CN109517806B - 一种罗非鱼湖病毒强毒株及其rpa检测引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种罗非鱼湖病毒强毒株及其RPA检测引物和方法，本发明设计了针对RPA反应的引物组；本发明首次分离出罗湖病毒，而且检测方法快速简便、特异性强，灵敏度高，适用于养殖场的现场检测等，具有极高的应用价值。

Description

一种罗非鱼湖病毒强毒株及其RPA检测引物和方法
技术领域
本发明属于病毒分子检验领域，关于一种罗非鱼湖病毒强毒株以及其RPA（聚合酶扩增技术）检测引物和方法。
背景技术
自2009年开始，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、印度、马来西亚等区域相继暴发了一种新型RNA病毒---罗非鱼湖病毒，简称罗湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV），给全世界的罗非鱼养殖带来巨大威胁和严峻挑战。罗非鱼湖病毒初步确定与流感病毒同为正粘病毒科，也是一种高度传染性的烈性病毒，感染罗非鱼湖病毒可导致罗非鱼死亡率高达70%--90%，罗非鱼湖病毒所引发的疫病引起了全球罗非鱼养殖业及相关产业的高度重视。
由于TiLV具有高传染性和高死亡率等特点，引起了全球罗非鱼养殖产业的高度恐慌和重视，该疫病一旦全面爆发和流行，必将给罗非鱼养殖业造成毁灭性打击，不仅影响养殖其产量，更严重影响其出口贸易，从而加剧各国之间的经济矛盾和冲突。由于罗非鱼湖病毒病的发生和流行具有较强的温度依赖性，冬季时，该区域的水温一直低于25℃，加上控制措施采取得当，所以疫情没有进一步加大和扩散。我国的广东、海南、广西、江苏等多个区域均出现罗湖病毒，可见该病毒在我国具有普遍存在和分布的现象，根据这个疫病在国外的流行规律和情况来判断，罗非鱼湖病毒病后续在我国将会有继续扩散和流行的趋势。目前对于该新发疫病的流行病学和病原学都了解甚少，更缺乏有效的防治办法和控制措施，一旦疫情大规模爆发，将会给我国的罗非鱼养殖产业带来毁灭性的打击。
由于TiLV基因组存在显著的地理差异，因而针对不同的地理株应用分子生物学方法，可能存在特异性和敏感性的不同，甚至出现假阴性的结果，将严重影响罗湖病毒病的现场诊断、病原监测、流行病学调查及疫情处理。
然而，到目前为止，还没有开发出有效的药物或疫苗来预防由TiLV引起的疾病。因此，筛选出适用性强的特异性引物和建立一种快速可靠的检测TiLV方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种罗非鱼湖病毒 GD1710株。
本发明的另一目的在于提供了罗非鱼湖病毒PRA检测引物。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA引物，其核苷酸如下所示：
TiLV-S2-F：5' -GGCGGCTCTAGGGTACA- 3'；
TiLV-S2-R：5' -CGAAGTGTTGGAACCCGTCAT- 3'。
一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。
进一步的，该试剂盒中还包括酶、醋酸镁和再水化缓冲液Rehydration Buffer。
一种快速检测罗非鱼湖病毒的RPA方法，包含以下步骤：
1）提取样本核酸；
2）以提取的核酸为模板，用上述所述的引物TiLV-S2-F和TiLV-S2-R和醋酸镁，进行RPA反应；
3）将RPA反应产物进行PCR反应，确定样品中是否含有罗非鱼湖病毒。
进一步的，步骤2）中的RPA反应体系为：
Rehydration Buffer 29.5μL；TiLV-S2-F 2μL；TiLV-S2-R 2μL；核酸模板 1μL；醋酸镁2.5μL；RPA扩增酶1000 IU；ddH2O补至50μL。
进一步的，RPA反应条件为：在39～41℃下反应。
进一步的，RPA反应条件为：反应时间为20～30min。
一株罗非鱼湖病毒株TiLV-GD1710，于2018年2月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：V201807，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的有益效果是：
（1）首次自患病的罗非鱼中分离出罗湖病毒，对于我国罗湖病毒病及其防控技术的研究具备开拓性的意义。
（2）本发明的方法快速简便：本发明所建的RPA方法1小时内完成检测，快速准确地分析检测，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。
（3）本发明的方法特异性强：这对特异性引物对保守区域的靶序列的特异性识别，保证了RPA方法扩增的高度特异性；
（4）灵敏度高，可以检测浓度为5.8 ×101 copies/μL的核酸。
附图说明
图1 为本发明提供的采用罗非鱼脑细胞分离罗湖病毒GD1710结果示意图；第2d开始产生细胞病变效应（CPE）（A1），第4d和第6d病变脱离的细胞分别达到50% （A2）和70%以上（A3），而对照组则没有明显变化（B1-B3）。
图2 为分离的TiLV-GD1710感染细胞后通过透射电镜进行形态学鉴定结果，病毒粒子呈圆形，且表面有突起的丝状结构，完整病毒粒子的直径在100nm-120nm之间。
图3为RPA反应扩增产物结果分析示意图，其中泳道M为marker，泳道P为阳性对照,泳道N为阳性对照。
图4为罗湖病毒RPA检测引物特异性试验结果，其中泳道M为marker，泳道1-8分别为TiLV-GD1710 cDNA浓度分别为，罗非鱼基因组，罗非鱼链球菌，GCRV，SVCV ，KHV和阴性对照。
图5为罗湖病毒RPA检测引物灵敏性试验结果，其中泳道M为marker，泳道1-8分别为5.8×107 copies/μL，5.8×106 copies/μL，5.8×105 copies/μL，5.8×104 copies/μL，5.8×103 copies/μL，5.8×102 copies/μL，5.8×101 copies/μL和5.8×100 copies/μL，泳道9为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种罗非鱼湖病毒GD1710的分离及全基因组序列测定，其主要过程如下：
（1）在无菌条件下，取感染了罗非鱼湖病毒的罗非鱼的肝、肾、脾, 加入含双抗的灭菌的PBS中制成1:1的匀浆液，在-20℃冻融三次后，组织匀浆液依次经2000rpm/min离心10min取上清，再经5000rpm/min离心10min取上清，最后经10000rpm/min离心取上清液经滤膜孔径为0.22μm的微孔滤器过滤除菌，接种密度为80%-90%的单层罗非鱼脑细胞（TiB细胞）。室温下吸附1h，吸弃病毒液，加入与培养液等量的维持液（含3% FBS的M199），28℃恒温培养，每日观察病毒细胞培养物的形态。病毒传代时，将病毒细胞培养物反复冻融2-3次，再按上述接种方法做传代培养。传至第3代时，发现第2d 开始产生细胞病变效应（CPE）（见图1的A1）；可见TiB细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，第4d 和第6d 病变脱离的细胞分别达到50%和70%以上（见图1的A2、A3）。
（2）收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。
电镜观察发现细胞内有大量圆形的病毒粒子，且病毒粒子表面有突起的丝状结构，完整病毒粒子的直径在100nm-120nm之间，与典型的正粘病毒形态相符（见图2）。
新分离的病毒暂命名为TiLV-GD1710，保藏编号：CCTCC NO：V201806，地址：中国武汉武汉大学。
（3）收集TiLV-GD1710病毒，对其进行全基因组测序，序列如SEQ ID NO.2（Segment1-Segment 10）所示。TiLV-GD1710基因组与其它已知的TiLV分离株的核苷酸序列同源性为95%~98%，氨基酸序列同源性为91%~100%；其中S2节段最为保守，其氨基酸序列同源性均在99%以上，而S9变异最大，其氨基酸序列同源性在91%至94%不等。本发明TiLV-GD1710病毒分离株中，10个基因节段（Segment 1～Segment 10，见SEQ ID NO. 1 ~SEQ ID NO. 10）的3’和5’端均含有“CCA AA……ATT TGC”共有保守序列。
Segment 1
CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCACTATTACTGTATCACCATAAGGTATGTGGGCATTTCAAGAAGGAGTTTGCAAAGGTAACCTGTTGTCAGGCCCGACTTCAATGAAGGCACCGGATTCAGCAGCGAGAGAGTCACTAGACAGAGCGTCTGAAATCATGACAGGGAAATCGTACAATGCTGTCCACACTGGGGACTTGAGCAAGCTGCCTAACCAGGGAGAAAGTCCATTGAGGATAGTCGATTCCGACCTCTATTCAGAGAGGAGTTGCTGTTGGGTTATAGAGAAAGAGGGCAGAGTTGTGTGCAAAAGTACCACGCTCACCCGCGGTATGACGAGCCTGCTGAACACAACAAAGTGTAGTTCTCCATCTGAGCTCATATGTAAGGTTTTGACAGTGGAATCCCTATCTGAAAAGATAGGCGACACGAGTGTCGAGGAGTTACTTTCTCATGGCAGGCACTTTAAGTGCGCACTTCGCGACCAAGAGAGGGGTAAACCCAAGAGCAGAGCTATCTTTCTGTCACATCCGTTCTTCAGGTTGCTTTCCTCTGTAGTAGAGACGCACGCTAGATCTGTGCTGTCAAAGGTCTCAGCAGTGTACACCGCTACTGCTAGTGCAGAACAACGGGCTATGATGGCCGCACAGGTTGTAGAGTCAAGAAAACATGTTCTCAATGGCGACTGTACTAAGTATAATGAGGCGATCGACGCAGACACACTGCTAAAAGTGTGGGATGCAATAGGCATGGGGTCAATTGGAGTCATGCTCGCTTACATGGTGCGCAGGAAATGCGTTCTCATTAAAGACACTCTAATGGAGTGTCCAGGAGGTATGTTGATGGGAATGTTTAACGCAACTGCCACCTTGGCATTGCAAGGGACGACTGACAGATTCCTGTCTTTCAGCGACGACTTTATAACATCGTTTAACTCGCCTGCTGAATTACGCGAGATAGAGGACCTGCTTTTCGCAAGCTGTCATAACTTGTCACTAAAGAAGAGTTATATTTCAGTTGCCTCACTGGAAATAAACTCGTGTACCCTCACTAGGGACGGTGACCTAGCCACAGGATTAGGCTGTACTGCTGGTATCCCCTTCAGGGGGCCACTTGTGACTCTGAAACAGACTGCAGCTATGTTATCTGGTGCTGTTGACTCAGGAGTTATGCCATTCCACTCAGCAGAACGCCTGTTCCAGATAAAGCAGCAGGAATGTGCCTATAGGTATAACAACCCCACTTACACCACGAGGAATGAGGACTTCCTCCCCACATGCCTGGGAGGGAAGACTGTGATTAGCTTTCAATCTCTACTGACTTGGGATTGCCACCCATTTTGGTATCAAGTGCACCCTGATGGCCCAGACACTATAGATCAGAAAGTCCTGTCTGTCCTTGCCTCAAAGACTCGCAGAAGGAGAACCCGACTAGAGGCTCTCTCAGACTTGGACCCCCTGGTTCCTCATAGGCTCCTCGTGTCAGAGTCAGACGTTAGCAAGATCAGAGCAGCTAGGCAGGCTCACCTGAAGTCTTTAGGCTTGGAGCAACCCACAAACTTTAACTATGCTATTTATAAAGCAGTCCAGCCCACCGCTGGGTGCTAAGTAACTATATAGGCGAATGAGAGAAATATTTGC（SEQ ID NO.1）
Segment 2
CCAAATTTTACTCTCTATTACCAAATACATTTACTTCTGAAAATGAGTCAATTTGAGAAATCATTCAAGGGCAGAACTGAGGTCACAATAACCGAATATCGTTCTCATACTGTCAAAGATGTGCACAGAAGCTTACTCACGGCTGACAAATCTCTAAGGAAGTCATTCTGCTTTAGGAATGCCCTAAACCAGTTCTTGGATAAAGATTTGCCTCTTTTGCCCACTCGGCCAAAGTTAGAGTCCAGGGTTGCTGTGAAAAAGTCTATGCTGAGGAGTCAGCTGTCGTTCAGACCCGGTTTGACTCAGGAGGAAGCAATTGATCTTTACAACAAGGGCTATGATGGTGACAGCGTCTCAGGTGCCTTACAAGACAGGGTAGTCAATGAGCCTGTAGCTTACTCGAGTGCAGATAATGACAAATTTCACAGGGGCTTGGCGGCTCTAGGGTACACTTTGGCTGATAGAGCATTTGATACGTGCGAATCCGGCTTCGTGAGAGCAATCCCTACTACTCCATGTGGGTTCATATGTTGTGGGCCAGGTTCTTTTAAAGACTCACTTGGATTTGTGATAAAAATCGGCGAATTCTGGCACATGTATGACGGGTTCCAACACTTCGTCGCTGTCGAAGATGCTAAGTTCTTAGCAAGTAAGTCTCCTTCGTTTTGGTTGGCAAAACGTCTTGCAAAGAGGCTGAATCTGGTCCCAAAAGAGGATCCATCTGTAGCAGCAGCTGAGTGCCCCTGTAAAAAAGTGTGGGAAGCTAGTTTTGCTAGGGCACCTACTGCACTAGATCCATTTGGAGGCAGGGCCTTCTGCGACCAGGGTTGGGTGTACCACAGGGATGTAGGGTATGCAACAGCTAACCACATATCACAAGAGACACTCTTTCAACAGGCGCTTTCAGTGAGGAACCTTGGACCGCAAGGTAGTGCAACTGTCTCAGGCTCAATACATACCGCCCTGGACAGGCTCAGAGCAGCGTACAGCAGGGGAACGCCCGCTTCTAGATCTATACTGCAAGGGCTCGCGAATCTCATCACACCTGTAGGTGAAAACTTTGAATGTGATCTCGATAAGAGGAAGCTCAATATAAAGGCATTGCGTTCTCCCGAGAGGTACATTACGACAGAGGGCCTGGTTGTAAACCTGGACGATGTGGTTAGAGGGTTCTATCTTGACAAGGCGAAGGTCACCGTTCTCTCGAGATCAAAGTGGATGGGTTACGAGGACCTGCCTCAGAAACCTCCGAATGGTACATTTTACTGCAGAAAGAGGAAGGCAATGCTTCTCATCTCATGTAGTCCAGGCACGTACGCAAAGAAGCGAAAGGTGGCAGTGCAGGAGGATCGCTTTAAGGATATGAGGGTTGAGAATTTCCGGGAGGTAGCGGAAAATATGGATCTGAATCAGTAGGGTTTCTTGGCAAAAGCCTTCACTATATATATGGTAATAATGAGAAAGATTTGCGCTCCCGGAGACGTGTGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATCGTAATCATGTCATGTCCGT（SEQ ID NO. 2）
Segment 3
GCAAATTTTTCCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGTAACCTTTAGCAAAAGCGTCGAAAGCGATCATCTCGCAAATGGGTGTACTGTCATCCGCAATCTTACTGCACAAAGTGAATAATAAAGTGAGCTTAAGGGTATTGTACCCCTTATCTCAGAAGCCAGCTGATAGCCTTTCCTGAACTCGTCCTTACAGACGCTAAGTGCTAGCCGGTGCCTATTGAAATGTTGAGCCACTGCTCGGCTGACCCTTGTAGAGTCGAGACATTCTAGAAGTAAGATGACGTCCCACCTTGTCTCAAGACCACTAGCTCTGTCCAGATCACCCTTCCTACTTATGGGAGGCAGTTCCAACATATCCAGCTTATAAATTTCTCGGGTACTCACAAGGTCTTGCTCCCCTATATTAGCCGATTGCTTAGGATCTAAGTGCATCACATGCACAGCTGCCCTGTACCCGTCAAACTCAAAGTCATGCTCACAGCCAGGCTTACTTAGACCTACAACTAAGTGGTGAGTGGAGGCGGTTGGTCTCCGTTTACTGTGCTTTCCGGAGTCGCGCATGACCGGTACAGCTAGTATGCTGGTATTGTCGCTATGCAGTACTTTCCCTGCCTGAGTTGTGCTCCTAGCAATCAACATCAAAAGCTCACGAGCAAGTGGGGCACTAGCCGGTAGAGGCAATATCTTCTGCGTAGCAGGCTTATGAGAAGCAACTGTGTACCTTTGTATCCACCCTCCATTGCGGAACTCAAATTCTCTATCACGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCTCTTGCCTCCTGGTCAAGACCACACTCCTCACCACAGGCGAGGAACTTTGAACACTCGAAGAATCCATATTGCCTCTTTAGCTCAGCTGTCTCCTTGGATATGTCCGCAAGTCTGGGTGGCGCCACCCACTCGATACGAGGCTTCGGGCCACTCTTTGGATGTGGTAGTTCCAATAGCCGTTCCCTTAGCTCAGCATCGTAGAATGCCCTGTGCCCAACTTTAACAACCCCGTCGATCTCTAAATAATCCTTGAATTGTACCTTACAAATCTGCTGGTACTCTTGTTCAGAGCAAACGTATGTGGCATCATTGTTCAAAATGCAACGAACTGTTGCCTTTGGGAATTTCCGCGGCTGGCCTTCCAGCTCAAAGGCAATCCACTTATTCTTCAAACAGTCATAACAGTCACCCTCTACGGGGACTCCTGGTCGTCTCTCTACTGTACTGTAAGAACTTAGGAACCTTCGGCTCCCTTCGCTATAAGTGAAATCGTCACAGAAAACCCCAGTTAGCTGTGCAAACCGCGAGTCCATTTCAAAGAAAGTTAACGGTCTATTAAGGATTAAGGGGTAATATTTGG（SEQ ID NO. 3）
Segment 4
CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGAATAGCTAACTTAACAAACTGAAAATGGTGAGAACTACAAAGACTAGTATGGCAGCTGCCAGCACTGTTGCACCAGAGGTAGCAATGGATGAAAGTTCACCCAGCACTTCGCAGACACAAGCTGAACTCCCAAGAAACCTCGAGGTCTTCAATGAAGCTTGTGGTCATGTGTTTGGAAGTTCCTTCAACAGGGAGGACAACAGTGTAATATCTGATGCTGCTGCATTCCTCTTTAAAATGCATACTCACTCCCTCGATGGTCAGGAGGCTAAGGTTCTGAGAGCCAGCGAAAAGAAGAGAGAGAGGGAAAACGCTAAGAAATCAAGGAAGGCGCCAGAAGCAGGGATGAGGGTCGGAAGGAGCCTTATATTAACCAGCAGATGGACTGAATACTGCGCAACCTATGTGCCTGCACTGGGCTCAAAGATGAAGGTGATAAAAGCCTCAGGGGACGCAGCTATGATTCAGATGATGAAGGACCATAACTCTCTATTGAGGGTGTGTGTTCGCATTGAGGTCTGGAAGGCTAGGTACGTCAGTTTGGTTGCTCTCGACGAGAGGATTCAAACTTTGGAGGATGCTCAGTGGTTCCCATACCTGAGTGGGGATTCCTATCGTGCTTGCCCAGGGCTAGTTGGTGGCTATTTTGCAAAGAAAGCAGCAGCAGGAGAAAGAGGAAAGAACTACAAAAAGTTGAATCAGACTGCTATAATCCCGCCTCCGAGATTTCTGATTGTTGGCCACAGGCTGCAGATAGGCGACCAGGTCACCCTCAGGGAGTTACTTGCCTCAATTGCTTGGGGCCTTTGCGACGGTGTCCTTGCTGAATGTTGGAGCCCCTCGCAGGGGGACGGGAGCATTGGTGTAGTTGTTGGTCTACCTCTGCAGGCTACAGGAAGCTGCTTCCTGGTGGTGGCTAGCCACGGGCTCTCAGCAATTGCCGACTCCAGGATTGAGGGAACAGGGAACACAAACCTGCTGGAAGAGTGCATTGCCATTCAGAAACAGGACGGTGTCATAAAATGTAAGAGAAGTGGGAAGAGTCTGTATCACTGCCTCAAAGAGACAGCAGGGGCTGTTGGAAGATAGGCAACGGAATAGGCTACCCATGCGCGGAAAGCTGCACAGGTTGCCAAGGGCCCCTCTGAGCCCAAGTTTTCTATATATCCTTTAACAAGTCATCAAAAACTGGTAAATTCTTAGACGGTAATTGGAGAAAGATTTGC（SEQ ID NO. 4）
Segment 5
CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTCCAATAGCTATGCAGGCGCTGGTCCTGGCAAGCTGCCTAGTCTGCGCACTAGCAAGTGATGAAAGTTTAAGGATAAAGCGACTACAATCATACCTGAACAATACCTACCAAAGTAGGGAGATAGAAAGTGAAATAAGGCGTGGATTTGCATCCAAGTTCAGGGTGGAGAGTTGTTCCTGCACCATGGGGGTGCACTACATTGTAACTCCATCCTCGGGTGGGTCGTTCTGCACTGGGTTACATGCAGTACCTGACAGCTTCCCAGCCCTTGGGTACAAACTTCCCAAAGCAGGGGGAAGAGGTGATTGGAAAACTACTGAAGTTAGGATTGACGAAGATAGTGGGGTTGTTCTATACAATGTTTCCAGGTGCAGCCACAGTAGCGAGTGCAGGGATTTGGAGGTGTATTCCACCGTATTGCCAGGTCAGTGTGACTGTACCAGACCCACTGTGGACGACTACAAGACCATGCCGGCCTCAAGGCAGCCGAAGTCGTTTGTAGTAGCAGGCCTCATTATACTGTGTTTACTTGCTAGCTCGGTAGCAATTGGCATGGGTGTTTACAATTATGCTGGGGTCATCGGCCTAGCAGACGCAGCTCAAGCAGATGTTTCTGAGATTTGGGAGTATTTAGAAGCTTTGACACGGGAAGTCACCGGTATGACGCTAGGAGAGTTTTGCTCGATCAAATCCCTCGTCTGTAAATCTGATAACATAGGCAAATTCAAGGAGCAATTTGCAGCTTTTGGGGAAGCTATCCTTGCAATAGTGTTTGGGATGCTAGAGAAATATAAGTTTGTCTATTACCTGGTGCTTTCGCTGATGGTTCTCTCGTTGCTCAGTAAACTTGTTTCTCTGTTGAAGCAGGTGCCCTTCTATGGGAGTATCAAAGTTTTAGTGTTCCGGAGGCTAAGAGTTGTGTGCCTCAAGACCTTTTTCTATATTAAGAAACGGCTTAAGAAGAAAAGCCCGCTTGAGGATGACGAAGTCCCTCTGCTTCTATTATCTTGATCCTCAAGCTTCTATTCCTGATAGGTCATAAAGTGGTAAACTGAGAAAAAGAGTAAAATTTGC（SEQ ID NO. 5）
Segment 6
CCAAATTTTACCTCTCGCATGCATTTTTATCTACAGGATTGTCCAATGAGTTGGCCTAGGGTGATAAGGACCCTTGCTTTGTTTTCAACACTCCTTAGCGGAAGCGATCAATGCGTGGACAACATGTGGCGGTTTTACGGGAGGTCAAACTACACGTCAAGTGTAGTCATTGACGGGGACAAATATTCTGTTGAAGGTTCATATTCGAGTAGTGATTATCTGGATCCAGCAGTACAGAAGGTGGTTCTGGGACTTGATGGTAACAACGAAGTCATAGATTCAGGTGGGTCTCCATACTACATGTATGATTTAGAGGGATCCAAAGGGGAACTCCATCATCTGAACTGCAACTTTGTCGAAAAACGATGTAATCCGACGCTGAACTTTATGCTTGGAGGATTTGTTTTGTGCCCAGGAATATCGAGAAGAGAACTGGAACCTGTAACTGACAAGATATTGGAAAGCCGGGGAATACCGGGCCGAGGTAAAATACGTACTATAAAAATAAGCTCTAAACTGTTTGAGACATCGTTGTGCCTTTCGAAGAGGAGGCCCATCTTTAGCACCTGTATGCTAATGTCGCGCGGTCTTTGTACAAACTGTAAGCGTACCATAGATAGAACATATATGACACCAAACGGTTTCAGAACTGAGTACAAGTGGAGCTGCAGAGACAATAGCACAAAACAGTGTTGGGTATTAGTTGAGTCACTGGAGGAGAATCACTCCCCTTACAAGTGCCACTTTTCCGCAGTGGAAGTTCTACTACCAGCCGAAATAAAGCGCCATCAGCTCATCAGCGAATGGTCCGCAATGCAGGATGAAGTTGTTTATAAGAGGTCAAATGCCTATCTTCTTGCTCGTACTTTTCTCAGTTATACAAAAATGCGTAGATTGAATCCTGTAATTGATCTTTCGATATCACCACCAGTAACAGTAAGATCCTGCTGTAAAATCAATAAATACATGTGACACTATATGTCCTATCGTGTGGGCGAAACGCCCAGGTACAGTTTCAAGTGCTTGATTGAGAGAAATATTTG（SEQ ID NO. 6）
Segment 7
CCAAATTTTACTCTCTTTGCATTGCATACCGTATAGTAATAGACACAATGTCCTACAAGATTGGTGAGCTTGAGAGAATTATCACGCGCAAAAGCACCCTCCCCAAGGACAGTGGAAGTCAGACTGGGCTGTTCCATCGATTGCTCTTGGAGCATTACTCTGGCGCCTCGAACGTATGGTTCTTTTGTGCAACTGGGTTTACACCCAATACAAATGGCACAACCTGGATTGTACTGACGAGTCACCCGACCGATGGTGGAGAAAAGGTACCTCTGAAATGGAAATATGAAGTGAGCCCCGGATTGCCAGTCAGAAGGGTACTTGCCCAGGAGGGCACAGCAGTAAGAGGCCCTAAAGGAGCCTATCTAGTCAAAGGGGACATGCATCTCTGTTCAACTACCTTCTACACTAGAAGGGAAGCGAAGTACTGGCTCTGTGCGCCATCTCCAAAGTTTCCACACTGGACCAAGAGATCAGCACTGGTGACCAGTACTCGACCACTGACTGAGTTGAGCAGGGTTGCCACATACCTAGAGGCTGTGAGTAAGGGTGCAACTGATGTCAATGAATCGTGGTGTTCCTACCACAGGGTTGGGTTAGTGCCAATCCCTGAAGGGATCACATTTGAACTCTAATTACCCAGCTGTTTCGTTGTCTTATTGGGGAGGCCTTTCTGAGTTAACTAATTACTTTTGAAAGCAGGGATAATTGGTATGAAAGCTTCTTATGGTACTCAGTACCGTTCACTAAGGATGGTAGCATGAGAGAAAGATTTGC（SEQ ID NO. 7）
Segment 8
CCAAATATTACCTCATCTACACTAACATTTCCAATTGGACAGCATATCCAGGAATAAGTATGGCTCAAATTCCAACACTAAGAGAGGGCCAAGGGAAGCTCTACGATTTCACGCTCAACGGCATGACAGTGACTAGAGATACAGTAAACACTGTAGTTGCTCTGGAGTTTCTTGTCAATGCAAGTCCGGATTTGCTTTCCCTAACAATTGGCGAAGGCCTCTCAGAAGAAACAAAGTTTAAACACCTGCTTGTTAAGCACGCTGGTATGACCCGAAAGCGGATAGAGGAAAGGCTGGGACGAATCTCGAGGCGAGTCAGTGTGACAGTCGACGCAATTATAATAACAAACCGCAAGGGTCAAAGATTTGAATTCAACCGAAAACAGTACCTGGATATTGCCAAACAAGCTATGAAGCTTAAGCTCCCTGGGATTAACTGCGTCGACATACCCACTGCGCTCGCTTTTCTCGAGGAAGTCCTAGCAACTGCTTTGAAGGACACTGAAGGTTCACAAGATGACAGGATGGCCCTTAAGGCAGACACTTCTGCTGCTATCAATCATTTCCGTGAAATGCTTAAATAAAAAGTGAGTCTTCAGTGTCATTTTCCCCAGGGAGGTAAGCTACTCCATTTGTGTAATGATGAGAAAAATTGC（SEQ ID NO. 8）
Segment 9
CCAAATTTTACTCACAAGTCCGATTACTTTTCCCGCTTGGTGATGTCACGATGGATAGAAAATACAGGTTCTGTGTCAGTAATCTTGACAGAGATGAGTCGGTCGTACGTCACTTTGTGCCATTACCCCCCTTGGAGCTTGTGCTGCGGCGGCAGGACATCACAACCTGGTCAAGTCTGGATCCTGGATCGAAGACATTGTCTAGGATGTTCAGAGATCTCAGAGTTAATGACACTGAGTCAGCCAACTTGGCAGGAGAGTGCAATGGTGATAGGGAACTGGGTCCAAGTAGTAACGGAGCACGGAATTTTACACACTTTAACATCAGAAAGGCAGGCGCCAAGAAGGGTCATGTGGAGGATATCTGACATGACTGGCGATAAAACTTTATGAGGGCGGTCCAGGGGCAATTGAAGCTCCGCGAACCTACTGATTCCTCAGCTAGAGCACTGTAGTGAACCATGTGACATTAATAAGTTAACTTTAATAAAAATGGATAAGCTTCAGCTGGCAAAGTATGACTTTAAGGACGTGAGAAAGATTTGC（SEQ ID NO. 9）
Segment 10
CCAAATTTTAACCCTACTAACACCAAATATAGCTATAAGCCAGGATGAGTGTGGCAGATTATCTGTCAAGCGACAGTGACTCGGGGGCTGAGAGCTCAGGCTGTTTAGTACTAAGGAGTCGGAAGATCAAGAAGGGCAAGAAGGCTGCTTCAAAGAAGCGGAGTTGGAAGAATGAAAGGTATGGTGCTGACGAGAGCGGCGAAGATAATATAGAGTGGGGTGACGAAGTCGACCTCGAGATGGACGACTGTGATTCTGCAATCCCAGAGTGGGCTAGAGTTGATTTCAATCCCAAGAACAGAAGGGACAGAGAGGATGATGGGCAGAGTGACCTATCTCGATTTTCCGAAGATTTCGGGAAGAAGTCTCTTGACGTGCAGTCTTAGCACCTTAATATCGGTTCTGATTTCATTCGTATCCACAGGCCAACGCTAACTATACAGGGTGTCAGAGGGAAAGATTTGC（SEQ ID NO. 10）
实施例2：TiLV-GD1710新分离株的回归感染试验
将传至第3代的TiLV-GD1710细胞病毒液，以浓度为1.8x104 TCID50/mL 对不同大小的
尼罗罗非鱼、埃及红罗非、奥利亚罗非鱼和莫桑比克罗非鱼进行腹腔注射，统计2周后的累计死亡率（见表1）。
从表中可知，本发明制备的TiLV-GD1710病毒株对不同品种的罗非鱼和不同大小的鱼产生了强劲的毒性。人工感染本发明制备的TiLV-GD1710后，大部分罗非鱼有明显的腹部肿胀，腹腔有大量腹水；少数鱼则特别消瘦、鱼体表面出现轻微的出血点、肠道充满黄色透明的积液。
采用TaqMan qPCR对人工感染病毒的罗非鱼TiLV组织分布研究表明，TiLV的主要靶器官是肝、脾和肾。
表1 TiLV-GD1710回归感染不同品系罗非鱼试验结果
罗非鱼品种 感染数量（尾） 评价重量（g） 2周累计死亡数 2周累计死亡率
尼罗罗非 30 20 ±1 30 100%
埃及红罗非 30 650 ±20 26 86.7%
奥利亚罗非 30 50 ±3 28 93.3%
莫桑比克罗非 30 100 ±5 29 96.7%
实施例3：RPA扩增引物设计
本发明基于罗湖病毒GD1710株的S2基因节段（SEQ ID NO.1～10所示），设计了罗湖病毒的RPA检测引物，核苷酸序列如下所示：
上游引物TiLV-S2-F：5' -GGCGGCTCTAGGGTACA- 3'（SEQ ID NO. 11）
下游引物TiLV-S2-R：5' -CGAAGTGTTGGAACCCGTCAT- 3'（SEQ ID NO.12）
实施例4：阳性标准品制备、RPA反应
（1）RNA提取和cDNA合成
取感染了罗湖病毒的罗非鱼的肝、脾、肾组织或TiB细胞进行总RNA的提取及cDNA的合成：采用TRIzol®提取待测样品的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo（dT）18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65 ℃ 5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃ 5min，获得cDNA，即罗湖病毒阳性标准品，-20℃保存备用。
（2）RPA反应扩增
采用50μL扩增体系：向含有冻干酶粉（RPA扩增酶，1000 IU）的 0.2 mL Twist Amp反应管（Twist Amp Basic）中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer) 29.5 μL，上游引物TiLV-S2-F和下游引物TiLV-S2-R各2.0μ L（浓度为25μM），阳性标准品1 μL，再加入醋酸镁溶液 2.5μL(280 mmol/ L), 最后用灭菌双蒸水将反应体系均补齐至50μL。将 RPA扩增体系充分混匀，置于 39 ℃水浴锅上反应 30 min。
（3）RPA反应扩增产物分析
取RPA扩增体系的反应产物5μL，加入至含有0.5μg/mL 溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示出一条164bp特征性条带，则结果为阳性；如无特异性条带，则结果为阴性（结果见图3）。
实施例5: RPA反应
（1）RNA提取和cDNA合成
对21份罗非鱼临床样品进行检测，进行临床样品的RNA提取和cDNA合成。
（2）RPA反应扩增
采用50μL扩增体系：向含有冻干酶粉（RPA反应的扩增酶，1000 IU）的 0.2 mLTwistAmp 反应管（TwistAmp Basic）中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer) 29.5 μL，上游引物TiLV-S2-F和下游引物TiLV-S2-R各2.0μ L（浓度为25μM），临床样品核酸1 μL，再加入醋酸镁溶液 2.5μL(280 mmol/ L), 最后用灭菌双蒸水将反应体系均补齐至50μL。将 RPA扩增体系充分混匀，置于 39 ℃水浴锅上反应 30 min。
（3）RPA反应扩增产物分析
取RPA扩增体系的反应产物5μL，加入至含有0.5μg/mL 溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。
结果：发现临床样品中，有5份经PCR检测为阳性均能扩增得到目的片段，有16份经PCR检测为阴性未能扩增出特异性片段，结果符合率为100%。
实施例6：特异性试验
分别以罗湖病毒GD1710株（TiLV-GD1710）阳性核酸、罗非鱼肝脾脏和头肾组织混合的总RNA、罗非鱼链球菌基因组DNA、草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV)、鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of Carp Virus，SVCV）和锦鲤疱疹病毒（KoiHerpesvirus，KHV）的核酸作为模板，使用 DEPC水作为空白对照，使用本发明实施例4的PRA方法进行检测验证其特异性，结果见图 4。
结果显示：本发明实施例的方法特异性良好，TiLV-GD1710阳性核酸检测到一条164bp大小的特征性条带，有特异的反应，而其余病原与引物没有交叉反应均无特征条带，检测结果符合预期，准确率达到100%（见图4）。
实施例7：灵敏性试验
将浓度为5.8×107 copies/μL的TiLV-GD1710阳性标准品cDNA进行10倍梯度稀释，模板浓度为5.8×107～5.8×100 copies/μL，使用DEPC水做空白对照。
RPA反应扩增：
采用50μL扩增体系：向含有冻干酶粉（1000 IU）的 0.2 mL TwistAmp 反应管（TwistAmp Basic）中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer) 29.5 μL，上游引物TiLV-S2-F和下游引物TiLV-S2-R各2.0μ L（浓度为25μM），阳性标准品1 μL，再加入醋酸镁溶液2.5μL(280 mmol/ L), 最后用灭菌双蒸水将反应体系均补齐至50μL。将 RPA扩增体系充分混匀，置于 39 ℃水浴锅上反应 30 min。
RPA反应扩增产物分析：
取RPA扩增体系的反应产物5μL，加入至含有0.5μg/mL 溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。
结果：如图5所示，本发明检测方法的最低可以检测到浓度为5.8 ×101 copies/μL的罗湖病毒核酸。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种罗非鱼湖病毒强毒株及其RPA检测引物和方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaaacgtta tctcttaatt acgcactatt actgtatcac cataaggtat gtgggcattt 60
caagaaggag tttgcaaagg taacctgttg tcaggcccga cttcaatgaa ggcaccggat 120
tcagcagcga gagagtcact agacagagcg tctgaaatca tgacagggaa atcgtacaat 180
gctgtccaca ctggggactt gagcaagctg cctaaccagg gagaaagtcc attgaggata 240
gtcgattccg acctctattc agagaggagt tgctgttggg ttatagagaa agagggcaga 300
gttgtgtgca aaagtaccac gctcacccgc ggtatgacga gcctgctgaa cacaacaaag 360
tgtagttctc catctgagct catatgtaag gttttgacag tggaatccct atctgaaaag 420
ataggcgaca cgagtgtcga ggagttactt tctcatggca ggcactttaa gtgcgcactt 480
cgcgaccaag agaggggtaa acccaagagc agagctatct ttctgtcaca tccgttcttc 540
aggttgcttt cctctgtagt agagacgcac gctagatctg tgctgtcaaa ggtctcagca 600
gtgtacaccg ctactgctag tgcagaacaa cgggctatga tggccgcaca ggttgtagag 660
tcaagaaaac atgttctcaa tggcgactgt actaagtata atgaggcgat cgacgcagac 720
acactgctaa aagtgtggga tgcaataggc atggggtcaa ttggagtcat gctcgcttac 780
atggtgcgca ggaaatgcgt tctcattaaa gacactctaa tggagtgtcc aggaggtatg 840
ttgatgggaa tgtttaacgc aactgccacc ttggcattgc aagggacgac tgacagattc 900
ctgtctttca gcgacgactt tataacatcg tttaactcgc ctgctgaatt acgcgagata 960
gaggacctgc ttttcgcaag ctgtcataac ttgtcactaa agaagagtta tatttcagtt 1020
gcctcactgg aaataaactc gtgtaccctc actagggacg gtgacctagc cacaggatta 1080
ggctgtactg ctggtatccc cttcaggggg ccacttgtga ctctgaaaca gactgcagct 1140
atgttatctg gtgctgttga ctcaggagtt atgccattcc actcagcaga acgcctgttc 1200
cagataaagc agcaggaatg tgcctatagg tataacaacc ccacttacac cacgaggaat 1260
gaggacttcc tccccacatg cctgggaggg aagactgtga ttagctttca atctctactg 1320
acttgggatt gccacccatt ttggtatcaa gtgcaccctg atggcccaga cactatagat 1380
cagaaagtcc tgtctgtcct tgcctcaaag actcgcagaa ggagaacccg actagaggct 1440
ctctcagact tggaccccct ggttcctcat aggctcctcg tgtcagagtc agacgttagc 1500
aagatcagag cagctaggca ggctcacctg aagtctttag gcttggagca acccacaaac 1560
tttaactatg ctatttataa agcagtccag cccaccgctg ggtgctaagt aactatatag 1620
gcgaatgaga gaaatatttg c 1641
<210> 2
<211> 1544
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaaatttta ctctctatta ccaaatacat ttacttctga aaatgagtca atttgagaaa 60
tcattcaagg gcagaactga ggtcacaata accgaatatc gttctcatac tgtcaaagat 120
gtgcacagaa gcttactcac ggctgacaaa tctctaagga agtcattctg ctttaggaat 180
gccctaaacc agttcttgga taaagatttg cctcttttgc ccactcggcc aaagttagag 240
tccagggttg ctgtgaaaaa gtctatgctg aggagtcagc tgtcgttcag acccggtttg 300
actcaggagg aagcaattga tctttacaac aagggctatg atggtgacag cgtctcaggt 360
gccttacaag acagggtagt caatgagcct gtagcttact cgagtgcaga taatgacaaa 420
tttcacaggg gcttggcggc tctagggtac actttggctg atagagcatt tgatacgtgc 480
gaatccggct tcgtgagagc aatccctact actccatgtg ggttcatatg ttgtgggcca 540
ggttctttta aagactcact tggatttgtg ataaaaatcg gcgaattctg gcacatgtat 600
gacgggttcc aacacttcgt cgctgtcgaa gatgctaagt tcttagcaag taagtctcct 660
tcgttttggt tggcaaaacg tcttgcaaag aggctgaatc tggtcccaaa agaggatcca 720
tctgtagcag cagctgagtg cccctgtaaa aaagtgtggg aagctagttt tgctagggca 780
cctactgcac tagatccatt tggaggcagg gccttctgcg accagggttg ggtgtaccac 840
agggatgtag ggtatgcaac agctaaccac atatcacaag agacactctt tcaacaggcg 900
ctttcagtga ggaaccttgg accgcaaggt agtgcaactg tctcaggctc aatacatacc 960
gccctggaca ggctcagagc agcgtacagc aggggaacgc ccgcttctag atctatactg 1020
caagggctcg cgaatctcat cacacctgta ggtgaaaact ttgaatgtga tctcgataag 1080
aggaagctca atataaaggc attgcgttct cccgagaggt acattacgac agagggcctg 1140
gttgtaaacc tggacgatgt ggttagaggg ttctatcttg acaaggcgaa ggtcaccgtt 1200
ctctcgagat caaagtggat gggttacgag gacctgcctc agaaacctcc gaatggtaca 1260
ttttactgca gaaagaggaa ggcaatgctt ctcatctcat gtagtccagg cacgtacgca 1320
aagaagcgaa aggtggcagt gcaggaggat cgctttaagg atatgagggt tgagaatttc 1380
cgggaggtag cggaaaatat ggatctgaat cagtagggtt tcttggcaaa agccttcact 1440
atatatatgg taataatgag aaagatttgc gctcccggag acgtgtgtga atctctagag 1500
gatccccggg taccgagctc gaatcgtaat catgtcatgt ccgt 1544
<210> 3
<211> 1370
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaaattttt cccataatcc tctattagaa cgtcgtaacc tttagcaaaa gcgtcgaaag 60
cgatcatctc gcaaatgggt gtactgtcat ccgcaatctt actgcacaaa gtgaataata 120
aagtgagctt aagggtattg taccccttat ctcagaagcc agctgatagc ctttcctgaa 180
ctcgtcctta cagacgctaa gtgctagccg gtgcctattg aaatgttgag ccactgctcg 240
gctgaccctt gtagagtcga gacattctag aagtaagatg acgtcccacc ttgtctcaag 300
accactagct ctgtccagat cacccttcct acttatggga ggcagttcca acatatccag 360
cttataaatt tctcgggtac tcacaaggtc ttgctcccct atattagccg attgcttagg 420
atctaagtgc atcacatgca cagctgccct gtacccgtca aactcaaagt catgctcaca 480
gccaggctta cttagaccta caactaagtg gtgagtggag gcggttggtc tccgtttact 540
gtgctttccg gagtcgcgca tgaccggtac agctagtatg ctggtattgt cgctatgcag 600
tactttccct gcctgagttg tgctcctagc aatcaacatc aaaagctcac gagcaagtgg 660
ggcactagcc ggtagaggca atatcttctg cgtagcaggc ttatgagaag caactgtgta 720
cctttgtatc caccctccat tgcggaactc aaattctcta tcacgtgcgt actcgttcag 780
tataagttct cttgcctcct ggtcaagacc acactcctca ccacaggcga ggaactttga 840
acactcgaag aatccatatt gcctctttag ctcagctgtc tccttggata tgtccgcaag 900
tctgggtggc gccacccact cgatacgagg cttcgggcca ctctttggat gtggtagttc 960
caatagccgt tcccttagct cagcatcgta gaatgccctg tgcccaactt taacaacccc 1020
gtcgatctct aaataatcct tgaattgtac cttacaaatc tgctggtact cttgttcaga 1080
gcaaacgtat gtggcatcat tgttcaaaat gcaacgaact gttgcctttg ggaatttccg 1140
cggctggcct tccagctcaa aggcaatcca cttattcttc aaacagtcat aacagtcacc 1200
ctctacgggg actcctggtc gtctctctac tgtactgtaa gaacttagga accttcggct 1260
cccttcgcta taagtgaaat cgtcacagaa aaccccagtt agctgtgcaa accgcgagtc 1320
catttcaaag aaagttaacg gtctattaag gattaagggg taatatttgg 1370
<210> 4
<211> 1250
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaaagttta ctcctattac ccagaatagc taacttaaca aactgaaaat ggtgagaact 60
acaaagacta gtatggcagc tgccagcact gttgcaccag aggtagcaat ggatgaaagt 120
tcacccagca cttcgcagac acaagctgaa ctcccaagaa acctcgaggt cttcaatgaa 180
gcttgtggtc atgtgtttgg aagttccttc aacagggagg acaacagtgt aatatctgat 240
gctgctgcat tcctctttaa aatgcatact cactccctcg atggtcagga ggctaaggtt 300
ctgagagcca gcgaaaagaa gagagagagg gaaaacgcta agaaatcaag gaaggcgcca 360
gaagcaggga tgagggtcgg aaggagcctt atattaacca gcagatggac tgaatactgc 420
gcaacctatg tgcctgcact gggctcaaag atgaaggtga taaaagcctc aggggacgca 480
gctatgattc agatgatgaa ggaccataac tctctattga gggtgtgtgt tcgcattgag 540
gtctggaagg ctaggtacgt cagtttggtt gctctcgacg agaggattca aactttggag 600
gatgctcagt ggttcccata cctgagtggg gattcctatc gtgcttgccc agggctagtt 660
ggtggctatt ttgcaaagaa agcagcagca ggagaaagag gaaagaacta caaaaagttg 720
aatcagactg ctataatccc gcctccgaga tttctgattg ttggccacag gctgcagata 780
ggcgaccagg tcaccctcag ggagttactt gcctcaattg cttggggcct ttgcgacggt 840
gtccttgctg aatgttggag cccctcgcag ggggacggga gcattggtgt agttgttggt 900
ctacctctgc aggctacagg aagctgcttc ctggtggtgg ctagccacgg gctctcagca 960
attgccgact ccaggattga gggaacaggg aacacaaacc tgctggaaga gtgcattgcc 1020
attcagaaac aggacggtgt cataaaatgt aagagaagtg ggaagagtct gtatcactgc 1080
ctcaaagaga cagcaggggc tgttggaaga taggcaacgg aataggctac ccatgcgcgg 1140
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<211> 1099
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<213> 人工序列
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cctagtctgc gcactagcaa gtgatgaaag tttaaggata aagcgactac aatcatacct 120
gaacaatacc taccaaagta gggagataga aagtgaaata aggcgtggat ttgcatccaa 180
gttcagggtg gagagttgtt cctgcaccat gggggtgcac tacattgtaa ctccatcctc 240
gggtgggtcg ttctgcactg ggttacatgc agtacctgac agcttcccag cccttgggta 300
caaacttccc aaagcagggg gaagaggtga ttggaaaact actgaagtta ggattgacga 360
agatagtggg gttgttctat acaatgtttc caggtgcagc cacagtagcg agtgcaggga 420
tttggaggtg tattccaccg tattgccagg tcagtgtgac tgtaccagac ccactgtgga 480
cgactacaag accatgccgg cctcaaggca gccgaagtcg tttgtagtag caggcctcat 540
tatactgtgt ttacttgcta gctcggtagc aattggcatg ggtgtttaca attatgctgg 600
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gtgataagga cccttgcttt gttttcaaca ctccttagcg gaagcgatca atgcgtggac 120
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gtggttctgg gacttgatgg taacaacgaa gtcatagatt caggtgggtc tccatactac 300
atgtatgatt tagagggatc caaaggggaa ctccatcatc tgaactgcaa ctttgtcgaa 360
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tcaaatgcct atcttcttgc tcgtactttt ctcagttata caaaaatgcg tagattgaat 900
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<400> 7
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ttggtgagct tgagagaatt atcacgcgca aaagcaccct ccccaaggac agtggaagtc 120
agactgggct gttccatcga ttgctcttgg agcattactc tggcgcctcg aacgtatggt 180
tcttttgtgc aactgggttt acacccaata caaatggcac aacctggatt gtactgacga 240
gtcacccgac cgatggtgga gaaaaggtac ctctgaaatg gaaatatgaa gtgagccccg 300
gattgccagt cagaagggta cttgcccagg agggcacagc agtaagaggc cctaaaggag 360
cctatctagt caaaggggac atgcatctct gttcaactac cttctacact agaagggaag 420
cgaagtactg gctctgtgcg ccatctccaa agtttccaca ctggaccaag agatcagcac 480
tggtgaccag tactcgacca ctgactgagt tgagcagggt tgccacatac ctagaggctg 540
tgagtaaggg tgcaactgat gtcaatgaat cgtggtgttc ctaccacagg gttgggttag 600
tgccaatccc tgaagggatc acatttgaac tctaattacc cagctgtttc gttgtcttat 660
tggggaggcc tttctgagtt aactaattac ttttgaaagc agggataatt ggtatgaaag 720
cttcttatgg tactcagtac cgttcactaa ggatggtagc atgagagaaa gatttgc 777
<210> 8
<211> 656
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccaaatatta cctcatctac actaacattt ccaattggac agcatatcca ggaataagta 60
tggctcaaat tccaacacta agagagggcc aagggaagct ctacgatttc acgctcaacg 120
gcatgacagt gactagagat acagtaaaca ctgtagttgc tctggagttt cttgtcaatg 180
caagtccgga tttgctttcc ctaacaattg gcgaaggcct ctcagaagaa acaaagttta 240
aacacctgct tgttaagcac gctggtatga cccgaaagcg gatagaggaa aggctgggac 300
gaatctcgag gcgagtcagt gtgacagtcg acgcaattat aataacaaac cgcaagggtc 360
aaagatttga attcaaccga aaacagtacc tggatattgc caaacaagct atgaagctta 420
agctccctgg gattaactgc gtcgacatac ccactgcgct cgcttttctc gaggaagtcc 480
tagcaactgc tttgaaggac actgaaggtt cacaagatga caggatggcc cttaaggcag 540
acacttctgc tgctatcaat catttccgtg aaatgcttaa ataaaaagtg agtcttcagt 600
gtcattttcc ccagggaggt aagctactcc atttgtgtaa tgatgagaaa aattgc 656
<210> 9
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccaaatttta ctcacaagtc cgattacttt tcccgcttgg tgatgtcacg atggatagaa 60
aatacaggtt ctgtgtcagt aatcttgaca gagatgagtc ggtcgtacgt cactttgtgc 120
cattaccccc cttggagctt gtgctgcggc ggcaggacat cacaacctgg tcaagtctgg 180
atcctggatc gaagacattg tctaggatgt tcagagatct cagagttaat gacactgagt 240
cagccaactt ggcaggagag tgcaatggtg atagggaact gggtccaagt agtaacggag 300
cacggaattt tacacacttt aacatcagaa aggcaggcgc caagaagggt catgtggagg 360
atatctgaca tgactggcga taaaacttta tgagggcggt ccaggggcaa ttgaagctcc 420
gcgaacctac tgattcctca gctagagcac tgtagtgaac catgtgacat taataagtta 480
actttaataa aaatggataa gcttcagctg gcaaagtatg actttaagga cgtgagaaag 540
atttgc 546
<210> 10
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccaaatttta accctactaa caccaaatat agctataagc caggatgagt gtggcagatt 60
atctgtcaag cgacagtgac tcgggggctg agagctcagg ctgtttagta ctaaggagtc 120
ggaagatcaa gaagggcaag aaggctgctt caaagaagcg gagttggaag aatgaaaggt 180
atggtgctga cgagagcggc gaagataata tagagtgggg tgacgaagtc gacctcgaga 240
tggacgactg tgattctgca atcccagagt gggctagagt tgatttcaat cccaagaaca 300
gaagggacag agaggatgat gggcagagtg acctatctcg attttccgaa gatttcggga 360
agaagtctct tgacgtgcag tcttagcacc ttaatatcgg ttctgatttc attcgtatcc 420
acaggccaac gctaactata cagggtgtca gagggaaaga tttgc 465
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 11
ggcggctcta gggtaca 17
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 12
cgaagtgttg gaacccgtca t 21

Claims (4)

1.一株罗非鱼湖病毒株TiLV-GD1710，于2018年2月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：V201807。
2.一种快速检测权利要求1所述罗非鱼湖病毒的RPA引物，其核苷酸如下所示：
TiLV-S2-F：5' -GGCGGCTCTAGGGTACA- 3'；
TiLV-S2-R：5' -CGAAGTGTTGGAACCCGTCAT- 3'。
3.一种快速检测权利要求1所述罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括RPA扩增酶、醋酸镁和再水化缓冲液Rehydration Buffer。
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