CN108950075A - 一种虾血细胞虹彩病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种虾血细胞虹彩病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种虾血细胞虹彩病毒的RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法，所述的引物组包括引物S1、S2，其中：S1:5’‑AACTGTAGGCTAGCTTACCAT‑3’,S2：5’‑CAATAGCTGAGTCGACCTTATG‑3’，S3：5’‑ATAAGCTGAGTCGGACTGAT‑3’。本发明设计特异性引物S1、S2和S3，能够对虾血细胞虹彩病毒进行特异性扩增。本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性、特异性，且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达100％，能够广泛用于临床虾血细胞虹彩病毒的鉴别诊断。

Description

一种虾血细胞虹彩病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物病毒检测技术领域，具体涉及一种虾血细胞虹彩病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
自1954年Xeros在沼泽大蚊(Tiphoneula paludosa)中发现首例虹彩病毒以来，人们已经陆续从两栖类、甲壳类、鱼类和爬行类中发现虹彩病毒。根据国际病毒分类委员会第九次报告，虹彩病毒科(Iridoviridae)下设五个属：即虹彩病毒属(Iridovirus)，绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)，蛙病毒属(Ranavirus)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)，其中后面三个属的虹彩病毒可以感染鱼类。
虹彩病毒病是一种广泛存在于水生动物且危害较大的病毒性疾病。目前，虹彩病毒成为一些鱼类、两栖类动物的新型病原体，特别是水产养殖业中的经济类品种再加上其特殊的生物学特性，因此越发引起人们的关注和重视。
对虾感染虹彩病毒，最早于1993年Lightner和Redman在靠近厄瓜多尔对虾养殖场发现了被虹彩病毒感染的原糙对虾(Protrachypene precipua Burkenroad)。这是首次报道十足目动物能够感染虹彩病毒。对感染虹彩病毒的原糙对虾组织病理学观察发现，表皮上皮细胞(鳃、胃内层甚至遍布全身)呈现典型的虹彩病毒的感染；造血组织，触角腺上皮组织，以及心脏、肌肉、皮下组织、鳃、肝胰腺中的结缔组织细胞和吞噬细胞也被虹彩病毒感染。
2017年，中科院黄海研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾上发现一种新病毒，相关研究报道称新分离的病毒属于虹彩病毒科，但不属于虹彩病毒科下已建立的五个属，感染该病毒的虾造血组织、鳃丝、肝胰腺、附肢和肌肉的血细胞中出现嗜碱性包涵体和核固缩现象，因此命名为虾血细胞虹彩病毒(SHIV)。该病毒与2014年国家海洋局第三海洋研究所的科研人员从红螯螯虾中分离的红螯螯虾虹彩病毒(CQIV)的基因序列一致，属于同一种病毒的不同分离株。
对于虾血细胞虹彩病毒，我们的了解不是很多，也还没有正式的文献报道，虾感染SHIV后出现的主要症状与感染红螯螯虾虹彩病毒(CQIV)、樱花虹彩病毒(SIV)、虾白斑综合症病毒(WSSV)等极为相似，建立一种虾血细胞虹彩病毒的反转录PCR诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种虾血细胞虹彩病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒能够快速区分虾血细胞虹彩病毒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种虾血细胞虹彩病毒的RT-PCR检测试剂盒，所述的引物组包括引物S1、S2、S3，其中：
S1：5’-AACTGTAGGCTAGCTTACCAT-3’；
S2：5’-CAATAGCTGAGTCGACCTTATG-3’；
S3：5’-ATAAGCTGAGTCGGACTGAT-3’。
一种所述的引物组在制备用于虾血细胞虹彩病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。
一种所述的引物组的虾血细胞虹彩病毒鉴别诊断试剂盒。
所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。
所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。
所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、Taq DNA聚合酶和双蒸水。
所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5mmol/L dNTP8.0μL、10mmol/L S1引物1.0μL、10mmol/L S2引物1.0μL、5U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。
一种所述的试剂盒的使用方法，包括核酸提取、反转录、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。
所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
本发明的有益效果：
本发明通过比对虾血细胞虹彩病毒的差异，设计特异性引物S1、S2、S3，能够对虾血细胞虹彩病毒进行特异性扩增；在此基础上研制了专用试剂盒，先提取病毒RNA，再使用S2引物反转录合成cDNA，并采用RT-PCR方法鉴别检测虾血细胞虹彩病毒。与现有技术相比，本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性、特异性，对红螯螯虾虹彩病毒(CQIV)和樱花虹彩病毒(SIV)的扩增结果均为阴性，能够广泛用于虾血细胞虹彩病毒的鉴别诊断。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂所建议的条件与实施步骤。
实施例1、鉴别诊断方法的构建
1、引物设计
设计两条特异性引物，具体如下:
S1：5’-AACTGTAGGCTAGCTTACCAT-3’(SEQ ID NO.1)
S2：5’-CAATAGCTGAGTCGACCTTATG-3’(SEQ ID NO.2)
S3：5’-ATAAGCTGAGTCGGACTGAT-3’(SEQ ID NO.3)
使用S1、S2和S3进行PCR扩增，SHIV疫苗株预期扩增片段大小为768bp，SHIV现地分离株预期扩增片段大小为378bp。
2、病毒RNA的提取
取SHIV毒株细胞培养液，反复冻融3次后，5000g离心15min，取上清备用。
(1)取0.2ml氯仿，加入等体积的上清，剧烈摇晃15s，室温放置3min，然后12，000g，4℃离心5min。离心后分成3层，最下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，上层是无色的水相，RNA存在于水相中；
(2)将步骤(1)中的上层水相转移到另一只干净的EP管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，室温静置10min，然后12,000g，4℃离心10min；
(3)倒掉上清，加入1ml体积分数75％乙醇洗涤RNA沉淀，混匀后，7500g，4℃离心5min；
(4)倒掉上清，室温放置10min，然后加入适量无RNAse水溶解RNA，即得到总RNA。
3、反转录
以步骤2提取的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA，反转录反应体系为：
模板RNA 4.9μL
S2引物(10mmol/L) 0.3μL
RTase酶抑制剂(40U/μL) 0.3μL
M-MLV反转录酶(200U/μL) 0.5μL
dNTP(2.5mmol/L) 2.0μL
10×M-MLV缓冲液 2.0μL
反应条件为：42℃保温60min，70℃10min。
4、聚合酶链式反应(PCR)
4.1PCR反应体系
以步骤3获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：
dNTP(2.5mmol/L) 8.0μL
10×PCR扩增缓冲液 5μL
S1引物(10mmol/L) 1.0μL
S2引物(10mmol/L) 1.0μL
S3引物(10mmol/L) 1.0μL
cDNA 3.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1.0μL
ddH2O 至50μL
4.2 PCR反应条件优化
对SHIV疫苗株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃进行PCR反应扩增SHIV疫苗株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57和62℃可以扩增出768bp大小的片段，与预期大小一致。
对SHIV现地分离株的PCR反应条件进行优化，分别以退火温度为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃进行PCR反应扩增SHIV现地分离株，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min。发现在57℃出现378bp大小的片段，与预期大小一致。
综合上述反应，本发明最终将复合PCR的退火温度设置为57℃，优化后的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物置于-20℃保存。
5、电泳
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳40min，在DNA凝胶成像系统仪下观察结果。
本发明的专用试剂盒包括上述检测方法中所用的核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂。
实施例2、特异性实验
分别以红螯螯虾虹彩病毒(CQIV)和樱花虹彩病毒(SIV)为对照毒株，以虾血细胞虹彩病毒作为实验毒株，以上3种病毒均是引起腹泻的常见病原，且这3种病毒引起的腹泻在流行病学上、临床上和病理变化等方面极其相似，临床上很难区分。按照实施例1中的方法进行检测，结果表明，只有SHIV疫苗株和SHIV现地分离株可以得到扩增片段，其他病毒均无扩增条带产生。实验结果证实，本发明的引物和检测方法具有很高的特异性。
实施例4、灵敏度实验
将SHIV现地分离株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为5.4×104-5.4×10- 4copies/μL，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为5.4×10- 3copies/μL可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为5.4×10- 3copies/μL，但第9泳道5.4×10-4copies/μL无预期大小的片段，判断其灵敏度为5.4×10- 3copies/μL。
将SHIV疫苗株病毒液进行10倍梯度稀释，使病毒浓度为1.5×104-1.0×10- 4copies/μL，并按照实施例1的方法进行检测，结果表明，在第8泳道浓度为1.5×10- 3copies/μL可扩增出预期片段，本发明的引物和检测方法的最低核酸检测量为1.5×10- 3copies/μL，但第9泳道1.5×10-4copies/μL无预期大小的片段，判断其灵敏度为1.5×10- 3copies/μL。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 李梅秀
<120> 一种虾血细胞虹彩病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aactgtaggc tagcttacca t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatagctga gtcgacctta tg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataagctgag tcggactgat 20

Claims (9)

1.一种虾血细胞虹彩病毒的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的引物组包括S1、S2、S3，其中：
S1：5’-AACTGTAGGCTAGCTTACCAT-3’；
S2：5’-CAATAGCTGAGTCGACCTTATG-3’；
S3：5’-ATAAGCTGAGTCGGACTGAT-3’。
2.一种如权利要求1所述的引物组在制备用于虾血细胞虹彩病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。
3.一种包含如权利要求1所述的引物组的虾血细胞虹彩病毒鉴别诊断试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、Taq DNA聚合酶和双蒸水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5mmol/L dNTP8.0μL、10mmol/L S1引物1.0μL、10mmol/LS2引物1.0μL、5U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。
8.一种如权利要求3-7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括核酸提取、反转录、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。
9.根据权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
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