CN107245532A - 一种鲫鱼冠状病毒hb93的数字rt‑pcr检测引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT‑PCR检测引物及应用，所述方法包括利用CCBV基因片段设计的引物序列和探针序列进行数字PCR扩增反应。利用本发明所提供的数字PCR检测引物可以实现对鲫鱼冠状病毒样品的精准检测，灵敏度可以达到2个拷贝。此外，该方法步骤简便易于操作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，是一种检测鲫鱼冠状病毒的有效方法。

Description

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用。

背景技术

国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2012年发表了最新的病毒分类第九次报告，将套式病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科(Coronaviridea)中新设冠状病毒亚科(Coronavirinea)和环曲病毒亚科(Torovirinae)。

冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒^[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。2002-2003年期间，自我国局部地区发生的非典型肺炎，即由冠状病毒属的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。

目前对冠状病毒科的研究主要集中在冠状病毒亚科，而对环曲病毒亚科研究甚少。其中，2006年鳊鱼病毒属(Bafinivirus)的中的鳊鱼病毒(White bream virus)由Schütze H等科学家在鳊鱼体内发现，这也是目前ICTV分类中确定的唯一以水生动物为宿主的冠状病毒。

目前鲫鱼冠状病毒(CrucianCarpBafinivirus,CCBV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，所述的引物如下：

F：5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R：5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'

P：5'-FAM-CTGGGACAACACCAAAACCACCTAAG-TAMRA-3'。

本发明的另一个目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物的应用。所述的引物可用于制备检测鲫鱼冠状病毒的检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，所述的引物如下：

F：5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R：5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'

P：5'-FAM-CTGGGACAACACCAAAACCACCTAAG-TAMRA-3'。

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备检测鲫鱼冠状病毒的检测试剂盒。

优选的，当制备成试剂盒时，该试剂盒的非诊断性检测方法包括：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测方法，步骤包括：

1)提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；

2)微滴PCR

扩增体系：2×SuperMix 10μL、10μM上下游引物各0.8μL、10μM探针0.4μL、cDNA模板2μL、ddH₂O补足至20μL。

反应体系：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。

3)结果判定

(1)在利用数字PCR进行扩增的过程中，阳性孔的判定方法为：出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，这个反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法为：在相同样品的三个平行组里面，至少出现一个组还有阳性扩增孔，就说明检测样品中含有靶向病毒成分；

(2)阳性质控品反应孔中产生阳性结果以及阴性质控品反应孔中产生阴性结果时，该实验视为有效实验，否则实验无效，需要重新更换反应试剂，并重新进行；

(3)当待测样品反应管中为阴性结果时，则说明未检测到鲫鱼冠状病毒核酸；待测样品反应管中为阳性结果，则说明待测样品中含有鲫鱼冠状病毒核酸。

以上所述反应体系适合于从病鱼组织、细胞中提取得到的RNA样品，并逆转录成cDNA，可以实现对鲫鱼冠状病毒的精准检测。

在本发明所提供的方法中，可以利用本领域常规的数字PCR仪器完成检测过程。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

利用本发明所提供的数字RT-PCR检测方法和试剂盒可以实现对含鲫鱼冠状病毒样品的精准检测，灵敏度可以达到2个拷贝。此外，该方法步骤简便易于操作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，是一种检测鲫鱼冠状病毒的有效方法。

附图说明

图1为本发明提供的引物的特异性的实验结果示意图。

图2为本发明提供的引物的灵敏度的实验结果示意图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1：

一种鲫鱼冠状病毒HB93(本发明或称为CCBV-HB93)，其分离过程如下：

1)将携带病毒的鲫鱼肝、脑、脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到草鱼性腺细胞(Grass carp ovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。

培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2

2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。

3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQ ID NO.1所示。

鲫鱼冠状病毒的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafinivirus)HB93，保藏编号：CCTCC NO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，所述的引物如下：

F：5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R：5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'

P：5'-FAM-CTGGGACAACACCAAAACCACCTAAG-TAMRA-3'。

实施例3：

利用鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR检测引物和探针对鲫鱼冠状病毒的检测，方法包括：

1.鲫鱼组织或感染细胞总RNA的提取及cDNA的合成：采用提取待测样品的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mMdNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板通过紫外分光光度法测定浓度和纯度，稀释至50ng/μL待用。

2.数字PCR扩增反应

1)配制微滴PCR反应体系：微滴PCR扩增反应的反应体系，以20μL计：10μL 2×SuperMix，10μM上下游引物各0.8μL，10μM探针0.4μL，cDNA模板2μL，ddH₂O补足至20μL。

2)在微滴PCR的生成芯片上，加入步骤1)中的20μL微滴PCR反应体系，再加入70μL的微滴生成用油，进行微滴生成步骤，完成微滴生成步骤后，将微滴化的反应体系转移至96孔板中，封膜。

3)将封膜后的96孔板放入PCR扩增仪中，PCR扩增程序为50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；

完成PCR扩增后，将微滴吸入流式荧光检测器中，在60℃下进行荧光检测。

出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，这个反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法为：在同一组的三个平行组里面，至少出现一个组还有阳性扩增孔，就说明检测样品中含有鲫鱼冠状病毒核酸。阳性质控品反应孔中产生阳性结果以及阴性质控品反应孔中产生阴性结果时，该实验视为有效实验，否则实验无效，需要重新更换反应试剂，并重新进行；当待测样品反应管中为阴性结果时，则说明未检测到鲫鱼冠状病毒核酸；待测样品反应管中为阳性结果，则说明待测样品中含有鲫鱼冠状病毒核酸。

实施例4：

鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR引物特异性实验

利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(CCBV-HB93)，待检病毒样品具体为：鲤春病毒血症病毒(SVCV)，草鱼呼肠孤病毒873(GCRV-873)，草鱼呼肠孤病毒9014(GCRV-9014)，草鱼呼肠孤病毒104(GCRV-104)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)，传染性胰腺坏死病毒(IPNV)，病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。

表1鲫鱼冠状病毒RT-PCR检测试剂盒特异性试验

结果如表1所示，仅阳性对照组(CCBV-HB93)可检测到扩增信号(图1)，其余组均无扩增信号，说明鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR检测引物具备很强的特异性。

实施例5：

鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR引物灵敏度实验：

本实验采用鲫鱼冠状病毒阳性样品CCBV-HB93的cDNA进行10倍梯度稀释。通过实施例3给出的检测方法进行检测。结果显示本体系在2个拷贝的模板量下，可以产生稳定的扩增，即本数字PCR的检测方法在扩增体系为20ul时，最低可检测到为2个拷贝(图2)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不

偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 中国检验检疫科学研究院 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心 中华人民共和国龙岩出入境检验检疫局

<120> 一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用

<130> 一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 26000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgaattacc aataaactac cacccgctat catagcacta gacactagcg aactgctagc 60

ttcctccaag ctgcacaacg caaactgtct ttttaactct cctaacctcg aacgcagcgc 120

aggtaccctc acccggacca cgcgtgtgcc cttgactgga aaccctacct tcgatcaggc 180

cttcgaacgc agcaaaggta ccctcacccg gaccacttgt gtgcccctac gcctgctctt 240

acgtagcccc atcctaccca cccgccaact cttaacctat cagctttgcc caccgtgacg 300

actagacgtg atctaactgc tactaccaat cctattacaa ccaacttgcc caccaagacg 360

actagagagt gacgtaactg ctactgccta aggcactacc agcgaaatca taatctgctc 420

ctcttgaccc aagacggttt ggaacggtgc tactagtgaa ctcacttctg ctccttgcga 480

cccaaagacg gttattattt ggaaaacctc ttacagacta gagtcttgaa tctccactgc 540

tactgtcgaa gtcggtgtgc tgcctttata aagccggtga actgctactg ttcttagaac 600

attatcagga atcctgctga attttgtcag ctatccctcc aagcgctact agtggtctct 660

tacctctact ctgccccttt acctactcaa tataacttaa atctcttcta gaatcgcgct 720

agcgcaaacc ttcaccggta accgccagaa cgtcctacaa gctctcaacc accggcactt 780

tgttgctaaa tcctacgtgc aagcatcttt ttgctataac atccacgttc gaaaatcaac 840

aaaaatgccc aacatgcgaa tccgcaagat tgctcctaaa gccgctgtta aaccaaccca 900

tagcggccca agagtggtct ccaatcccgc aagctgccac atttacatcg gaccccaact 960

gcgtgctcac aactacccga gcgtgctaaa gggttccttt aaggctgcca gcgcggaaac 1020

cataacagct atcaacctaa ttgccaccgt ccgcaaggat gctggtattt caggtcaata 1080

tgctgggaag atgggttatg accccgagat gggacttttc gtttccgtcg aaggtgttcg 1140

tgctctccaa gcttccaaac tccaaactgc ccttaaggca attaaaaagg gtactagacc 1200

ctttggcctt ttcaggccta aacagagtgt gactaacacc cacgctcaaa atttgctagc 1260

cctccaccgt gctagctcca ccggcccttg gaccaaacac ttaccatctc aaggtcccat 1320

aggtaactgc ctcgcagaat tcatgcagga gtacactacc acaattccac catttgatag 1380

tgtcctcact gaaaacggtt ggcaatacgc tgtcacgatt gacggtgtga ctaaatctcg 1440

cctcccgtac accgaaattc gccgcggtgg ttatgaattt aaaacaacta attaccacat 1500

cggtgcaatc caggttactg ccaaccacat tggcaaagta aaccctggag atactaaatt 1560

ggactgtcaa tatttcatgt tgacacgtaa tcaaaagccc caaaacttca ctgctgagca 1620

actcgaagga aacatccata acatcatctt cgacctcagt catgaaactg gcaaacccaa 1680

actctatgga atggaagaaa cacgacaatg ggctgggaca acaccaaaac cacctaagaa 1740

aaagcttaga cttgtagcta tgacatcaac tctcagtgcc actccatcaa ccacacaccc 1800

agcgccccta acaaccacac gcgcaccact taaaacacac atttcaattg gcccgcacaa 1860

ctgcaccatc atagatatta ataaagccca attcgccttt gataactaca cttctcaact 1920

ccctaactct tgtgttcacc gtgccaacaa agctgtttgc gccggtttga atggctgatc 1980

ctttcctttt cctacccact ttaactacct ctctaaagta gaaacatcta aaggaactta 2040

tcaattgggg tacattttag ccccaaaact acggcccctg ctatccaatt ctacgtcttg 2100

caatttcaga accacgtcta cctacgtctt ctccccatgc ctatgaacct ttctttccgc 2160

actatctgcg acattgaaac cgcccacggt caaccacacc caacttacac aagcccagac 2220

tggcgcgtgt attacctcgc aaagtacgat cccaccaaag tactcagagt tcaagttgtt 2280

gattgggcag gttcagatac cattactgaa gatcatgtca ccctcttccc acgccgacac 2340

attatgacta aagttttgaa aaacgaccaa actaaagtta actacatcga cccaactaaa 2400

gatgcagcaa caacaccctt cacaattgaa acagttgaag gaggcaaagt tgaagtactc 2460

tccgccaacg tcatccgtca aattaacatt gaaactggtc gcggcaagaa acgtaaaaca 2520

gctaaattag atgtaaaaat ttcaattaga gttaaagcta ctaaaacccg cacaacaatt 2580

cacgtcttca taacccaagc aaaagatgaa agcaaaatcg tcactccaac ctcagaaatg 2640

cagggagtag ttgacgtttt aatttccaga gcatgtgtcc tctcacaaca cgcaggacct 2700

gacatgactt atgaactgca cacacctgac ggttcttgca ctaaccccct cgttcaattc 2760

tttgaagaag aaggcgaggt tcctgaagat gtttacgatc tcttcccatc tgtagaacgt 2820

aacgctgaag gcttagttat gtgcatgcca gaaggttttg ccctcatctc tggttgcatt 2880

cctcatccac ttgcttacta tgctgacaag tacggtcaaa cactcgtacc tgaattcaaa 2940

gtgacaagaa ctcacgttga acgcggcccc attccaccat cacggtccat ttactacaca 3000

ttcatcccaa ttaatgtaga ctccatccca cccttcggac acacctacaa atccctcgcc 3060

aaacttaaca catttaacct gggttgggaa gatcaagaca tgttagataa cgctgacacc 3120

ctccttccat gtctcttaga aaatgaaaac atgaaacttc acctaacatg gaaaatcatc 3180

gcccgtgact tctcagataa caccactgaa acagccctta ctacctacac tgattttaca 3240

actagtgatt tcaccccagc caaccaaaca ggatccagct ctcaatccct tagctctcca 3300

cctctttccc aactctcttc ccacaaatct cttgctaacc tctcagaaac tggctcaata 3360

gataacatcc cggaaaacac ccctgaaaca atccaagaag aagaagatat cgaagaggaa 3420

gtaacatctc ctgttcaacc cacactcaac acactccaag aacaagctac tctcaacgaa 3480

tccattcaat cactcgttga atcagttgat tctgatgtcc cttacacctg ggaacaacgt 3540

gttgaagaaa gtgaggttgc aactattgat ttacaagctg tagaattaga tcaaacaccc 3600

actcccacca ctctctcaac agaagcagtg caagaatggg tcaacgcaac atcacctgac 3660

cttgctacag tagactggaa cagtgcaata actgaacagg aaaccacagt aacttcacta 3720

atagaagaaa tctccctacg ccccaacacc aacaacaccg gctataactt gtttaaacct 3780

aaccaacgta acaacaacag cccatcagac tacctatcac gaacaacatc agcaaccaaa 3840

cactgcttaa ttaacggtct tacttcaggt tccaccatcc ttgaagtcgg atgcggatat 3900

ggtaaagaat tccacaaata caagaactct aacatcaaag tcgttgcttt ggaacctcac 3960

catgaacgct acaccgaagc cgcgaagaaa ctaccaccaa attctaccat ttacaacaag 4020

accctagaag aatacaacca aattgtcatt aaagaacaaa ttgacgccct agtttccttt 4080

aacgccattc attacagtac agttactgaa gctcttaaag catgtaacct tgccaaagat 4140

caagttgtca ttttaacacc aaatcatgat aaacttaaag ctcttcacga tagtaacaca 4200

accatcacaa attacaaaat tgaacttgct aataacaaat ttacatttac aatcggccaa 4260

aacacctaca gcgaaaacta cttctcactt caggatttca tgattggaat gcatgccagc 4320

aacttcatgc tttcttcccg ctcttgtact ctgcttgaac atgttaacac cttcaatgcc 4380

cacctcttaa ttgacgccac aacagaaaca actaccctgc tagacgccta tgaagtactc 4440

gtcttcataa aatttagacc actgctcctc acctactcca acaccgctct tgcaactaac 4500

aactcaagaa caatccgcag tgcactctca cgtcttatta acttccgtgt cgcaccttct 4560

aaaacaacat cacaggtaca tgttcacatc ctcacccgca acgaccacgc aaccacagaa 4620

caagaacatc tagacttagc aaatattgaa attgcccaca tgaacccaaa accagtaatt 4680

atctttgtaa cttcttcccg atccaaacat aactacacca ccccaactgt cttcttcgac 4740

tttgctacac tatcagcccc caccctccca gaacagctta aaccactcac tgatctagcc 4800

ctcgcaatcc aacacactgc taccaaaact ccaacaacag tacttacaac tgccccagag 4860

gacccaaaaa ccctcccagc agcacccacc tcctttacaa aaccttcccg taaacgctac 4920

cactgcttcc acgatttaac caccctacca gttaacaaaa atttcatctt agttaacgca 4980

ggtaaccccc acttaaaatc aggtggtgga ataactaaag ccgtctataa tcgctacggc 5040

caaggattca tgcaaactaa caacagcatg catgctacac aattacctct tgaagttggt 5100

gacgtcttgg aatacccctc tgaccgtaac aacctgatta acgtgacagc cccctgcatc 5160

aacatcaaac acgcagatta caaaggccca caaccagccc acgcactact agcaacatat 5220

aacgcaatta tcaactacgt tgaacgtaag tacgataatg gtgacgagaa acacgtcttc 5280

attcctctac ttggtgctgg atactacggt tggtcacaga tccaaagcct tcaagctttt 5340

ctatccgcga ctgataatag tttccgcaac acatatgttc tactcctaca cccatcatct 5400

gtagatgttg aaacagctga agtatttgca aaaatgctcg ccactactaa cccacactac 5460

taccatgttg agggcatagc taaagttaat gccaactctt gcgttctgcg tgcccacatt 5520

gaccttgccc gcaaaacatc ttaccctcaa cctagcttag gattaatcgg cgcttactgg 5580

atgtacacct gccccaccct ggccgcccca ttgatacaag ctggcatgca cggtcccaac 5640

acctggactc ctggcagctt tattgatact agtattgctg aaatgactgc tcgcgcttac 5700

aaaataaatc ttgtttgcga cggttgcttc actgatatca tcaatttcaa tcccgaccaa 5760

ggtttaatct gcaatacctg taagacacct gtcactctcc ggacaaacta ttatcgccca 5820

cgcctcccac acatgattaa aaatagtcac ggacaaccca tccctaacat tattctggat 5880

ggaatctacc acatggccac gcaccaattg ttcctaaatt cggtactctt taaaaattca 5940

catgctttca caattaacaa cctaagtgaa tgtgatctcc caacaactac agcagtagca 6000

acctactttt acaaaccttc agatgcttta aacttcttcc tgaactttaa ctctgctatt 6060

tctgctaacg taacttatac atcagaacag ataacacaag ctcaaaccac ccctcaactc 6120

accactgatg atgactactc ggacttggac attgacacaa ttaaccctac acctactact 6180

ttaccacgcg tcccaacacc gctttcaatt agtgatagta gcgaagatat ctcactctcc 6240

gatgacaccc acaccgtagc atcccatcac gcttcacaaa tgtccataac agccgacata 6300

actagtgata gatatagctc tacaaactct ctagctatct cagaagatat aacatttcaa 6360

acaggtgacg gtgaaacaac aacttcactt ctgactgatt cggtcctata ctactctgtc 6420

gttacagtct tacaactacg taaagcagag gattgtgtag aacctgctgt agaaactatt 6480

aacctaagac ccaactcatc acttcatacc ttgacacatg acacaaacgc catcgaccaa 6540

ctttacatcc aagtggcttc tgatgcttca aatcacactg taatcaataa caccacactt 6600

gaatctattt ctaaaacgat gtgtgtgaaa aactccttgt acacccttct tactaactca 6660

aagtgtataa gtcaccacat catagttaca ggatatgacc aacatgctca tgaaacacat 6720

accattaaaa gcgtcacgcg ccaaactatg ctcgccatcc aacctctcgt acaactcacg 6780

cccacacacg tttacagcac acttgaagaa gatatttcca ccatctttca aactgtcgtc 6840

ctagaacatg tcaaccacac taagctttcc acttataaca ccaagctaca ctacgcaact 6900

acagtaccaa caaacctact catcgatgga acaatcgaag atgttcaagg taagctgcgc 6960

gaagttgatt tcggcattgt tgttccttac cagtgtgaag ttgacgagca aattgaatac 7020

acaaatgcaa ttggcgactt actctaccaa aacacaaatc accactcacc actagtgacc 7080

tttgtttcta tcgacaaatc ttttactaaa cgtattttta attctttaaa gtttcaaact 7140

ctacagaacc tatggctcta ccttattacc ctacaagtat ttttcacagt taaaggaatt 7200

ggcttcggct tcagctcaac ggaaccaaac acacaactca tgaacggtct ctggatacaa 7260

tacggcatct tctacttcca agtacacctc caaaccctca tcacccaccc agtgaaaaat 7320

ggctacagac tactttcatt accaatcatg ctatacaaca aaggcaaaag attcaccgaa 7380

cgttcagtcc aaacaatgac gggagaaatc gttaacatac gaaaaccctc gccatcaaac 7440

gctgtacaaa aatacggcat taacacccga cttgaatacg ttgacatctt cgatctcctc 7500

cactatacac ctggatacat cgcatttaat ttcgccttgt tgtacctttt ttctggtaat 7560

ggttacataa cattcttagc ctacaccatt caattcttca ctgctcgtga catttacaga 7620

ctctctaaac acctttacac agtctcaaaa ctcactacct tcctctcgaa attcaaaaca 7680

gcaaccaccc gccacgtctt gtacgcaact aatcaagtaa ataaccgttc cctccacctt 7740

acccttggat ccacaacagt tgacttactt agctttacaa gcaaagcagt ttttctcgcc 7800

ctgtgctctt ctttcatttc atggcatttc ggattagctc ttgccggcgg ccactctggt 7860

gaagactact ctcgaccacc ctaccatgca atatttcaac acgcactccg cactttcgga 7920

cttatccctc ctaaagaaca ttactatagc tacccttccc tagcttcagc ttgcgcagac 7980

tcctcagctc cactttgctt cctgggaaca ccatttaact ttcacttccc atcatcctac 8040

acacaagcag catccatgac tactgaacac gtagtaccat tttggattca actaatcatc 8100

ctagccccac catcgctttt cctagttgtc atcccgtggc tgatcacaat gttcatctca 8160

ccagtattaa catttaacca acttttgctc cctgcactcg ccgtacattt cttagctatc 8220

tatgtaagtt acctttacta ttttaagaaa tcatgctgtc attctcacac atgccttaaa 8280

cacgctaaat tagaccgccc catccaaatt aaaggcctct ttgatttatc catgtacttc 8340

aatcacaata aactttgccc ccgccacaac ttctactgta ataatgctga cgaacccggc 8400

cacacacttg gacccgtcct agcagctcac atcactgaat tttaccatct taaacctggc 8460

actattaagc ccgatgtcgc cctagtacac acagaacacc acgcttctct gagtcgcaaa 8520

gaattgaaga aacacgacga cccaaccgat tgtgtctgga ccgccccaca aggcgctgct 8580

gatactctcg tctacgaagc ttacgctcat ttgaaaggag tccaaattcg cattgatgcc 8640

aacaccgata caacaactcg tagcatgcct attcccatgg gcgctaagac aacatcttct 8700

ccagctacag gtgttatcaa cacaaaagtt ctcggccatc ttaaaagaca ttgtaaaaac 8760

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ccaggctatg ttacctacgc aggaatatgc gtctgccaac gctgcacact cagagaacaa 13380

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atttcaaaac atcacagttg ggaacagttt tcattacact ctacgattct accactacat 22680

gcacaattca acagactact tactctcgct ctgctgtcct gcgccaagtc aacacgttta 22740

caccaaatgc tactgattta gtcgtgccct acggcaaaac accaatatac aatggagcct 22800

ataatattaa ttccactgca tctggtgctg tctctctctc taccaacaca cactacattc 22860

cacgtctcct cacttcagtt ttaacaccgc aaagtgacta caagattaca cctacaacca 22920

ctaatcttga accattcgtg gaaattaatg gcacaacctt ttactacgat gctaatcaag 22980

cctacgttaa tacatcggac gtttatcaag ctaacgttga ttttggactc ccccaaacat 23040

tttctcttga taccagcttc cttaattgca cagctttcct ctgcgcttct gactacaaat 23100

gtatcgccga cttttcacca atctgctcag ctacacaacc actaatcgac gccctactcc 23160

aaacctacac actgtacaat caacaactta cactgtacaa ttcttccctg ctcacaattc 23220

aagccgctgc aaactacctc tacgacacaa gaacacgtac tagacgatca ctcctatcta 23280

ctgtcaacct tggctacggt gacgtttttc aacaaccagc ctgggtctac gaaataggtg 23340

caacagctgc aattcctatg atcggccctg cagtctcagt cggtttgtta gccagtagag 23400

tagcatctat tgaatcaacc ctctatcaaa ttacccaagg agtgaaggag tctattatgg 23460

ctatgaacac caagcttgat aagattgcca acattttaca ctcagacatc gaaagattag 23520

gattaacagt taacacatta gcctcttcat tcaacacatt cactaaacaa gtaacagata 23580

aatttgcctc tgttgatgtt gcatttaacg acttatcaac atcactgaac acactcacca 23640

caacaacaac tgttggtgcc tcttatgcag ctcaaattaa cttcgcaaca accacgctaa 23700

ccaatttaga agttcaaatc tctcaaacaa cagatcacgc tctatcttgc atcgctgcgc 23760

ttaatgaaca tgttctttct ccacactgca tttccgtttc acaacttagc gcttacacac 23820

ctaatgctct ctctaacatt ggtgaaaaac tagtactaac tcactacatc aacggatcac 23880

tcatcacatt ctaccatctc attgctagca agggagttta cagacccctg ccaaaaatgt 23940

ataattctac acaccattta gttgcaacaa ctggcttcta tgacggccat tgtatcttct 24000

gtggtgaaca ttattgtgat atcagcgttt ctgtaccatg tgattatgcg tacgaaccac 24060

ttaaatccac tgtactagca gcttacccac taacaactgg tgtagccctt ctcactcttg 24120

actctacagc tactaacttc gttattaact ataataatgc ccctctcatt tcatcaagcg 24180

ttccaaaacc acctatcatc aataacaccg atggtacagt tattacgctc caacaacaag 24240

taatccagct ccaaactcaa ttcgatcact ttaacatctc gtcgaatttt cacgtgtcag 24300

aaatccaacc agtcatagac tactacaatg cacaaatcaa ctcatctcta aaccagatag 24360

ttgatttcgg aaatggctca acatctaatg taggaacaat catcctcatt gtaactatag 24420

ttgcccttgc tcttgcatca gctatcgcca tcatctgtgg attaaagcac taaagaccaa 24480

caagttgcaa tggcttccac cggtaaaaac accaccgcag gagatcccaa ccttgggttt 24540

cacttacaac ttaatgatgt ccttaacacc ctggacatct ccggcttcag catctcaaat 24600

tctcatttga tgagtgcgat gctgaccctt aaccttctct ggagcgctat ctttctagtc 24660

tccttctatc taatcttgga catggttatg tactacgttc ccctgctcaa taagattcca 24720

ctgctgccaa caatcaaaaa cctttgttgg tttatctcga ctctgcttgt tgctgtttcc 24780

atttacgctt caggaactct gctgatcatc aaaatcttcg gaggcgtagt cttgctcctt 24840

gcttttctcg gcatggtgaa gactttctat atgctcattg caatggcgct gtcctactac 24900

cgacaccgta acatcgcagt ggcattgaac ggccctaatg tcgttatggt taacggcaca 24960

gcagtccact ctgatttcat ccccacgtct gtgacactgg tgaagaaaga tggtgaactc 25020

tattttcaag gaacaaaggt ccccggaaac aacttgattg atgcaaccgt gaagatcttc 25080

actttcaacg aatcgtttga atgcctcccc atcgcactct cacgttacac taaaggttcc 25140

tacgctagat ttgagctcaa gtcgaccaac acccactatg aactccaaac tttctatcct 25200

tcgcaaacag aaactaaatc tgtttgaaac actagcgaaa acaaattaca atggcattct 25260

acggacaacc aatgatgcct atgcctatgc ctgcttcctt tcctcctcgt cgccgtgccc 25320

ctaaaaagcg cccgccacag aagaaacaag ccaagcccca acctaaacct ctcaatgacc 25380

aacagaaaac agctgttgcg aaagaggcta ttgccaaaac caatactgtg ccaatgccac 25440

ccatggccac agtagtgaag acaaacctgc gcgttcaggt tgtaaaaagc aaacgcggtg 25500

acctcctaga tgctcgaggg cgtcttacac aatcagagat caaccagctg tatttccaaa 25560

tcgccactgc cctcaacaac ggcctcggag aaattggaat acataatgct tcaacgcagg 25620

acggcgttcg tctcatcgtg cgcctcaatt tagcccctcc taatcctatt gctgagaaac 25680

tctacaaatc tcacgcggcg gctaatctca actcagaaat tctggtttct aaacaaaagg 25740

aactggagcg agaccccatt tttcatgttt cctcgactga gtaaactgac ttcacctcaa 25800

aactgaagaa agtatatata atcacatctc tcacactatc ctttataaac tatatattgg 25860

ggtggcatta ggccattcca aagaattctc taagatcaca ctcctcgata cctgactagt 25920

catcacgttt cctggggtct gctctttaac attctactat cctataagat ctaaaactat 25980

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 26000

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctatggaatg gaagaaacac gac 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagagttgat gtcatagcta caag 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgggacaac accaaaacca cctaag 26

Claims (2)

1.一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，包括：

F： 5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R： 5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'

P： 5'-FAM-CTGGGACAACACCAAAACCACCTAAG-TAMRA-3'。

2.权利要求1所述引物在制备鲫鱼冠状病毒检测试剂盒中的应用。