进行回收。步骤如下：

(1)向离心管中加入和胶等体积的Binding buffer(XP2)，在50～55℃的水浴锅中孵育7min，每隔2～3min摇晃混匀。

(2)充分溶解后，将液体转移至收集管中，10 000rpm离心1min。

(3)倒掉收集管内的液体，加入300μL Binding buffer(XP2)，10 000rpm离心1min。

(4)弃掉收集管内的液体，加入700μL SPW Wash Buffer，10 000rpm离心1min。

(5)重复步骤(4)

(6)弃掉收集管内液体，10 000rpm离心2min。

(7)将HinBind DNA管放入一个新的离心管上，在膜中央加入15～30μL的ElutionBuffer，然后静置1min，并在12 000rpm离心2min，最后将回收的产物放置在-20℃冰箱，保存备用。

3.3目的片段与pDM18-T载体的连接

按10μL的反应体系(见表1-3)，将胶回收产物与pDM18-T载体进行连接，将各组分加入PCR管中轻轻混匀，然后在16℃下放置3～5个小时，整个操作需要在冰浴上进行。

表2目的片段与pDM18-T载体连接体系(10μL)

3.4连接产物的转化及菌液的制备

(1)取50μL DH5α感受态细胞，冰浴至完全融化。

(2)取10μL连接产物加入完全融化的感受态细胞中，轻轻吹打混匀后，冰浴30min。

(3)30min后，将连接产物和感受态细胞取出，放入水浴锅中，在42℃下热激90s，再立刻冰浴90s。

(4)冷却后，加入400μL SOC培养液，轻轻混匀，放置在摇床中，在37℃，220rpm/min条件下振荡培养45min～60min。

(5)将培养物取出，在室温条件下，3 000rpm离心5min，然后弃去300μL上清。

(6)吹打混匀剩下的培养物和细胞沉淀，然后均匀的涂布在固体培养基上。

(7)将平板倒置放入37℃培养箱内进行培养，培养12～14h。

(8)用无菌枪头挑取平板上均匀分布的单个菌落，接种到液体培养基中，在摇床37℃下培养过夜。

将培养好的菌液送至生物公司测序鉴定，鉴定正确后进行质粒的提取。

3.5重组质粒的提取及鉴定

(1)取200μL Buffer GPS浸柱，静置3～5min后，室温下12 000rpm离心2min。

(2)取5mL的菌液，室温下10 000rpm离心1min。

(3)弃去上清。

(4)加入250μL SolutionⅠ，充分振荡混匀，然后转移至1.5mL的离心管中。

(5)加入250μL SolutionⅡ，轻轻混匀，混4～6次。

(6)加入300μL SolutionⅢ，轻轻混匀，混4～6次，然后13 000rpm离心10min。

(7)用移液器吸取750μL上清转移至柱内，10 000rpm离心1min，弃掉液体。

(8)加入500μL Buffer HB，10 000rpm离心1min，弃掉液体。

(9)加入700μL WASH Buffer，10 000rpm离心1min，弃掉液体。

(10)重复一遍步骤(9)。

(11)在室温条件下，13 000rpm离心2min。

(12)将柱子放在一个新的离心管中，在膜中央加入30μL～50μL Elution Buffer，静止2min，然后13 000rpm离心1min，将提取的质粒放在-20℃冰箱保存备用。

将提取的重组质粒进行PCR鉴定并送至生物公司测序，测序正确后将作为标准阳性质粒模板。

3结果与分析

3.1多重PCR检测方法的最终反应条件的确立

通过反复多次对多重PCR反应过程中的酶浓度进行优化，确定了PCV2、PRV、PRRSV的三重PCR方法的最佳Taq酶的添加量为0.5μL、引物最佳添加量为0.7μL、最佳退火温度是52.1℃、最佳循环次数是31次(结果见附图4～7)。

PCR最佳反应体系：总体积为25μL，Taq酶0.5μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPMixture 4.0μL，PCV2-F 0.7μL，PCV2-R 0.7μL，PRV-F 0.7μL，PRV-R 0.7μL，PRRSV-F 0.7μL，PRRSV-R 0.7μL，DNA模板4.0μL，cDNA模板2.0μL，灭菌dd H2O 7.8μL。

通过反复多次对多重PCR反应过程中的引物浓度、酶浓度、退火温度和循环次数进行优化，确定了PCV2、PRV、PRRSV的三重PCR方法的最佳反应条件：95℃5min；94℃30s，52.1℃35s，72℃30s，循环31次；最后4℃冷却10min，扩增结束。通过建立的三重PCR方法对阳性病料的核酸进行目的基因的扩增，扩增出的目的条带与预期条带大小相符，PCV2扩增的目的条带150bp，PRV扩增的目的条带349bp，PRRSV扩增的目的条带689bp。

3.2多重PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性实验结果

分别提取PCV2、PRV、PRRSV、PEDV、CSFV阳性病料的核酸，应用建立的PCV2、PRV、PRRSV三重PCR方法，对PCV2、PRV、PRRSV等比混合核酸，PCV2、PRV的DNA溶液，PRRSV、PEDV、CSFV的cDNA溶液及ddH2O进行PCR扩增，结果应用建立的多重PCR方法，只有在检测PCV2、PRV、PRRSV的混合核酸，PCV2的DNA溶液，PRV的DNA溶液，PRRSV的cDNA溶液时会出现预期的目的条带，其他病原均没有出现扩增条带，不存在交叉反应，表明所建立的PCV2、PRV、PRRSV的三重PCR检测方法具有很好的特异性(结果见附图8)。用紫外分光光度计测定PCV2的DNA浓度为45.3ng/μL，PRV的DNA浓度为62.4ng/μL，PRRSV的cDNA的浓度为63.7ng/μL，然后将PCV2、PRV的DNA以及PRRSV的cDNA等比混合后进行10倍的梯度稀释，共稀释6个梯度，用建立的PCV2、PRV和PRRS的三重PCR方法进行扩增，PCV2检测到的最低浓度为4.53×10^-5ng/μL；PRV能检测到的最低浓度为6.24×10-5ng/μL，PRRSV能检测到的最低浓度为6.37×10^-5ng/μL(结果见附图9)。按已优化的多重PCR方法将PCV2、PRV的DNA和PRRSV的cDNA的混合核酸溶液进行扩增，重复5次，结果均可通过扩增得到预期目的片段，说明建立的多重PCR方法具有良好的重复性。

实施例3：临床样品检测结果

对采集自2016年3月至2016年12月山东境内13个猪场的79份疑似病例进行单一PCR和多重PCR的检测，单一PCR检出PCV2 36份，PRV检出28份，PRRSV检出22份；多重PCR检出PCV2 35份，PRV检出28份，PRRSV检出22份。其中检出PCV2、PRV双重感染样品14份，PCV2、PRRSV双重感染样品9份，PRV、PRRSV双重感染样品6份，PCV2、PRV、PRRSV三重感染样品2份。

本发明成功建立了检测猪圆环病毒病、猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸障碍综合征的三重PCR检测方法，根据上述研究结果，本研究所建立的PCR检测方法具有很好的应用性，能够用于上述三种疫病的检测。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caaggacagg tttcgggg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggctccac tgctgttact 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacctgctg gactttatcg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtcaggact cgcatcac 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgctaagccg caagtacgtt ct 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacacggtcg ccctaataga at 22

Claims

1.一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中包含有：

检测PCV2的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1；下游引物的序列为SEQ ID NO:2；

检测PRV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3；下游引物的序列为SEQ ID NO:4；

检测PRRSV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5；下游引物的序列为SEQ IDNO:6。

2.权利要求1所述的引物组在制备检测PCV2、PRV、PRRSV的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为PCR扩增检测试剂盒。

4.一种PCR扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。

5.一种用于非疾病诊断治疗目的的检测PCV2、PRV、PRRSV的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的引物组对待检测样品进行PCR扩增检测。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCRDE反应条件如下：95℃5min；94℃30s，52.1℃35s，72℃30s，循环31次；最后4℃冷却10min。