CN101906482B - 草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

一种草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，包括：1.内脏组织中病毒RNA提取试剂：DEPC水；蛋白酶K(1mg/mL，pH8.0)；SDS(1％)；酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；氯仿/异戊醇(24/1)；异丙醇；70％乙醇；2.细胞感染病毒的RNA提取试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；70％乙醇；DEPC水；3.RT反应试剂成分：5×AMV Buffer，dNTP，DEPC水，反向引物R1，RNA酶抑制剂RNAsin(RI)，反转录酶AMV；4.PCR反应试剂成分：10×PCR buffer(含mg2+)，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)；特异性寡核苷酸引物F1和引物R1；DEPC水和Taq E(5U/uL)，所述正向引物F1：5’-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3’；所述反向引物R1：5’TTGGAGACGAACATAGACGC-3。本发明用于草鱼呼肠孤病毒基因诊断。

Description

草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉水生动物病毒的诊断试剂盒及其应用，主要是针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV，Grass carp reovirus)第六基因片段保守部分的诊断试剂盒及检测方法。
背景技术
草鱼出血病病毒(Grass Carp Hemorrhage Virus，GCHV)，属于水生呼肠孤病毒，病毒颗粒为二十面体对称的球形颗粒，其成熟病毒直径为75nm，具有双层衣壳，无囊膜，其基因组由11条dsRNA组成，在pH3-11范围内十分稳定，对氯仿和乙醚有抗性。国际病毒分类委员会第五次会议决定在呼肠孤病毒科中正式新建水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus，ARV)，并将草鱼出血病病毒纳入该属，命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，但有别于其它六个亚型(A-F)的水生呼肠孤病毒的代表种，而单独列为第七个亚型(G)的代表种。GCRV是我国分离的第一种鱼类病毒，也是中国在国际上首次完成全基因序列分析的第一株水生呼肠孤病毒，并且各基因序列已登录GenBank。该病毒是水生呼肠孤病毒属中毒力最强的病毒，能引起草鱼出血病的流行。该病流行于我国各地养殖区，尤以长江流域和广东、广西、福建最为普遍，流行季节在每年5月初和10底之间，水温在20℃开始流行，最适流行水温为27℃-30℃，死亡率可达50％-80％。每年造成数万吨鱼产量损失，严重影响我国草鱼养殖业的发展。目前对于草鱼病毒病还未有特效的治疗方法，推行草鱼的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。早期快速诊断草鱼呼肠孤病毒是目前草鱼养殖所采取的主要预防措施的前提，也是减少草鱼损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大草鱼养殖者急切盼望的。多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。虽然关于GCRV RT-PCR方法也有文献报道，但只有用于设计引物的原株病毒为PCR阳性，扩增不出其它GCRV的相应片段，本试验根据GenBank已发表的GCRV及其它水生呼肠孤病毒的第六基因片段，在保守区设计了一对GCRV特异性引物，建立了GCRV快速诊断方法，在国内外尚无报道。该方法的建立为草鱼呼肠孤病毒的快速诊断和病原调查提供技术支撑。
发明内容
本发明目的是利用GCRV基因保守区序列设计一对引物，建立GCRVRT-PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供草鱼呼肠孤病毒的快速基因诊断试剂盒和检测方法。该试剂盒操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于草鱼出血病的快速检测及草鱼鱼种和草鱼养殖过程中的GCRV的跟踪检测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率；也可用于草鱼肾细胞系(CIK)分离病毒的鉴定，为病毒的进一步研究奠定基础，具有很高的实用价值。
本发明提供的草鱼呼肠孤病毒的基因诊断试剂盒包括：
1)内脏组织中病毒RNA提取试剂：DEPC水；蛋白酶K(1mg/mL，pH8.0)；SDS(1％)；酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；氯仿/异戊醇(24/1)；异丙醇；70％乙醇；
2)细胞感染病毒的RNA提取试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；70％乙醇；DEPC水；
3)RT反应试剂成分：5×AMV Buffer，dNTP，DEPC水，，反向引物R1，RNA酶抑制剂RNAsin(RI)，反转录酶AMV；
4)PCR反应试剂成分：10×PCR buffer(含mg2+)，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)；特异性寡核苷酸引物F1和引物R1；DEPC水和Taq E(5U/uL)，
5)所述的特异性寡核苷酸引物F1和R1：是根据GCRV第六基因片段保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：
正向引物F1：5’-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3’
反向引物R1：5’-TTGGAGACGAACATAGACGC-3
使用草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因诊断试剂盒检测方法程序如下：
(1)肝脾肾组织中病毒RNA的提取
发病鱼的组织60-100mg加入500μL DEPC水捣碎匀浆，8,000-10,000r/m离心5-10min，取上清，加40μL蛋白酶K和40μL1％SDS，37℃孵育30min；再加入600μL酚/氯仿/异戊醇((25/24/1))，充分混匀30S，10,000-12,000r/m离心5-10min，取上层水相；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1))混合液，充分混匀30S，10,000-12,000r/m离心5-10min取上层水相；加入等体积的异丙醇，混匀后室温15-20min或-20℃1h-2h，沉淀核酸，12,000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备用。
(2)草鱼肾细胞(CIK)感染病毒的RNA的提取
染毒的CIK细胞液反复冻融三次，取250μL病毒悬液，加750μL Trizol高速混匀，室温3-5min，再加200μL氯仿剧烈摇晃，室温3-5min；12,000r/m离心10-15min，吸上清450-500μL，再加入等体积异丙醇，室温沉淀15-20min，12,000r/m离心10-15min，70％乙醇洗涤，吹干。再加入适量DEPC水溶解，备用。
(3)RT-PCR扩增
RT反应：反应体系共25μL
RNA模板            13.5μL
Rnasin(RI)         0.5μL(20U)
所述反向引物R1     1μL(120nmol/L)
置于72℃水浴中作用10min，冰浴5min。
然后依次加入
5×AMV Buffer      5.0μL
dNTP               4μL(每种dNTP溶液浓度均为2.5mmol/L)
AMV反转录酶        1μL(5U)
置于42℃水浴中作用1h，再95℃作用5min灭活AMV。
PCR反应：反应体系为50μL
反转录模板         1.0μL
10×PCR Buffer     5.0μL(含Mg2+)
dNTP               4μL(浓度同上)
Taq E              0.25μL(1.25U)
所述正向引物F1     1μL
所述反向引物R1     1μL
DEPC-H2O           37.75μL
PCR扩增程序
(1)95℃    3min
(2)94℃    50s
(3)52℃    50s
(4)72℃    50s
(5)回到第2步，重复30次
(6)72℃    7min
(7)4℃     5min
(4)电泳、PCR产物结果判定
取PCR产物5μL，制备1％琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成像系统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，PCR阳性结果为436bp。
使用阳性或阴性对照的目的是用于比较扩增产物的电泳结果，以便判断待测样品是否含有草鱼呼肠孤病毒。若含有GCRV，则从电泳结果可以观察到与阳性对照位置相同的条带；若不含GCRV，则与阴性对照一样不具有这一条带。
附图说明
图1为实施例二中：草鱼组织中草鱼呼肠孤病毒检测结果。
M.DL2000 DNA Marker；1.GCRV阳性对照；2-6.检测样品(其中2-4样品RT-PCR检测结果在436bp处有一条带，显示GCRV结果为阳性，而5-6为阴性)；7.阴性对照
图2为实施例三中：CIK细胞感染病毒检测结果。
M.DL2000 DNA Marker；1.GCRV阳性对照；2-4.检测样品(RT-PCR检测结果全为阳性)；5.阴性对照
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：草鱼呼肠孤病毒的基因诊断试剂盒
该试剂盒由以下各部分构成(提取组织和细胞中病毒各10样份)：
1、组织中病毒RNA提取液A、B、C、D液各1管，A为0.5mL蛋白酶K(4℃冰箱保存)，B为0.5mL 1％SDS，C为8mL酚/氯仿/异戊醇混合液，D为8mL氯仿/异戊醇混合液。
2、细胞中病毒RNA提取液a，b各1管，a为10mL Trizol液，b为2.5mL氯仿(也可自备)。
3、E液，1管，内装异丙醇(也可自备)，共10mL。
4、F液，2管，10mL/管，内装70％乙醇(也可自备)。
5、G液，2管，5mL/管，内装DEPC水。
6、RT反应液H、I液各1管，内装RT反应液(25μL体系)，其中H液30μL/管，包括反向引物R1(120nmol/L)和RNAsin(RI)(40U/μL)；I液200μL/管，包括5×AMV Buffer，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，反转录酶AMV(5U/μL)。
7、RT-PCR反应液(J液)，1管，1mL/管，内装RT-PCR反应液(50μL体系)，包括10×PCR buffer(含mg2+)，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)；正向引物F1、反向引物R1(120nmol/L)；ddH2O和Taq E(5U/μL)。
8、阳性对照(K液)和阴性对照(L液)，各1管，25μL/管，分别内装GCRV阳性模板和阴性模板。
该试剂盒中一对特异性引物序列如下：
F1：5’-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3’
R1：5’-TTGGAGACGAACATAGACGC-3
RT反应液体系(25μL体系)如下：
Rnasin(RI)            0.5μL
反向引物R1            1μL
5×AMV Buffer         5.0μL
dNTP                  4μL
AMV                   1μL
RT-PCR反应液体系(50μL体系)如下：
10×PCR Buffer(含Mg2+)    5.0μL
dNTP                      4μL
正向引物F1                1μL
反向引物R1                1μL
DEPC-H2O                  37.75μL
Taq E                     0.25μL
使用实施例一的试剂盒，进行实施例二和例三的应用，具体分别按下列步骤进行：
实施例二：草鱼肝脾肾组织中GCRV的检测
(1)样品核酸的提取
发病鱼的组织100mg加入500μL DEPC水捣碎匀浆，10,000rpm离心10min，取上清，加40μL蛋白酶K和40μL1％SDS，37℃孵育30min；再加入600μL酚/氯仿/异戊醇，充分混匀30S，12,000rpm离心5min，取上层水相；再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，充分混匀30S，12,000rpm离心5min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，混匀后-20℃1h以上沉淀核酸，12,000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备用。
(2)RT-PCR扩增
RT反应：反应体系共25μL
RNA模板            13.5μL
Rnasin(RI)         0.5μL
所述反向引物R1     1μL
置于72℃水浴中作用10min，冰浴5min。
然后依次加入
5×AMV Buffer      5.0μL
dNTP               4μL
AMV反转录酶        1μL
置于42℃水浴中作用1h，再95℃作用5min灭活AMV。
PCR反应：反应体系为50μL
反转录模板         1.0μL
10×PCR Buffer     5.0μL
dNTP               4μL
Taq E              0.25μL
所述正向引物F1     1μL
所述反向引物R1     1μL
DEPC-H2O           37.75μL
同时设立GCRV阳性和阴性对照，PCR反应体系所加量同上，只是将模板换做试剂盒所提供的已反转录的cDNA阳性和阴性模板。
PCR扩增程序
(1)95℃    3min
(2)94℃    50s
(3)52℃    50s
(4)72℃    50s
(5)回到第2步，重复30次
(6)72℃    7min
(7)4℃     5min
(3)电泳、PCR产物结果判定
取PCR产物5μL，制备1％琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成像系统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，GCRV的PCR阳性结果应在436bp处有一条带。电泳结果如图1所示。
实施例三：草鱼肾细胞分离GCRV的检测
(1)CIK细胞感染病毒的RNA的提取
染毒的CIK细胞液反复冻融三次，取250μL病毒悬液，加750μL Trizol高速混匀，室温5min，再加200μL氯仿剧烈摇晃，室温5min；12,000rpm离心15min，吸上清500μL，再加入500μL异丙醇，室温沉淀15-20min，12,000rpm离心15min，70％乙醇洗涤，吹干。再加入适量DEPC水溶解，备用。
(2)RT-PCR扩增
RT反应：反应体系共25μL
RNA模板            13.5μL
Rnasin(RI)         0.5μL
所述反向引物R1     1μL
置于72℃水浴中作用10min，冰浴5min。
然后依次加入
5×AMV Buffer      5.0μL
dNTP               4μL
AMV反转录酶        1μL
置于42℃水浴中作用1h，再95℃作用5min灭活AMV。
PCR反应：反应体系为50μL
反转录模板         1.0μL
10×PCR Buffer    5.0μL
dNTP              4μL
Taq E             0.25μL
所述正向引物F1    1μL
所述反向引物R1    1μL
DEPC-H2O          37.75μL
同时设立GCRV阳性和阴性对照，PCR反应体系所加量同上，只是将模板换做试剂盒所提供的已反转录的cDNA阳性和阴性模板。
PCR扩增程序
(1)95℃    3min
(2)94℃    50s
(3)52℃    50s
(4)72℃    50s
(5)回到第2步，重复30次
(6)72℃    7min
(7)4℃     5min
(3)电泳、PCR产物结果判定
取PCR产物5ul，制备1％琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成像系统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，GCRV的PCR阳性结果应在436bp处有一条带。电泳结果如图2所示。

Claims (1)

1.一种草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于它包括：
1)内脏组织中病毒RNA提取试剂：DEPC水；蛋白酶K水溶液，浓度1mg/mL，pH8.0；1％SDS；酚/氯仿/异戊醇，体积比为25/24/1；氯仿/异戊醇，体积比为24/1；异丙醇；70％乙醇；
2)细胞感染病毒的RNA提取试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；70％乙醇；DEPC水；
3)RT反应试剂成分：5×AMV Buffer，dNTP，DEPC水，反向引物R1，RNA酶抑制剂RNasin，反转录酶AMV；
4)PCR反应试剂成分：10×PCR buffer；dNTP Mixture，浓度各2.5mmol/L；特异性寡核苷酸引物F1和引物R1；DEPC水和浓度5U/uL的Taq E；所述正向引物F1：5’-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3’；所述反向引物R1：5’-TTGGAGACGAACATAGACGC-3。
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