CN110551845B - 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒 - Google Patents
一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110551845B CN110551845B CN201910740891.7A CN201910740891A CN110551845B CN 110551845 B CN110551845 B CN 110551845B CN 201910740891 A CN201910740891 A CN 201910740891A CN 110551845 B CN110551845 B CN 110551845B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kit
- seq
- primer
- nucleotide sequence
- necrosis virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001051238 Infectious spleen and kidney necrosis virus Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 8
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 4
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000701372 Iridovirus Species 0.000 description 8
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- 241000701383 Frog virus 3 Species 0.000 description 4
- 241000748649 Largemouth bass virus Species 0.000 description 4
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 3
- 241000404975 Synchiropus splendidus Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241001506334 Santee-Cooper ranavirus Species 0.000 description 2
- 241000049502 Singapore grouper iridovirus Species 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241001518045 Bolinichthys indicus Species 0.000 description 1
- 241000269817 Centrarchidae Species 0.000 description 1
- 241001597062 Channa argus Species 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 241001446480 Embiotoca jacksoni Species 0.000 description 1
- 241000357439 Epinephelus Species 0.000 description 1
- 241000593470 Grouper iridovirus Species 0.000 description 1
- 241000701377 Iridoviridae Species 0.000 description 1
- 241000218652 Larix Species 0.000 description 1
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001502129 Mullus Species 0.000 description 1
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 description 1
- 241000269907 Pleuronectes platessa Species 0.000 description 1
- 241001417495 Serranidae Species 0.000 description 1
- 241001461527 Soft-shelled turtle iridovirus Species 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字PCR检测引物和特异性探针,其特征在于,所述引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明还提供了一种包含前述引物和特异性探针用于检测传染性脾肾坏死病毒的试剂盒,该试剂盒与微滴数字PCR结合使用检测ISKNV病毒,其检测的灵敏度高,不用设置标准曲线,根据检测结果可以直接判读样品中ISKNV的核酸拷贝数,极大的简化了操作步骤。
Description
技术领域
本发明属于水生动物病毒检测技术领域,更具体地,涉及传染性脾肾坏死病毒微滴数字PCR检测引物及试剂盒。
背景技术
传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),肿大病毒属(Megalocytivirus)。ISKNV宿主范围广泛,可以感染全世界范围内鲈形目、鳉形目、鲱形目、鲀形目、灯笼鱼目、鲻形目和鲽形目等50多种海水和淡水鱼类。付小哲等通过对33株不同宿主来源的肿大病毒的外膜蛋白进行同源性比对发现肿大病毒可以分为3个型,I型主要感染海水鱼,II型主要感染淡水鱼,III型主要感染鲆鲽类。ISKNV则分为I型和II型2种基因型。ISKNV于1998年最早在我国的鳜鱼上发现,现在已经发现其可以感染大口黑鲈、乌鳢、太阳鱼和石斑鱼等多种鱼类。该病的病程短,危害大,死亡率高,对我国的水产养殖业造成巨大的损失。
目前已报道的实验室检测ISKNV的方法主要包括病毒分离、电镜观察与鉴定、聚合酶链反应(PCR)、间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)、荧光定量PCR(qPCR)和环介导等温扩增(LAMP)等。传统的分离鉴定方法存在需要昂贵的仪器设备,耗时长等不足。PCR、qPCR和LAMP等方法与以前的检测方法相比,虽然具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测,且对低浓度病毒的定量结果较不稳定,无法在病毒低含量样品实现精准检测。
微滴式数字PCR(Droplet digitalpolymerase chain reaction,ddPCR)是20世纪末,Vogelstein等提出的一项核酸定量检测新技术。通过将一个样本分成20,000个纳升级的微滴,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),本质上将传统定量PCR的一个反应变成20,000个反应,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行判读,根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数,大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度。与传统的定量PCR相比,ddPCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析,精确度和灵敏度更佳。将ddPCR技术用于ISKNV的检测,可以实现快速、准确的对ISKNV核酸进行绝对定量。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字PCR检测引物及试剂盒。采用本发明设计的特异性引物和探针与数字PCR结合的方式来检测传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
第一方面本发明提供了一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字PCR检测引物和特异性探针,所述引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其下游核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示;所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
第二方面本发明提供了如上所述的引物和特异性探针在制备用于检测传染性脾肾坏死病毒的试剂盒或检测试剂中的应用。
第三方面本发明提供了一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的试剂盒,所述试剂盒包含如上所述的引物和特异性探针。
优选地,所述试剂盒还包括无RNA酶的蒸馏水,一步法ddPCR探针法预混液,探针法ddPCR微滴发生油,质控液,阴性对照和阳性对照。
优选地,一步法ddPCR探针法预混液包括:500μL的2×One-step ddPCR Supermixfor probes,分别为50μL的上、下游引物,50μL的特异性探针,300μL的RNase酶蒸馏水,所述一步法ddPCR探针法预混液的总体积为950μL。
优选地,所述上下引物和特异性探针的浓度均为10μM。
优选地,所述阳性对照为含有传染性脾肾坏死病毒基因组的质粒;所述阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
第四方面本发明提供了如上所述的试剂盒在微滴数字PCR中的应用。
优选地,所述微滴数字PCR反应程序中的退火温度为55-65℃,退火时间为60秒。
优选地,所述微滴数字PCR反应程序中的退火温度为55℃。
本发明的有益效果:本发明采用微滴数字PCR技术检测ISKNV病毒,其检测的灵敏度高,不用设置标准曲线,根据检测结果可以直接判读样品中ISKNV的核酸拷贝数,极大的简化了操作步骤。
附图说明
图1为本发明实施例3验证本发明引物和探针的特异性实验结果示意图(其中B01表示:大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass Virus,LMBV)、、;C01表示:石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)、;D01表示:蛙病毒(Frog Virus 3,FV3);E01表示:甲鱼虹彩病毒(Soft-shelled tutle iridovirus,STIV);F01表示:鳜鱼蛙虹彩病毒(Santee-Cooper RanaViruses,ScRIV);G01表示:阴性对照组(无RNA酶蒸馏水);H01表示:ISKNV阳性质粒。
图2为本发明实施例4对检测ISKNV的数字PCR检测方法的退火温度优化结果示意图(其中A01表示:65℃;B01表示:64.5℃;C01表示:63.3℃;D01表示:61.4℃;E01表示:59℃;F01表示:57℃;G01表示:55.7℃;H01表示55℃。
图3为本发明实施例5验证试剂盒中的引物和特异性探针以及检测方法的灵敏度实验结果示意图(其中A02表示:4×104copies/μL;B02表示:4×103copies/μL;C02表示:4×102copies/μL;D02表示:4×101copies/μL;E02表示:4×100copies/μL;F02表示:阴性对照组(无RNA酶蒸馏水))。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点,下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种用于检测ISKNV的数字PCR检测试剂盒,包括无RNA酶的蒸馏水,一步法ddPCR探针法预混液,探针法ddPCR微滴发生油,质控液,阴性对照和阳性对照。
所述一步法ddPCR探针法预混液包括:500μL的2×One-step ddPCR Supermix forprobes,上、下游引物分别为50μL,特异探针为50μL,引物和探针的浓度均为10μM,以及无RNase酶蒸馏水300μL,总体积为950μL。
所述阳性对照为含有传染性脾肾坏死病毒基因组的质粒,阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
所述引物和探针核苷酸序列分别如下:
ISKNV-F:CACCCTGGCTAACATTGGCA(SEQ ID NO:1)
ISKNV-R:CACAACCTCACGCTCCTCAC(SEQ ID NO:2)
ISKNV-Probe:FAM-ACCCGCACTGACCAACGTGTCCGT-MGB(SEQ ID NO:3)
实施例2
本实施例提供一种用于检测ISKNV的数字PCR检测方法,采用实施例1的试剂盒进行检测,具体检测方法包括如下步骤:
(1)提取待测样品的DNA,作为PCR反应模板。
(2)配制ddPCR反应液,体积20μL,其配方为:一步法ddPCR探针法预混液18μL(其中包含所述引物、探针和无RNase酶蒸馏水),待测样品DNA模板为2μL。
(3)制备微滴,按照液滴发生板上标记位置,分别在样品孔和油位孔加入ddPCR反应液20μL和微滴发生油70μL,然后将固定有微滴发生卡的底座置于微滴发生仪中生成微滴;将液滴生成孔中生成的微滴(一般在42μL左右)以一一对应的方式全部转入96孔板,用热封仪进行封膜,
(4)将封好膜的96孔板转入PCR仪中进行扩增,PCR扩增程序为95℃预变性10min;94℃变性30sec,55℃退火60sec,共40个循环;98℃10min,4℃恒温,结束反应,每步都设置2.5℃/sec的降温速度。
(5)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中,使用微滴分析仪检测微滴进行读数,分析每管反应体系中发出荧光的微滴数,显示样品中传染性脾肾坏死病毒检测结果。
实施例3
本实施例验证本发明提供的检测引物和探针的特异性,具体操作如下:
利用实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法,对待测病毒DNA进行检测,同时设置阳性对照组(ISKNV阳性质粒)和阴性对照组(无RNA酶蒸馏水),使用的待测病毒包括大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass Virus,LMBV)、石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouperiridovirus,SGIV)、蛙病毒(Frog Virus 3,FV3)、甲鱼虹彩病毒(Soft-shelled tutleiridovirus,STIV)、鳜鱼蛙虹彩病毒(Santee-Cooper RanaViruses,ScRIV)。
实验结果如图1所示,仅阳性对照组(ISKNV)可检测到信号,其余各组均无信号未阴性,说明该方法的引物和探针具有良好的特异性。
实施例4
本实施例对检测ISKNV的数字PCR检测方法的退火温度进行了优化,具体操作如下:
利用实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法,形成微滴,上PCR仪扩增,PCR的扩增程序为:50℃反转录10min;95℃预变性10min;94℃变性30sec,55-65℃退火60sec(仪器自动分布8个温度梯度,分别为65℃、64.5℃、63.3℃、61.4℃、59℃、57℃、55.7℃、55℃),共40个循环;98℃10min结束反应。使用微滴分析仪检测微滴进行读数,分析每管反应体系中发出荧光的微滴数。
实验结果如图2所示,退火温度65℃、64.5℃、63.3℃、61.4℃、59℃、57℃、55.7℃、55℃对应的拷贝数分别为0copies,0copies,88copies,50copies,124copies,128copies,148copies,156copies。因此,根据结果显示选择55℃为本发明的最佳退火温度。
实施例5
本实施例验证了本发明试剂盒中的引物和特异性探针以及检测方法的灵敏度,具体操作如下:
本实验采用ISKNV阳性质粒进行10倍梯度连续稀释,共设置5个梯度(4×104copies/μL、4×103copies/μL、4×102copies/μL、4×101copies/μL、4×100copies/μL),按照实施例1所述的试剂盒和实施例2所述的方法进行检测。
实验结果如图3所示,本发明建立的ddPCR检测方法最低检出限为1.8copies/μL个拷贝数。
实施例6
采用ddPCR和TaqMan荧光定量PCR方法分别检测广东省内采集的样品,比较两种方法的检测准确性和灵敏度。结果如表1所示,实验数据结果表明ddPCR检测到15份阳性样品,而TaqMan荧光定量检测到7份阳性样品,qPCR检测到的阳性样品ddPCR均得到一致的检查结果,但8份ddPCR阳性样品中病毒含量极低,所以导致qPCR无法对样品进行读数,表明ddPCR更具高灵敏度。
表1 ddPCR和qPCR样品检测结果
-表示Negative
表1的检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量,与其他定量PCR检测方法相比结果更加准确可靠。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字PCR检测引物及试剂盒
<130> 7.4
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 1
caccctggct aacattggca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 2
cacaacctca cgctcctcac 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成
<400> 3
acccgcactg accaacgtgt ccgt 24
Claims (2)
1.一种数字PCR检测引物和特异性探针在制备用于检测传染性脾肾坏死病毒的试剂盒或检测试剂中的应用,其特征在于,所述引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含数字PCR检测引物和特异性探针;
所述引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其下游核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述试剂盒还包括无RNA酶的蒸馏水,一步法ddPCR探针法预混液,探针法ddPCR微滴发生油,质控液,阴性对照和阳性对照;
所述一步法ddPCR探针法预混液包括:500μL的2×One-step ddPCR Supermix forprobes,分别为50μL的上、下游引物,50μL的特异性探针,300μL的RNase酶蒸馏水,所述一步法ddPCR探针法预混液的总体积为950μL;
所述引物和特异性探针的浓度均为10μM;
所述阳性对照为含有传染性脾肾坏死病毒基因组的质粒;所述阴性对照为无RNA酶蒸馏水。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910740891.7A CN110551845B (zh) | 2019-08-12 | 2019-08-12 | 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910740891.7A CN110551845B (zh) | 2019-08-12 | 2019-08-12 | 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110551845A CN110551845A (zh) | 2019-12-10 |
CN110551845B true CN110551845B (zh) | 2023-12-19 |
Family
ID=68737289
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910740891.7A Active CN110551845B (zh) | 2019-08-12 | 2019-08-12 | 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110551845B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110819740A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-21 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测鲤浮肿病毒的数字pcr试剂盒 |
CN111254225A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-06-09 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种鳜鱼蛙病毒及弹状病毒双重pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN113637797A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-11-12 | 中山大学 | 用于检测鱼类神经坏死病毒的微滴式数字pcr方法及相应的试剂盒 |
CN113637802A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-11-12 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法 |
CN113684312B (zh) * | 2021-08-24 | 2022-05-10 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种用于检测桑提库珀蛙病毒的数字pcr检测试剂盒 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101956022A (zh) * | 2010-08-17 | 2011-01-26 | 中国检验检疫科学研究院 | 传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法及其试剂盒 |
CN103966358A (zh) * | 2014-04-23 | 2014-08-06 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN104096240A (zh) * | 2014-06-20 | 2014-10-15 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种抗传染性脾肾坏死病毒的dna疫苗 |
CN107245532A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-10-13 | 湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种鲫鱼冠状病毒hb93的数字rt‑pcr检测引物及应用 |
CN109055618A (zh) * | 2018-09-13 | 2018-12-21 | 江苏省渔业技术推广中心 | 用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒 |
CN109762940A (zh) * | 2019-02-02 | 2019-05-17 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组及试剂盒 |
CN109971890A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-05 | 上海海洋大学 | Ii型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字pcr检测试剂盒及其专用引物和探针 |
-
2019
- 2019-08-12 CN CN201910740891.7A patent/CN110551845B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101956022A (zh) * | 2010-08-17 | 2011-01-26 | 中国检验检疫科学研究院 | 传染性脾肾坏死病毒Nest-PCR的检测方法及其试剂盒 |
CN103966358A (zh) * | 2014-04-23 | 2014-08-06 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN104096240A (zh) * | 2014-06-20 | 2014-10-15 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种抗传染性脾肾坏死病毒的dna疫苗 |
CN107245532A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-10-13 | 湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种鲫鱼冠状病毒hb93的数字rt‑pcr检测引物及应用 |
CN109055618A (zh) * | 2018-09-13 | 2018-12-21 | 江苏省渔业技术推广中心 | 用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒 |
CN109762940A (zh) * | 2019-02-02 | 2019-05-17 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 用于检测传染性脾肾坏死病毒与鳜鱼弹状病毒的引物组及试剂盒 |
CN109971890A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-05 | 上海海洋大学 | Ii型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字pcr检测试剂盒及其专用引物和探针 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Molecular confirmation of infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV) in farmed and imported ornamental fish in Australia;Peter G. Mohr等;《DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS》;20151016;第116卷;第104页左栏第1段至第106页右栏第1段,表1 * |
巢式PCR检测鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV);劳海华等;《南方水产》;20090805;第5卷(第4期);摘要,第70页112-114部分 * |
鳜鱼传染性脾肾坏死病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立;安伟等;《中国预防兽医学报》;20140315;第36卷(第3期);摘要,第215页1.2-1.4部分 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110551845A (zh) | 2019-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110551845B (zh) | 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒 | |
CN110551853B (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒 | |
CN105624330B (zh) | 同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法 | |
CN108676920B (zh) | 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法 | |
CN110951916A (zh) | 一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒 | |
CN112080584A (zh) | 一种检测大口黑鲈病毒的引物及探针、试剂盒和方法 | |
CN116024208B (zh) | 一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒 | |
CN111471797B (zh) | 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
CN113637802A (zh) | 一种利用数字pcr技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法 | |
CN106222298B (zh) | 一种rna病毒的lamp检测试剂盒、检测方法及应用 | |
CN108624713B (zh) | 一种猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒 | |
CN111471802A (zh) | 一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用 | |
CN116411136B (zh) | 一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
CN113684312B (zh) | 一种用于检测桑提库珀蛙病毒的数字pcr检测试剂盒 | |
CN116162734B (zh) | 一种快速检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的特异性引物、探针和试剂盒 | |
CN115896354A (zh) | 一种同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组及试剂盒 | |
CN107937615A (zh) | 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针 | |
CN114381551A (zh) | 一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针及试剂盒 | |
CN112680544B (zh) | 一种用于检测ii型草鱼呼肠孤病毒的rt-rpa引物、探针、试剂盒及检测方法 | |
CN113846188B (zh) | 一种rf-raa检测鸭圆环病毒的引物和探针组合及其应用 | |
CN110894551A (zh) | 草鱼出血病i型病毒(gcrv-i)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN117004747B (zh) | 一种多重实时荧光pcr的引物探针组、检测方法及应用 | |
CN116515840B (zh) | 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法 | |
CN115595382B (zh) | 用于检测猪肠道冠状病毒的引物组及其应用 | |
CN117327841B (zh) | 一种毛细管改良lamp法联合检验猴痘病毒和基孔肯雅病毒的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |