CN107245532B - 一种鲫鱼冠状病毒hb93的数字rt-pcr检测引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT‑PCR检测引物及应用，所述方法包括利用CCBV基因片段设计的引物序列和探针序列进行数字PCR扩增反应。利用本发明所提供的数字PCR检测引物可以实现对鲫鱼冠状病毒样品的精准检测，灵敏度可以达到2个拷贝。此外，该方法步骤简便易于操作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，是一种检测鲫鱼冠状病毒的有效方法。

Description

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用。

背景技术

国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2012年发表了最新的病毒分类第九次报告，将套式病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科(Coronaviridea)中新设冠状病毒亚科(Coronavirinea)和环曲病毒亚科(Torovirinae)。

冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒^[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。2002-2003年期间，自我国局部地区发生的非典型肺炎，即由冠状病毒属的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。

目前对冠状病毒科的研究主要集中在冠状病毒亚科，而对环曲病毒亚科研究甚少。其中，2006年鳊鱼病毒属(Bafinivirus)的中的鳊鱼病毒(White bream virus)由Schütze H等科学家在鳊鱼体内发现，这也是目前ICTV分类中确定的唯一以水生动物为宿主的冠状病毒。

目前鲫鱼冠状病毒(CrucianCarpBafinivirus,CCBV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，所述的引物如下：

F：5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R：5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'

P：5'-FAM-CTGGGACAACACCAAAACCACCTAAG-TAMRA-3'。

本发明的另一个目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物的应用。所述的引物可用于制备检测鲫鱼冠状病毒的检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，所述的引物如下：

F：5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R：5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'

P：5'-FAM-CTGGGACAACACCAAAACCACCTAAG-TAMRA-3'。

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备检测鲫鱼冠状病毒的检测试剂盒。

优选的，当制备成试剂盒时，该试剂盒的非诊断性检测方法包括：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测方法，步骤包括：

1)提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；

2)微滴PCR

扩增体系：2×SuperMix 10μL、10μM上下游引物各0.8μL、10μM探针0.4μL、cDNA模板2μL、ddH₂O补足至20μL。

反应体系：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。

3)结果判定

(1)在利用数字PCR进行扩增的过程中，阳性孔的判定方法为：出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，这个反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法为：在相同样品的三个平行组里面，至少出现一个组还有阳性扩增孔，就说明检测样品中含有靶向病毒成分；

(2)阳性质控品反应孔中产生阳性结果以及阴性质控品反应孔中产生阴性结果时，该实验视为有效实验，否则实验无效，需要重新更换反应试剂，并重新进行；

(3)当待测样品反应管中为阴性结果时，则说明未检测到鲫鱼冠状病毒核酸；待测样品反应管中为阳性结果，则说明待测样品中含有鲫鱼冠状病毒核酸。

以上所述反应体系适合于从病鱼组织、细胞中提取得到的RNA样品，并逆转录成cDNA，可以实现对鲫鱼冠状病毒的精准检测。

在本发明所提供的方法中，可以利用本领域常规的数字PCR仪器完成检测过程。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

利用本发明所提供的数字RT-PCR检测方法和试剂盒可以实现对含鲫鱼冠状病毒样品的精准检测，灵敏度可以达到2个拷贝。此外，该方法步骤简便易于操作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，是一种检测鲫鱼冠状病毒的有效方法。

附图说明

图1为本发明提供的引物的特异性的实验结果示意图。

图2为本发明提供的引物的灵敏度的实验结果示意图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1：

一种鲫鱼冠状病毒HB93(本发明或称为CCBV-HB93)，其分离过程如下：

1)将携带病毒的鲫鱼肝、脑、脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到草鱼性腺细胞(Grass carp ovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。

培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2

2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。

3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQ ID NO.1所示。

鲫鱼冠状病毒的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafinivirus)HB93，保藏编号：CCTCC NO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，所述的引物如下：

F：5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R：5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'

P：5'-FAM-CTGGGACAACACCAAAACCACCTAAG-TAMRA-3'。

实施例3：

利用鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR检测引物和探针对鲫鱼冠状病毒的检测，方法包括：

1.鲫鱼组织或感染细胞总RNA的提取及cDNA的合成：采用提取待测样品的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mMdNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板通过紫外分光光度法测定浓度和纯度，稀释至50ng/μL待用。

2.数字PCR扩增反应

1)配制微滴PCR反应体系：微滴PCR扩增反应的反应体系，以20μL计：10μL 2×SuperMix，10μM上下游引物各0.8μL，10μM探针0.4μL，cDNA模板2μL，ddH₂O补足至20μL。

2)在微滴PCR的生成芯片上，加入步骤1)中的20μL微滴PCR反应体系，再加入70μL的微滴生成用油，进行微滴生成步骤，完成微滴生成步骤后，将微滴化的反应体系转移至96孔板中，封膜。

3)将封膜后的96孔板放入PCR扩增仪中，PCR扩增程序为50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；

完成PCR扩增后，将微滴吸入流式荧光检测器中，在60℃下进行荧光检测。

出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，这个反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法为：在同一组的三个平行组里面，至少出现一个组还有阳性扩增孔，就说明检测样品中含有鲫鱼冠状病毒核酸。阳性质控品反应孔中产生阳性结果以及阴性质控品反应孔中产生阴性结果时，该实验视为有效实验，否则实验无效，需要重新更换反应试剂，并重新进行；当待测样品反应管中为阴性结果时，则说明未检测到鲫鱼冠状病毒核酸；待测样品反应管中为阳性结果，则说明待测样品中含有鲫鱼冠状病毒核酸。

实施例4：

鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR引物特异性实验

利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(CCBV-HB93)，待检病毒样品具体为：鲤春病毒血症病毒(SVCV)，草鱼呼肠孤病毒873(GCRV-873)，草鱼呼肠孤病毒9014(GCRV-9014)，草鱼呼肠孤病毒104(GCRV-104)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)，传染性胰腺坏死病毒(IPNV)，病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。

表1鲫鱼冠状病毒RT-PCR检测试剂盒特异性试验

结果如表1所示，仅阳性对照组(CCBV-HB93)可检测到扩增信号(图1)，其余组均无扩增信号，说明鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR检测引物具备很强的特异性。

实施例5：

鲫鱼冠状病毒数字RT-PCR引物灵敏度实验：

本实验采用鲫鱼冠状病毒阳性样品CCBV-HB93的cDNA进行10倍梯度稀释。通过实施例3给出的检测方法进行检测。结果显示本体系在2个拷贝的模板量下，可以产生稳定的扩增，即本数字PCR的检测方法在扩增体系为20ul时，最低可检测到为2个拷贝(图2)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不

偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 中国检验检疫科学研究院 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心 中华人民共和国龙岩出入境检验检疫局

<120> 一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用

<130> 一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 26000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgaattacc aataaactac cacccgctat catagcacta gacactagcg aactgctagc 60

ttcctccaag ctgcacaacg caaactgtct ttttaactct cctaacctcg aacgcagcgc 120

aggtaccctc acccggacca cgcgtgtgcc cttgactgga aaccctacct tcgatcaggc 180

cttcgaacgc agcaaaggta ccctcacccg gaccacttgt gtgcccctac gcctgctctt 240

acgtagcccc atcctaccca cccgccaact cttaacctat cagctttgcc caccgtgacg 300

actagacgtg atctaactgc tactaccaat cctattacaa ccaacttgcc caccaagacg 360

actagagagt gacgtaactg ctactgccta aggcactacc agcgaaatca taatctgctc 420

ctcttgaccc aagacggttt ggaacggtgc tactagtgaa ctcacttctg ctccttgcga 480

cccaaagacg gttattattt ggaaaacctc ttacagacta gagtcttgaa tctccactgc 540

tactgtcgaa gtcggtgtgc tgcctttata aagccggtga actgctactg ttcttagaac 600

attatcagga atcctgctga attttgtcag ctatccctcc aagcgctact agtggtctct 660

tacctctact ctgccccttt acctactcaa tataacttaa atctcttcta gaatcgcgct 720

agcgcaaacc ttcaccggta accgccagaa cgtcctacaa gctctcaacc accggcactt 780

tgttgctaaa tcctacgtgc aagcatcttt ttgctataac atccacgttc gaaaatcaac 840

aaaaatgccc aacatgcgaa tccgcaagat tgctcctaaa gccgctgtta aaccaaccca 900

tagcggccca agagtggtct ccaatcccgc aagctgccac atttacatcg gaccccaact 960

gcgtgctcac aactacccga gcgtgctaaa gggttccttt aaggctgcca gcgcggaaac1020

cataacagct atcaacctaa ttgccaccgt ccgcaaggat gctggtattt caggtcaata1080

tgctgggaag atgggttatg accccgagat gggacttttc gtttccgtcg aaggtgttcg1140

tgctctccaa gcttccaaac tccaaactgc ccttaaggca attaaaaagg gtactagacc1200

ctttggcctt ttcaggccta aacagagtgt gactaacacc cacgctcaaa atttgctagc1260

cctccaccgt gctagctcca ccggcccttg gaccaaacac ttaccatctc aaggtcccat1320

aggtaactgc ctcgcagaat tcatgcagga gtacactacc acaattccac catttgatag1380

tgtcctcact gaaaacggtt ggcaatacgc tgtcacgatt gacggtgtga ctaaatctcg1440

cctcccgtac accgaaattc gccgcggtgg ttatgaattt aaaacaacta attaccacat1500

cggtgcaatc caggttactg ccaaccacat tggcaaagta aaccctggag atactaaatt1560

ggactgtcaa tatttcatgt tgacacgtaa tcaaaagccc caaaacttca ctgctgagca1620

actcgaagga aacatccata acatcatctt cgacctcagt catgaaactg gcaaacccaa1680

actctatgga atggaagaaa cacgacaatg ggctgggaca acaccaaaac cacctaagaa1740

aaagcttaga cttgtagcta tgacatcaac tctcagtgcc actccatcaa ccacacaccc1800

agcgccccta acaaccacac gcgcaccact taaaacacac atttcaattg gcccgcacaa1860

ctgcaccatc atagatatta ataaagccca attcgccttt gataactaca cttctcaact1920

ccctaactct tgtgttcacc gtgccaacaa agctgtttgc gccggtttga atggctgatc1980

ctttcctttt cctacccact ttaactacct ctctaaagta gaaacatcta aaggaactta2040

tcaattgggg tacattttag ccccaaaact acggcccctg ctatccaatt ctacgtcttg2100

caatttcaga accacgtcta cctacgtctt ctccccatgc ctatgaacct ttctttccgc2160

actatctgcg acattgaaac cgcccacggt caaccacacc caacttacac aagcccagac2220

tggcgcgtgt attacctcgc aaagtacgat cccaccaaag tactcagagt tcaagttgtt2280

gattgggcag gttcagatac cattactgaa gatcatgtca ccctcttccc acgccgacac2340

attatgacta aagttttgaa aaacgaccaa actaaagtta actacatcga cccaactaaa2400

gatgcagcaa caacaccctt cacaattgaa acagttgaag gaggcaaagt tgaagtactc2460

tccgccaacg tcatccgtca aattaacatt gaaactggtc gcggcaagaa acgtaaaaca2520

gctaaattag atgtaaaaat ttcaattaga gttaaagcta ctaaaacccg cacaacaatt2580

cacgtcttca taacccaagc aaaagatgaa agcaaaatcg tcactccaac ctcagaaatg2640

cagggagtag ttgacgtttt aatttccaga gcatgtgtcc tctcacaaca cgcaggacct2700

gacatgactt atgaactgca cacacctgac ggttcttgca ctaaccccct cgttcaattc2760

tttgaagaag aaggcgaggt tcctgaagat gtttacgatc tcttcccatc tgtagaacgt2820

aacgctgaag gcttagttat gtgcatgcca gaaggttttg ccctcatctc tggttgcatt2880

cctcatccac ttgcttacta tgctgacaag tacggtcaaa cactcgtacc tgaattcaaa2940

gtgacaagaa ctcacgttga acgcggcccc attccaccat cacggtccat ttactacaca3000

ttcatcccaa ttaatgtaga ctccatccca cccttcggac acacctacaa atccctcgcc3060

aaacttaaca catttaacct gggttgggaa gatcaagaca tgttagataa cgctgacacc3120

ctccttccat gtctcttaga aaatgaaaac atgaaacttc acctaacatg gaaaatcatc3180

gcccgtgact tctcagataa caccactgaa acagccctta ctacctacac tgattttaca3240

actagtgatt tcaccccagc caaccaaaca ggatccagct ctcaatccct tagctctcca3300

cctctttccc aactctcttc ccacaaatct cttgctaacc tctcagaaac tggctcaata3360

gataacatcc cggaaaacac ccctgaaaca atccaagaag aagaagatat cgaagaggaa3420

gtaacatctc ctgttcaacc cacactcaac acactccaag aacaagctac tctcaacgaa3480

tccattcaat cactcgttga atcagttgat tctgatgtcc cttacacctg ggaacaacgt3540

gttgaagaaa gtgaggttgc aactattgat ttacaagctg tagaattaga tcaaacaccc3600

actcccacca ctctctcaac agaagcagtg caagaatggg tcaacgcaac atcacctgac3660

cttgctacag tagactggaa cagtgcaata actgaacagg aaaccacagt aacttcacta3720

atagaagaaa tctccctacg ccccaacacc aacaacaccg gctataactt gtttaaacct3780

aaccaacgta acaacaacag cccatcagac tacctatcac gaacaacatc agcaaccaaa3840

cactgcttaa ttaacggtct tacttcaggt tccaccatcc ttgaagtcgg atgcggatat3900

ggtaaagaat tccacaaata caagaactct aacatcaaag tcgttgcttt ggaacctcac3960

catgaacgct acaccgaagc cgcgaagaaa ctaccaccaa attctaccat ttacaacaag4020

accctagaag aatacaacca aattgtcatt aaagaacaaa ttgacgccct agtttccttt4080

aacgccattc attacagtac agttactgaa gctcttaaag catgtaacct tgccaaagat4140

caagttgtca ttttaacacc aaatcatgat aaacttaaag ctcttcacga tagtaacaca4200

accatcacaa attacaaaat tgaacttgct aataacaaat ttacatttac aatcggccaa4260

aacacctaca gcgaaaacta cttctcactt caggatttca tgattggaat gcatgccagc4320

aacttcatgc tttcttcccg ctcttgtact ctgcttgaac atgttaacac cttcaatgcc4380

cacctcttaa ttgacgccac aacagaaaca actaccctgc tagacgccta tgaagtactc4440

gtcttcataa aatttagacc actgctcctc acctactcca acaccgctct tgcaactaac4500

aactcaagaa caatccgcag tgcactctca cgtcttatta acttccgtgt cgcaccttct4560

aaaacaacat cacaggtaca tgttcacatc ctcacccgca acgaccacgc aaccacagaa4620

caagaacatc tagacttagc aaatattgaa attgcccaca tgaacccaaa accagtaatt4680

atctttgtaa cttcttcccg atccaaacat aactacacca ccccaactgt cttcttcgac4740

tttgctacac tatcagcccc caccctccca gaacagctta aaccactcac tgatctagcc4800

ctcgcaatcc aacacactgc taccaaaact ccaacaacag tacttacaac tgccccagag4860

gacccaaaaa ccctcccagc agcacccacc tcctttacaa aaccttcccg taaacgctac4920

cactgcttcc acgatttaac caccctacca gttaacaaaa atttcatctt agttaacgca4980

ggtaaccccc acttaaaatc aggtggtgga ataactaaag ccgtctataa tcgctacggc5040

caaggattca tgcaaactaa caacagcatg catgctacac aattacctct tgaagttggt5100

gacgtcttgg aatacccctc tgaccgtaac aacctgatta acgtgacagc cccctgcatc5160

aacatcaaac acgcagatta caaaggccca caaccagccc acgcactact agcaacatat5220

aacgcaatta tcaactacgt tgaacgtaag tacgataatg gtgacgagaa acacgtcttc5280

attcctctac ttggtgctgg atactacggt tggtcacaga tccaaagcct tcaagctttt5340

ctatccgcga ctgataatag tttccgcaac acatatgttc tactcctaca cccatcatct5400

gtagatgttg aaacagctga agtatttgca aaaatgctcg ccactactaa cccacactac5460

taccatgttg agggcatagc taaagttaat gccaactctt gcgttctgcg tgcccacatt5520

gaccttgccc gcaaaacatc ttaccctcaa cctagcttag gattaatcgg cgcttactgg5580

atgtacacct gccccaccct ggccgcccca ttgatacaag ctggcatgca cggtcccaac5640

acctggactc ctggcagctt tattgatact agtattgctg aaatgactgc tcgcgcttac5700

aaaataaatc ttgtttgcga cggttgcttc actgatatca tcaatttcaa tcccgaccaa5760

ggtttaatct gcaatacctg taagacacct gtcactctcc ggacaaacta ttatcgccca5820

cgcctcccac acatgattaa aaatagtcac ggacaaccca tccctaacat tattctggat5880

ggaatctacc acatggccac gcaccaattg ttcctaaatt cggtactctt taaaaattca5940

catgctttca caattaacaa cctaagtgaa tgtgatctcc caacaactac agcagtagca6000

acctactttt acaaaccttc agatgcttta aacttcttcc tgaactttaa ctctgctatt6060

tctgctaacg taacttatac atcagaacag ataacacaag ctcaaaccac ccctcaactc6120

accactgatg atgactactc ggacttggac attgacacaa ttaaccctac acctactact6180

ttaccacgcg tcccaacacc gctttcaatt agtgatagta gcgaagatat ctcactctcc6240

gatgacaccc acaccgtagc atcccatcac gcttcacaaa tgtccataac agccgacata6300

actagtgata gatatagctc tacaaactct ctagctatct cagaagatat aacatttcaa6360

acaggtgacg gtgaaacaac aacttcactt ctgactgatt cggtcctata ctactctgtc6420

gttacagtct tacaactacg taaagcagag gattgtgtag aacctgctgt agaaactatt6480

aacctaagac ccaactcatc acttcatacc ttgacacatg acacaaacgc catcgaccaa6540

ctttacatcc aagtggcttc tgatgcttca aatcacactg taatcaataa caccacactt6600

gaatctattt ctaaaacgat gtgtgtgaaa aactccttgt acacccttct tactaactca6660

aagtgtataa gtcaccacat catagttaca ggatatgacc aacatgctca tgaaacacat6720

accattaaaa gcgtcacgcg ccaaactatg ctcgccatcc aacctctcgt acaactcacg6780

cccacacacg tttacagcac acttgaagaa gatatttcca ccatctttca aactgtcgtc6840

ctagaacatg tcaaccacac taagctttcc acttataaca ccaagctaca ctacgcaact6900

acagtaccaa caaacctact catcgatgga acaatcgaag atgttcaagg taagctgcgc6960

gaagttgatt tcggcattgt tgttccttac cagtgtgaag ttgacgagca aattgaatac7020

acaaatgcaa ttggcgactt actctaccaa aacacaaatc accactcacc actagtgacc7080

tttgtttcta tcgacaaatc ttttactaaa cgtattttta attctttaaa gtttcaaact7140

ctacagaacc tatggctcta ccttattacc ctacaagtat ttttcacagt taaaggaatt7200

ggcttcggct tcagctcaac ggaaccaaac acacaactca tgaacggtct ctggatacaa7260

tacggcatct tctacttcca agtacacctc caaaccctca tcacccaccc agtgaaaaat7320

ggctacagac tactttcatt accaatcatg ctatacaaca aaggcaaaag attcaccgaa7380

cgttcagtcc aaacaatgac gggagaaatc gttaacatac gaaaaccctc gccatcaaac7440

gctgtacaaa aatacggcat taacacccga cttgaatacg ttgacatctt cgatctcctc7500

cactatacac ctggatacat cgcatttaat ttcgccttgt tgtacctttt ttctggtaat7560

ggttacataa cattcttagc ctacaccatt caattcttca ctgctcgtga catttacaga7620

ctctctaaac acctttacac agtctcaaaa ctcactacct tcctctcgaa attcaaaaca7680

gcaaccaccc gccacgtctt gtacgcaact aatcaagtaa ataaccgttc cctccacctt7740

acccttggat ccacaacagt tgacttactt agctttacaa gcaaagcagt ttttctcgcc7800

ctgtgctctt ctttcatttc atggcatttc ggattagctc ttgccggcgg ccactctggt7860

gaagactact ctcgaccacc ctaccatgca atatttcaac acgcactccg cactttcgga7920

cttatccctc ctaaagaaca ttactatagc tacccttccc tagcttcagc ttgcgcagac7980

tcctcagctc cactttgctt cctgggaaca ccatttaact ttcacttccc atcatcctac8040

acacaagcag catccatgac tactgaacac gtagtaccat tttggattca actaatcatc8100

ctagccccac catcgctttt cctagttgtc atcccgtggc tgatcacaat gttcatctca8160

ccagtattaa catttaacca acttttgctc cctgcactcg ccgtacattt cttagctatc8220

tatgtaagtt acctttacta ttttaagaaa tcatgctgtc attctcacac atgccttaaa8280

cacgctaaat tagaccgccc catccaaatt aaaggcctct ttgatttatc catgtacttc8340

aatcacaata aactttgccc ccgccacaac ttctactgta ataatgctga cgaacccggc8400

cacacacttg gacccgtcct agcagctcac atcactgaat tttaccatct taaacctggc8460

actattaagc ccgatgtcgc cctagtacac acagaacacc acgcttctct gagtcgcaaa8520

gaattgaaga aacacgacga cccaaccgat tgtgtctgga ccgccccaca aggcgctgct8580

gatactctcg tctacgaagc ttacgctcat ttgaaaggag tccaaattcg cattgatgcc8640

aacaccgata caacaactcg tagcatgcct attcccatgg gcgctaagac aacatcttct8700

ccagctacag gtgttatcaa cacaaaagtt ctcggccatc ttaaaagaca ttgtaaaaac8760

ccggctctcc aatcttacct atcaggatac gtcggcgccc ctaacgccaa aaccactatc8820

atgcccatta cgctctttaa acatttgcct gaaggcctta agaaatacgc catcaaaaac8880

atcaccttct caattaacat gctaaccgat aactctaact caggtttcat tccagaaggc8940

atacacaacc caaacaacct cccaaccaag actttcctgg tcaaatctat tgatcaaaca9000

atctttgacc aactccaccc tgaaacacaa gctatgctta aagacgaata ccacattaaa9060

cttcatgaca taacatctca attttacgaa gttatttctt caatgatgtc ctacgaaagt9120

ttcatcttcg cactcatcat cgtcttatcc gtctttctcg gtttcatctc ctacagctct9180

accattactg ccaccacatc cctacatgcc ggcttgaacc ccaccatgcg cggatccacc9240

acaggtaaac cattcatcca accagttact taccccaact ccattctaat ccctctgaca9300

tcttcccaat ataatgtatt cagactacaa aacggaactc tctacttcac ttctcaaata9360

actgctccaa cctgtaccgt taaactacca aacccctaca ttggcttaac cacagaaaaa9420

ttctatgaat gctcatctgc cctcctccac atgcccttca tggttcatct tggcggtgtg9480

aaaattgctt accttagagc cggtgttgcc tataacatgc caacatactc agagacacca9540

caaactagta aactctgtgt tctcactgca ctctcaaaga cgaaatgctt taacatccta9600

ccaggcggtt tccacacccc agtgctagcc atcctcgttt caacttgtgc acttctggca9660

acggtcctct tctaccttta cctactccag atctttaaat tctacaccaa ctcagtcttg9720

atggtggttg ccattcaaat tgcaactatc ttcctcttca tgctatcccc agctcttgct9780

ctaacacttc aactggtctg tctcatgtac ctttaccata actggatggt tgccatgatt9840

aacatcgcaa acctcgcagt tctagcccac acaacatttg gcatggtact catcttcatc9900

tacgcgctct acagacttta caaagtctac caagttacat caaccgctgc agttacaatt9960

aacgcaactg gtgaaatgcg cttccacgga actcttgatg aagttgctct ctgcaccttt10020

ccaattagct ctgcaagtgt ttaccaaatc atgtctgacc tcagcttaga ttacattaaa10080

ctggccagct acaaaacatc ttataaccgt gctacccgta acctggttaa catgatgcaa10140

agatatattc tcgatacctc catcccagct atactctatg acggctcagt aacaactggc10200

atcatgcaac aatccctagt tagacttaaa tccctagtta caacagttta caaggataac10260

tactccaaca tctgcaaaat tttatcaaca acccactcac gatcaacatt ctgcgtcgga10320

actttcctta acccaaccac tgttatcact tgctcccacg gaatcttagc aaactctact10380

attaccgtct cccacaagtc aactatttat gaagcaacaa ttgaatcaca acgcaatgat10440

atcacaattc ttaaactcac aacaccaaac tccgcaatca ctcacaccat cgagtgccat10500

tcaccaaatg acgctgatct cgaaaatatg caaattaact acacccaatt tgttactttc10560

gctgataaag atcactcaga tgccatagcc atgaacaaca caacctattt accatctggt10620

cacttctttg ctatcggaac tgaatctggc gaatctggca gtccctactt ctttaacaac10680

aaacttgtag gaattcacta cggagttaac acctgtgatc aatttatgct cgcctctaaa10740

cctgatggca gttactacat cccagagatc caacacaaca tctccacaca accatctttt10800

agccttagtt gcatagccca tggtcgaaaa tcggtaaccg ccaaaaacac ccccacactt10860

cacgatgcta tcaccaaagc ccttgcccaa acaacacgct cagcttacac caacgattta10920

acaatagacc acacacctga acaacttcag gctgtccttg actttctgac aaaccctctg10980

aataaattag gccctaagac actccacgac tacatggcaa catccatcca agttcaatct11040

accaccacag cccaatccgc ccacattgac gtccacaaac caattagaca agcagcaact11100

ctctactatc taatggttat catttttgac atcatcgcat tcttcttaac ccccggttct11160

gatttctcta atcaacttgt atccatgact gcctacctag ctgcctggtt ccttaataaa11220

acatgctttt acaacaccca tgtcctttac acagtaacca catgcttcca actctgcaaa11280

tacttcaaca tcgtctatct tttcacaatc attcaatcct ataaaccaat tgaaatgtca11340

atgatggata aacaatatga tttcctttgc gccatcattg tagccctctt actctctcca11400

atcctggtcc tcatctggaa acgcctctgc aacttcacct ggcattatct tgtcgctcat11460

ctagttgttg gttgtgtgct ttgcatccac gtcttcttca gctacagatc ctttacatct11520

tcaacaggcg gtctattaac attttcagaa ttcgccttta actcaccatt aacagcagtc11580

ataacagcta cagttgatga aagtcctgtt tctgttattg tctacccact cttgcagcat11640

gtcatcagcg caaccctgat cttagcaatc gtgccatctc ccctcctcgc agcaacagtc11700

tactctttct atctcattga ccaagatgtc ctctgcctcc taatctttct cctgcttaca11760

tccaaactga caccactctt cctccgccca ctcacaacat tcgtttccta cgatgttgtc11820

attctctcac cctctgctta cgctcaatgg ctcatggcaa aatctgaagg taaagaatac11880

ggtctctttt tcgctgtcat tcaatcagtc tttgatttta catctcaaca cgaagttgaa11940

ttgacacttg aagcacaaga gattacacag caagtccgtg ttgaaattca taacaccgaa12000

cctaaagata ccaaggatga cacctgctac atcacaccca ctactattat taacccaatt12060

ttaattagaa ctgacaatta cttctacacc aataccaaga aagtgatctg cgaagctccc12120

attgaattat cagacaaggc taaagaaatc gtcgctaaac aacttgacgc tatcccacat12180

cctgatttag agacaattga cttagaagtt gccacactta ttgactgcac aactacaact12240

aagcaatcag aagttaaaga aatcgaagta gatgacttaa cacacgccta tctactcgct12300

ctcatcaaag caacttgtat agaatctggc ctccccatcc cagtgatgaa ctacatttca12360

tcccaaaccc aaattgattc agtgatgatc cattacttcg tcaaagccgc taataaacta12420

ttgcttaaag atcaggaact gcctctcatt acagcccaat ctgacacctc caccattcaa12480

gaaaccttgg aagctctcaa attaaaggac accaccctaa tgaaccccca agaacttaaa12540

gctcaccgca aacagattaa cattctgaaa gctgaacaag aacgacagct atccatggaa12600

cggaaactca acgctttcct agacacaatg caccaacgtg ctgtggctga aaagaataga12660

tcagaagttc acagcaaagt atcagctgct ctacgcatgc acctttcaaa ggttgcaaac12720

gctgcacatt gtgacatgga aacaacagac ggtgttatca cactatgctc tgctttctct12780

attcgctcag tctgcattac tcaaaacact gcagatgtct ctatctacta ctcacaaccc12840

acagatacat actcaatcac aactaccacc acagtcttca cagcttacaa ccctatgaac12900

gccaacggac aacccatcat tccaaccact gacccttaca atcctatcat ttcattcccg12960

gttatcttct cactaaaaca ccgtgaggaa aaatcggaga tagaacaaca agcaaacgtg13020

ggatactccg aacgtgccat aaaaataaca acaactgaac acgccactgg tacagttctc13080

atgattgaca acattacatc tgtcatcccc gccactaaaa ccgatgctcg cttcaccgta13140

aacggtaaag gctacaagat cgtcgacaat gccgttgccc acaaagctcg tgctaacatg13200

tctacaattc ttgctgtctt gcgcaaatcc accatcagcg cacaagcagc agtagttaga13260

attggcggtg ctagatacca aacatctcac caagctatct ctttcacccc cttccaaaca13320

ccaggctatg ttacctacgc aggaatatgc gtctgccaac gctgcacact cagagaacaa13380

cacgagtgcc actacgcagg taactttgtc cagataccca ctaacatctc gacacaagga13440

cttaataaaa tttatgaatt aacatctatc ggcccatgca aacacaacca atttgaatgt13500

accacatgtc aaccagatct aattacaaaa gcccccggac aagtactggt ttacttcaca13560

gcccacgccc aaacccacta taaacaaata gttactcaaa tctgcaagtt ttaccaagtt13620

aaacaatgca actcccaaaa gcatgcagat ttcactatcc acataattcc acacggccac13680

tcaactgata caactcatcc taacaccacc gttctagttg tacgaaaaca cctagtcgat13740

ccagatcctg aacctccaca catcgggata agttccacct taactggcga agaactgatt13800

actcttgaca gattactaca acctgctgtc gagcctcaaa ctaagtcgtt tttaaacttc13860

tggagcgggt ggtaggtgta tcgttaccat ccgctagcga cccttataca tcagggagct13920

ataaaccgat acctcgtatc ttttacatta acgttgcaac acgtaatgac acaaaattag13980

ataaagtctc caaactcaac acctggagca tggaaacacc aagcggaatt atcatggtaa14040

aaaatcgtga cgcctctaaa gaatttgata tagctaacaa cctaccaaag tcactaccaa14100

ttttaacaca taaactcatg acttacaacc gcgacaacct cctaatcaga tactacacaa14160

caccttactc actaggagac cttgtctacg cttaccaact cggcgatttt gaacaccttc14220

tactcgcggc cggactttca ccaaatcctg cccaattgct cgaccctggt aattacaccc14280

aatatcaaca aacaaaagaa catctcagac aaattatcta cagatctaat ggaaaacctc14340

cataaaatca tttattactt caccaccact gataaatatc tgccgctaac cctggacaac14400

attgatcaga acggttattt gtatgatttc ggtgactacc cagctaaaag tcccgtcaat14460

aatcaccacg tactagaatc atggacacaa ttctgtgtat tctgcgaagt taaccttgct14520

gaactaccag gttttaacct ctacactcaa acccactcaa ctccacaaat tataaagagc14580

cgacaagacc tagtctctgg ctcctacatg gataaactac tagctcttaa ccacctaata14640

gcagcaaatc cagaagcccc ttccaccgct tccactccct tctttaacgc ctccgcagcc14700

acaactgaca tggtcggcct acactcacca ctctttggct accatgaagt caacaatgat14760

ttgattcgct ctaaactctc accaacagaa gttgacttca tcagatctca agattctgca14820

aactatgcta aacccaacgt catctccatc ggcaacacaa ttagctacta cggcaaaaga14880

ataacaacta aagctgccca aagaaaacct caatacgatc tcgacatgct caaaagatta14940

gaatcaattg gcatcagcac actcgctaca acatcttacc actaccaagt agctgacgat15000

gaacaatgtg tgcaagattt taaatactac gattacaact cgcccaaaac ctatgaccct15060

aacttcctca aggccatcta ccactacatg caagacatct tttccattta caaaactgat15120

gtttccctta accatgaaac aggacaacca cgcccctctt ctatgggtct tggaatcaca15180

ggttttactc aaaaagctgt ttggcagtct ctaccacctg attttggccc acgcatgctt15240

gaagttgcaa aagaaactct actaccattt acaacaaagg taattgcaaa atacgctcgc15300

acaaagaaag cccgtgcacg tacagtaggt gcttccagct tcgtcgcatc aacagttttc15360

agatttcttc acaaacctgt aaccatgcgc atggtcgaac aagcccaaaa caacattggc15420

ccactcctaa ttggcgtctc taaatttaac ggcggttttg ataaatacat ccgtactcaa15480

catccaaacg gtatagaaca ttacaacgtc atgggtgcag attacacaaa atgtgatcgt15540

agcttcccat tgatcaaccg cgccttcgcc gcagcccttt tctatgattt aggaggttta15600

ccatctgaca acatgtggtt tatcaacgaa atatccgcct tcatgactga cttctgcaac15660

atctcaggtc acacatttaa taaaccaggc ggcacaacat caggcgactc aacaactgcc15720

ttttccaact ccatctacaa ctacttcgta cacctcactg tacaattcct caccttcctc15780

tcagccgacg tgccagaaac atacaaacat cttcaaggtt ctgctcatcg cgcttactca15840

actggaactc tcgaagatta caacacctac ttcgaactca tccatgattt aaactgcact15900

gaatacttct ttcactttct cagtgacgat tcttttatct tctcaaccca agaagctttc15960

cccatcttca caacatctaa cttttcaacc aaacttcaat ctatccttgg ctgcactgtt16020

gacgtaacta aagcctgggc tgcatctgga cacatcgaag aattctgcag ttctcacatt16080

gaagaaatcg acggtgtcta tcaatacatt cctgatccta acaacatgat cgcaggcttg16140

tacatgtccg gtgacccagt accagtagat aagaccatct ggaaactagt tgctacactc16200

agtgaattgg ccatttttca acacaaggac ccatcacttt ttaacgccct ttaccaactc16260

cttcaaaaca tgcacagtga atatgtcact caacacaacc acgctctcct ccctcttcaa16320

ttgcttaata agaaattcta cactgatcta cttcaaccag gatttgatac tgaaacaatt16380

ttcctcactg acttgctaac atctgtcggt gtgaaactcc aagcatctaa tgattcacaa16440

tgctacttct gtgacaaccc tacaatttca acatgtgctg attgcgtagt gccatatcct16500

atgtgtgcac tctgcgccta cactcactgg gttcaaacag accatgcccc ctcacaagta16560

ccaccatgtg tgtcctgtgg ctgtgtcaat cctggaaagc tttaccactg tttcactggc16620

agcgttaaaa tctgctgtca agatcatgtc tctggcctct ccctacctct agtagaccac16680

gccaagaaag taattagaat acccctcttt caaaactgcg aacgtcaacg atccctagtc16740

catgcaataa cacacacggc cttatttgat gacaatgatg aaccacttaa caccgcaaca16800

ttttccaaat atgatccaga acaaactaaa gaagaaaact tcgtacgcat cttaaacgat16860

tgctatatgc ttgaagccta ccaagctcac caaaacccag catataccta tgacgttact16920

gaacctggca caatagtcgt atcacaacct ccatcaacag catatggtaa ctgtgtctac16980

gctgaaattc tcgatgacaa aaatcgtgtc gtcttgaaag tcactcttga tacaaagtca17040

gtactaacac ctactgtcta ccatgtaaca tcttgtcgtg gtacacttta cactcgctac17100

aataaaatcc gcagagttca gcacaaacct tcaatagttc ctagatcaac cctagcctac17160

tttaacaacg cacaattcat aattggacca ccaggaacag gaaaaactac tttcgtcatc17220

aagaactaca ttgacagagc agaaccaact aacaaaatag cctacattgc cccaacacac17280

gcactcgtac aagctatgga tcaagccatc ttcgaagctc acggatatgc agctagtgtc17340

aacatcgtta aatcagaact taacaacaag acctacaact acaaagcaaa catgcctgga17400

tgcgatatca tgctcgggac acccggagct gtatcagcgc acactggttg taccatgatc17460

ttcgatgaga tgtcacttgt acagttgaat actgctatga ctgcaattgc tcgagtaaaa17520

ccatctaaac tcatccttct cggtgaccca tttcaattag gcccagtagt tcacttcaga17580

aactttcagt acaactacga agacttcccc tatcttcatt tcgccccaac aataacatct17640

ctccgcgtat gcttccgatg cccaacccaa atctttaacg tatggagtca ctactacacc17700

aaacatgaca tcccactcaa tgcctttaaa gacggcggct catttgaaat cattaaacac17760

cactcatgcg ccagagtttc agaaacagct caccctctgg tcacaagact ctcagaagaa17820

aatccagact ccatgatcct ttgtaactac aaagctccag tctcctgcct cgaaaacgct17880

ctaacaattg actcaagtca aggcagaacc taccgagacg tcatagtcgt gttgctcgga17940

aacacaaatt tcacccgtgt acccaaccga tttattgtcg ctgcttcaag agctacacat18000

tctctcaaag tttacctttc tgaagagatg tacgaccact actccacact attcaattgg18060

ccacacttag aaacaccaca aatccagcca caaaacgcct tcacaacacc taacaactta18120

gaagaaacaa atctcacaat ggccgctaat aacatcagct ctctcgtcat ctgtgatata18180

gaattcttcc atcaagttcg cagccttgaa cccaaagttt gcacacttga agtcggtgac18240

attaccatcc atacatcaac aagcgccaaa cagatcatcg ttccacgcgt ttcatcaaca18300

tctagtgaaa tttttccaaa atactttgct cataacatgc caaccctcac tctccccaaa18360

ccaacaccaa aaggagattg ggactacatg aaacctcacc gtggaatttc tcgccgcatc18420

aacatcgaca gaactcacaa actcttctcc catatggctt gcacaacaac tggaactccc18480

atctatgttc tctacggtgc ccgcaacgat atcctagccc tttctaaatt aaatatcgtt18540

ggtgactata aatgtttctg caatctacca gctaactact tcaccctaga tgcccaagat18600

aacatcaaat actactgcac ccaacacgcc aaaccagcag cacctctcgc tggaaccatc18660

aatgctaaat acattgacat ccaaacagaa aagatcactc ttgccaaacg ccatgctgaa18720

atttgtgatc accaccatgg tgcagcacac acatctgatg tcgacaccat tatgaccgga18780

tgcatcttag gcaatgaatt gacactagca actcaacatc tcagccagct tctcttcacg18840

gaacccttca gccactactc aagtgtaatt tctccagata tgcaccttac agtttcaacc18900

cgcccttgca ggacactcgg acaacttatc ataactaaca tcaatggtaa gaactacaga18960

ttctcaatcc aaccacacct ggatcttaaa acacactttt ttaacatcgt tgctaaacaa19020

ggccactcct ctgttttagt caacgttcca gaaacagttc cgacctgtac taaaattcgc19080

ggtgaaacct gcgctacatg ctacaacacc tggcttatcc tccaagaact tcatgctgaa19140

ctagctaaca caggtctcgc cctggtcaac ccactccaac gccaatacac tcaacgagaa19200

acacaaattt taaccaaggt aatgtctgtc actccaacat ctacaggcaa aatcatggtc19260

catctcgaca acacactctc cttccccttc ctactcgatt taccaacaag tatccaaaca19320

tactgtaaca agatcgataa accaatccct aaccctgcaa ttttcacttc ccttaaaatt19380

acacacactt acggattcgg aacaccattt gtccctatga caaacaaccc actcattcca19440

tctatcctca gtaaccaaaa acttgctgac aacccagact actactacat cacacatcaa19500

ccatcaaaca gtgaacttcc tttcatgact tcttcaccaa ctgctggctt ctattgctat19560

gacacccctt tgattaactt ctcggaacgt accattaaca aaccacccta ctatatcaca19620

cgaattgtcc gtggccaact acaaaaacct gatattggcc tcttctccac taatagactt19680

ttcaccaacc aatacgtacc tttacctaat gaacaacaag cgtacgaaga ctttggtaaa19740

catgtctcac ttggcgaaac aacatcaaca tcctggacaa tcggtggcat gcatctactc19800

ccagccttcc aaaccacaac caattggcag atcacatcag aacatacacc aattctctca19860

attaccatag ctcgcgatcg cggggtcaaa ctaggaacaa cagccctaga tgtacctgct19920

gaccaactac ttgaattaat cgactataaa aacatcacag tctcaaaagt aatagctatt19980

aagatcgacg gccaaaaagt aaacatgatg gttttcactc aaaacggtaa aatccaaaca20040

gcctacccag tacaacaagc aaagatgcac gatgtgacaa aacaccacgt cactcctgac20100

tacataatct ggcctaaaat tttcagcgac tcacctgtcg ataaatggga tcttcctaat20160

tacaaccaac cacctaaagg tctcacatcc aacgtcaaca tccataaata cgatcaaatg20220

tgtgcattct ttgacaaaca cctaaccatt ccaacaaatg gccacgtaca ccatcttggt20280

catgccggac aagtttacag ccctggtgat atagttttaa aaagctattt cacaaaagct20340

cgtttaacat catacgactt gcgtgattgc atatcaacca gcgaaacagc tcaccctgat20400

gacaactggc gtgcacactt catcctgtca gatgcatact gtcccaacac cgactttaca20460

tctctctgca aagactacat gactaaacac ctacgtcttg gcggaagcat gctctggaag20520

atgacagaaa cctgtaacat cgacgctgaa tccattctac catactttgg atctttcact20580

ttcgtcacct tcgctgtcaa ctactcatca tctgaaactt acgctttcct taagggatac20640

atgggtgaac ctaactacaa caccacactt ccagctaaca tcatgggtca actcggcgcg20700

tacagacaaa acctattgta cgtcccctat gctagtgagt ataccggtac cagagtttat20760

aaagattctg gtgctgttaa agtcattccg gccatgtatg cagatcgtct gaatacttcc20820

cactatgctc tcggctgcat ctacagcact tagacatggc aaacttgcta tggctaactc20880

ttctcatcac tctcagtctc gtgtccgctc aaattaacac gacacttcca gactgtccta20940

ccccaacctg cacctacaca ccaccaacaa cgaccccatt tgaccacaca tcactacact21000

cttttttcac acatgacaca aactatgctt tccttcttgc tcttaagtat aatggtactt21060

tcattcctgc cactatggct atgcctgcta acaacctttc gcaaacatat acactcaact21120

ataaaaatgt ctttgtcaac gtacctgatt ctcaactccc tcctcctcaa agaagtaata21180

ctcagttggc tgttgttgca accacagatt cctgtcttac tgcaacgtat caagcgattc21240

ctggtactat tcctggcctt tcaactaatc acatgtattg tgtgaaattt actcagtcgt21300

ccaactttgt gtacttgtac gataccactg tgaaaacccc tgttggcgta cttttaaaaa21360

acccaactgc cccagtagtt acaactatcc tatccactat catggttaac cgccctacaa21420

cagtttcaac ctcacagctg ctagctaata tctactccct tatgagaacg agaagcaacg21480

tgattcaaca acaattcact tgcacatctt gcctctttgc catcgacgca tctacaggaa21540

gagcagctac ctcaccaact acttacctcc taaacaactg gtccccatcc ttctttgaaa21600

ctaaaacagc tatgttggac cacgtctcta tgaacaccat ctaccaaaca gcacgtggtg21660

ttactcgtga aaccttcact ggttacatcc ttaacgcagc taaaaccgct gcctacgctc21720

gtggttctcc cgcctattac atcttttcat tcgcagccat tgcacgctac catcaagcaa21780

tggttactcc ttataactat aacatcggaa aactttgtga agcaacagct gcttgctgct21840

tatcaaatgg cattgaacat tttgacatct atacctggct atttcactac tacggcttta21900

tgaaatccaa agtctacagt gaaactttta caacaaaccc agtactaaca tcagttatta21960

acttagccac atcaattaaa ggtaaacatt ccgtgtactg tgacctaaca ccttacagtt22020

catttactgc ctataatttg atcatgcttc aagacgttgt cgaacaatac caagggacac22080

gtacaacatc cacatacgct aacaattttc tcaacctcac tgatattaac ggatacctac22140

cctattccac cgataccccc ctcccacaaa actaccaaaa ctacatgcct tttgcaacct22200

acctacttgc aacattttac tcttctttca ctttacaaca gaaatttgac ttccacagat22260

tcctccaatc tgtctgttat tatgactctg gtttcatttc tcgtaaccaa gcctaccatt22320

ctatctgtca cataatcact ctgaaaacat catcttcagt accttacccc gcagaactcc22380

aatggccctt tactgctctc ccttcctctg gttatgactc ttatccagtt tctacagatt22440

taggcacagt agctgttggc aacacaaatc cacttgatta ccctggaatt tgttaccaat22500

cagtttgctt gactcatcct actattaact tcagactttt gttatcagaa ttaccaatta22560

aatgggaagt ccgacctgaa ggtatctatg taacatctag aaacgatcct acatgcctga22620

atttcaaaac atcacagttg ggaacagttt tcattacact ctacgattct accactacat22680

gcacaattca acagactact tactctcgct ctgctgtcct gcgccaagtc aacacgttta22740

caccaaatgc tactgattta gtcgtgccct acggcaaaac accaatatac aatggagcct22800

ataatattaa ttccactgca tctggtgctg tctctctctc taccaacaca cactacattc22860

cacgtctcct cacttcagtt ttaacaccgc aaagtgacta caagattaca cctacaacca22920

ctaatcttga accattcgtg gaaattaatg gcacaacctt ttactacgat gctaatcaag22980

cctacgttaa tacatcggac gtttatcaag ctaacgttga ttttggactc ccccaaacat23040

tttctcttga taccagcttc cttaattgca cagctttcct ctgcgcttct gactacaaat23100

gtatcgccga cttttcacca atctgctcag ctacacaacc actaatcgac gccctactcc23160

aaacctacac actgtacaat caacaactta cactgtacaa ttcttccctg ctcacaattc23220

aagccgctgc aaactacctc tacgacacaa gaacacgtac tagacgatca ctcctatcta23280

ctgtcaacct tggctacggt gacgtttttc aacaaccagc ctgggtctac gaaataggtg23340

caacagctgc aattcctatg atcggccctg cagtctcagt cggtttgtta gccagtagag23400

tagcatctat tgaatcaacc ctctatcaaa ttacccaagg agtgaaggag tctattatgg23460

ctatgaacac caagcttgat aagattgcca acattttaca ctcagacatc gaaagattag23520

gattaacagt taacacatta gcctcttcat tcaacacatt cactaaacaa gtaacagata23580

aatttgcctc tgttgatgtt gcatttaacg acttatcaac atcactgaac acactcacca23640

caacaacaac tgttggtgcc tcttatgcag ctcaaattaa cttcgcaaca accacgctaa23700

ccaatttaga agttcaaatc tctcaaacaa cagatcacgc tctatcttgc atcgctgcgc23760

ttaatgaaca tgttctttct ccacactgca tttccgtttc acaacttagc gcttacacac23820

ctaatgctct ctctaacatt ggtgaaaaac tagtactaac tcactacatc aacggatcac23880

tcatcacatt ctaccatctc attgctagca agggagttta cagacccctg ccaaaaatgt23940

ataattctac acaccattta gttgcaacaa ctggcttcta tgacggccat tgtatcttct24000

gtggtgaaca ttattgtgat atcagcgttt ctgtaccatg tgattatgcg tacgaaccac24060

ttaaatccac tgtactagca gcttacccac taacaactgg tgtagccctt ctcactcttg24120

actctacagc tactaacttc gttattaact ataataatgc ccctctcatt tcatcaagcg24180

ttccaaaacc acctatcatc aataacaccg atggtacagt tattacgctc caacaacaag24240

taatccagct ccaaactcaa ttcgatcact ttaacatctc gtcgaatttt cacgtgtcag24300

aaatccaacc agtcatagac tactacaatg cacaaatcaa ctcatctcta aaccagatag24360

ttgatttcgg aaatggctca acatctaatg taggaacaat catcctcatt gtaactatag24420

ttgcccttgc tcttgcatca gctatcgcca tcatctgtgg attaaagcac taaagaccaa24480

caagttgcaa tggcttccac cggtaaaaac accaccgcag gagatcccaa ccttgggttt24540

cacttacaac ttaatgatgt ccttaacacc ctggacatct ccggcttcag catctcaaat24600

tctcatttga tgagtgcgat gctgaccctt aaccttctct ggagcgctat ctttctagtc24660

tccttctatc taatcttgga catggttatg tactacgttc ccctgctcaa taagattcca24720

ctgctgccaa caatcaaaaa cctttgttgg tttatctcga ctctgcttgt tgctgtttcc24780

atttacgctt caggaactct gctgatcatc aaaatcttcg gaggcgtagt cttgctcctt24840

gcttttctcg gcatggtgaa gactttctat atgctcattg caatggcgct gtcctactac24900

cgacaccgta acatcgcagt ggcattgaac ggccctaatg tcgttatggt taacggcaca24960

gcagtccact ctgatttcat ccccacgtct gtgacactgg tgaagaaaga tggtgaactc25020

tattttcaag gaacaaaggt ccccggaaac aacttgattg atgcaaccgt gaagatcttc25080

actttcaacg aatcgtttga atgcctcccc atcgcactct cacgttacac taaaggttcc25140

tacgctagat ttgagctcaa gtcgaccaac acccactatg aactccaaac tttctatcct25200

tcgcaaacag aaactaaatc tgtttgaaac actagcgaaa acaaattaca atggcattct25260

acggacaacc aatgatgcct atgcctatgc ctgcttcctt tcctcctcgt cgccgtgccc25320

ctaaaaagcg cccgccacag aagaaacaag ccaagcccca acctaaacct ctcaatgacc25380

aacagaaaac agctgttgcg aaagaggcta ttgccaaaac caatactgtg ccaatgccac25440

ccatggccac agtagtgaag acaaacctgc gcgttcaggt tgtaaaaagc aaacgcggtg25500

acctcctaga tgctcgaggg cgtcttacac aatcagagat caaccagctg tatttccaaa25560

tcgccactgc cctcaacaac ggcctcggag aaattggaat acataatgct tcaacgcagg25620

acggcgttcg tctcatcgtg cgcctcaatt tagcccctcc taatcctatt gctgagaaac25680

tctacaaatc tcacgcggcg gctaatctca actcagaaat tctggtttct aaacaaaagg25740

aactggagcg agaccccatt tttcatgttt cctcgactga gtaaactgac ttcacctcaa25800

aactgaagaa agtatatata atcacatctc tcacactatc ctttataaac tatatattgg25860

ggtggcatta ggccattcca aagaattctc taagatcaca ctcctcgata cctgactagt25920

catcacgttt cctggggtct gctctttaac attctactat cctataagat ctaaaactat25980

ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 26000

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctatggaatg gaagaaacac gac 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagagttgat gtcatagcta caag 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgggacaac accaaaacca cctaag 26

Claims (2)

1.一种鲫鱼冠状病毒HB93的数字RT-PCR检测引物，其特征在于，所述引物的序列是：

F：5'-CTATGGAATGGAAGAAACACGAC-3'

R：5'-GAGAGTTGATGTCATAGCTACAAG-3'；

所述的鲫鱼冠状病毒HB93的保藏编号为：CCTCC NO：V201722。

2.权利要求1所述引物在制备鲫鱼冠状病毒HB93检测试剂盒中的应用，所述的鲫鱼冠状病毒HB93的保藏编号为：CCTCC NO：V201722。