CN111270009B - 一种鲤冠状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒检测领域，具体公开了一种鲤冠状病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测引物和探针及应用，发明人首次从鲤鱼中分离出了一种鲤冠状病毒，该病毒为鲤冠状病毒（Cyprinid Nidovirus）HL39，针对该病毒序列设计引物和探针：正向引物F：5'‑TTGCGACCCAAAGACGGTTATT‑3'，反向引物R：5'‑CGGTGGTTGAGAGCTTGTAG‑3'；荧光探针为P：5'‑FAM‑ACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCT‑TAMRA‑3'。可对鲤冠状病毒进行定量检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

Description

一种鲤冠状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物及应用

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲤冠状病毒TaqMan实时荧光定量R T-PCR检测引物及应用。

技术背景

套式病毒目(Nidovirales)于1996年首次由国际病毒分类委员会(InternationalCommitt ee on Taxonomy of Viruses,ICTV)提出，该目病毒宿主广泛，可引起哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼虾等水生动物多种重大疾病。套式病毒目冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒^[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。2002-2003年期间，自我国局部地区发生的非典型肺炎，即由冠状病毒属的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。

2018年ICTV调整了套式病毒目的分类，新增了Abyssoviridae、Medioniviridae、Monon iviridae、Euroniviridae和Tobaniviridae等5个病毒科，其中在Tobaniviridae科下新增Oncots havirus属。2017年，申请人发表了鲫冠状病毒的相关研究成果，目前鲤冠状病毒(Cyprinid Nidovirus,CyNV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。

申请人首次从鲤鱼病变组织中分离出一株鲤冠状病毒，针对该病毒，设计了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物，从而实现鲤冠状病毒的快速、精确检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物，所述的引物为：F：5'-TTGCGACCCAAAGACGGTTATT-3'和R：5'-CGGTGGTTGAGAGCTTGTAG-3'，所述病毒的保藏编号为CCTCC NO：V201988。

本发明的另一个目的在于提供一种鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物在制备鲤冠状病毒检测试剂盒中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供了一种鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR的阳性对照，所述的阳性对照是将SEQ ID NO.2所示序列插入pGEM-T载体中获得。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物，所述的引物为：F：5'-TTGCGACCCAAAGACGGTTATT-3'和R：5'-CGGTGGTTGAGAGCTTGTAG-3'，所述病毒的保藏编号为CCTCC NO：V201988。

一种鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物在制备鲤冠状病毒检测试剂盒中的应用；

以上所述的应用中，优选的，所述的鲤冠状病毒HL39的检测试剂盒包括：

10×Taq反应缓冲液、dNTPs、正向引物和反向引物、探针、Taq DNA聚合酶。

以上所述的检测试剂盒中，所述的荧光探针为P：5'-FAM-ACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCT-TAMRA-3'。

以上所述的应用中，所述的试剂盒中还包括阳性对照，为将SEQ ID NO.2所示序列插入pGEM-T载体中获得。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明公开了一种鲤冠状病毒HL39的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物，利用该引物制备的试剂盒，灵敏度高，在50-5×10⁹拷贝数范围内定量准确。检测速度快，仅1小时，加上RNA提取及逆转录制备，共仅需3－4小时；可同时进行高通量的样品检测。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1：

一种鲤冠状病毒HL39(本发明或称为CyNV-HL39)，其分离过程如下：

1)将携带病毒的鲤鱼肝、脑、脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到草鱼性腺细胞(Grass carp ovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂，培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2

2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。

3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQ ID NO.1所示。

鲤冠状病毒的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符，该病毒已于2019年11月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲤冠状病毒(Cyprinid Nidovirus)HL39，保藏编号：CCTCC NO：V201988，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

基于鲤冠状病毒HL39的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物，所述的引物为：F：5'-TTGCGACCCAAAGACGGTTATT-3'和R：5'-CGGTGGTTGAGAGCTTGTAG-3'。

实施例3：

一种鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，步骤包括：

1)提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；

2)PCR体系

荧光定量反应液由10×Taq反应缓冲液2μL、2.5mmol/L dNTPs 0.4μL、50μmol/L正向引物和反向引物各0.4μL、25μmol/L探针0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL、无菌双蒸水14μl组成。循环条件为：95℃预变10min；94℃10s，60℃45s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。

所述的探针为P：5'-FAM-ACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCT-TAMRA-3'。

3)检测结果判定，

Ct值≤30,且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性。无Ct值或无扩增曲线，则结果为阴性。Ct值>30时，重做该样本，若重做结果无Ct值为阴性，否则为阳性。

标准阳性模板是含有鲤冠状病毒基因203个核苷酸片段(SEQ ID NO.2所示)连接入pGEM-T载体构成的。且该载体可在大肠杆菌E.coli DH5a中增殖。该质粒转化大肠杆菌E.coli DH5a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀的定量并稀释至1×10⁹拷贝/微升，-20℃保存。

实施例4：

鲤冠状病毒荧光定量RT-PCR引物制备的试剂盒的定量公式的建立及灵敏性试验。

A).模板制备:

将含有鲤冠状病毒基因203个核苷酸片段(SEQ ID NO.2所示)连接入pGEM-T载体的质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测定阳性重组质粒浓度为210ng/μL，A260/A280值为1.82。

并根据以下方法计算重组质粒的DNA拷贝数。

分子拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³×DNA质量浓度/DNA分子量，其中：DNA质量浓度＝260nm吸光度×50×稀释倍数；DNA分子量＝DNA碱基数×324.5。

B).标准曲线制备

将重组质粒进行10倍梯度稀释，以1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、10co pies/μL作为标准品模板，建立标准曲线。分别取不同稀释梯度的重组质粒5μL，依次加入10×Taq反应缓冲液2μL、2.5mmol/L dNTPs 0.4μL、50μmol/L引物F/R各0.4μL、25μmol/L探针P 0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL补水至20μL将上述反应体系混匀后进行PCR扩增，反应参数：95℃10min；95℃10s，64℃45s，共40个循环每个稀释度设3个重复。100拷贝数重组质粒可见明显扩增曲线。据质粒拷贝数与Ct值的相关性，分析得到标准曲线。拷贝数(x)与Ct的关系为：Ct＝-4.47lgx+56.72，相关系数R²＝0.9952。

实施例5：

鲤冠状病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒特异性试验

利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(CyNV-HL39)，待检病毒样品具体为：鲤春病毒血症病毒(SVCV)，草鱼呼肠孤病毒873(GCRV-873)，草鱼呼肠孤病毒9014(GCRV-9014)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)。

表1鲤冠状病毒RT-PCR检测试剂盒特异性试验

试验编号	名称	扩增结果
			1	CyNV-HL39	+
2	SVCV	－
			3	GCRV-873	－
4	GCRV-9014	－
			5	IHNV	－

结果如表1所示，仅阳性对照组(CyNV-HL39)可见典型扩增曲线，ct值为：24.2说明鲤冠状病毒HL39RT-PCR检测引物具备很强的特异性。

实施例6：

用鲤冠状病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测鲤冠状病毒临床标本：对4个疑似患病鲤鱼采集组织样品。

结果如下：

一共4份样品，全为阳性，阳性率为100％。疑似患病鲤鱼组织的Ct值分别为28.8、29.2、30.1和32.3。根据标准曲线计算出反应体系中疑似患病鲤鱼的冠状病毒量分别为10^6.25拷贝数/μL、10^6.16拷贝数/μL、10^5.96拷贝数/μL和10^5.46拷贝数/μL。

从上述实验可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需4个小时就能完成，而传统的PCR法约需7个小时左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量PCR检测仪的型号决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

武汉海关技术中心

<120> 一种鲤冠状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25833

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgaattacc aataaactac cacccgctat tatagcacta gacactagcg aactgctagc 60

ttcctccaag ctgcacaacg caaactgtct ttttaactct cctaacctcg aacgcagcgc 120

aggtaccctc acccggacca cgcgtgtgcc cttgactgga aaccctacct tcgatcaggc 180

cttcgaacgc agcaaaggta ccctcacccg gaccacttgt gtgcccctac gcctgctctt 240

acgtagcccc atcctaccca cccgccaact cttaacctat cagctttgcc caccgtgacg 300

actagacgtg atctaactgc tactaccaat cctattacaa ccaacttgcc caccaagacg 360

actagagagt gacgtaactg ctactgccta aggcactacc agcgaaatca taatctgctc 420

ctcttgaccc aagacggttt ggaacggtgc tactagtgaa ctcacttctg ctccttgcga 480

cccaaagacg gttattattt ggaaaacctc ttacactctg cccctttacc tactcaatat 540

aacttaaatc tcttttagaa tcgcgctagc gcaaaccttc accggtaacc gccagaacgt 600

cctacaagct ctcaaccacc ggcactttgt tgctaaatcc tacgtgcaag catctttttg 660

ctataacatc cacgttcgaa aatcaacaaa aatgcccaac atgcgaatcc gcaagattgc 720

tcctaaagcc gctgttaaac caacccatag cggcccaaga gtggtctcca atcccgcaag 780

ctgccacatc tacatcggac cccaactgcg tgctcacaac tacccgagcg tgctaaaggg 840

ctcctttaag gctgtcagcg cggaaaccat aacagctacc aacctaattg ccaccgtccg 900

caaggatgct ggtatttcag gtcaatatgc tgggaagatg ggttatgacc ccgagatggg 960

acttttcgtc tccgtcgaag gtgttcgtgc tctccaagct tccaaactcc aaactgccct 1020

taaggcaatt aaaaagggta ctagaccctt tggccttttc aggcctaaac agagtgtgac 1080

taacacccac gctcaaaatt tgctagccct ccaccgtgct agctccaccg gcccttggac 1140

caaacactta ccatctcaag gtcccatagg taactgcctc gcagaattca tgcaggagta 1200

cactaccaca attccaccat ttgatagtgt cctcactgaa aacggttggc aatacgctgt 1260

cacgattgac ggtgtgacta aatctcgcct cccgtacacc gaaattcgcc gcggtggtta 1320

tgaatttaaa acaactaatt accacatcgg tgcaatccag gttactgcca accacattgg 1380

caaagtaaac cctggagata ctaaattgga ctgtcaatat ttcatgttgg cacgtaatca 1440

aaagccccaa aacttcactg ctgagcaact cgaaggaaac atccataaca tcatcttcga 1500

cctcagtcat gaaactggca aacccaaact ctatggaatg gaagaaacac gacaatgggc 1560

tgggacaaca ccaaaaccac ctaagaaaaa gcttagactt gtagctatga catcaactct 1620

cagtgccact ccatcaacca cacacccagc gcccctaaca accacacgcg caccacttaa 1680

aacacacatt tcaattggcc cgcacaactg caccatcata gatattaata aagcccaatt 1740

cgcctttgat aactacactt ctcaactccc taactcttgt gttcaccgtg ccaacaaagc 1800

tgtttgcgcc ggtttgaatg ctgatcttct ttctacccac tttaactacc tctctaaagt 1860

agaaacatct aaaggaactt atcaatgggt acattttagc cccaaaacta cggcccctgc 1920

tatccaattc tacgtcttgc aatttcagaa ccacgtctac ctacgtcttc tccccatgcc 1980

tatgaacctt tctttccgca ctatctgcga cattgaaacc gcccacggtc aaccacaccc 2040

aacttacaca agcccagact ggcgcgtgta ttacctcgca aagtacgatc ccaccaaagt 2100

actcagagtt caagttgttg attgggcagg ttcagatacc attactgaag atcatgtcac 2160

cctcttccca cgccgacaca ttatgactaa agttttgaaa aacgaccaaa ctaaagttaa 2220

ctacatcgac ccaactaaag atgcagcaac aacacccttc acaattgaaa cagttgaagg 2280

aggcaaagtt gaagtactct ccgccaacgt catccgccaa attaacattg aaactggtcg 2340

cggcaagaaa cgtaaaacag ctaaattaga tgtaaaaatt tcaattagag ttaaagctac 2400

taaaacccgc acaacaattc acatcttcat aacccaagca aaagatgaaa gcaaaatcgt 2460

cactccaacc ttagaaatgc agggagtagt cgacgtttta atttccagag catgtgtcct 2520

ctcacaacac gcaggacctg acatgactta tgaactgcac acacctgacg gttcttgcac 2580

taaccccctc gttcaattct ttgaagaaga aggcgaggtt cctgaagatg tttacgatct 2640

cttcccatct gtagaacgta acgctgaagg tttagttatg tgcatgccag aaggttttgc 2700

cctcatttct ggttgcattc ctcatccact tgcttactat gctgacaagt acggtcaaac 2760

actcgtacct gaattcaaag tgacaagaac tcacgttgaa cgcggcccca ttccaccatc 2820

acggtccatt tactacacat tcatcccaat taatgtagac tccatcccac ccttcggaca 2880

cacctacaaa tccctcgcca aacttaacac atttaacctg ggctgggaag atcaagacat 2940

gttagataac gctgacaccc tccttccatg tctcttagaa atgaaaacat gaaacttcac 3000

ctaacatgga aaatcatcgc ccgtgacttc tcagataaca ccactgaaac agcccttacc 3060

atctacactg attttacaac tagtgatttc accccagcca accaaacagg atccagctct 3120

caatccctta gctctccacc tctttcccaa ctctcttccc acaaatctct tgctaacctc 3180

tcagaaactg gctcaataga taacatcccg gaaaacaccc ctgaaacaat ccaagaagaa 3240

gaagatatcg aagaggaagt aacatctcct gttcaaccca cactcaacac actccaagaa 3300

caagctactc tcaacgaatc cattcaatca ctcgttgaat cagttgattc tgatgtccct 3360

tacacctggg aacaacgtgt tgaagaaagt gaggttgcga ctattgattt acaagctgta 3420

gaattagatc aaacacccac tcccaccact ctctcaacag aagcagtgca agaatgggtc 3480

aacgcaacat cacctgacct tgctacagta gactggaaca gtgcaataac tgaacaggaa 3540

accacagtaa cttcactaat agaagaaatc tccctacgcc ccaacaccaa caacaccggc 3600

tataacttgt ttaaacctaa ccaacgtaac aacaacagcc catcagacta cctatcacga 3660

acaacatcag caaccaaaca ctgcttaatt aacggtctta cttcaggttc caccatcctt 3720

gaagtcggat gcggatatgg taaagaattc cacaaataca agaactctaa catcaaagtc 3780

gttgctttgg aacctcacca tgaacgctac accgaagccg caaagaaact accaccaaat 3840

tctaccattt acaacaagac cctagaagaa tacaaccaaa ttgtcattaa agaacaaatt 3900

gacgccctag tttcctttaa cgccattcat tacagtacag ttactgaagc tcttaaagca 3960

tgtaaccttg ccaaagatca agttgtcatt ttaacaccaa atcatgataa acttaaagct 4020

cttcacgata gtaacacaac catcacaaat tacaaaattg aacttgctaa taacaaattt 4080

acattcacaa tcggccaaaa cacctacagc gaaaactact tctcacttca ggatttcatg 4140

attggaatgc atgccagcaa cttcatgctt tcttcccgct cttgtactct gcttgaacat 4200

gttaacacct ttaatgccca cctcttaatt gacgccacaa cagaaacaac caccctgcta 4260

gacgcctatg aagtactcgt cttcataaaa tttagaccac tgctcctcac ctactccaac 4320

accgctcttg caactaacaa ctcaagaaca atccgcagtg cactctcacg tcttattaac 4380

ttccgtgtcg caccttctaa aacaatatca caggtacatg ttcacatcct cacccgcaac 4440

gaccacgcag ccacagaaca agaacatcta gacttagcaa atattgaaat tgcccacatg 4500

aacccaaaac cagcaattat ctttgtaact tcttcccgat ccaaacataa ctacaccacc 4560

ccaactgtct tcttcgactt tgctaaacta tcagccccca ccctcccaga acagcttaaa 4620

ccactcactg atctagccct cgcaatccaa cacactgcta ccaaaactcc aacaacagta 4680

cttacaactg ccccagagga cccaaaaacc ctcccaacag cacccacctc ctttacaaaa 4740

ccttcccgta aacgctacca ctgcttccac gatttaacca ccctaccagt taacaaaaat 4800

ttcatcttag ttaacgcagg taacccccac ttaaaatcag gtggtggaat aactaaagcc 4860

gtctataatc gctacggcca aggattcatg caaactaaca acagcatgca tgctacacaa 4920

ttacctcttg aagttggtga cgtcttggaa tacccctctg accgtaacaa cctgattaac 4980

gtgacagccc cctgcatcaa catcaaacac gcagattaca aaggcccaca accagcccac 5040

gcactactag caacatataa cgcaattatc aactacgttg aacgtaagta cgataatggc 5100

gacgagaaac acgtcttcat tcctctactt ggtgctggat actacggttg gtcacagatc 5160

caaagccttc aagcttttct atccgcgact gataatagtt tccgcaacac atatgttcta 5220

ctcctacacc catcatctgt agatgttgaa acagctgaag tatttgcaaa aatgctcgcc 5280

actactaacc cacactacta ccatgttgag ggcatagcta aagttaatgc caactcttgc 5340

gttctgcgtg cccacattga ccttgcccgc aaaacatctt accctcaacc tagcttagga 5400

ttaatcggcg cttactggat gtacacctgc cccaccctgg ccgccccatt gatacaagct 5460

ggcatgcacg gtcccaacac ctggactcct ggcagcttta ttgacactag tattgctgaa 5520

atgactgctc gcgcttacaa aataaatctt gtttgcgacg gttgcttcac tgatatcatc 5580

aatttcaatc ccgaccaagg tttaatctgc aatacctgca agacacctgt cactctccgg 5640

acaaactatt atcgcccacg cctcccacac atgattaaaa atagtcacgg acaacccatc 5700

cctaacatta ttctggatgg aatctaccac atggccacgc accaattgtt cctaaattcg 5760

gtactcttta aaaattcaca tgctttcaca attaacaacc taagtgaatg tgatctccca 5820

actactatag cagtagcaac ctacttttac aaaccttcag atgctttaaa cttcttcctg 5880

aactttaact ctgctatttc tgctaacgta acttatacat cagaacagat aacacaagct 5940

caaaccaccc ctcaactcac cactgatgat gactactcgg acttggacat tgacacaatt 6000

aaccctacac ctactacttt accacgcgcc ccaacaccgc tttcaattag tgatagtagc 6060

gaagatattt cactctccga cgacacccac accgtagcat cccatcacgc ttcacaaatg 6120

tccataacag ctgacacaac tagtgataga tatagctcta caaactctct agctatctca 6180

gaagatataa catttcaaac aggtgacggt gaaacaacaa cttcacttct gactgattcg 6240

gtcctatact actctgtcgt tacagtctta caactacgta aagcagagga ttgtgtagaa 6300

cctgctgtag aaactattaa cctaagaccc aactcatcac ttcatacctt gacacatgat 6360

acaaacgcca ccgaccaact ttacatccaa gtggcttctg atgcttcaaa tcacactgta 6420

atcaataaca ccacacttga atctatttct aaaacgatgt gtgtgaaaaa ctccttgtac 6480

accctactta ccaactcaaa gtgtataagt caccacatca tagttacagg atatgaccaa 6540

catgctcatg aaacacatac tatcaaaagc gtcacgcgcc aagccatgct cgccatccaa 6600

cccctttcac aacttacgcc cacacacgtt tacagcacac ttcaagaaga tatttccacc 6660

atcttccaaa ctgtcgtcct agaacacgtc aaccacacca agctttccac ttacaacacc 6720

aagcttcact acgcaaccac agtaccaaca aacctactca tcgatggaac aatcgaagat 6780

gttcaaggta agctgcgcga agttgatctt ggcattgttg ttccttacca gtgtgaagtt 6840

gacgagcaaa ttgaatacac aaatgcaatt ggcgacgttc tctaccaaaa cacaaatcac 6900

cactcaccac tagtgacctt tgtttctatc gacaaatctt ttactaaacg tatttttaat 6960

tctttaaagt ttcaaactct acagaaccta tggctctacc ttattaccct acaagtattt 7020

ttcacagtta aaggaattgg cttcggcttc agctcaacgg aaccaaacac acaactcatg 7080

aacggtctct ggatacaata cggcatcttc tacttccaag tacacctcca aaccctcatc 7140

acccacccag tgaaaaatgg ctacagacta ctttcattac caatcatgct atacaacaaa 7200

ggcaaaagat tcaccgaacg ttcagtccaa acaatgacgg gagaaatcgt taacacacga 7260

aaaccctcgt tatcaaacgc tgtacaaaaa tacggcatta acactcgact tgaatacgtt 7320

gatatcttcg atctcctcca ctatacacct ggatacatcg cgtttaacat cgcctttttc 7380

tatctctttg ctggtaatgg ctatataaca ttcttagcct acatcatcca atttttcacc 7440

gctcgcgata tctacagact ctctaaacac ctctacacag tctcaaaact caccaccttc 7500

ctcgcgaaat ttaaaacagc aaccacccgt cacgtcttgt acgccaccaa ccaagtaaac 7560

aaccgttccc ttcatctcac cctcggatcc acgacaattg acttactcag ctttacaagc 7620

aaagcagctt tccttgccct gtgctcctcc ttcatctcat ggcatttcgg attagctctc 7680

gccggtggtc actctggtga agactactct caaccaccct accacgcagt atttcaacat 7740

gcactccgca ctttcggact tattcctcct aaagaacatt actacagcta cccatcccta 7800

gcttcagcct gcgcagactc atcagcccct ctctgcttcc tcggaacacc atttaacttc 7860

cacttcccat catcctacac acaagcagca tccatgacta cagaacacgt agtaccattc 7920

tggatccaac taatcatcct agccccacca tcgctttttt tagttgtcat tccgtggctg 7980

atcacaatgt tcatctcacc agtattaaca tttaaccaac ttttgctccc tgcactcgcc 8040

gtacatttct tagctatcta tgtaatctac ctttactatt tcaagaaatc gtgctgccat 8100

tctcacacat gccttaaaca cgctaaatta gaccgcccca tccaaattaa aggcctcttc 8160

gatttatcca tgtacttcaa tcacaataaa ctttgccccc gccataactt ttactgtaat 8220

aatgctgacg aacctggcca cacacttgga cccgtcctag cagctcacat cactgaattt 8280

tatcatctta aacctggcac tattaagccc gatgtcgccc tagtacacac agaacaccac 8340

gcttccctga gtcgcaaaga attgaagaaa cacgacgacc caaccgattg tgtctggacc 8400

gccccacaag gcgctgctga tactctcgtc tacgaagcct actcccattt gaaaggagtc 8460

caaattcgca ttgatgccaa caccgataca acaactcgta gcatgcctat tcccatgggc 8520

gccaaaacaa catcttctcc agctacaggt gtcatcaaca caaaagttct cggccatctt 8580

aaaagacatt gtaagaaacc agctctccaa tcttacctct caggatacgt cggtgccccc 8640

aacgctaaaa ctactatcat gcccattacg ttttttaaac atctgcctga aggactcaag 8700

aaatacgcca tcaaaaacat caccttctca actaacatgc taactgacaa ctctaactca 8760

ggtttcatcc cagaaggcat ccacaaccca aacaacctcc caaccaagac tttcctggtc 8820

aagtctatcg atcaaacaat tttcgaccaa ctccacccag aaacacaagc tatgctaaaa 8880

gacgaatacc acattaaact tcatgatata acacctcaat ttcacgaagt tattgcttca 8940

gtgatgtcct acgaaagttt catcttcgca ctcatcattg tcttatccgt cttcctcggt 9000

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actatgcgcg gatccaccac aggtaaacca ttcattcaac cagttactta ccccaactcc 9120

attctaatcc ctctgacatc ttcccaatat aatgtattca gactacaaaa cggaaccctc 9180

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gttcatctcg gtggtgtgaa aatcgcttac cttagagccg gtgttgctta caacatgcca 9360

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aaaccaattg aaatgtcaat gatggataaa caatatgact tcctctgcgc catcattgta 11220

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tacagatcct tcacatcttc aacaggcggt ctcttaacat tctcagaatt cgcctttaac 11400

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tacccactct tgcagcatgt catcagcgca accctgatct tagcaatcgt gccatctccc 11520

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gatctaatga aaacctccat aaaatcattt attacttcac caccactgat aaatatctgc 14220

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cacaaattat aaagagccga caagacctag tctctggctc ctacatggat aaactactag 14460

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tcgcatcaac agttttcaga tttcttcaca aacctgtaac catgcgcatg gtcgaacaag 15240

cccaaaacaa cattggccca ctcctaattg gcgtctctaa atttaacggc ggttttgata 15300

aatacatccg tactcaacat ccaaacggta tagaacatta caacgtcatg ggtgcagatt 15360

acacaaaatg tgatcgtagc ttcccattga tcaaccgcgc cttcgccgca gcccttttct 15420

atgatttagg aggtttacca tctgacaaca tgtggtttat caacgaaata tccgccttca 15480

tgactgactt ctgcaacatc tcaggtcaca catttaataa accaggcggc acaacatcag 15540

gcgactcaac aactgccttt tccaactcca tctacaacta cttcgtacac ctcactgtac 15600

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tctgcagttc tcacattgaa gaaatcgacg gtgtctatca atacattcct gatcctaaca 15960

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tccagtttct acagatttag gcacagtagc tgttggcaac acaaatccac ttgattaccc 22320

tggaatttgt taccaatcag tttgcttgac tcatcctact attaacttca gacttttgtt 22380

atcagaatta ccaattaaat gggaagtccg acctgaaggt atctatgtaa catctagaaa 22440

cgatcctaca tgcctgaatt tcaaaacatc acagttggga acagttttca ttaccctcta 22500

cgattctacc gctacatgca cactccaaca gactacttac tctcgctctg ctgtcctgcg 22560

ccaagtcaac acgtttacac caaatgctac tgatttagtc gtgccttacg gcaaaacacc 22620

aatatacaat ggagcctata atattaattc cactgcatct ggtgctgtct ctctctctac 22680

caacacacac tacattccac gtctcctcac ttcagtttta acaccgcaaa gtgactacaa 22740

gattacacct acaaccacta atcttgaacc attcgtggaa attaatggca caacctttta 22800

ctacgatgct aatcaagcct acgtcaacac atcggacgtt tatcaagcta acgttgattt 22860

tggactcccc caaacatttt ctcttgatac cagctttctt aattgcacag ctttcctctg 22920

cgcttctgac tacaaatgta tcgccgactt ttcaccaatc tgctcagcta cacaaccact 22980

aatcgacgcc ctactccaaa cctacacact gtacaatcaa caacttacac tgtacaattc 23040

ttccctgctc acaattcaag ccgctgcaaa ctacctctac gacacaagaa cacgtactag 23100

acgatcactc ctatctactg ttaaccttgg ctacggtgac gtttttcaac aaccagcctg 23160

ggtctacgaa ataggtgcaa cagctgcaat tcctatgatc ggccctgcaa tctcagtcgg 23220

tttgttagcc agtagagtag catctattga atcaaccctc taccaaatta cccaaggagt 23280

gaaggagtct attatggcta tgaacaccaa gcttgataag attgccaaca ttttacactc 23340

agacattgaa agattaggat taacagttaa cacattagcc tcttcattca acacattcac 23400

taaacaagta acagataaat ttgcctctgt tgatgttgca tttaacgact tatcaacatc 23460

actgaacaca ctcaccacaa caacaactgt tggtgcctct tatgcagctc aaattaactt 23520

cgcaacaacc acgctaacca atttagaagt tcaaatctct caaacaacag atcacgctct 23580

atcttgcatc gctgcgctta atgaacatgt tctttctcca cactgcattt ccgtttcaca 23640

acttagcgct tacacaccta atgctctctc taacatcggt gaaaaactag tactaactca 23700

ctacatcaac ggatcactca tcacattcta ccatctcatt gctagcaagg gagtttacag 23760

acccctgccc aaaatgtata actctacaca ccatttagtt gcaacaactg gcttttataa 23820

cggccattgt atcttctgtg gtgaacatta ttgtgatatc agcgtttctg taccatgtga 23880

ttatgcgtac gaaccactta aatccactgt actagcagct tacccactaa caactggtgt 23940

agcccttctt actcttgact ctacagctac taacttcgtt attaactata ataatgcccc 24000

tctcatttca tcaagcgttc cacaaccacc tatcatcaat aacaccgatg gtacagttat 24060

tacgctccaa caacaactaa tccagctcca aactcaattc gatcacttta acatctcgtc 24120

gaattttcac gtttcagaaa tccaaccagt catagactac tacaatgcac aaatcaactc 24180

atctctaaac cagatagttg atttcggaaa tggctcaaca tctaatgtag gaacaatcat 24240

cctcattgta actatagttg cctttgctct tgcatcagct attgccatta tctgtggatt 24300

aaagcactaa agaccaacaa gttgcaatgg tttccaccgg tacaaacacc accgcaggag 24360

atcccaacct tgggtttcac ttacaactta atgatgtcct taacaccctg gacatctccg 24420

gcttcagcat ctcaaattct catttgatga gtgcgatgct gaccctcaac cttctctgga 24480

gcgctatctt tctagtctcc ttttatctaa tcttggacat ggttatgtac tacgttcccc 24540

tgctcaataa gattccactg ctgccaacaa tcaaaaacct ttgttggttt atctcgactc 24600

tgcttgttgc tgtttccatt tacgcttcag gaactctgct gatcatcaaa atcttcggag 24660

gcgtagtctt gctccttgct tttctcggca tggtgaagac tttctatatg ctcattgcaa 24720

tggcgctgtc ctactaccga caccgtaaca tcgcagtggc attgaacggc cctaatgtcg 24780

ttatggttaa tggcacagca gtccactctg atttcatccc cacgtctgtg acactggtga 24840

agaaagatgg tgaactctat tttcaaggaa caaaggtccc cggaaacaac ttgattgatg 24900

caaccgtgaa gatcttcact ttcaacgaat cgtttgaatg cctccccatc gcactctcac 24960

gttacactaa aggttcctac gctagatttg agctcaagtc gaccaacacc cactatgaac 25020

tccaaacttt ctatccttcg caaacagaaa ctaaatctgt ttgaaacact agcgaaaaca 25080

aattacaatg gcattctacg gacaaccaat gatgcctatg cctatgcctg cttcctttcc 25140

tcctcgtcgc cgcgccccta aaaagcgccc gccacagaag aaacaagcca agccccaacc 25200

taaacctctt aatgaccaac agaaaacagc tgttgcaaaa gaggctattg ccaaaaccaa 25260

tactgtgcca atgccaccca tggccacagt agtgaagaca aacctgcgcg ttcaggttgt 25320

aaaaagcaaa cgcggtgacc tcctagatgc tcgagggcgt cttacacaat cagagatcaa 25380

ccagctgtat ttccaaatcg ccactgccct caacaacggc ctcggagaaa ttggaataca 25440

caatgcttca acacaggacg gcgttcgtct catcgtgcgc ctcaatttag cccctcctac 25500

ccctattgct gagaaactct acaaatctca cgcggcggct aatctcaact cagaaattct 25560

ggtttctaaa caaaaggaac tggagcgaga ccccattttt catgtttcct cgactgagta 25620

aactgacttc acctcaaaac tgaagtatat ataatcacat ctatcacact atcctttata 25680

aactatatat tggggtggca ttaggccatt ccaaagaatt ctttaagatc acactcctcg 25740

atacctgact agtcatcacg tttcctgggg tctgctcttt aacattctac tatcctataa 25800

gatctaaaac tatccaaaaa aaaaaaaaaa aaa 25833

<210> 2

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctcttgacc caagacggtt tggaacggtg ctactagtga actcacttct gctccttgcg 60

acccaaagac ggttattatt tggaaaacct cttacactct gcccctttac ctactcaata 120

taacttaaat ctcttttaga atcgcgctag cgcaaacctt caccggtaac cgccagaacg 180

tcctacaagc tctcaaccac cgg 203

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgcgaccca aagacggtta tt 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggtggttga gagcttgtag 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctcttaca ctctgcccct ttacct 26

Claims (4)

1. 一种鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，所述的引物为：F：5'-TTGCGACCCAAAGACGGTTATT-3'和R：5'-CGGTGGTTGAGAGCTTGTAG-3'，所述病毒的保藏编号为CCTCC NO：V201988，所述的探针为P：5'-FAM-ACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCT-TAMRA-3'。

2. 权利要求1所述的鲤冠状病毒HL39 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针在制备鲤冠状病毒HL39的检测试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的鲤冠状病毒HL39的检测试剂盒包括：

10×Taq反应缓冲液、dNTPs、权利要求1所述的引物和探针、Taq DNA聚合酶。

4. 根据权利要求3所述的应用，所述的试剂盒中包括阳性对照，为将SEQ ID NO.2所示序列插入pGEM-T载体中获得。